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Artículo de método

Establecimiento de un modelo murino de fibrosis renal mediante lesión unilateral por isquemia-reperfusión y nefrectomía contralateral retardada

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DOI:

10.3791/70598

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22 de mayo de 2026

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1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Guangzhou Chest Hospital, Institute of Tuberculosis, Guangzhou Medical University, 2Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 3Department of Transplantation, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para establecer un modelo murino de fibrosis renal utilizando lesión unilateral de isquemia-repercusión seguida de nefrectomía contralateral retardada. Esta estrategia permite estudios longitudinales de la transición de AKI a ERC y una evaluación precisa de la función renal residual en el punto final.

Resumen

La lesión por isquemia-reperfusión renal (IRI) contribuye a la lesión renal aguda (AK) y es un factor clave en la progresión de la enfermedad renal crónica (ERC). Es necesario un modelo animal reproducible para facilitar la evaluación de los mecanismos de reparación desadaptativa y fibrosis. Aquí se informa de un modelo estándar murino de fibrosis renal establecido por lesión unilateral por isquemia-repercusión (uIRI) seguida de nefrectomía contralateral (CNx). Esta estrategia garantiza la supervivencia a largo plazo de los animales durante la progresión de la enfermedad, permitiendo la evaluación precisa de la función renal residual del riñón lesionado en el momento de la cosecha. Los ratones machos C57BL/6 fueron sometidos a isquemia tibia durante 28 minutos a 37 °C, y se realizó una CNx 24 horas antes de cada punto final del estudio. Se sacrificaron ratones para evaluaciones histológicas e inmunohistoquímicas en los siguientes momentos: 2 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas después de la IRI. En los días 2 y 5 postoperatorios, los riñones presentaron principalmente necrosis tubular, especialmente en la unión corticomedilar, sin evidencia de fibrosis intersticial. A partir de una semana después de la cirugía, estas características patológicas fueron reemplazadas por infiltración celular inflamatoria y atrofia tubular temprana; También apareció fibrosis intersticial y alcanzó su máxima gravedad en la segunda semana. Durante la tercera y cuarta semana tras la cirugía, los riñones mostraron atrofia tubular generalizada compatible con atrofia por desuso. Cabe destacar que la fibrosis intersticial se redujo en comparación con la segunda semana, lo que indica progresión hacia la fase cicatricial hipocelular y silenciosa. Este modelo reproduce eficazmente los escenarios clínicos de la transición de AKI a ERC y proporciona una plataforma fiable para explorar los mecanismos fibróticos y el cribado de intervenciones terapéuticas.

Introducción

La lesión por isquemia-reperfusión renal (IRI) es uno de los factores críticos que conducen a la lesión renal aguda (AK) en el ámbitoclínico 1. Las etiologías comunes incluyen trasplante renal (que implica isquemia fría y tibia seguida de reperfusión del riñón donante), cirugías cardiovasculares o renales que requieren oclusión vascular temporal y estados de hipoperfusión sistémica causados por traumatismos graves, hemorragia mayor osepsis tipo 2.

La fisiopatología de la IRI implica un proceso bifásico complejo. Inicialmente, durante la fase isquémica, la interrupción del suministro de oxígeno y nutrientes provoca alteración metabólica, agotamiento de ATP y alteración del citoesqueleto en las células epiteliales tubulares renales (TECs)3. Posteriormente, la restauración del flujo sanguíneo durante la reperfusión, aunque necesaria para salvar el tejido isquémico, desencadena un "insulto secundario" más complejo. 4 Esta fase de lesión está impulsada por una cascada de eventos, incluyendo el estrés oxidativo por la explosión de especies reactivas de oxígeno (ROS), disfunción endotelial, infiltración masiva de células inflamatorias (como neutrófilos y macrófagos) y activación del sistema delcomplemento 3. Estas cascadas complejas agravan colectivamente la apoptosis y necrosis de los TECs, constituyendo la principal presentación patológica de la AKI.

Cabe destacar que la IRI no se limita a daños agudos y reversibles. Existen pruebas sustanciales que indican que la reparación incompleta o desadaptativa tras una IRI renal es un mecanismo central que impulsa la transición hacia una patología crónica a largo plazo. En condiciones fisiológicas, el riñón inicia un programa de reparación tras la INKA, que elimina eficazmente las células dañadas y promueve la proliferación y diferenciación de los TEC supervivientes para restaurar la estructura y función de los túbulos dañados. Sin embargo, tras un insulto grave o repetitivo de IRI, este proceso de reparación puede desregularse, lo que finalmente conduce a atrofia tubular, fibrosis intersticial renal y acelera el desarrollo y progresión de la enfermedad renal crónica (ERC)5,6.

Por lo tanto, es urgente esclarecer los mecanismos de transición de la AKI a la ERC y desarrollar intervenciones terapéuticas. Los modelos de roedores, especialmente los modelos murinos, se han vuelto esenciales e indispensables in vivo. Herramientas para estudiar la fibrosis post-IRI debido a sus bien definidos antecedentes genéticos y su similitud con la progresión de la enfermedad humana. Sin embargo, existe una heterogeneidad significativa en las metodologías actuales de IRI (por ejemplo, duración de la isquemia, control de temperatura, lesión unilateral vs. bilateral), lo que conduce a una baja reproducibilidad y a una comparabilidad limitada entre estudios7.

Para abordar estos desafíos, el presente estudio detalla un protocolo estandarizado para un modelo modificado de lesión unilateral de isquemia-reperfusión (uIRI). Además, este protocolo incluye una nefrectomía contralateral (CNx) realizada 24 horas antes del final del estudio. Esta estrategia supera la alta mortalidad asociada a la isquemia bilateral permitiendo la evaluación precisa de la función renal residual y la progresión fibrótica en el riñón lesionado. Este modelo recapitula con precisión la transición dinámica de AKI a ERC, proporcionando una plataforma robusta in vivo. para la exploración mecanicista y el cribado terapéutico.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme al Reglamento para la Administración de Asuntos Relacionados con Animales de Experimentación. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd. (Número de Aprobación: JENNIO-IACUC-2025-A053). Todos los procedimientos se realizaron de estricta conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las directrices institucionales, cumpliendo plenamente con los principios de las 3R. La cronología del estudio, incluyendo los puntos de sacrificio y la recogida de muestras, se resume en la Figura 1.

1. Preparación de animales e instrumentos

  1. Utiliza ratones machos C57BL/6 (8 semanas, con un peso de 20–25 g) alojados en instalaciones específicas libres de patógenos (SPF) para el estudio.
  2. Divide los ratones aleatoriamente en el grupo uIRI y el grupo Sham. Para cada uno de los seis puntos temporales designados (2 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas), asignar n = 4 ratones por grupo.
    NOTA: Los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 horas luz y 12 horas de oscuridad con acceso libre a comida y agua. Fueron aclimatados al entorno de laboratorio durante al menos una semana antes de la experimentación.
  3. Esteriliza todos los instrumentos quirúrgicos mediante .Autoclav de vapor a alta presión antes de su uso.
  4. Mantener la temperatura corporal central estrictamente en 37,0 °C ± 0,5 °C utilizando un sistema de monitorización homeotérmica equipado con una sonda rectal para monitorización continua de la temperatura. Inserta la sonda lubricada en el recto inmediatamente después de la inducción de la anestesia y mantenla en su lugar durante todo el procedimiento.
  5. Anestesiar ratones usando un sistema de anestesia gaseosa para animales pequeños con isoflurano (5% para inducción, 1,5% para mantenimiento, con un caudal de oxígeno de 1,0 L/min mediante un vaporizador calibrado).
    NOTA: Confirmar anestesia profunda por la ausencia de reflejo de retirada de los pedales. Todos los procedimientos quirúrgicos deben realizarse solo después de que el ratón haya alcanzado un estado de anestesia profunda.
  6. Afeita el pelaje en la zona dorsal izquierda del flanco.

2. Procedimiento quirúrgico

  1. Modelo uIRI (Día 0)
    1. Coloca el ratón en el decúbito lateral derecho para exponer el flanco izquierdo.
    2. Realiza una incisión longitudinal cutánea de 1 cm a 1,5 cm en la espalda izquierda, seguida de una incisión muscular para entrar en el espacio retroperitoneal.
    3. Empuja suavemente el riñón izquierdo con un hisopo de algodón estéril humedecido con solución fisiológica.
      NOTA: El riñón solo debe moverse manipulando la almohadilla de grasa perirrenal o usando hisopos de algodón estériles. Las pinzas nunca deben tocar la superficie del riñón.
    4. Diseca cuidadosamente el pedículo renal usando pinzas de punta fina para aislar la arteria y la vena renal del tejido conectivo circundante.
    5. Pinza el pedículo renal izquierdo usando un microclip vascular no traumático para inducir isquemia.
      NOTA: La disección del pedículo renal debe realizarse de forma limpia y completa. El procedimiento debe excluir explícitamente el uréter de la aplicación de la pinza. El pinzamiento ureteral involuntario induciría una lesión híbrida IRI/Obstrucción Ureteral Unilateral (UUO), introduciendo potencialmente un componente obstructivo permanente.
    6. Poned un temporizador inmediatamente después de pinzar. La duración de la isquemia se establece estrictamente en 28 minutos.
    7. Verifica la isquemia: el color del riñón debería cambiar de rojo brillante a púrpura oscuro en cuestión de segundos.
    8. Cubre el riñón con gasas estérils remojadas en solución salina tibia.
    9. Después de 28 minutos, quita la pinza para iniciar la reperfusión.
    10. Confirma la reperfusión visualmente: el color del riñón debería volver a ser rosa/rojo en pocos minutos.
    11. Devuelve suavemente el riñón a la cavidad abdominal.
    12. Cierra la capa muscular con suturas absorbibles 5-0 y la incisión cutánea con suturas de nailon 5-0.
  2. Operación simulada (Día 0)
    1. Realizar los mismos pasos de anestesia, incisión y exteriorización renal que se describen en el paso 2.1.
    2. Diseca el pedículo renal pero no clampees los vasos.
    3. Mantén el riñón exteriorizado durante el mismo tiempo (28 minutos) antes de volver a la cavidad abdominal y cerrar la incisión.
  3. Cirugía CNx
    NOTA: Realizar CNx 24 horas antes del final programado de la recogida de muestras para cada grupo específico para evaluar la función residual del riñón lesionado.
    Para el grupo de 2 días: realiza CNx el día 1 después de IRI.
    Para el grupo de 5 días: realiza CNx en el día 4 después del IRI.
    Para el grupo de una semana: realiza CNx en el día 6 después de IRI.
    Para el grupo de 2 semanas: Realiza CNx el día 13 después de IRI.
    Para el grupo de 3 semanas: realiza CNx el día 20 después del IRI.
    Para el grupo de 4 semanas: Realiza CNx el día 27 después de IRI.
    1. Anestesiar al ratón como se describe en el paso 1.5. Luego, afeita y desinfecta el costado dorsal derecho.
    2. Haz una pequeña incisión en el flanco derecho para exponer el riñón derecho.
    3. Exterioriza el riñón derecho y disecciona suavemente el pedículo renal.
    4. Liga firmemente el pedículo renal (arteria, vena y uréter) usando una sutura de seda 4-0 no absorbible.
    5. Extirpa el riñón derecho distal a la ligadura.
      NOTA: Asegúrese de que no haya sangrado activo en el muñón.
    6. Devuelve el muñón pedicular a la cavidad abdominal y cierra la incisión como se describe en el paso 2.1.12.
    7. Deja que el ratón se recupere en una almohadilla térmica.

3. Cuidados postoperatorios y monitorización

  1. Mantén a los ratones en la almohadilla térmica hasta que recuperen completamente la conciencia y la movilidad.
  2. Devuelven a los ratones a jaulas limpias con comida y agua fácilmente accesibles.
  3. Controla diariamente el estado de salud de los ratones.
    1. Revisa la mortalidad a diario.
    2. Vigila cambios en el aseo, signos de angustia o dolor y postura.
    3. Inspecciona las incisiones en busca de signos de infección, inflamación o dehiscencia.

4. Evaluaciones postoperatorias

  1. Recogida de muestras
    NOTA: Los ratones fueron sacrificados en los momentos designados: 2 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas tras la IRI para evaluar la progresión de la lesión y la fibrosis.
    1. Anestesiar a los ratones con un 3% de isoflurano.
    2. Recoger muestras de sangre para análisis bioquímicos séricos (si es necesario).
    3. Eutanasiar a los ratones mediante dislocación cervical.
    4. Extrae rápidamente el riñón izquierdo (lesionado).
    5. Seccionar el tejido renal: fijar una porción en paraformaldehído comercial al 4% para análisis histológico, congelar el tejido restante en nitrógeno líquido y almacenarlo a -80 °C para el análisis molecular.
  2. Procesamiento y seccionamiento de tejidos
    1. Deshidratar, limpiar e incrustar los tejidos fijos en cera de parafina, siguiendo estrictamente el protocolo de procesamiento tisular descrito por Feldman yWolfe 8.
    2. Seccionar los bloques de parafina a un grosor de 4 μm usando un microtomo rotatorio.
    3. Monta las secciones de tejido sobre portaobjetos de vidrio y hornealas a 60 °C durante 2 horas para asegurar la adhesión del tejido.
  3. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
    1. Desparafina las llaves de tejido en xileno y rehidrátala a través de una serie descendente de etanol graduado hasta agua destilada.
    2. Realizar tinción H&E para evaluar el daño morfiológico. Ejecuta los pasos de tinción y lavado exactamente como se detalla en el protocolo estandarizado de Feldman yWolfe 8.
    3. Deshidrata, limpia y cubre las láminas teñidas usando un medio de montaje resinoso.
  4. Tinción tricroma de Masson
    1. Deparafina y rehidrata las secciones de tejido hasta convertirlas en agua destilada.
    2. Aplicar los tintes mordente, nuclear, citoplásmico y de colágeno de forma secuencial para evaluar la deposición de colágeno y la fibrosis renal. Sigue los tiempos exactos de incubación de los reactivos y los pasos de lavado establecidos por Islam yKumar 9.
    3. Enjuaga, deshidrata, limpia y cubre las láminas para una evaluación microscópica.
  5. Inmunohistoquímica (IHC)
    1. Deparafiniza y rehidrata las secciones del tejido.
    2. Realizar la recuperación de epítopos inducida por calor utilizando un tampón de citrato de sodio de 10 mM que contiene 0,05% de Tween-20 (pH 6,0) según lo descrito por Magaki et al.10.
    3. Bloquea la actividad endógena de la peroxidasa incubando las secciones en peróxido de hidrógeno al 3%.
    4. Bloquea los sitios de unión inespecíficos usando albúmina sérica bovina al 5% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    5. Incubar las secciones con el anticuerpo primario anti-alfa-músculo liso actina (α-SMA) (dilución 1:400) durante la noche a 4 °C.
    6. Lava las láminas e incubalas con el anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente.
    7. Visualiza el antígeno objetivo usando DAB y contra-tinción con hematoxilina, siguiendo los pasos procedimentales proporcionados por Magaki et al.10.
    8. Deshidrata, limpia y cubre las láminas para la imagen final.

5. Análisis estadístico

  1. Presenta todos los datos cuantitativos como media ± desviación estándar (DS).
    NOTA: Los análisis estadísticos y la generación de grafos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 10.0. Las diferencias entre varios grupos en comparación con un solo grupo de control (Sham) se analizaron utilizando un Análisis Ordinario de Varianza Unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Se consideró estadísticamente significativo un valor P de < 0,05 (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P. < 0,0001). NS indica que no hay diferencia significativa.

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Resultados

Durante todo el periodo experimental, la tasa global de supervivencia fue del 100% tanto para el grupo Sham como para el grupo uIRI (n = 4 por punto temporal). No se observó mortalidad ni durante la cirugía inicial de uIRI ni durante el posterior procedimiento de CNx retrasado. Este resultado confirma el alto perfil de seguridad y fiabilidad de este protocolo de dos etapas en comparación con los modelos bilaterales de isquemia, que suelen sufrir una mortalidad significativa inducida por ...

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Discusión

El presente estudio describe un protocolo estandarizado para establecer un modelo murino de fibrosis intersticial renal utilizando uIRI, seguido de CNx realizado 24 horas antes del final del estudio. El cribado histopatológico dinámico reveló fases patológicas distintas: necrosis tubular aguda caracterizada con pico de incidencia en los días 2–5, seguida de fibrogénesis activa y activación de miofibroblastos que alcanzó su máximo entre 1 y 2 semanas, y notablemente, en las semanas 3–4, e...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82373042), el Equipo Conjunto de Innovación para la Investigación Clínica y Básica (202409) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2022QH291 ZR2025MS1199).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo anti-&alfa;-SMAProteintech14395-1-APAnticuerpo primario utilizado en IHC para detectar la expresión de la SMA alfa y evaluar la activación de los miofibroblastos
Kit de ensayo de nitrógeno ureico en sangre (BUN)Instituto de Investigación Biotecnológica Jiancheng de Nanjing Co., Ltd.C013-2-1Se utiliza para cuantificar los niveles séricos de BUN para evaluar la función renal residual
Kit de ensayo de creatinina (CRE)Instituto de Investigación Biotecnológica Jiancheng de Nanjing Co., Ltd.C011-2-1Se utiliza para cuantificar los niveles de creatinina sérica para evaluar la función renal residual
Sistema de anestesia gaseosaNanjing Calvin Biotechnology Co., Ltd.KW-MZJ-4Equipado con isoflurano para anestesia general
Software de prisma GraphPadGraphPad Software, Inc.N/AUtilizado para análisis estadístico y representación gráfica de datos (https://www.graphpad.com)
Sistema de Monitorización HomeotérmicaCiencia de la conductaCS-HS-0001Equipado con una sonda rectal para monitorización y regulación continua de la temperatura corporal central en circuito cerrado
ImageJ SoftwareInstitutos Nacionales de SaludN/ASoftware de código abierto utilizado para la cuantificación morfométrica de áreas fibróticas y señales IHC
IsofluranoRWD Life Science Co., Ltd R510-22Agente anestésico inhalante utilizado durante procedimientos quirúrgicos
Masson' s Kit de tinte tricromoBeyotimeC0189MCuantificar la deposición de colágeno
Micro-clip vascular no traumáticoROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO.RS-5481TSe usa para pinzar el pedículo renal durante 28 minutos
Paraformaldehído (4%)Beyotime Biotech IncP0099-100mlUtilizado para la fijación rápida de muestras de tejido renal extraídas
Amortiguador de citrato de sodio (10 mM, pH 6,0)Thermo Fisher Scientific Inc. 005000Utilizado para la recuperación de epítopos inducida por calor antes de la tinción inmunohistoquímica
Microscopio quirúrgico estereotáxicoBeijing Zhongtian Guangzheng Technology Co., Ltd.TS-39NKUtilizado para realizar cirugías IRI

Referencias

  1. Lameire, N. H., et al. Acute kidney injury: An increasing global concern. Lancet. 382 (9887), 170-179 (2013).
  2. Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat Rev Nephrol. 7 (4), 189-200 (2011).
  3. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  4. Bonventre, J. V., Yang, L. J. T. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121 (11), 4210-4221 (2011).
  5. Venkatachalam, M. A., Weinberg, J. M., Kriz, W., Bidani, A. K. Failed tubule recovery, AKI-CKD transition, and kidney disease progression. J Am Soc Nephrol. 26 (8), 1765-1776 (2015).
  6. Ferenbach, D. A., Bonventre, J. V. J. N. R. N. Mechanisms of maladaptive repair after AKI leading to accelerated kidney ageing and CKD. Nat Rev Nephrol. 11 (5), 264-276 (2015).
  7. Wei, Q., Dong, Z. J. Mouse model of ischemic acute kidney injury: Technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
  8. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  9. Islam, M. A., Kumar, S. Masson's trichrome staining technique to evaluate tissue fibrosis. Methods Mol Biol. 2983, 91-100 (2026).
  10. Magaki, S., Hojat, S. A., Wei, B., So, A., Yong, W. H. An introduction to the performance of immunohistochemistry. Methods Mol Biol. 1897, 289-298 (2019).
  11. Marschner, J. A., Schäfer, H., Holderied, A., Anders, H. J. Optimizing mouse surgery with online rectal temperature monitoring and preoperative heat supply: Effects on post-ischemic acute kidney injury. Plos One. 11 (2), e0149489(2016).
  12. Lu, X., et al. C57BL/6 and 129/Sv mice: genetic difference to renal ischemia-reperfusion. J Nephrol. 25 (5), 738-743 (2012).
  13. Wei, Q., Wang, M. H., Dong, Z. J. Differential gender differences in ischemic and nephrotoxic acute renal failure. Am J Nephrol. 25 (5), 491-499 (2005).
  14. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), e50495(2013).
  15. Chou, Y. H., et al. Methylation in pericytes after acute injury promotes chronic kidney disease. J Clin Invest. 130 (9), 4845-4857 (2020).
  16. La Russa, A., et al. Kidney fibrosis and matrix metalloproteinases (MMPs). Front Biosci (Landmark Ed). 29 (5), 192(2024).
  17. Fu, Y., et al. Rodent models of AKI-CKD transition. Am J Physiol Renal Physiol. 315 (4), F1098-F1106 (2018).
  18. Soranno, D. E., et al. Matching human unilateral AKI, a reverse translational approach to investigate kidney recovery after ischemia. J Am Soc Nephrol. 30 (6), 990-1005 (2019).
  19. Lourenço, B. N., et al. Development of a model of tubulointerstitial fibrosis using transient unilateral renal ischemia and delayed contralateral nephrectomy in domesticated cats. Comp Med. 74 (4), 274-283 (2024).

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