Explorando el mecanismo del gránulo Guben Pingchuan en el tratamiento del asma bronquial

Resumen

Este protocolo investiga el mecanismo de acción de los gránulos de Guben Pingchuan en el asma bronquial utilizando farmacología en red, acoplamiento molecular y validación in vivo.

Resumen

Este estudio investiga el mecanismo de acción de los gránulos de Guben Pingchuan en el tratamiento del asma bronquial mediante farmacología de redes, acoplamiento molecular y validación experimental. Se identificaron los ingredientes activos y los objetivos correspondientes utilizando las bases de datos TCMSP, HERB y SymMap. Los objetivos relacionados con el asma bronquial se recogieron de GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank y PharmGKB. Se identificaron objetivos superpuestos y se construyeron redes componente-objetivo e interacción proteína-proteína (IBP). Se realizaron análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) con corrección de la tasa de descubrimiento de falsos (FDR). Se realizó acoplamiento molecular para evaluar la afinidad de unión, seguido de una validación in vivo . Se identificaron un total de 121 componentes activos y 234 objetivos relacionados con fármacos, lo que dio 155 objetivos superpuestos. Los objetivos principales incluían TP53, AKT1, TNF e IL6. El análisis KEGG demostró un enriquecimiento significativo de la vía de señalización PI3K–Akt, que fue seleccionada para validación experimental. El acoplamiento molecular reveló una fuerte afinidad de unión entre los componentes centrales y AKT1. En ratas asmáticas inducidas por ovalbumina, el gránulo Guben Pingchuan redujo los niveles séricos de IL-4 e IL-10 , aumentó la expresión de FoxP3 en el tejido pulmonar y aumentó los niveles de ARNm de PI3K y AKT . Estos hallazgos indican que el gránulo de Guben Pingchuan alivia el asma bronquial modulando la vía de señalización PI3K–Akt ., regulando las citocinas inflamatorias y mejorando la función reguladora de las células T.

Introducción

El asma bronquial es una enfermedad respiratoria crónica heterogénea caracterizada por inflamación de las vías respiratorias, hiperreactividad, hipersecreción de moco y remodelación^{de las vías respiratorias.} Su patogénesis implica interacciones complejas entre la activación de las células inmunitarias, mediadores inflamatorios y múltiples vías de señalización. Clínicamente, el asma se presenta con sibilancias recurrentes, disnea, opresión en el pecho y tos. La inflamación de las vías respiratorias es un mecanismo central que subyace al inicio y progresión de la enfermedad, caracterizada por un aumento en la secreción de citocinas proinflamatorias como IL-6, IL-4, IL-17 y TNF-α., infiltración de células inflamatorias incluyendo eosinófilos y neutrófilos, y cambios estructurales como proliferación de músculo liso en las vías respiratorias, engrosamiento de la membrana basal e hiperplasia de las glándulas^{mucosas 2˒3}. Estos procesos patológicos conducen finalmente a la obstrucción de las vías respiratorias y a una disminución del flujo de aire.

La fisiopatología del asma está regulada por múltiples vías de señalización interactuantes en lugar de un solo mecanismo. La vía de señalización PI3K–Akt desempeña un papel clave en la modulación del equilibrio inmunitario, especialmente en el eje Treg/Th17, regulando la expresión de FoxP3. Esta vía también interactúa con las vías de señalización IL-17 y TNF para amplificar las respuestas inflamatorias y la remodelación de las vías respiratorias, contribuyendo a la heterogeneidad de la enfermedad y a la resistencia al^{tratamiento 3,4}. Los datos epidemiológicos indican un aumento continuo global de la prevalencia del asma, con más de 358 millones de personas afectadas en todo el mundo y aproximadamente 45,7 millones de pacientes adultos en^{China 5,6}. Las estrategias de tratamiento actuales se basan principalmente en agonistas de β₂ inhalados y glucocorticoides; Sin embargo, estas terapias actúan en mecanismos patológicos limitados y pueden provocar efectos adversos y resistencia a los glucocorticoides en ciertos pacientes. La desregulación de vías como PI3K–Akt. se ha asociado con una reducción de la respuesta terapéutica, lo que pone de manifiesto la necesidad de enfoques terapéuticos^{multi-objetivo 7,4}.

La medicina tradicional china (MTC) clasifica el asma como el "Síndrome de Xiao", que se asocia con deficiencias en la función pulmonar, del bazo y del riñón, combinadas con factores patógenos externos. Las formulaciones de la MTC se han utilizado ampliamente en el manejo del asma debido a sus características multicomponentes y^{multi-objetivo 8,9}. A diferencia de los agentes farmacológicos de un solo objetivo, los compuestos de la MTC ejercen efectos terapéuticos coordinando la regulación de múltiples vías biológicas, alineándose con la compleja fisiopatología del^{asma 10}. La farmacología de redes proporciona un enfoque a nivel de sistemas para analizar interacciones entre componentes de fármacos, dianas y vías de enfermedades, permitiendo la identificación de compuestos bioactivos clave y mecanismos^{moleculares 11}. El acoplamiento molecular complementa aún más este enfoque evaluando la afinidad de unión entre moléculas pequeñas y proteínas objetivo.

El gránulo Guben Pingchuan es una formulación medicinal tradicional china compuesta por ocho componentes herbales, incluyendo Ephedra sinica (hierba Ephedra), fruto de Psoralea corylifolia , semilla de Prunus armeniaca (semilla de albaricoque), raíz de Pseudostellaria heterophylla , fruto de Perilla frutescens , hoja de Eriobotrya japonica (hoja de níspero), bulbo de Lilium brownii y Epimedium brevicornum. Esta formulación se utiliza tradicionalmente para fortalecer la energía vital, eliminar la flema y aliviar la sibilancia. Estudios clínicos previos han demostrado su eficacia terapéutica en el asma bronquial, con tasas de respuesta más altas en comparación con los tratamientos^{convencionales 12}.

Para dilucidar el mecanismo subyacente de acción, se aplica un enfoque integrado que combina farmacología de redes, acoplamiento molecular y validación experimental in vivo . La farmacología de redes se utiliza para identificar componentes activos y posibles objetivos asociados al asma bronquial. El acoplamiento molecular se emplea para evaluar las interacciones entre compuestos clave y proteínas objetivo. Posteriormente se realiza validación experimental en un modelo animal para evaluar los efectos regulatorios sobre las vías críticas de señalización, especialmente la vía PI3K–Akt . Este enfoque tiene como objetivo proporcionar conocimientos mecanicistas sobre los efectos terapéuticos multi-objetivo del gránulo Guben Pingchuan y apoyar su aplicación en el tratamiento del asma bronquial.

Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Liaoning (Aprobación: 21000042023058) y se realizaron conforme a las directrices institucionales. Las herramientas de investigación utilizadas en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Bases de datos y software

1. Accede a las siguientes bases de datos y software: TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt y Cytoscape (versión 3.9.1).

2. Adquisición de objetivos componentes

1. Recuperar constituyentes químicos de hierba efedra, semilla de albaricoque, raíz de Pseudostellaria, fruto de Perilla, hoja de níspero, especies de Lilium y epimedium de la base de datos^{TCMSP 13}. Recuperar compuestos de Psoralea de las bases de datos HERB y SymMap.
2. Criba compuestos activos utilizando biodisponibilidad oral (OB ≥ 30%) y similitud con fármacos (DL ≥ 0,18)^14,15.
3. Predecir genes objetivo usando TCMSP. Estandariza todos los objetivos usando la base de datos UniProt seleccionando Homo sapiens. Eliminar objetivos duplicados e inválidos, incluyendo entradas no humanas, proteínas no anotadas e identificadores obsoletos.

3. Adquisición de objetivos para el asma bronquial

1. Busca en GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank y PharmGKB usando la palabra clave "asma bronquial". Pon la puntuación de relevancia de GeneCard en >4. Fusiona todos los objetivos recuperados y elimina los duplicados.

4. Identificación de objetivos de intersección

1. Importa objetivos de medicamentos y objetivos de enfermedades a una herramienta de análisis de Venn en línea. Identificar objetivos superpuestos y registrar el número total para análisis posteriores.

5. Construcción de la red componente–objetivo

1. Importar los objetivos de intersección en Cytoscape 3.9.1. Construye la red componente–objetivo. Ajusta el tamaño y el color del nodo según los valores de grado.

6. Construcción de la red de interacción proteína-proteína (IBP)

1. Sube los objetivos de intersección a la base de datos STRING. Selecciona Homo sapiens y fija la puntuación de confianza en ≥0,900. Exporta la red e importala a Cytoscape.
2. Calcula parámetros topológicos (centralidad de grados, centralidad de intermedios y centralidad de cercanía). Identificar objetivos principales usando umbrales medianos y grado >20.

7. Análisis de enriquecimiento GO y KEGG

1. Sube los objetivos superpuestos a la base de datos DAVID o analiza usando el paquete R clusterProfiler.
2. Realizar análisis de enriquecimiento por Ontología Génica (GO) para categorías de procesos biológicos, componentes celulares y funciones moleculares.
3. Realizar un análisis de enriquecimiento de vías KEGG. Aplicar la corrección de tasa de descubrimiento de falsos (FDR) y establecer el umbral de significancia a FDR < 0,05.
4. Visualiza los términos enriquecidos en la parte superior usando gráficos de barras o diagramas de burbujas.

8. Acoplamiento molecular

1. Descarga estructuras 2D de compuestos centrales de PubChem. Genera estructuras 3D usando ChemOffice y guarda como archivos mol2.
2. Descarga estructuras proteicas de la base de datos RCSB PDB. Elimina moléculas de agua y ligandos usando PyMOL.
3. Realiza acoplamiento molecular usando AutoDock Vina. Define los parámetros de la cuadrícula y ejecuta simulaciones de acoplamiento.
4. Registrar las energías de enlace (kcal/mol) y los residuos que interactúan con claves. Visualiza los resultados del acoplamiento utilizando plataformas de modelado molecular, visualización y simulación.

9. Validación experimental

1. Animales
   1. Obtén 48 ratas machos de Sprague–Dawley (9 semanas, 220–240 g). Animales domésticos a 20–25 °C con un 55%–60% de humedad bajo condiciones estándar.
2. Fármacos y reactivos
   1. Prepara gránulos Guben Pingchuan compuestos de hierba Efedra, Psoralea, semilla de albaricoque, raíz de Pseudostellaria, fruto de Perilla, hoja de níspero, Lilium y Epimedium.
   2. Prepara dexametasona, ovalbumina (OVA), hidróxido de aluminio, kits ELISA, kits de extracción de ARN y anticuerpos según la Tabla de Materiales.
3. Instrumentos
   1. Preparar el equipo estándar de laboratorio, incluyendo un lector de microplacas, un sistema de electroforesis, un microtomo de parafina y un sistema de imagen.
4. Agrupación y tratamiento de animales
   1. Asignar aleatoriamente a las ratas en seis grupos (n = 8): grupo control en blanco, grupo modelo, grupo dexametasona (0,3 mg/kg), grupo de medicina china en dosis bajas, grupo de medicina china de dosis medias y grupo de medicina china en dosis altas.
   2. En los días 1, 7 y 14, administrar 1 mL de inyección intraperitoneal de 10% OVA + 10% Al(OH)₃ a ratas del grupo modelo, grupo de medicina china de dosis bajas, grupo de medicina china de dosis medias, grupo de medicina china de dosis altas y grupo de dexametasona para sensibilización.
   3. Administrar 1 mL de inyección intraperitoneal de solución fisiológica salina al 0,9% a ratas del grupo control en blanco en los días 1, 7 y 14.
   4. Del día 15 al 21, realiza estimulación inhalada nebulizada una vez al día durante 20 minutos. Administrar inhalación nebulizada con OVA al 5% a ratas del grupo modelo, grupo de medicina china de dosis bajas, grupo de medicina china de dosis medias, grupo de medicina china de dosis altas y grupo de dexametasona.
   5. Administrar inhalación nebulizada fisiológica salina al 0,9% a ratas del grupo control en blanco desde los días 15 hasta 21.
   6. Administrar tratamientos con gavage oral una vez al día, de los días 22 al 36, según el grupo de tratamiento asignado.
   7. Controla el peso corporal y la condición general a diario durante todo el experimento. La cronología experimental se resume en la Tabla 1.
5. Histopatología
   1. Recoge tejido pulmonar. Arreglar, incrustar y mostrar las secciones. Realizar tinción de hematoxilina-eosina.
   2. Realizar tinción de Masson para evaluar la deposición de colágeno.
6. Análisis RT-PCR
   1. Extrae ARN total del tejido pulmonar.
   2. Homogeneizar tejido pulmonar congelado bajo condiciones de temperatura ultra baja. Después de pesar la muestra, transfiera rápidamente a un mortero preenfriado que contenga nitrógeno líquido y muélitala hasta convertirla en polvo.
   3. Transfiere la muestra en polvo a un tubo de centrífuga. Añade 1 mL de TransZol UP y 0,2 mL de reactivo de extracción de ARN por cada 50–100 mg de tejido. Agita el tubo a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   4. Centrifugar la muestra a 1000 × g y 2–8 °C durante 15 minutos. Transfiere la fase acuosa incolora a un nuevo tubo de centrífuga.
   5. Añade 1 mL de TransZol hasta 0,5 mL de isopropanol. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos.
   6. Centrifuga la muestra a 1000 × g durante 10 minutos. Añade 1 mL de etanol al 75% y centrifuga de nuevo durante 5 minutos.
   7. Desecha el sobrenadante y seca el precipitado al aire a temperatura ambiente durante 5 minutos. Disuelva el precipitado en 50–100 μL de solución de ARN y luego incube durante 10 minutos.
   8. Almacenar la muestra a −70 °C para su conservación a largo plazo.
   9. Sintetiza ADNc y realiza PCR cuantitativa para medir la expresión de PI3K y AKT.
7. ELISA
   1. Muestras de suero de descongelación a 4 °C. Mide los niveles de IL-4 e IL-10. utilizando kits ELISA según las instrucciones del fabricante.
8. Inmunohistoquímica
   1. Tejido pulmonar fijo con un 4% de paraformaldehído, incrustado en parafina, cortado, decerado e hidratado.
   2. Realizar la recuperación de antígenos, bloqueo e incubación de anticuerpos. La tinción según el kit de inmunohistoquímica FoxP3, la solución de tinción DAB y la expresión positiva aparecen como tinción marrón amarillenta o marrón oscuro.
   3. Observa y fotografía bajo un microscopio, y utiliza el software Image J para el análisis estadístico cuantitativo de la expresión FoxP3.
9. Análisis estadístico
   1. Normalidad de datos de prueba usando la prueba de Shapiro–Wilk y homogeneidad de varianzas usando la prueba de Levene.
   2. Analizar datos utilizando pruebas ANOVA unidireccionales o no paramétricas según corresponda. Expresa los datos como media ± desviación estándar.
   3. Defina p < 0,05 como estadísticamente significativo. ★★p < 0,01 y ★p < 0,05 frente al grupo de control; ◆◆p < 0,01 y ◆p < 0,05 vs grupo de modelos; ##p < 0,01 y #p < 0,05 frente al grupo de dexametasona.

Tabla 1: Cronología experimental. Calendario de sensibilización, procedimientos de desafío y tratamiento. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Resultados

Cribado de ingredientes activos
Tras filtrar la actividad del objetivo, se identificaron un total de 121 componentes activos de la base de datos TCMSP. Estos incluían 23 componentes de hierba Ephedra , 7 de Psoralea, 19 de semilla de albaricoque, 8 de raíz de Pseudostellaria , 16 de fruto de Perilla, 18 de hoja de níspero, 7 de Lilium y 23 de Epimedium. (Tabla 2). Se identificaron dieciséis componentes comu...

Discusión

El asma bronquial es una enfermedad común en el departamento^{respiratorio 16}. Es un trastorno obstructivo de las vías respiratorias causado por alérgenos y hiperreactividad de las vías^{respiratorias 17}. Tiene una alta incidencia clínica, es propensa a la recurrencia y es difícil de curar, afectando significativamente la salud y la calidad de vida de los pacientes. La Iniciativa Global para el Asma (GINA) de 2025 informa que la terapia con glu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
qPCR Kit	Novogene	NQ-001, 2×1mL	Detección de la expresión relativa de ARNm de genes diana
hidróxido de aluminio Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500g	Adyuvante inmunológico para mejorar la respuesta inmune al antígeno
Kit de prueba de concentración de proteínas BCA	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 100 piezas por caja	Cuantificación de proteínas totales para estandarizar la carga de muestras
Sistema de imagen de quimioluminiscencia	Tanon	5200Multi	Imagen de bandas WB, recolección y análisis de imágenes de geles y blots
Marcador de proteínas pre-teñido de color	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	Referencia de peso molecular de proteínas para experimentos de electroforesis
Kit de extracción de ARN mejorado	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 50 piezas por caja	Extracción y purificación de ARN total de tejidos y células
Lector de ensayos de inmunoabsorción enlazada a enzima	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	Detección cuantitativa de citocinas y contenido proteico en muestras
Anticuerpo primario FOXP3	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/pieza	Unión específica al proteína FOXP3 para inmunoensayo
Kit de preparación rápida de gel	Shanghai Yamei	PG212, 30 juegos	Preparación rápida de gel de separación y gel de apilamiento para electroforesis
Kit de tinción masson	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 tabletas	Tinción específica para fibras de colágeno de tejido y observación de fibrosis
OVA	Beijing Boaotoda Technology Co., LTD.	OVA-10g, ≥98%	Alergeno clásico para establecer modelos animales alérgicos
Solución de dilución de anticuerpo primario	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	Dilución de anticuerpo primario, mantenimiento de actividad y reducción de unión no específica
Kit ELISA de IL-10 de rata	Andy Bio	E-30649, 96T	Detección cuantitativa del factor antiinflamatorio IL-10 de rata
Kit ELISA de IL-4 de rata	Andy Bio	E-30623, 96T	Detección cuantitativa del factor inflamatorio Th2 de rata IL-4
Kit de transcripción inversa	Baori Medical Technology Co., LTD	E047-01A	Transcripción inversa de ARN a ADNc para el análisis génico posterior
Kit de tinción Oil Red O saturado	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2 botellas	Tinción y detección específicas de gotas de lípidos en tejido
Anticuerpo secundario anti-conejo Shangyang	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	Unión al anticuerpo primario de conejo para la reacción de color WB
Tampon TBST	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1L / botella	Tampon para el lavado de membranas y dilución de anticuerpos en Western blot
Sistema de transferencia por electroforesis	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	Usado para electroforesis de proteínas y transferencia de membranas en Western blot
Refrigerador de ultra baja temperatura	Zhongke Meiling	MDF-382	Criopreservación a baja temperatura de reactivos, muestras de proteínas y tejidos
Tanque de electroforesis vertical	BIO-RAD	JY-ZY5	Separación electroforética vertical de muestras de proteínas y ácidos nucleicos