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Detección de senescencia usando luz reflejada en la fracción vascular estromal adiposa

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DOI:

10.3791/70588

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5 de junio de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta microscopía confocal de luz reflejada para la detección objetiva y unicelular de la actividad beta-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) en la fracción vascular estromal aislada del tejido adiposo humano. El método es compatible con inmunocitoquímica, incorpora controles de pH para la evaluación cuantitativa y, además, ofrece una alternativa más sensible y menos subjetiva a la tinción convencional de SA-β-gal.

Resumen

La senescencia celular es un estado inducido por el estrés caracterizado por la detención permanente del ciclo celular y el desarrollo de un perfil secretor distintivo que afecta la función tisular y contribuye al envejecimiento y a las enfermedades metabólicas. La actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) se utiliza ampliamente como marcador de células senescentes; sin embargo, los ensayos convencionales SA-β-gal suelen basarse en una evaluación visual subjetiva y proporcionan información cuantitativa limitada. Estas limitaciones son especialmente evidentes en poblaciones celulares humanas primarias, como la fracción vascular estromal (SVF) derivada del tejido adiposo, que contiene una mezcla heterogénea de preadipocitos, células inmunitarias y células endoteliales. Aquí presentamos un enfoque optimizado de microscopía confocal con luz reflejada para la detección cuantitativa y de alta resolución de la actividad de SA-β-gal en células SVF humanas. Este protocolo permite un análisis objetivo de célula única de la actividad SA-β-gal, permite la inmunocitoquímica simultánea para la detección multiplexada de marcadores adicionales de senescencia o linaje, e incorpora controles con pH igualado. Al combinar estas características, este método proporciona un enfoque sensible, reproducible y cuantitativo para estudiar la senescencia celular en poblaciones celulares primarias heterogéneas. Ofrece una alternativa mejorada al tinte convencional de SA-β galones.

Introducción

La senescencia celular es una respuesta multifacética que puede surgir de muchos tipos de estrés, incluyendo daño en el ADN, desgaste de telómeros y activación de oncogénicos. Conduce a una detención estable del ciclo celular junto con una mayor resistencia a la apoptosis, impulsada en parte por la inducción de proteínas antiapoptóticas 1,2. La senescencia se ha relacionado con una mejora en la supervivencia celular en contextos donde la preservación de la integridad tisular es esencial, como la reparación y el mantenimiento 3,4. Más allá de su papel en la homeostasis tisular, la senescencia también contribuye al desarrollo normal al modelar el patrón embrionario 5,6 y como barrera para la formación tumoral al promover la eliminación de células dañadas o potencialmentemalignas 7,8,9. Aunque la senescencia puede desempeñar funciones beneficiosas, varios estudios han destacado un aspecto contrastante en el que las células senescentes adquieren un perfil secretor proinflamatorio que puede alterar el metabolismo local, dañar el tejido circundante e incluso apoyar la progresióntumoral 10,11,12,13.

La senescencia se ha detectado en diversos tipos celulares de múltiples tejidos y a menudo se asocia con el envejecimiento, enfermedades, disfunción tisular o cáncer. En el hígado, se ha demostrado que la senescencia de las células estrelladas hepáticas promueve la progresión tumoral al alterar la homeostasis metabólica mediante factoressecretados 14,15. Los estudios que examinan hepatocitos16 o biopsias hepáticascompletas 17 indican que la senescencia en estas células puede contribuir a comorbilidades metabólicas como la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica y la esteatohepatitis asociada a la disfunción. Además, la relación entre la diabetes tipo 2 y la senescencia ha recibido una atención significativa en la última década, con evidencia que vincula la senescencia con complicaciones relacionadas con la diabetes en células β pancreáticas,hepatocitos 16 yadipocitos 18,19,20,21. Estos hallazgos destacan la importancia de identificar con precisión las células senescentes en los tejidos metabólicos, donde su acumulación y heterogeneidad contribuyen a la progresión de la enfermedad y al objetivoterapéutico 22.

Los cambios en la señalización y la expresión proteica asociados con la senescencia suelen ser específicos de células y tejidos; sin embargo, varias características son en general características de las células senescentes. Uno de los marcadores más utilizados es el aumento de la actividad enzimática de la β-galactosidasa a pH 6,0, denominada β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal)23. β-galactosidasa es una hidrolasa lisosomal presente en todas las células y normalmente está activa a pH ácido (~4,5–5,0), donde contribuye a la degradación de sustratos glicosilados. La característica definitoria de la SA-β-gal es la retención de la actividad de β-galactosidasa bajo condiciones de pH subóptimas. En el ensayo clásico, las células se incuban con el sustrato sintético 5-bromo-4-cloro-3-indolilo-β-D-galactopiranósido (X-gal) a pH 6,0, donde la actividad enzimática se reduce en la mayoría de las células pero permanece detectable en las células senescentes. Esto conduce a la formación de un precipitado azul insoluble que puede visualizarsemicroscópicamente como 24.

Aunque este ensayo ha sido ampliamente adoptado, la detección del precipitado X-gal tradicionalmente se ha basado en microscopía de campo claro. La detección en campo brillante depende de la identificación visual del precipitado azul y, por tanto, tiene una sensibilidad limitada para señales de bajo nivel y estados de senescencia temprana. En cambio, la imagen por luz reflejada captura la densidad óptica del precipitado X-gal, permitiendo la detección cuantitativa en un rango dinámico más amplio. Más recientemente, se han desarrollado sustratos fluorogénicos para mejorar la sensibilidad25. Sin embargo, estos enfoques suelen medir la actividad de la β-galactosidasa en condiciones que no preservan la definición clásica dependiente del pH de SA-β-gal. Como resultado, pueden aumentar la intensidad de la señal pero reducir la especificidad para la senescencia. En cambio, la opacidad inherente del precipitado X-gal permite su detección mediante imagen confocal reflejada por luz, proporcionando una lectura más sensible y cuantitativa manteniendo la definición enzimática original de SA-β-gal26.

A lo largo de los años, se han identificado signos adicionales de la senescencia, incluyendo el aumento de la expresión de los inhibidores de quinasas dependientes de ciclina P16 y P21, así como el factor de transcripción P53, que regula la detención del ciclo celular y otros programasde senescencia 27,28,29,30,31,32,33 . Estos avances han llevado a una definición más robusta de la senescencia, en la que las células suelen clasificarse en función de la presencia combinada de múltiples marcadores. Sin embargo, en la práctica, estos marcadores suelen medirse mediante diferentes modalidades: los marcadores nucleares, como P16 y P21, suelen detectarse mediante técnicas basadas en fluorescencia, mientras que la actividad SA-β-gal tradicionalmente se ha evaluado mediante microscopía de campo brillante. Esta separación ha limitado la capacidad de evaluar múltiples características de senescencia dentro de la misma célula. La imagen por luz reflejada supera esta limitación al permitir la integración directa de la detección de SA-β-gal con marcadores basados en fluorescencia dentro de un único flujo de trabajo de imagen, facilitando una evaluación más robusta y biológicamente significativa de la senescencia en poblaciones celulares heterogéneas.

Aunque Dedic y sus colegas abordan varias limitaciones de la imagen tradicional de SA-β-gal, incluyendo la mejora de la sensibilidad, el uso de controles con pH para el umbral objetivo y la compatibilidad con inmunocitoquímica, su método confocal de luz reflejada se optimizó específicamente para adipocitos madurosaislados 26. Sin embargo, la senescencia en tejido adiposo no se limita a losadipocitos 34,35, y se puede obtener información adicional examinando la fracción vascular estromal (SVF). La SVF comprende preadipocitos, poblaciones endoteliales y fibroblastos, y diversas células inmunitarias, todas las cuales pueden experimentar senescencia y contribuir a la remodelación adiposa, inflamación y alteración de la señalización metabólica. Por tanto, caracterizar la senescencia dentro de este compartimento heterogéneo es importante para vincular procesos específicos de tipo celular con resultados a nivel de tejido y sistémicos.

Aquí, extendemos la detección de luz reflejada SA-β-gal a las células SVF, permitiendo su aplicación a múltiples tipos de células del tejido adiposo. Al combinar este enfoque con inmunocitoquímica, el método permite un análisis integrado de una sola célula de la actividad SA-β-gal junto a marcadores de linaje y funcionalidad en muestras humanas primarias.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron conforme a los estatutos de la Declaración de Helsinki. El estudio fue aprobado por el comité de ética regional en Estocolmo, DNR 2012/50-31.

1. Preparación de la célula

  1. Utiliza células de fracción vascular estromal (SVF) aisladas del tejido adiposo humano mediante digestión de colagenasa.
    NOTA: El rendimiento celular varía según el tamaño de la biopsia y la composición tisular; sin embargo, normalmente se obtienen aproximadamente 1,0 ×10 6 células SVF por cada 10 g de tejido adiposo.

2. Tinción de X-gal y preparaciones para láminas

  1. Fija las células en 1 mL de paraformaldehído (PFA) al 2% en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT) sobre un balancín.
  2. Centrifuga a 600 × g durante 10 minutos y retira el sobrenadante.
  3. Prepara la solución de tinción X-gal usando el kit de tinción senescencia β-Galactosidasa según las instrucciones del fabricante.
  4. Divide la solución de tinción en 3 tubos (1 mL cada uno) y ajusta el pH a 5, 6 y 8 con 1 M HCl y 1 M NaOH. Mide el pH usando un medidor calibrado.
  5. Añadir solución X-gal a 0,5 × 106 células para la condición e incubar durante 24 horas a 37 °C sin CO2.
  6. Centrifuga a 600 × g durante 10 minutos y quita el sobrenadante.
  7. Lava las células con PBS (pH 7), centrifuga a 600 × g durante 10 minutos y retira el sobrenadante.
  8. Preparar la solución primaria de anticuerpos (CD31 [1:200] o control IgG [1:333]) en suero de burro normal al 5% (NDS). Incubar las células durante la noche a 4 °C.
  9. Lava las células 3 veces en PBST (0,1%) durante 10 minutos en RT sobre un balancín.
  10. Preparar una solución secundaria de anticuerpos (anti-ratón Alexa Fluor 555 [1:500]) y aglutinina germinal de trigo (WGA [1:200]) en un 5% de NDS. Incuba durante 1 hora en RT en un balancín.
  11. Centrifugar a 600 × g durante 10 minutos y eliminar la solución secundaria de anticuerpos para tinción.
  12. Lava las células 3 veces en PBST (0,1%) durante 10 minutos en un balancín en RT.
  13. Centrifuga a 600 × g durante 10 minutos y retira el sobrenadante.
  14. Resuspende las células en el antifade.
  15. Pipeta la suspensión celular sobre portaobjetos de microscopio.
  16. Deja que el medio de montaje cure durante la noche en RT para inmovilizar las células.
  17. Añade 100 μL de glicerol al 100%, coloca una capa de cubierta encima y sella con esmalte de uñas.

3. Microscopía

NOTA: Células de imagen usando un microscopio confocal configuradas para la detección de luz reflejada. La señal de luz reflejada debe recogerse en o cerca de la longitud de onda de excitación utilizando un divisor de haz proporcionado por el fabricante o una configuración de espejo dicróico. Usa un objetivo del 30× con aceite de silicona (apertura numérica 1,05) para todos los experimentos.

  1. Selecciona la configuración del divisor de haz T90/R10 dentro del software del microscopio.
  2. Utiliza excitación de 633 nm y recoge la luz reflejada entre 635 y 645 nm.
  3. Adquirir señal Hoechst usando excitación de 405 nm.
  4. Adquirir señal WGA usando excitación de 488 nm.
  5. Adquirir señal CD31 usando excitación de 555 nm.
  6. Establezca el tamaño de paso Z al óptimo del sistema (0,74 μm) y define una pila Z basada en la señal de membrana para capturar el volumen completo de la celda.
  7. Adquiere imágenes usando configuraciones idénticas para todas las muestras. Guarda archivos en el formato nativo de microscopio (por ejemplo, .oir) sin compresión.

4. Análisis de imágenes

NOTA: Analizar imágenes usando ImageJ y CellProfiler.

  1. Dividir canales en ImageJ para generar pilas Z para cada canal (405, 488, 555, 633).
  2. Genera proyecciones de intensidad sumada usando la función Z Project y exporta como archivos TIFF de 16 bits.
  3. Importar imágenes en CellProfiler (versión 4.2.8) para segmentación celular automatizada y cuantificación de la intensidad de luz reflejada por celda (Figura suplementaria 1 y Figura suplementaria 2).
  4. Exportar las mediciones de intensidad a una hoja de cálculo para análisis posteriores.

5. Puntuación SA-β gal

  1. Defina el umbral para la positividad SA-β-gal como la intensidad media de luz reflejada de la condición de pH 8 más tres desviaciones estándar.
  2. Clasificar las células en condición de pH 6 con valores de intensidad superiores a este umbral como SA-β-gal positivos.

Resultados

La tinción de luz reflejada en SA-β-gal de células SVF humanas produjo patrones claros y reproducibles en las tres condiciones controladas por pH. Se incluyó la tinción CD31 para identificar células endoteliales dentro de la SVF, permitiendo distinguir estas células de otras poblaciones. Aunque solo había un pequeño número de células CD31 positivas, el marcador confirmó la presencia de células endoteliales y demostró la compatibilidad del método con muestras primarias heterogéneas.

La condición de pH 5 generó una señal fuerte en la mayoría de las células, consistente con una alta actividad endógena de beta galactosidasa a pH ácido (Figura 1Aa–Ac). Al pH 6, la condición utilizada para evaluar la actividad SA-β-gal, la intensidad de la tinción se redujo en comparación con el pH 5, y solo un subconjunto de células mostró señal por encima del fondo (Figura 1Ba–Bc). Este cambio tanto en la intensidad como en la frecuencia de la señal es coherente con la dependencia esperada del pH del ensayo y permite identificar células con actividad retenida de SA-β-galactosidasa bajo condiciones subóptimas. La condición de pH 8 produjo una señal mínima de luz reflejada, con la mayoría de las células cerca o en niveles de fondo (Figura 1Ca–Cc). Esta condición se utilizó para definir el umbral de positividad de SA-β-gal, indicado por la línea de puntos roja en la Figura 1A c,Bc,Cc.

Para el análisis cuantitativo, el umbral para la actividad de SA-β-gal se definió como la intensidad media de luz reflejada de la condición de pH 8 más tres desviaciones estándar. Las células en la condición de pH 6 con valores de intensidad superiores a este umbral se clasificaron como SA-β-gal positivos. Este enfoque proporciona un corte objetivo y basado en datos que tiene en cuenta la señal de fondo y minimiza la clasificación de falsos positivos.

Para evaluar la sensibilidad y compatibilidad de detección con inmunocitoquímica, se compararon imágenes de luz reflejada y campo claro en todas las condiciones de pH. Al pH 5 (Figura 2Aa–Ad), la luz reflejada reveló un fuerte precipitado X-gal, mientras que el campo claro detectó solo los depósitos más prominentes. A pH 6 (Figura 2Ba–Bd), la luz reflejada identificó células positivas de SA-β gal que no eran detectables de forma fiable por campo claro, donde la señal parecía débil o difusa. A pH 8 (Figura 2Ca–Cd), la luz reflejada detectó una señal mínima, compatible con baja actividad enzimática, mientras que el campo claro no reveló precipitado detectable. Estas observaciones indican que la imagen por luz reflejada proporciona una mejor detección del precipitado X-gal, especialmente en niveles de actividad intermedios y bajos.

El ensayo de luz reflejada SA-β-gal también se realizó en una placa de 96 pozos (Figura suplementaria 3). Esta configuración resultaba en un aumento de la señal de fondo debido a la reflexión en la superficie plástica, reduciendo el contraste entre las células positivas y negativas. Las imperfecciones superficiales, como arañazos, aumentan aún más la reflexión del fondo (Figura suplementaria 3, flechas negras). Como resultado, el análisis cuantitativo fue menos fiable en comparación con la imagen en engobe de vidrio. Si se requiere un formato de placa, se recomienda placas con fondo de vidrio para una detección óptima de señales.

En conjunto, estos resultados muestran una clara separación entre la condición de pH 5 fuertemente positiva, la señal intermedia en pH 6 y el fondo mínimo en pH 8. Este patrón es coherente con el comportamiento esperado del ensayo y apoya el uso de imágenes por luz reflejada para la detección de la actividad de SA-β-gal en poblaciones celulares primarias heterogéneas.

figure-results-1
Figura 1: Detección de luz reflejada dependiente de pH β en células SVF.
WGA (Aa, Ba, Ca) y la imagen por luz reflejada (Ab, Bb, Cb) detectan precipitado X-gal en condiciones de pH 5, 6 y 8. La señal es más fuerte en pH 5, reducida en pH 6 y mínima en pH 8. La cuantificación de la intensidad de la luz reflejada (Ac, Bc, Cc) muestra la distribución de la actividad de la β-galactosidasa bajo cada condición. Cada punto representa una sola celda, y la línea roja de puntos indica el umbral utilizado para clasificar las células SA-β-gal-positivas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Comparación entre la detección de luz reflejada y la detección de SA-β-gal en campo claro en células SVF. Imágenes ampliadas de células SVF teñidas con X-gal en pH 5, 6 y 8 muestran tinción WGA (Aa, Ba, Ca), tinción CD31 (Ab, Bb, Cb) para identificar células endoteliales, imágenes con luz reflejada (Ac, Bc, Cc) para detectar precipitado X-gal, y correspondientes imágenes de campo claro (Ad, Bd, Cd). La imagen por luz reflejada detecta precipitación de X-gal en todas las condiciones, mientras que el campo claro revela principalmente depósitos de mayor intensidad y proporciona una detección limitada a niveles de señal más bajos. Se observa tinción CD31 tanto en condiciones de pH 5 como de pH 6, lo que permite la identificación de células endoteliales. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Resumen de la cadena de CellProfer. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Flujo de trabajo para la segmentación de núcleos y células. Imágenes representativas de (A) núcleos teñidos con Hoechst y (B) segmentación correspondiente de núcleos. (C) Segmentación celular basada en la tinción de membrana. (D) Superposición de núcleos y límites celulares. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Imagen de luz reflejada SA-β-gal en una placa de 96 pozos con fondo plástico. (A) tinción por WGA y (B) imagen por luz reflejada de células SVF teñidas por X gal en una placa estándar de fondo plástico de 96 pozos. Se observa un aumento de la señal de fondo en comparación con la imagen en vidrio, consistente con la reflexión de luz en la superficie plástica, lo que reduce el contraste para la detección de SA-β-gal. Los arañazos superficiales (flechas negras) aumentan aún más la señal de fondo (B). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La β-galactosidasa asociada a la senescencia es uno de los marcadores más utilizados para identificar células senescentes; sin embargo, los métodos tradicionales de detección de campos brillantes están limitados por una baja sensibilidad y un alto grado de subjetividad. La imagen por luz reflejada de células SVF teñidas con X-gal proporciona un enfoque más sensible y reproducible para medir la actividad de SA-β-gal a nivel de célula individual, manteniéndose compatible con la tinción de anticuerpos fluorescentes. Optimizando este método para SVF, la actividad de SA-β-gal puede detectarse junto con marcadores específicos de células como CD31, lo que permite el análisis de poblaciones celulares primarias heterogéneas sin necesidad de clasificar células.

Varios parámetros técnicos son críticos para una implementación fiable. Es esencial una calibración precisa del pH de la solución de tinción X-gal, ya que pequeñas desviaciones pueden alterar la actividad enzimática y afectar la detección de señales. El medidor de pH debe calibrarse inmediatamente antes de usarlo con tampones estándar (por ejemplo, pH 4,0 y pH 7,0), y el pH de la solución de tinción debe verificarse tras la preparación. Además, la adquisición de la pila Z debe capturar el volumen completo de la celda, ya que la cobertura incompleta conduce a una subestimación de la intensidad de la luz reflejada. Los parámetros de imagen, incluyendo la potencia láser y la ganancia del detector, deben optimizarse para maximizar la señal sin saturación y mantenerse consistentes entre muestras.

En comparación con ensayos de senescencia alternativos, la imagen por luz reflejada ofrece varias ventajas. La detección de campo brillante SA-β-gal se basa en la identificación visual del precipitado y, por tanto, tiene una sensibilidad limitada y no es fácilmente compatible con el análisis multiplexado. En cambio, la imagen por luz reflejada detecta la densidad óptica del precipitado X-gal mientras preserva la definición enzimática dependiente del pH de SA-β-gal. Esto permite la detección simultánea de la actividad SA-β-gal junto con marcadores basados en fluorescencia, permitiendo evaluar la senescencia utilizando múltiples características dentro de células individuales.

A pesar de estas ventajas, el método tiene limitaciones. La imagen por luz reflejada detecta la densidad óptica del precipitado X-gal, pero no puede distinguir definitivamente esta señal de otras estructuras intracelulares densas, por lo que condiciones controladas por pH son esenciales. La condición de pH 8 proporciona una base para la luz reflejada de fondo y favorece la discriminación entre señales específicas y no específicas. El enfoque también requiere un microscopio confocal con capacidades adecuadas de detección de luz reflejada, que pueden no estar disponibles en todos los sistemas. Además, las propiedades de la superficie de imagen pueden afectar la calidad de la señal: las placas de fondo de plástico aumentan el fondo debido a la reflexión y reducen el contraste, mientras que las superficies de vidrio proporcionan una detección más fiable.

Este método se basa en el trabajo de Dedic et al., quienes establecieron la imagen de luz reflejada para la detección de SA-β-gal en adipocitos maduros, y amplía el enfoque a una gama más amplia de tiposcelulares 26. La aplicación a SVF recién aislado demuestra que la detección por luz reflejada del precipitado X-gal es compatible con diversas poblaciones primarias de células humanas. La capacidad de combinar la detección de SA-β-gal con marcadores de linaje como CD31 permite aún más el análisis de subpoblaciones definidas dentro de tejidos heterogéneos.

Aunque se espera variabilidad entre donantes en muestras humanas primarias, el objetivo de este estudio es establecer la implementación técnica del método más que caracterizar la variabilidad biológica. Las futuras aplicaciones en múltiples muestras biológicas o condiciones experimentales deberían incorporar análisis estadísticos apropiados. Además, la validación en modelos establecidos de inducción por senescencia y la integración con marcadores de senescencia ortogonales refinarán aún más la interpretación de la actividad de SA-β-gal en poblaciones celulares complejas.

Divulgaciones

Los autores declaran no haber conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a Liv Eidsmo y Keira Melican por proporcionar acceso a biopsias de tejidos humanos, y a Lena Appelsved por la ayuda en el procesamiento de muestras. Este estudio fue financiado por subvenciones a KLS del Consejo Sueco de Investigación (2022-01236), el Programa Estratégico de Investigación sobre Diabetes en el Instituto Karolinska (C5471162), la Fundación Novo Nordisk (C5475033), el Premio Becario de la Fundación Vallee (C5471234), la Beca Mark Foundation Aspire (C5477023), la Sociedad Sueca del Cáncer (22 2420), el Programa Estratégico de Investigación en Células Madre y Regeneración en el Instituto Karolinska (C5472022) y la Fundación Knut y Alice Wallenberg (2020.0118; 2023.0536).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1.5 mL tubesBioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 PC
5 mL tubesEppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96-well plateCorning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31 primary antibodyAbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
Confocal microscope with reflected light capabilitiesEvidentFV-4000
CoverslipsEprediaBB02400500A113MNZOCoverslips 24 mm x 50 mm, #1.5 thickness (0.13-0.16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, no calcium, no magnesium
Fixation bufferSigma Aldrich1.00496.5000Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLHydrochloric acid (37%)
IncubatorStuartS130HHybridization oven/shaker
Microscopy slidesAvantor VWR631-1560Single-frosted slides, coloured ends
Mounting mediaInvitrogenP36984ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 isotype controlR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GSodium hydroxide ≥ 98%
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH meterMeterLabR21M002 PHM210 standard pH meter 
Pipette tips (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL filtered pipette tips
Pipette tips (200 µL)Corning4823200µL filtered pipette tips
SABG KitCell signaling9860SSenescence beta-galactosidase staining kit
Secondary antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Pure, Fisher chemical
Water bathRowe ScientificSWB20DStandard water bath
WGAInvitrogenW11261Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm

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