Una plataforma digital de electroporación microfluídica para edición genómica CRISPR de baja entrada y transfección de ARNm en células T en suspensión y modelos de células 3D

Resumen

Este protocolo describe la edición miniaturizada del genoma CRISPR–Cas9 del receptor TCRα/β en células T humanas primarias utilizando 'DMF-ection', una plataforma de electroporación microfluídica digital (DMF). El método permite la edición genética paralela y de baja entrada y alta viabilidad y es además adaptable para la entrega de ARNm en esferoides 3D multicelulares.

Resumen

La electroporación microfluídica digital (DMF) permite una manipulación genética precisa y de bajo volumen de las células de mamíferos, minimizando la entrada celular hasta en 100 veces y preservando la viabilidad. Este estudio presenta un flujo de trabajo de transfección basado en DMF de alto rendimiento para la eliminación mediada por CRISPR del locus TRAC en células T de suspensión humana primaria y para la transfección de ARNm de esferoides HEK293T tridimensionales. Utilizando ARN guía CRISPR depositados espacialmente y ensamblaje de ribonucleoproteínas (RNP) en cartucho, se logró una alteración eficiente del locus TRAC tanto en poblaciones de células T CD4⁺ como CD8⁺ utilizando solo 10.000 células por condición, con viabilidades posteriores a la edición superiores al 85%. La caracterización biofísica mediante análisis inducidos por flujo y dispersión de Taylor reveló que los aditivos poliméricos estabilizan los complejos Cas9–sgRNA bajo condiciones de tampón de electroporación, apoyando la edición reproducible a volúmenes submicrolitros. El flujo de trabajo se adaptó aún más para aplicaciones 3D al introducir ARNm EGFP en esferoides intactos HEK293T, resultando en una fluorescencia robusta y espacialmente uniforme sin afectar el crecimiento o la morfología de los esferoides. En conjunto, estos resultados demuestran que la electroporación del DMF permite una edición eficiente del genoma y la entrega de ARNm tanto en células inmunitarias en suspensión como en esferoides multicelulares. Esta plataforma ofrece una solución escalable y de baja entrada para aplicaciones en terapia con células CAR-T, genómica funcional y modelos celulares 3D avanzados.

Introducción

La edición génica en células humanas primarias es cada vez más central tanto para el desarrollo terapéutico como para la investigación básica, incluyendo aplicaciones en inmunoingeniería, modelado de enfermedades raras y genómica^funcional. Aunque la electroporación permite una edición genómica altamente eficiente, los sistemas convencionales basados en cuvetas suelen requerir hasta millones de células por condición, lo que restringe su uso para muestras derivadas del paciente y poblaciones inmunitarias^{raras 2}. Además, estos sistemas son poco adecuados para el cribado a gran escala debido a limitaciones en el rendimiento de producción, automatización y consumo^{de reactivos 3}.

La electroporación microfluídica ha surgido como un enfoque prometedor para la edición genómica de baja entrada⁴. Sin embargo, la mayoría de las plataformas existentes dependen de arquitecturas de flujo continuo que implican un manejo complejo de fluidos, flexibilidad limitada en la mezcla de reactivos y requisitos relativamente altos de celda por condición. En cambio, la microfluídica digital (DMF) permite la manipulación activa de gotas discretas a escala de nanolitros en una matriz de electrodos planos, lo que permite un control preciso sobre la composición de la reacción, el tiempo y la localización espacial. Este formato plug-and-play basado en gotas es muy adecuado para flujos de trabajo de bajo volumen y alto rendimiento donde la conservación de las células primarias y reactivos es^{esencial 5}.

Trabajos recientes han demostrado la viabilidad de la entrega intracelular basada en DMF utilizando arquitecturas de electroporación tri-gotas que generan campos eléctricos localizados y de baja corriente para una entrega eficiente de RNP y ARNm, minimizando al mismo tiempo el estrés térmico y^{electroquímico 6,7,8}. Sobre esta base, se desarrolló una plataforma de electroporación DMF de próxima generación, denominada 'DMF-ection', que cuenta con 48 sitios de reacción direccionables de forma independiente, compatibilidad total de automatización y fabricación escalable^{de cartuchos 9} (Figura 1). El cartucho DMF consta de una placa inferior de la PCB y una placa superior de plástico separadas por una junta, ensambladas mediante broches de alineación en una única orientación correcta (Figura 1A). El diseño de 48 plexos está organizado en ocho familias idénticas (Figura 1A–H), cada una con seis sitios de electroporación direccionables de forma independiente, que soportan hasta 48 condiciones de edición paralela por cartucho (Figura 1B). Las bibliotecas de ARN guía se depositan sobre la superficie del sustrato mediante un dispensador acústico antes del ensamblaje del cartucho. Se confirmó la precisión posicional de la deposición en los 48 sitios, con posiciones de caída agrupadas dentro de una desviación submilimétrica respecto al punto medio del electrodo (Figura 1C), apoyando un ensamblaje fiable de RNP en el cartucho. Tras la carga, las celdas y las gotas de electrodo líquido se accionan en el cartucho para formar la geometría de electroporación de la triple gota (Figura 1D). Tras la electroporación, las células se descargan en placas de cultivo para su recuperación y análisis posteriores, incluyendo citometría de flujo, secuenciación y microscopía (Figura 1E). Este sistema permite una edición genómica de alta eficiencia utilizando hasta 100 veces menos células que los métodos estándar basados en cubetas, ampliando significativamente el acceso a la ingeniería genómica en aplicaciones de baja entrada y alto rendimiento.

Este estudio evalúa el rendimiento de la plataforma mediante la entrega de múltiples cargas biomoleculares, incluyendo complejos de ARNm y ribonucleoproteínas (RNP) CRISPR–Cas9, logrando una transfección eficiente y una alteración génica. Además de las células T primarias, la DMF-ection proporciona un marco generalizable para entregar ácidos nucleicos a estructuras multicelulares complejas. Los esferoides tridimensionales (3D) y los modelos de tipo organoide imponen barreras significativas a la penetración de los reactivos debido a su arquitectura y fragilidad, y los enfoques convencionales de electroporación a menudo alteran la morfología o generan una entrega heterogénea. Para evaluar si los mismos principios de electroporación miniaturizada usados para la edición de células T se extienden a tejidos estructurados, se aplicó el flujo de trabajo DMF a esferoides de HEK293T 3D. Estos experimentos demostraron que la electrohumectación basada en DMF puede posicionar suavemente esferoides intactos dentro de geometrías tri-gotas y soportar una entrega uniforme de ARNm mientras preserva la estructura y el crecimiento. Aunque estos resultados están fuera del protocolo principal de células T descrito aquí, ilustran la aplicabilidad más amplia de la electroporación programable de DMF para sistemas celulares 3D emergentes relevantes para el descubrimiento de fármacos y la modelización de enfermedades.

Protocolo

Las células T humanas primarias utilizadas en este protocolo se obtuvieron de proveedores comerciales bajo el consentimiento informado del donante y en cumplimiento de las directrices institucionales, éticas y regulatorias aplicables. Toda la manipulación de materiales biológicos de origen humano se realizó de acuerdo con los protocolos institucionales de bioseguridad. Los investigadores que implementan este protocolo son responsables de garantizar que su uso de células humanas primarias cumpla con los requisitos de la junta de revisión institucional local (IRB) o comité de ética, las normativas de bioseguridad aplicables y cualquier legislación nacional o regional relevante que regule el uso de material biológico humano. No se asoció información identificable por el paciente con el material celular utilizado en este estudio.

1. Preparación y activación de células T humanas primarias

1. La criopreservación rápida de células T CD3⁺ primarias humanas en un baño de agua a 37 °C. Transfiere las celdas a un medio basal de células T precalentado y centrifuga a 180 × g durante 10 minutos. Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en un medio fresco.
2. Determina la concentración y viabilidad celular usando un contador celular automático.
3. Resuspender células a 1 × 10⁶ células/mL en un medio de cultivo de células T suplementado con un anticuerpo tetramérico soluble para el activador de células T CD3/CD28 (según las instrucciones del fabricante) y 200 IU/mL de IL-2. Incubar células durante 72 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
   NOTA: Mantener la densidad celular entre 0,5–2 × 10⁶ células/mL durante la activación. Realizar activación en placas de 96 pozos en U-bottom para optimizar la eficiencia de contacto celda-activador y activación.

2. Preparación de manchas de ARN guía en el sustrato del DMF (spotting acústico por dispensador)

1. Reconstituir el ARNsg liofilizado en agua libre de nucleasas a una concentración de stock de 100 μM. En un tubo separado, prepare un stock de 100 mg/mL de ácido poli-L-glutámico (PGA, sal sódica, MW 15.000–50.000 Da) en agua libre de nucleasa. Combinar material de sgRNA y PGA en una proporción de volumen 5:4 (sgRNA: PGA) que produce una concentración final de sgRNA de 55,6 pmol/μL y una concentración final de PGA de 44,4 mg/mL en agua libre de nucleasa. Vortex brevemente y centrifugar a 1.000 × g durante 30 s y alicuotas en volúmenes de un solo uso, y almacenar alicuotas no utilizadas a −80 °C durante hasta 6 meses.
   NOTA: Evita ciclos repetidos de congelación y descongelación.
2. Añadir la mezcla guía-PGA a una placa fuente acústica de bajo volumen muerto en pozos correspondientes al diseño deseado del sitio de reacción.
3. Transfiere 40 nL (equivalente a 2,2 pmol sgRNA) de la mezcla guía-PGA a cada región de detección objetivo del sustrato DMF usando un dispensador acústico calibrado.
   NOTA: A 55,6 pmol/μL, 40 nL suministra 2,2 pmol sgRNA por sitio (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Las guías secas se reconstituyen durante la fusión de gotas en el cartucho; La resuspensión completa se confirma mediante una eficiencia de edición constante entre los sitios.
4. En un armario de seguridad biológica, dejar que las gotas moteadas se sequen completamente al aire a temperatura ambiente hasta que no quede líquido visible (aproximadamente 5 minutos).
   NOTA: No utilice flujo de aire forzado ni calor, ya que esto podría desalojar o degradar el ARN guía.
5. Monta el cartucho DMF.
   1. En un armario de seguridad biológica, alinea la placa superior sobre el sustrato moteado haciendo coincidir las características asimétricas de plástico de la placa superior con las muescas de la placa inferior. Aplica una presión uniforme y simultánea a lo largo de los bordes cortos hasta que se sienta un chasquido mecánico distintivo, confirmando el acoplamiento total de las características de bloqueo.
      NOTA: El cartucho está diseñado con una única orientación correcta; un montaje incorrecto no producirá el chasquido. Sujeta los sustratos por los bordes en todo momento para evitar contaminaciones o daños en superficies funcionales y evita que los sustratos se deslicen entre sí, ya que esto podría rayar los recubrimientos superficiales.
   2. Punto de control: Confirma el montaje correcto mediante el chasquete mecánico.
      NOTA: No existe un indicador eléctrico previo de la integridad del recubrimiento; cualquier fallo funcional resultante de un ensamblaje incorrecto se detecta automáticamente y se reporta en el informe de control de calidad posterior a la ejecución.
      Punto de pausa: Guarda los cartuchos ensamblados sin usar en un paquete sellado con desecante (sobres de gel de sílice) a temperatura ambiente durante hasta 48 horas.

3. Preparación celular

1. Preparar 1 mL de tampón de transfección completo fresco antes de cada uso, combinando un tampón de electroporación compatible con DMF con el tensioactivo bioiónico no iónico proporcionado en una proporción 20:1 (v/v) (tampón de electroporación: tensioactivo), obteniendo una concentración final de tensioactivo del 0,05% (v/v). Mezcla suavemente y déjalo en hielo.
   NOTA: El buffer de transfección compatible con DMF utilizado aquí es un buffer isotónico de baja conductividad (conductividad: 3,5 mS/cm, osmolalidad: 305 mOsm/L). Los investigadores que utilicen buffers alternativos deben verificar la compatibilidad con la actuación del DMF y la viabilidad de las celdas. El tensioactivo no iónico biocompatible sirve para reducir la fijación de gotas; si no se utiliza el tensioactivo proporcionado, un sustituto adecuado.
2. Lava las células T activadas una vez con tampón de transfección (sin surfactante). Centrifugar a 180 × g durante 5 minutos, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de celda en un tampón de transfección completa (que contiene tensioactivo) a 1,0 × 10⁷ células/mL en un volumen total de 100 μL por cartucho. Mantente en el hielo.
3. Inmediatamente antes de cargarla en el cartucho, añadir nucleasa Cas9 directamente a los 100 μL de suspensión de células T y mezclar pipeteando suavemente; Mantente en hielo.
   NOTA: Para las células T primarias, Cas9 se carga a 42 pmol por cada volumen de cartucho de 100 μL (0,42 pmol/μL). Cada sitio de electroporación procesa aproximadamente 1 μL de suspensión de celda, entregando 0,42 pmol Cas9 por edición. Optimiza esta dosis al adaptarte a otros tipos de células inmunitarias ( véase la Tabla 1).

Componente	Concentración final por edición
Cas9	0,42 pmol en ~1 μL de gota
sgRNA	2,1 PMOL (desde la posición de 40 NL)
PGA	44,4 mg/mL de fondo en mezcla para manchar
Tensioactivo	0,05% (v/v)
Entrada de celda	~10.000 celdas

Tabla 1: Tabla resumen de las concentraciones finales en cada gota de transfección.

4. Transfección en la plataforma de DMF-ección

1. Utilizando una pipeta multicanal, dispensa 10 μL de la mezcla T-célula/Cas9 en cada uno de los 8 puertos de carga de celdas, y 10 μL de buffer de transfección completo en los 16 conductos de carga de electrodos líquidos (como se muestra en la Figura 1).
2. Ajusta el voltaje a 500 V, la duración del pulso a 3 ms y el número de pulsos a 2. Inicia la secuencia de electroporación según las instrucciones de la plataforma.
   1. Punto de control: Revisa el informe de control de calidad post-carrera inmediatamente después de la carrera. Las fallas esporádicas (<10% de los sitios) no requieren intervención. Si los fallos son sistemáticos, sustituye el cartucho por la placa de control de calidad proporcionada, realiza la Revisión de Estado del Sistema (~2 min) y contacta con el soporte técnico si persisten los problemas.

5. Descarga y recuperación de células T editadas

1. Utilizando un manipulador de líquidos, transfiere las células electroporadas de cada sitio de reacción a una placa U-bottom de 96 pozos que contiene 150 μL de medio basal de células T precalentadas, suplementado con 200 IU/mL de IL-2.
2. Incubar células durante 72 horas a 37 °C, 5% de CO₂ para permitir la renovación proteica y cambios en la expresión de los receptores superficiales.

6. Análisis de citometría de flujo del knockout TRAC

1. Transfiere las células a una placa inferior cónica estéril de 96 pozos para reducir la pérdida celular entre lavados. Lava las células dos veces con Flow Cytometry Buffer (1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) centrifugando a 400 × g durante 5 minutos y retirando el sobrenadante invirtiendo suavemente la placa inferior cónica. Las células permanecerán en pellets dentro de la placa.
2. Preparar una mezcla maestra de tinción superficial que contenga anticuerpos anti-CD4, anti-CD8 y anti-TCRα/β en un tampón de citometría de flujo a las concentraciones recomendadas por el fabricante. Añade 25 μL de la mezcla maestra por pozo e incuba durante 20 minutos a 4 °C protegido de la luz. Lava dos veces con 1× PBS (sin FBS) centrifugando a 400 × g durante 5 minutos. Resuspender las células en 100 μL de 1× PBS que contenga un colorante de viabilidad a 1:1.000 (v/v) e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz.
   NOTA: Las placas inferiores cónicas son efectivas para esterilizar células; Comprueba que las células estén bien resuspendidas en todos los pasos.
3. Lavar las células dos veces con Flow Cytometry Buffer y resuspender en 150–200 μL por muestra para la adquisición.
4. Configura el citómetro con líneas láser y conjuntos de filtros apropiados para los fluorocromos utilizados (por ejemplo, excitación de 488 nm para tinte de viabilidad; 405 nm o 488 nm para marcadores superficiales según corresponda). Ajusta los voltajes usando controles de compensación de una sola mancha y una muestra sin teñir. Recoger un mínimo de 5.000 eventos en directo de singlets por muestra. Compuerta secuencial en: singletes de dispersión → células vivas (colorante de viabilidad negativo) → expresión CD4⁺ o CD8⁺ → TCRα/β.
   NOTA: Bajo condiciones estándar, el total de eventos vivos adquiridos puede variar entre 5.000 y más de 10.000 por muestra tras pérdidas durante el lavado y la tinción, dado que las células han tenido tiempo para proliferar.
5. Determinar la alteración del gen TRAC midiendo la frecuencia de células TCRα/β-negativas dentro de las poblaciones CD4⁺ y CD8⁺. Reporta la eficiencia de knockout como el porcentaje de celdas TCRα/β-negativas en relación con la puerta singlete viva para cada subconjunto.

Resultados

Resultados esperados
La electroporación de 10.000 células T activadas por condición suele resultar en una eficiencia de eliminación TRAC del >85% con una viabilidad del >95% 72 horas después de la transfección. La citometría de flujo revela una clara pérdida de tinción TCRα/β en la condición de dirección TRAC en comparación con controles de ARNsg (NTC) no dirigidos y controles no expuestos a campos eléctricos. Salvo que se indique lo contrario, n representa las ejecuciones DMF-ection independientes realizadas en días separados. Las réplicas técnicas de la misma serie de cartuchos se promediaron antes del análisis estadístico y no contribuyen de forma independiente a n. Todos los experimentos con células T reportados aquí se realizaron utilizando células criopreservadas procedentes de un único donante sano. La variabilidad de donante a donante utilizando la misma plataforma se caracteriza además⁹.

Mejora de la estabilidad de la ribonucleoproteína de Cas9–sgRNA bajo condiciones de electroporación debido a aditivos poliméricos aniónicos
Un requisito fundamental de diseño de la microfluídica digital es una superficie altamente hidrofóbica, que permite que las gotas se deslizen libremente durante el electrohumectado. Aunque esta propiedad es esencial para el movimiento de las gotas y la actuación precisa, supone desafíos para la carga de reactivos. Para aplicaciones de pantalla en array, es fundamental que las bibliotecas de carga útil definidas por el usuario puedan depositarse directamente sobre la superficie del cartucho. Esto permite que los diseños de los reactivos reflejen el diseño de la biblioteca del usuario y asegura que el flujo de trabajo microfluídico digital pueda ejecutar experimentos en disposición sin transferencias adicionales ni intervención manual. Prescindir de un dispensador acústico de nanolitros es muy adecuado para esta tarea, ya que puede entregar volúmenes de nanolitros con alta precisión posicional a través de grandes matrices sobre diversas superficies. Sin embargo, cuando las gotas impactan en una superficie hidrofóbica del cartucho, a menudo rebotan, forman gotas o no se dispersan de forma uniforme, lo que provoca una deposición y recuperación inconsistentes. Esta variabilidad es más evidente en volúmenes intermedios de gotas que van de 40 nL a 120 nL (Figura 2A, n = 3 por condición, *** valor p < 0,01), donde se hipotetiza que la energía cinética de la gota es lo suficientemente alta como para causar rebote, pero la adhesión superficial es insuficiente para anclar el líquido. Como resultado, la deposición directa en el cartucho a dosis de carga útil más altas puede ser poco fiable sin modificaciones adicionales. Para mitigar este efecto, se suplementaron los reactivos con el polímero bioseguro poli-L-glutámico ácido (PGA). El PGA es un polipéptido biodegradable y cargado negativamente ampliamente utilizado como estabilizador en formulaciones farmacéuticas, con excelente compatibilidad para flujos de trabajo de células vivas. Se hipotetiza que la columna vertebral cargada reduce el ángulo de contacto de las gotas y promueve una dispersión más uniforme, reduciendo el rebote y mejorando la adhesión superficial. Con la presencia de PGA, los volúmenes depositados de fluoresceína se escalaron linealmente con la absorbancia, y la variación se redujo notablemente entre los cartuchos. El análisis estadístico confirmó que la PGA mejoró significativamente la reproducibilidad a volúmenes de mancha de 40, 90 y 120 nL (***p < 0,001, ****p < 0,0001), mientras que las gotas muy pequeñas (10–20 nL) mostraron poca diferencia, ya que el rebote es menos pronunciado a bajas energías cinéticas.

A continuación, se evaluó la adición de aditivos poliméricos utilizados en el flujo de trabajo DMF por su influencia en el comportamiento de la ribonucleoproteína (RNP) Cas9–sgRNA bajo las condiciones de bajo volumen de tampón utilizadas para la electroporación. Para ello, se utilizó la tecnología de análisis de dispersión inducida por flujo (FIDA). FIDA fue seleccionado porque proporciona una medición precisa en fase solución del radio hidrodinámico y la afinidad de unión, permitiendo cuantificar las interacciones proteína-ácido nucleico bajo las mismas condiciones de tampón utilizadas en un entorno experimental. FIDA demostró que el ARNsgRNA libre exhibía un radio hidrodinámico (Rh) de 3,45 ± 0,26 nm, consistente con una especie de ARN pequeño y monocatenario. La titulación con Cas9 produjo un complejo RNP estable con un Rh de 15,32 ± 0,46 nm y una afinidad de unión subnanomolar (KD = 0,70 ± 0,14 nM) (Figura 2).

Para evaluar el efecto de la estabilización polimérica, se añadió ácido poli-L-glutámico (PGA) al ARN guía antes de la formación del RNP. La presencia de PGA redujo la aparente afinidad entre Cas9 y sgRNA (K_D = 67,7 ± 9,5 nM) y redujo el tamaño del complejo a aproximadamente 10 nm (Figura 2A panel derecho). Aunque la afinidad reducida sugiere complejos menos estrechamente asociados, la_{R h} más pequeña y uniforme indica que la PGA previene la formación de conjuntos RNP sobredimensionados (Figura 2B).

A continuación, se evaluó la estabilidad RNP bajo condiciones de electroporación mediante análisis de dispersión de Taylor (Figura 2C). Sin polímero, las mezclas Cas9–sgRNA producían Taylorgramas anchos y mal ajustados, indicativos de agregación (Figura 2B). En cambio, la adición de 0,0025 mg/mL de PGA produjo perfiles de dispersión monodispersos bien definidos (R² = 0,999) con_{R h} ~ 9,6 nm. Estos resultados demuestran que el PGA previene la agregación y mejora la uniformidad del RNP, apoyando así la electroporación reproducible a escala de nanolitros. Esta estabilización proporciona una justificación mecanicista para las altas eficiencias de edición observadas en experimentos posteriores con células T.

Eficiencia de edición dependiente de la dosis en células T primarias

Aunque los experimentos FIDA indicaron que la PGA reduce la eficiencia del ensamblaje RNP, se hipotetizó que los resultados de edición funcional se vieron menos afectados, ya que la electroporación se realiza típicamente con un exceso de ARN guía en comparación con Cas9. Por lo tanto, se evaluó el volumen de entrada PGA–RNP para evaluar su impacto en la eficiencia de eliminación en células T humanas primarias en el locus TRAC (Figura 2D). En cuatro cartuchos, la eficiencia de edición fue consistentemente alta (>75–80%) en entradas RNP de 40 nL (2,1 pmol), 20 nL (1,05 pmol) y 10 nL (0,53 pmol), con una variabilidad mínima entre los subconjuntos CD4⁺ y CD8⁺ . Incluso a 5 nL (0,26 pmol), la edición se mantuvo robusta, aunque se observó una reducción modesta en comparación con dosis más altas. En la dosis más baja probada (2,5 nL, 0,13 pmol), la eficiencia de edición disminuyó sustancialmente, estancándose, cerca del ~60% de TRAC KO. Los controles confirmaron la especificidad de la edición: los pozos sin electroporación (0V) y los controles fuera de cartucho (OCC) solo mostraban eliminación de fondo. La frecuencia elevada de TCR-negativo observada en la población CD8⁺ de control fuera del cartucho (OCC) probablemente refleja la baja de la modulación base de TCR específica del donante tras la activación, independientemente de la electroporación o la edición génica, ya que estas células no estuvieron expuestas al cartucho. En conjunto, estos resultados demuestran que la DMF-ection permite una edición eficiente mediada por CRISPR a entradas RNP a escala de nanolitros. Es importante destacar que la edición fue comparable entre las células T CD4⁺ y CD8⁺ , lo que pone de manifiesto la aplicabilidad de la plataforma en subconjuntos de células T y sugiere que el uso de RNP puede reducirse en más de un orden de magnitud sin comprometer la eficiencia del knockout.

Alteración génica eficiente en células T primarias CD4⁺ y CD8⁺ utilizando DMF-ection miniaturizada
Para validar el rendimiento del flujo de trabajo DMF-ection con mayor profundidad, se evaluó la eliminación mediada por CRISPR–Cas9 del locus TRAC en células T primarias humanas CD4⁺ y CD8⁺ utilizando solo 10.000 células activadas por condición. Se incluyeron tres grupos experimentales: la condición guía de dirigimiento de TRAC (TRAC KO), un control no dirigido (NTC) para tener en cuenta los efectos no específicos de la administración RNP, y un control fuera de cartucho (OCC) para establecer la expresión basal de TCRα/β en células no tratadas y no manipuladas. Se aplicó una estrategia estándar de gating para identificar singlets vivos, seguidos por subconjuntos CD4⁺ y CD8⁺ y expresión TCRα/β (Figura 3A). Se logró una alteración génica de alta eficiencia del locus TRAC en ambos subconjuntos de células T a lo largo de 40 corridas de electroporación independientes. En células T CD4⁺, la eficiencia de eliminación TRAC alcanzó el 88,4 ± el 4,9%, frente al 3,2 ± 4,7% en NTC y 9,8 ± 5,1% en condiciones OCC. Un resultado comparable se observó en células T CD8⁺, donde TRAC KO alcanzó 89,8 ± 4,2%, frente a 4,2 ± 7,4% (NTC) y 20,2 ± 4,9% (OCC) (Figura 3B, izquierda). Es importante destacar que la electroporación no produjo citotoxicidad sustancial en todas las condiciones. La viabilidad superó el 96% en todos los grupos, sin diferencias significativas entre las condiciones TRAC KO (97,1 ± 1%), NTC (96,8 ± 1%) y OCC (97 ± 1%) (Figura 3B, derecha). En conjunto, estos datos demuestran que la electroporación DMF permite una interrupción robusta y de alta eficiencia de TRAC mientras preserva la viabilidad celular a lo largo de múltiples tramos independientes. Las células T humanas primarias se obtuvieron de fuentes comerciales con el consentimiento informado del donante y de acuerdo con las directrices éticas institucionales y del fabricante.

Manejo de esferoides HEK293T con microfluídica digital
A continuación, se evaluó el flujo de trabajo de electroporación microfluídico digital para aplicaciones con estructuras multicelulares tridimensionales. Los esferoides huecos HEK293T se formaron sembrando aproximadamente 100 celdas por pozo en microplacas de baja unión y cultivando durante 24 horas para permitir la formación de esferoides (Figura 4A). Los esferoides formados se recogieron, resuspendieron y cargaron en el cartucho microfluídico digital para electroporación. Tras el tratamiento, los esferoides se descargaban en una placa de 96 pozos para obtener imágenes aguas abajo y análisis de crecimiento.

Para lograr una recuperación media de un esferoide por pozo tras la electroporación, se cargaba intencionadamente un número excesivo de esferoides sobre el cartucho para compensar la pérdida de material durante la manipulación y transferencia. Aproximadamente 192 esferoides fueron resuspendidos en 100 μL de buffer de electroporación y cargados en el cartucho. Cada familia de reacciones recibió ~9,3 μL de la suspensión, correspondiente a ~18 esferoides, con gotas individuales que contenían ~1 μL (1–2 esferoides por gota). Como aproximadamente la mitad de los esferoides permanecían en el puerto de carga durante el funcionamiento del cartucho, esta estrategia de carga resultaba en una media de ~1 esferoide por sitio de electroporación de tres gotas.

El análisis de la recuperación de esferoides indicó que típicamente se descargaban 0–1 esferoides por pozo tras la electroporación, correspondiendo aproximadamente a 4–6 esferoides recuperados por familia de reacción (Figura 4B panel izquierdo). Esta recuperación es inferior al máximo teórico y refleja las pérdidas que ocurren durante el lavado, la aspiración de sobrenadante y la retención de esferoides en el puerto de carga. Estas pérdidas se atribuyen al pequeño diámetro esferoide (~100 μm) y a la dificultad inherente para mantener la distribución uniforme de estructuras no unicelulares dentro de la suspensión. Como resultado, algunos esferoides permanecen distribuidos de manera desigual o no logran entrar en la región de la triple gota. Cargar un número excesivo de esferoides aseguró que al menos uno estuviera presente en la mayoría de los sitios de electroporación, permitiendo un análisis posterior consistente, como demostró la imagen en microscopio del esferoide teñido con DAPI en el cartucho de microfluídicos (Figura 4B, panel derecho). Una optimización adicional del proceso puede reducir el número de esferoides necesarios para lograr una recuperación equivalente. A pesar de estas pérdidas de manipulación, el flujo de trabajo permitió un posicionamiento suave de los esferoides intactos dentro de la geometría de electroporación de tres gotas.

Entrega de ARNm de EGFP y viabilidad en HEK293T esferoides
Se observó una entrega eficiente de ARNm de EGFP en HEK293T esferoides tras la electroporación (50 ng de ARNm GFP por esferoide). La microscopía de fluorescencia realizada 24 horas después de la electroporación reveló una expresión robusta y espacialmente uniforme de GFP en los esferoides electroporados, mientras que no se observó fluorescencia detectable en condiciones de control de 0 V o fuera del cartucho (Figura 4C, panel izquierdo). El análisis cuantitativo de la intensidad media de fluorescencia (MFI) normalizada por área esferoide confirmó la transfección exitosa bajo ambos conjuntos de parámetros de electroporación probados (Figura 4C, panel central). Específicamente, los esferoides electroporados a 500 V, 2 ms, 2 pulsos mostraron un MFI de 6,96 × ^10-5 ± 3,50 × ^10-5, mientras que los electroporados a 375 V, 6 ms, 1 pulso mostraron un MFI de 5,05 × ^10-5 ± 3,29 × ^10-5. No se detectó fluorescencia medible en condiciones de control (0 ± 0). Ambas condiciones de electroporación produjeron una fluorescencia significativamente mayor en comparación con los controles (p < 0,05), sin diferencias estadísticamente significativas entre los parámetros del pulso. Para evaluar si la electroporación afectaba negativamente al crecimiento de las esferoides o a la integridad estructural, se midieron diariamente los diámetros de las esferoides durante 5 días después del tratamiento. Los esferoides electroporados mostraron cinética de crecimiento comparable a los controles no tratados, lo que indica que la transfección de ARNm no afectó la viabilidad ni la capacidad proliferativa de los esferoides (Figura 4C, panel derecho). En conjunto, estos resultados demuestran que la electroporación microfluídica digital permite la entrega eficiente de ARNm en esferoides multicelulares intactos mientras preserva la integridad y el crecimiento estructural, apoyando la viabilidad de extender esta plataforma a modelos celulares tridimensionales.

Los datos se presentan como media ± desviación estándar. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional con la corrección post hoc de Tukey para comparaciones múltiples, con un umbral de significación de p < 0,05. Los valores N representan réplicas biológicas independientes (donantes separados o tiradas independientes de cartuchos) según lo especificado en la figura.

Figura 1. Arquitectura y flujo de trabajo de la plataforma de electroporación DMF. (A) Fotografía del cartucho DMF. (B) Esquema anotado del diseño ensamblado de cartuchos 48-plex (imagen central), mostrando la organización (A–H) de ocho familias idénticas, cada una con seis sitios de electroporación direccionables de forma independiente, con puertos de carga de electrodos líquidos, puertos de carga de celdas, ánodos, cátodo y regiones de nano punto etiquetados (imagen insertada izquierda). Se etiquetan características clave, incluyendo puertos de carga, puertos de descarga y broches de montaje. El cartucho se ensambla mediante un ajuste de presión de las dos placas en una única orientación correcta hasta que se siente un acoplamiento mecánico distintivo. Imagen derecha: mapa de dispensadores de manipuladores de líquidos que muestra posiciones codificadas por colores para puertos de carga (rojo), puertos de descarga (rosa) y regiones de detección de objetivos (azul). (C) Izquierda: imagen que muestra la precisión posicional de la dispensación acústica en los 48 sitios (n = 48), con las posiciones de caída representadas respecto al punto medio del electrodo (mm). El agrupamiento ajustado confirma la precisión en la deposición submilimétrica. Derecha: imágenes representativas que muestran un punto correctamente centrado antes de la rehidratación por la gota celular (arriba) y durante la rehidratación, donde la gota se mueve de un lado a otro hacia donde está la guía para volver a suspenderla (abajo, flecha roja). (D) Imagen en vista superior de regiones discretas de electroporación, mostrando el movimiento escalonado de las gotas desde (i) la rehidratación de la carga útil mediante el traslado de la gota hacia adelante y hacia atrás sobre el ARN guía depositado, (ii) el movimiento hacia el sitio de electroporación, entre el ánodo y el cátodo, donde la gota de la celda se une con las dos gotas de electrodo líquido flanqueantes y es pulsada, y (iii) el tri-drop completo se desplaza a su puerto de descarga antes de ser recuperado por el manipulador de líquidos. (E) Esquema de flujo de trabajo de extremo a extremo. El ARN guía se deposita sobre el sustrato del cartucho mediante un dispensador acústico. Las celdas y la carga útil se preparan y cargan en el cartucho mediante un manipulador automático de líquidos. La electroporación se realiza en la plataforma DMF. Las células se descargan en una placa de 96 pozos y se transfieren a una incubadora para su recuperación. El análisis aguas abajo se realiza utilizando citometría de flujo, microscopía, secuenciación de nueva generación u otras lecturas adecuadas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2. Impacto de la suplementación de polímeros en la deposición y el ensamblaje de RNP. (A) La suplementación con polímeros mejora la fidelidad de la deposición acústica. Absorbancia de fluoresceína tras la deposición y reconstitución en cuatro cartuchos independientes, con o sin ácido poli-L-glutámico. La varianza se redujo en volúmenes intermedios (40–120 nL) en presencia de PGA. 
(B) Impacto de la PGA en el ensamblaje de Cas9–sgRNA. Curvas de unión de afinidad FIDA que miden el radio hidrodinámico (Rh) en ausencia (panel izquierdo) o presencia (panel derecho) de PGA. El sgRNA libre mostró Rh de 3,45 ± 0,26 nm, mientras que la titulación Cas9 produjo un tamaño del complejo RNP de 15,32 ± 0,46 nm (Kd = 0,70 ± 0,14 nM). La adición de PGA redujo el tamaño del complejo y debilitó la afinidad de unión de manera dependiente de la concentración. Con la adición de 0,005 mg/mL de PGA, el sgRNA libre mostró un Rh de 4,31 ± 0,07 nm, mientras que la titulación Cas9 produjo un tamaño del complejo RNP de 10,21 ± 0,38 nm (K_d = 67,7 ± 9,5 nM). Se realizaron experimentos en un tampón de ensayo de electroporación de baja conductividad con F-68 plurónico al 0,05%. La fluorescencia se detectó a 480 nm mediante el módulo LED integrado. Para todos los experimentos se utilizó un capilar recubierto de forma permanente (Ø 75 μm, L = 100 cm). Para probar el efecto de los polímeros polianiónicos en el ensamblaje de RNP, se añadió PGA a mezclas de ensayo a concentraciones de 0,0025 mg/mL y 0,005 mg/mL. Estas condiciones se seleccionaron para modelar el rango utilizado en microfluidos digitales, electrohumectación y búferes de electroporación. Para el análisis de unión directa, se utilizó un sgRNA marcado con FAM de 10 nM dirigido al locus TRAC como indicador fluorescente. Las concentraciones crecientes de nucleasa Cas9 (hasta 500 nM) se ajustaron al indicador en un ensayo CapMix para generar perfiles de dispersión para la formación de complejos. Todos los experimentos se realizaron a 25 °C, consumiendo cada punto de datos 40 nL de Indicador y ~12 μL de analito (Cas9). Se realizaron experimentos con la siguiente secuencia: (1) enjuague con ácido fosfórico al 0,1% a 3.500 mbar durante 30 segundos; (2) enjuague con tampón de ensayo a 3.500 mbar durante 30 s; (3) llenar el capilar con alito a 3.500 mbar durante 20 segundos; (4) inyectar el indicador a 50 mbar durante 10 s; (5) movilizar y medir con analito a 400 mbar durante 180 s. Los radios hidrodinámicos se calcularon utilizando el ancho de pico extraído a la mitad de la altura máxima y constantes de disociación (K_D) se determinaron mediante regresión no lineal ajustando a un modelo de unión 1:1. (C) Efecto de la PGA sobre la estabilidad del RNP. Perfiles de dispersión Taylor de complejos Cas9–sgRNA con y sin PGA, realizados con nucleasa Cas9 de 500 nM y sgRNA marcado con FAM de 50 nM. En ausencia de PGA, no se observó un complejo estable, como indica la creciente formación de grandes agregados junto con una señal decreciente del complejo a lo largo del tiempo (izquierda). La adición de 0,0025 mg/mL de PGA produjo un taylorgrama monodisperso bien definido con agregación mínima que mide una R_h ~ 9,6 nm (R² = 0,999, correcto). La estabilidad compleja se evaluó bajo condiciones estándar de electroporación (500 nM Cas9 + 50 nM sgRNA) con o sin 0,0025 mg/mL de PGA. Las muestras se premezclaron y mantuvieron a 4 °C en la bandeja de entrada mientras las inyecciones se realizaban en intervalos de 10 minutos durante varias horas. Se realizaron experimentos con la siguiente secuencia: (1) enjuague con ácido fosfórico al 0,1% a 3.500 mbar durante 30 segundos; (2) enjuague con tampón de ensayo a 3.500 mbar durante 30 s; (3) rellenar el capilar con analito (tampón de ensayo) a 3.500 mbar durante 20 s; (4) inyectar el indicador a 50 mbar durante 10 s; (5) movilizar y medir con analito a 400 mbar durante 180 s. La formación inestable del complejo se demostró mediante la formación de grandes agregados (picos en el Taylorgram) y la disminución de la señal. Los complejos estables se identificaron por Taylorgrams monodispersos bien ajustados (R)² > 0,99), y R_h los valores se extrajeron de perfiles ajustados. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3. Eficiencia y viabilidad de eliminación alfa/beta TCR en células T humanas primarias. (A) Estrategia representativa de gating de citometría de flujo para singlets vivos, subconjuntos de células T CD4⁺ y CD8⁺, y expresión de TCRα/β en condiciones de control (sgRNA no dirigido) y experimentales (sgRNA TRAC). Las células fueron seleccionadas secuencialmente en las poblaciones de FSC/SSC, singletes, viabilidad y CD4⁺ o CD8⁺ antes de la evaluación de la expresión superficial TCRα/β. (B) Izquierda: TCRα/β eficiencia de eliminación en subconjuntos de células T CD4⁺ y CD8⁺ en tres condiciones: TRAC KO, control no dirigido (NTC) y control fuera del cartucho (OCC). CD4⁺: TRAC KO = 88,4 ± 4,9% (n = 40), NTC = 3,2 ± 4,7% (n = 24), OCC = 9,8 ± 5,1% (n = 18). CD8⁺: TRAC KO = 89,8 ± 4,2% (n = 40), NTC = 4,2 ± 7,4% (n = 24), OCC = 20,2 ± 4,9% (n = 18). Derecha: Viabilidad post-electroporación en todas las condiciones, bloqueada por singlets. Viabilidad: TRAC KO = 97,1 ± 1% (n = 40), NTC = 96,8 ± 1% (n = 24), OCC = 97 ± 1% (n = 18). Los puntos de datos individuales se muestran con media y SD. n representa corridas de electroporación independientes a lo largo de múltiples cartuchos y días. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4. Entrega eficiente de ARNm en HEK293T esferoides mediante DMF-ection. (A) Diagrama de flujo de trabajo que describe el proceso de formación de esferoides y realización de la transfección de esferoides. Cien HEK293T celdas se cargan por pozo en microplacas esferoides especializadas y se cultivan durante 24 horas para formar esferoides de 100 μm de diámetro. Los esferoides (192) se descargan y resuspenden en 100 μL de tampón de transfección. Esta suspensión, con la carga útil adecuada, se carga en el cartucho DMF-ection con punteado guía a 9,3 μL por familia. Una vez producida la electroporación, las muestras se descargan en una placa de 96 pozos para su análisis aguas abajo. (B) Izquierda: Número de esferoides descargados por familia en cartuchos DMF-ection en comparación con los controles fuera de cartucho. Centro: Imagen fluorescente de la tri-caída, donde un cuadrado rojo más grande delimita la triple caída, y el óvalo rojo rodea el esferoide. Derecha: Imagen fluorescente mostrando puerto de carga con esferoides cargados (círculos azules). (C) Panel izquierdo: Imágenes en campo claro de esferoides HEK293T intactos antes de la electroporación e imágenes de fluorescencia de esferoides 24 horas después de la electroporación del ARNm por EGFP , comparadas con controles de 0 V y fuera de cartucho. (D) Panel superior: Cuantificación de la intensidad media de fluorescencia normalizada al área esferoide para dos condiciones de electroporación (500 V, 2 ms, 2 pulsos; 375 V, 6 ms, 1 pulso). No hay diferencia significativa entre las condiciones electroporadas, pero todas las condiciones electroporadas son significativamente diferentes de los controles de 0 V y fuera de cartucho (500 V 2 ms 2 pulso: 6,955 × ^10-5 ± 3,502 × ^10-5, 375 V 6 ms 1 pulso: 5,045 × ^10-5 ± 3,294 × ^10-5, 0 V: 0 ± 0, Control fuera de cartucho: 0 ± 0 (*p < 0,05). Las imágenes se procesaban usando el paquete de procesamiento de imagen^{FIJI 10}. (500 V, 2 ms, 2 pulsos: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 pulso: n = 4; Control fuera de cartucho: n = 3; 0 V control: n = 3). (D) Panel inferior: Diámetro del esferoide tras electroporación durante 5 días en diferentes condiciones. El diámetro se midió usando FIJI a partir de imágenes de contrato de fase tomadas a 20x de aumento con un microscopio invertido. (500 V, 2 ms, 2 pulsos: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 pulso: n = 4; Control fuera del cartucho: n = 3; 0 V control: n = 3). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Este protocolo describe un flujo de trabajo miniaturizado de electroporación microfluídica digital que permite una entrega intracelular eficiente a las células T humanas primarias utilizando gotas a escala de nanolitros. Una ventaja central de este método es la capacidad de realizar edición genómica CRISPR–Cas9 utilizando solo 10.000 células por reacción, reduciendo drásticamente los requerimientos de material en comparación con la electroporación convencional. La arquitectura basada en gotas soporta la automatización, asegurando el manejo reproducible de reactivos y el ensamblaje de reacciones a través de múltiples sitios paralelos.

En estudios previos, la comparación directa de la plataforma DMF-ection frente a un sistema ampliamente utilizado demostró que la nucleofección convencional producía menos del 2% de células T GFP-positivas a 10.000 células por edición, mientras que la plataforma DMF-ection alcanzó una eficiencia de transfección del >90% bajo las mismas condiciones de baja entrada. Para una pantalla en disposición de 192 condiciones, la plataforma DMF requería 25 veces menos celdas y aproximadamente 50 veces menos Cas9 por condición que los métodos^{convencionales 9}. Estas comparaciones destacan las ventajas materiales de la electroporación DMF miniaturizada para aplicaciones de baja entrada y cribado

Pasos críticos y resolución de problemas
Varios pasos son fundamentales para el éxito. La calibración precisa del manipulador acústico de líquidos garantiza una deposición precisa del ARN guía sobre el sustrato del cartucho, esencial para un ensamblaje consistente del RNP. Si el manchado es inconsistente o las gotas no se adhieren al sustrato, verifica que el PGA esté incluido en la mezcla de ARN guía a la concentración correcta (5 mg/mL final) y que el dispensador acústico esté calibrado para la geometría específica de la placa fuente. El manchado inconsistente en volúmenes intermedios (40–120 nL) es causado principalmente por el rebote de gotas en la superficie hidrofóbica; aumentar ligeramente la concentración de PGA o reducir la altura del dispensador puede solucionar esto.

Mantener la concentración celular correcta antes de la carga es importante, ya que las desviaciones en la densidad pueden afectar la formación de gotas y reducir la eficiencia de la edición. Si la eficiencia de edición cae por debajo del 75%, primero verifica que la activación de las células T fue suficiente (confirma la regulación alcista del CD25 y el CD69 mediante citometría de flujo antes de la electroporación) y confirma que Cas9 y el sgRNA se combinaron inmediatamente antes de la carga y no de antemano.

Los aditivos poliméricos desempeñan un papel importante en la estabilización de complejos Cas9–sgRNA bajo las condiciones del tampón de^{electroporación 11}. Aunque la PGA reduce la afinidad nominal de unión, su efecto estabilizador mejora la reproducibilidad y previene la agregación a volúmenes de nanolitros. Esto representa un parámetro ajustable para los investigadores que adaptan el flujo de trabajo a otros complejos proteína–ARN.

Resolución de problemas
Puente de gotas fallido
Revisa el informe instrumental de control de calidad posterior a la ejecución tras cada experimento. La ausencia de corriente detectada indica fallo en el puente, ya sea por gotas insuficientes o falta de fusión, y es señalada automáticamente por el sistema. Los sitios afectados no pueden recuperarse en la misma etapa. Si los fallos son esporádicos (<10%), no se requiere ninguna acción; Distribuir réplicas entre varios cartuchos para minimizar el impacto. Si los fallos son sistemáticos, ejecuta la tarjeta de control de calidad y la comprobación de salud del sistema y contacta con el soporte técnico si persisten los problemas.

Manchado inconsistente de sgRNA
Tras la dispensación, confirma visualmente que todas las gotas esperadas están presentes, centradas dentro de los límites de los electrodos y libres de gotas satélite. Incluir PGA en la mezcla de ARN guía para evitar la polidispersión. Si faltan gotas, revisa el informe de funcionamiento del dispensador y vuelve a dispensar si es necesario. Para una formación pobre de menisco, mantener un mínimo de 5 μL por pozo, girar brevemente la placa y golpear suavemente una superficie plana. Trabaja con hielo y sella las placas cuando no se usen para evitar la evaporación.

Reducción de la eficiencia de edición
Si se observa una reducción en la eficiencia de edición, se resuelve en el siguiente orden: (1) validar las condiciones de entrega usando ARNm EGFP antes de proceder con RNP; (2) confirmar que la corriente de control de calidad medida coincide con los valores esperados; (3) densidad de células de titulación, ARN guía y concentración de Cas9; (4) confirmar la alta viabilidad de las celdas inmediatamente antes de cargar; (5) verificar la integridad del reactivo y las condiciones de almacenamiento; (6) confirmar que el método de lectura es apropiado para la densidad celular y el objetivo de interés.

Adaptación de la plataforma a tipos y modelos celulares alternativos
Para otros tipos primarios de células inmunes, como las células NK o las células T reguladoras, los parámetros de electroporación requerirán optimización. El tamaño de la célula es un determinante importante del umbral del campo eléctrico necesario para la permeabilización de membrana: las células más pequeñas requieren mayores intensidades de campo, mientras que las más grandes se permeabilizan a voltajes más bajos, una relación bien documentada en la biofísica de la electroporación. Como punto de partida para tipos de células más pequeñas que las células CD3⁺ activadas, mantener o aumentar ligeramente el voltaje (500–550 V) manteniendo la duración del pulso corta (2–3 ms) para evitar un estrés térmico excesivo. Para celdas más grandes, reduce el voltaje a 350–400 V y modula la duración del pulso sin superar los 10 ms. Además, la microoptimización a nivel de donante es una práctica común en electroporación, y los parámetros validados en células donantes sanas pueden no traducirse directamente a material enfermo o derivado del paciente. Las células de donantes con malignidades hematológicas, infecciones crónicas o inmunodeficiencia presentan frecuentemente propiedades biofísicas alteradas, y la eficiencia y viabilidad de la edición deben reevaluarse para cada nuevo donante, especialmente cuando se trabaja con muestras no sanas o clínicas. La viabilidad celular debe evaluarse a las 24 y 72 horas tras la electroporación y ajustar los parámetros iterativamente. La dosis de Cas9 también puede necesitar aumentarse entre 1,5 y 2× respecto al protocolo de células T si la eficiencia de administración RNP se reduce.

Para modelos 3D más grandes o densos, como organoides que superan los 200 μm de diámetro, la junta del cartucho puede requerir modificaciones para acomodar un mayor tamaño de estructura y barreras de difusión. Los usuarios que intenten este tipo de aplicaciones deberían considerar la predisociación de las capas celulares externas para mejorar la penetración de los reactivos o aplicar múltiples condiciones de pulso en secuencia. Contacte con el autor correspondiente para orientación sobre cómo adaptar la geometría de las gotas y los parámetros de pulso para estructuras más allá de los 100 μm de diámetro esferoide validados aquí.

Relevancia traslacional
El potencial traslacional de este flujo de trabajo va más allá del simple knockout. La plataforma se ha aplicado al knock-in de reparación dirigido por homología de una construcción GFP de 4 kb y un CAR anti-HER2 funcional en el locus TRAC en células T primarias, así como a una pantalla CRISPR en matriz de 45 blancos que identifica nuevos reguladores del agotamiento de células T^{CD4⁺ 9}. Estas aplicaciones ilustran un camino desde la optimización a nivel de protocolo hasta el descubrimiento funcional en modelos celulares primarios clínicamente relevantes. No obstante, persisten limitaciones importantes: resultados funcionales como las tasas de interrupción alélica por secuenciación, secreción de citocinas y enjerto in vivo no fueron evaluados en el protocolo actual y representan los siguientes pasos necesarios para la traducción terapéutica. Además, aunque la plataforma soporta 48 reacciones paralelas por cartucho, será necesaria la paralelización multi-cartucho para pantallas más grandes.

Limitaciones
Como ocurre con cualquier plataforma miniaturizada, deben reconocerse ciertas limitaciones prácticas. El fenotipado aguas abajo debe adaptarse a la pequeña escala de reacción; La adquisición de citometría de flujo puede requerir pasos adicionales de concentración o agrupación de pozos replicados para lograr un número suficiente de eventos. Los ajustes de electroporación de la plataforma también pueden requerir optimización para tipos de células con alta sensibilidad a campos eléctricos, y los usuarios deberían tratar los parámetros publicados como puntos de partida en lugar de valores universalmente fijos. Finalmente, no se realizó tinción formal de viabilidad en puntos prolongados de tiempo post-electroporación para el flujo de trabajo esferoide presentado aquí; El seguimiento del crecimiento basado en el diámetro se utilizó como medida sustituta de la integridad estructural y representa una dirección importante para futuras caracterizaciones.

En general, la DMF-ection, un método de transfección no viral, proporciona un enfoque potente y flexible para la edición del genoma y la entrega de ARNm en entornos de baja entrada y alto rendimiento. Su compatibilidad con células T primarias, modelos estructurados 3D y manipulación automatizada de líquidos amplía las oportunidades en ingeniería de terapia celular, cribado multicondición CRISPR y genómica funcional miniaturizada.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentación
1x PBS	Gibco		Buffer de flujo
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Protocolo de esferoides
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Protocolo de esferoides
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 en 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentación
DMEM Media	Gibco	10564011	Suplemento de media- cultivo de esferoides
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfección
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentación
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Buffer de flujo
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentación
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Suplemento de media- cultivo de esferoides
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentación
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Protocolo de esferoides
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	Suplemento de media para células T
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Sangre periférica, criopreservada, células T auxiliares pan CD3+ seleccionadas negativamente
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	Medio para activación de células T
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	Medio para activación de células T
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentación
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentación
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 en 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 en 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Suplemento de media- cultivo de esferoides
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Uso a 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Protocolo de esferoides
Surfactant F	DropGenie		Transfección- uso a 1:20 en buffer compatible con DMF para hacer el buffer de transfección completo
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Protocolo de esferoides