Montaje y uso de un sistema de crecimiento gnotobióntico vegetal para estudios de interacción planta-microbio en cereales

Resumen

Este protocolo describe el montaje y uso de un nuevo sistema de crecimiento gnobiótico vegetal diseñado para acomodar cereales y validado en trigo y maíz. Este sistema gnotobiótico vegetal permite experimentos controlados planta-microbio proporcionando condiciones de crecimiento estériles, gestión de riego y compatibilidad con diversos sustratos de base en suelo.

Resumen

El desarrollo de enmiendas agrícolas basadas en microbios que funcionen de forma coherente en el campo requiere comprender los mecanismos moleculares de las interacciones planta-microbio. Estudiar estos mecanismos subyacentes de interacción exige la capacidad de cultivar plantas bajo condiciones ambientalmente controladas y gnotobióticas (es decir, se conocen todos los microorganismos que interactúan con la planta, ya sean libres de gérmenes, comunidades microbianas definidas o comunidades naturales). Los sistemas gnotobióticos vegetales actualmente disponibles no son adecuados para estudiar plantas grandes de relevancia agrícola, como los cereales. Además, la mayoría de estos sistemas carecen de la capacidad de gestionar el riego. Aquí presentamos GNOVA, un nuevo sistema gnotobiótico diseñado para acomodar plantas cerealeras con capacidad para gestionar el riego. Este nuevo sistema es una plataforma accesible compuesta por una base impresa en 3D y materiales disponibles comercialmente. Este protocolo proporciona una guía paso a paso para ensamblar el sistema y la configuración del experimento. Además, presentamos una comparación de rendimiento de GNOVA con un sistema de bolsas gnotobióticas. GNOVA extendió el crecimiento de las plantas de dos semanas en el sistema de sacos hasta 17 semanas para trigo y 4 semanas para maíz. La tasa de germinación de ambos cultivos también aumentó dentro de GNOVA, pasando del 66% al 100% para el trigo y del 75% al 100% para el maíz. El trigo cultivado dentro de GNOVA desarrolló cultivadores, que estaban ausentes en plantas de la misma edad dentro del sistema de bolsa. El peso fresco del maíz cultivado en la GNOVA fue un 594% superior al del sistema de bolsas. Además, la altura del brote y la longitud de las raíces del maíz eran un 89% y un 57% mayores dentro del sistema GNOVA que en las bolsas, respectivamente. El sistema GNOVA amplía la caja de herramientas disponible para los científicos para la exploración de las interacciones planta-microbiota más allá de la fase de plántulas en cereales, proporcionando un mayor espacio de crecimiento y gestión del riego.

Introducción

Los tratamientos agrícolas basados en microbios han despertado un gran interés en las últimas décadas debido a su potencial para mejorar la productividad de los cultivos al potenciar el crecimiento de las plantas y su resistencia al estrés ambiental. Al mismo tiempo, los mecanismos moleculares de acción de estos bioestimulantes siguen siendo poco comprendidos, lo que puede contribuir a sus resultados inconsistentes entre suelos, ubicaciones y condiciones^{ambientales 1,2}. Promover una mayor eficacia de los tratamientos basados en microbios existentes y el desarrollo de nuevas tecnologías requiere una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares de la interacción^{planta-microbio 3,4}. Sin embargo, desglosar estos mecanismos sigue siendo un reto debido a la complejidad de las comunidades microbianas^{naturales 5,6}. Para identificar los efectores microbianos y las interacciones que impulsan los beneficios para las plantas, podemos reducir la complejidad de los sistemas naturales empleando comunidades microbianas sintéticas (SynComs) dentro de sistemas de crecimiento que permitan el control de las condiciones ambientales y de la comunidad microbiana. La notobiología, el estudio de hospedadores asociados a comunidades microbianas^{definidas 7}, permite a los investigadores comparar hospedadores libres de gérmenes con aquellos colonizados con comunidades microbianas conocidas para vincular la función microbiana con el fenotipo⁸ de la planta.

Los primeros sistemas gnobibóticos se construyeron utilizando tubos de ensayo^{de vidrio 9, 10, 11 y 12} y frascos¹³. Desde entonces, hemos visto una rápida expansión de nuevos sistemas desarrollados para estudiar plantas de forma gnotobótica. Los sistemas más comunes empleados hoy incluyen el uso de placas de Petri¹⁴, tubos de ensayo^{15 y 16}, tarros^{de vidrio 17}, cajas magenta¹⁸, bolsas^{selladas 19}, hidroponía²⁰, FlowPot y GnotoPot²¹, sistemas microfluídicos²² y EcoFABs²³. A pesar de este progreso, la mayoría de los sistemas están optimizados para la obtención de imágenes²² o la colección^{de exudados 17,20}, o bien diseñados para especies modelo^pequeñas 14,18,21. Muchos son sistemas cerrados que limitan el control del riego y la duración de los experimentos. Estas limitaciones plantean desafíos para estudiar cultivos agrícolas de mayor tamaño, como los cereales, que requieren espacio, flujo de aire y gestión del agua adicionales.

Reconociendo la necesidad de un sistema que pueda acomodar plantas más grandes y estudios más largos, el EcoFAB 3.0 se desarrolló recientemente para ampliar el cultivo gnotobiótico a plantas más^{grandes 24}. El EcoFAB 3.0 ofrece un mayor volumen radicular y de espacio de cabeza, lo que favorece el crecimiento de Sorgo bicolor hasta 4 semanas y permite la recogida de exudados y la obtención de imágenes^{radiculares 24}. Aunque este nuevo sistema es un ejemplo prometedor de extensión de sistemas gnotobióticos a cultivos agrícolas, sigue existiendo la necesidad de una plataforma accesible y versátil que pueda adoptarse fácilmente en laboratorios y sea compatible con una amplia gama de flujos de trabajo experimentales. Por esta razón, desarrollamos GNOVA (sistema GNotobiótico para Aplicaciones Vegetales Versátiles), un sistema diseñado para acomodar cultivos de cereales bajo condiciones gnotobióticas. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para ensamblar y operar GNOVA y demostramos su rendimiento en relación con un sistema de bolsas gnotobióticas que se utiliza habitualmente en nuestro laboratorio. Con el desarrollo de este nuevo sistema, hemos mejorado la capacidad de cultivar trigo y maíz en condiciones estériles al proporcionar un mayor espacio de crecimiento y riego incorporado en comparación con sistemas cerrados anteriores. El rendimiento de GNOVA es comparable al del EcoFAB 3.0, ampliando así el repertorio de herramientas para diseccionar interacciones planta-microbioma en cultivos cerealíferos no modelo. Además, la versatilidad y adaptabilidad de la gnobiótica vegetal se ve reforzada por el diseño sencillo de GNOVA, el uso de materiales comercialmente disponibles y los archivos objeto 3D disponibles, que permiten a los investigadores cambiar materiales y diseños para ajustar sus necesidades de investigación y presupuesto.

Protocolo

NOTA: Los archivos de impresión 3D para la base se pueden encontrar en los materiales suplementarios y están disponibles públicamente en Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc). Para mayor rapidez y rentabilidad, recomendamos imprimir al por mayor en proveedores locales de servicios comerciales de impresión 3D.

1. Ensamblaje del sistema gnotobiótico

1. Iniciar el ensamblaje de potenciómetros (realizarlo una vez antes de un uso experimental repetido).
   1. Cierra el fondo de la olla colocando el círculo de malla metálica de acero inoxidable sobre un extremo del tubo de policarbonato y asegurando el círculo usando la abrazadera de manguera (Figura 1A).
   2. Perfora las aberturas de riego creando una abertura de riego de 1/4 de pulgada (6,35 mm) a 1,5 cm del borde superior del extremo abierto del tubo de policarbonato. Taladra dos ranuras de 1/8 de pulgada (3,18 mm) a 3 cm de la primera abertura, con una ranura a 1 cm del borde y la otra a 2 cm de la ranura superior.
      NOTA: Si es necesario, se pueden añadir líneas adicionales de tubo alrededor del borde superior de la maceta siguiendo los mismos pasos.
   3. Instala la tubería de riego insertando una sección corta de tubería de silicio por la abertura de 1/4 de pulgada.
   4. Asegura el tubo pasando la brida por las dos ranuras de 1/8 de pulgada (Figura 1B). Inserta el luer macho de la posición 1 en el tubo de silicio que se extiende fuera del potenciómetro (Figura 1C).
      NOTA: La barba de manguera del fitting 1 debe estar expuesta.
   5. Prepara los barriles de la jeringuilla llenando un barril vacío con lana de vidrio y cerrando el extremo con un pequeño trozo de papel de aluminio (Figura 1C).
   6. Coloca un trozo corto de tubo de silicona al extremo del luer lock del cilindro de la jeringuilla (Figura 1C).
   7. Prepara dos barriles de jeringuilla idénticos. Coloca uno de los barriles de jeringuilla preparados a la manguera expuesta de la manguera del encuadre 1 en el tubo que sobresale de la olla (Figura 1D).
   8. Pausa: Los potenciómetros ensamblados pueden almacenarse para un uso experimental posterior.

Figura 1: Conjunto de la olla. A) Fondo de la olla cerrado con malla metálica y abrazadera de manguera. (B) Puerto de riego en el borde superior de la maceta. (C) La línea de riego termina con la espiga de manguera expuesta del Fitting 1 con el tubo de jeringuilla preparado. (D) Maceta ensamblada con línea de riego cerrada Haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Preparación de macetas para el experimento (realizar antes de cada nuevo experimento)
   1. Forra el fondo de la olla con dos círculos precortados para tubos de fibra de vidrio (Figura 2A).
   2. Prepara el sustrato del suelo mezclando dos partes de arcilla con una parte de arena. Añade 840 mL de sustrato a la maceta.
   3. Cubre las ollas con una tapa de plástico y asegura con cinta adhesiva (Figura 2B).
   4. Ollas llenas de autoclave en ciclo seco a 121 °C durante 30 minutos. Deja que se enfríe toda la noche con tapones de plástico en las macetas. Re-autoclave en ciclo seco a 121 °C durante 30 minutos. Deja que se enfríe completamente. Mantén las macetas cubiertas con la tapa de plástico.
      NOTA: Se pueden usar otros sustratos de tierra, pero la cantidad necesaria por maceta debe optimizarse de antemano. GNOVA también se ha probado con 800 mL de arcilla al 100% y 1 L de arena al 100%. Otros sustratos de suelo pueden requerir más ciclos de autoclave o diferentes configuraciones para una esterilización completa.
      PRECAUCIÓN: Hay que tener cuidado al retirar los vasos del autoclave, ya que el material estará caliente y las abrazaderas podrían aflojarse. Asegúrate de que las abrazaderas de manguera estén bien ajustadas una vez enfriadas antes de recoger las ollas.
   5. Inserta potenciómetros refrigerados en la base impresa en 3D. Coloca la maceta llena de tierra dentro de la base impresa en 3D. Sujeta la maceta por la base, no por los pilares de apertura, ya que son la parte más frágil.
   6. Pasa el tubo de riego por una de las aberturas inferiores de la base impresa en 3D (Figura 2C).
      NOTA: No autoclaves la base de soporte impresa en 3D, ya que esto podría derretir la pieza. Los experimentos que requieren temperaturas superiores a 60 °C pueden requerir un filamento alternativo resistente al calor (véase Tabla de Materiales).
   7. Mantén las macetas a temperatura ambiente tras el autoclavado y no retires la tapa de plástico ni la jeringuilla preparada hasta la preparación final del experimento.

Figura 2: Ilustración de la maceta preparada. (A) Fondo de la maceta forrado con envoltura de tubo de fibra de vidrio. (B) La parte superior de la olla cerrada con una tapa de plástico. (C) Olla vacía encajada dentro del diseño final impreso en 3D. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Preparación del cilindro de vidrio (realizada antes de cada nuevo experimento)
   1. Cubre un extremo del cilindro de cristal con un filtro DW4 precortado y fíjalo usando la cinta de vinilo (Figura 3A).
   2. Gira el cilindro de cristal para que mire hacia el otro extremo abierto y coloca un anillo de algodón dentro del tubo a 14 cm del borde. Asegura el anillo de algodón con cinta quirúrgica (Figura 3B).
   3. Cierra el extremo inferior del cilindro con una capa de esterilización usando dos gomas elásticas (Figura 3B).
   4. Autoclave los cilindros de vidrio preparados en un ciclo seco a 121 °C durante 30 minutos antes de su uso. Una vez autoclaveados, guarda los cilindros de vidrio estériles a temperatura ambiente hasta que sea necesario sin quitar el envoltorio.

Figura 3: Conjunto del cilindro de vidrio. (A) Extremo superior del cilindro de vidrio cerrado con medio filtrante DW4 y cinta de vinilo. (B) Extremo inferior del cilindro de cristal equipado con anillo de algodón y cerrado con envolvente de esterilización y gomas elásticas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Preparación del filtro de riego (realizarse antes de cada evento de riego, con la excepción de los pasos 1.4.4–1.4.6, que solo deben hacerse una vez)
   1. Montar el soporte del filtro colocando la membrana del filtro PES (Figura 4A.4) entre el soporte del filtro (Figura 4A.5) y el disco del filtro (Figura 4A.3).
   2. Orienta el lado liso de la membrana del filtro hacia la dirección de salida, asegurando que mire hacia la parte superior del soporte del filtro (Figura 4A.1).
   3. Coloca la junta tórica (Figura 4A.2) en la parte superior del soporte del filtro (Figura 4A.1). Sujeta la tapa del filtro al portafiltros. Solo aprieta a mano.
   4. Conecta los conectores. Inserta el deslizante macho del conector 2 en el puerto superior del portafiltros.
   5. Sujeta un trozo corto de tubo de silicio al extremo de la espiga de la manguera en el filtro (Figura 4B). Inserta el luer macho de un raccordo 1 al final del otro barril de jeringuilla preparado del paso 1.1.6 (Figura 4B).
   6. Conecta el filtro al conector de la espiga de la manguera en el barril de jeringuilla preparado.
   7. Autoclave los filtros ensamblados en ciclo seco a 121 °C durante 30 minutos. Aprieta los filtros una vez que se hayan enfriado y antes de usarlos.
      NOTA: Se recomienda preparar todos los filtros necesarios y autoclavarlos en una caja cerrada de polipropileno. Una vez autoclaveados, los filtros de riego pueden mantenerse estériles a temperatura ambiente hasta su uso, siempre que no se retire la jeringuilla preparada.

Figura 4: Conjunto del soporte del filtro. (A) Parte del soporte del filtro desmontado: 1. Parte superior del portafiltros, 2. Juntas tóricas, 3. Disco del filtro, 4. Membrana del filtro y 5. Portafiltros. (B) Portafiltro ensamblado con un barril de jeringuilla preparado correspondiente. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Montaje del experimento

1. Prepara y esteriliza las soluciones y materiales al menos un día antes de montar el experimento.
   1. Prepara medios de crecimiento de plantas Murashige y Skoog 0,5X siguiendo las instrucciones del fabricante. Medio autoclave en ciclo líquido a 121 °C durante 30 minutos.
   2. Autoclave el dispensador desmontado con tapa de botella en ciclo seco a 121 °C durante 30 minutos. Autoclave 1 L de agua desionizada en ciclo líquido a 121 °C durante 30 minutos.
   3. Placa de Petri de vidrio autoclave, vasos de precipitados de 500 mL, coladores de té y pinzas en ciclo seco a 121 °C durante 30 minutos al día con antelación.
      NOTA: Salvo que se indique lo contrario, los siguientes pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar utilizando técnica aséptica.
2. Esteriliza las semillas en superficie.
   NOTA: El protocolo de esterilización superficial de semillas dependerá de la especie vegetal que se vaya a utilizar. El sistema gnotobiótico ha sido probado tanto con trigo como con maíz utilizando los siguientes protocolos de esterilización de semillas.
   PRECAUCIÓN: Lleva bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras al manipular lejía e hipoclorito de sodio, ya que estos productos químicos pueden ser irritantes o corrosivos para la piel y los ojos. El etanol es inflamable; No uses llamas cercanas a la llama abierta.
   1. Esterilización de semillas de^{trigo 25}
      1. Rellena dos vasos con 150 mL de etanol al 95% v/v, un vaso con 150 mL de lejía doméstica sin diluir y dos vasos con 150 mL de agua.
      2. Coloca las semillas de trigo en el colador de té. Agita suavemente el colador de té con semillas en uno de los vasos de precipitados y etanol al 95% V/V durante un minuto.
      3. Transfiere las semillas a un colador de té nuevo. Agita suavemente los coladores de té con semillas en lejía durante 10 minutos.
      4. Transfiere las semillas a un colador de té nuevo. Agita suavemente los coladores de té con semillas en el otro vaso de precipitados con etanol al 95% V/V.
      5. Agita suavemente los coladores de té con semillas en agua desionizada estéril durante 30 segundos. Agita suavemente los coladores de té con semillas en el otro vaso con agua desionizada estéril durante 2 minutos. Coloca las semillas estériles en una placa de Petri vacía y estéril.
   2. Esterilización de semillas de^{maíz 26}
      1. Coloca las semillas de maíz en un tubo cónico de 50 mL. Llena el tubo cónico con etanol al 70% v/v. Invierte suavemente el tubo cónico durante 3 minutos.
      2. Decanta etanol al 70% y llena el tubo cónico con semillas con hipoclorito sódico al 2% frente a la volatilidad. Invierte suavemente el tubo cónico durante 3 minutos.
      3. Decanta hipoclorito de sodio al 2% y enjuaga las semillas con agua desionizada estéril. Decanta agua y enjuaga las semillas con agua cuatro veces. Coloca las semillas de maíz en una placa de Petri estéril.
3. Añade el inóculo microbiano al medio cuando sea aplicable.
   NOTA: No se aplicó ningún inóculo microbiano durante la optimización y pruebas de esterilidad del sistema gnotobiótico.
4. Monta los dispensadores con tapa de botellas y colócalos a las botellas de medios.
   NOTA: Como es un sistema abierto, recomendamos que dispongas de un contenedor para recoger el medio de paso. Descubrimos que usar una bandeja para hornear funciona bien y permite moverlo fácilmente, pero requiere vaciarlo con frecuencia.
5. Quita la tapa de plástico de la olla y echa 378 mL de medium en la olla.
   NOTA: Esto corresponde a aproximadamente un 70% de espacio poroso relleno de agua (WFPS), que debe ajustarse al usar otros sustratos del suelo. Usa 360 mL para arcilla y 358 mL para arena.
   1. Siembra la semilla esterilizada a la profundidad adecuada usando pinzas estériles.
   2. Siembra trigo a una profundidad de 1/2 pulgada y maíz a una profundidad de 1 pulgada. Alternativamente, siembra plántulas pregerminadas estériles en GNOVA. Utiliza semillas pregerminadas para la prueba de crecimiento del maíz.
   3. Vuelve a poner la tapa de plástico encima de la olla.

3. Montaje final y operación experimental

1. Transfiere la olla y el cilindro de cristal a una cámara de crecimiento. Sujeta el cilindro de cristal con la parte inferior hacia abajo, cerca de la olla.
2. Quita rápidamente la tapa de plástico de la olla y el envoltorio de esterilización del cilindro de cristal. Baja el cilindro de cristal sobre la parte superior, colocándola en el borde de la base impresa en 3D.
   NOTA: También se puede colocar una llama (por ejemplo, un mechero portátil de Bunsen) junto a la olla durante el montaje final del sistema de crecimiento para reducir aún más el riesgo de contaminación.
   PRECAUCIÓN: Asegúrate de que, al trabajar con llama abierta, no haya otros materiales inflamables cerca. Ten cuidado con la posición de la llama respecto a tu cuerpo para evitar quemaduras.
3. Cultiva plantas entre 4 y 17 semanas, dependiendo de la especie, utilizando condiciones de crecimiento específicas para cada especie.
4. Cultivar trigo a temperaturas diurnas/nocturnas de 22 °C/16 °C y maíz a 27 °C/23 °C. El fotoperiodo para ambas plantas es de 12 horas solo bajo luces fluorescentes.

4. Riego

1. Coloca un tubo largo de silicona al dispensador de tapa de botella.
2. Mantén la esterilidad durante el riego usando una llama portátil. Si una llama portátil no es una opción, realiza riego con lejía para mantener la esterilidad.
3. Riego con una llama portátil.
   PRECAUCIÓN: Trabaja cuidadosamente alrededor de las llamas abiertas para evitar lesiones corporales y daños a las instalaciones.
   1. Coloca la llama cerca de la línea de riego. Quita el barril de la jeringuilla de la línea de riego y del soporte del filtro. Mantén todos los extremos de los tubos dentro de la zona de llama.
   2. Conecta el soporte del filtro a la línea de riego. Conecta los dos cañones de jeringuilla entre sí. Conecta la otra pieza larga de tubo de silicona en el dispensador superior de la botella al puerto inferior del portafiltros.
   3. Dispensa 150 mL de medios Murashige y Skoog 0,5X. Separa los dos cañones de la jeringuilla.
   4. Desconecta el tubo de silicio del soporte del filtro y reemplázalo por un solo barril de jeringuilla.
4. Riego con lejía al 10%
   NOTA: Recomendamos utilizar esta estrategia de riego en grandes experimentos (n > 50) para aumentar el rendimiento durante el riego.
   PRECAUCIÓN: Lleva bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras al manipular lejía.
   1. Dispensa un 10% de solución de lejía v/v en dos pequeños vasos de precipitados de plástico y colócalos cerca de la línea de riego. Quita el barril de la jeringuilla de la línea de riego y del soporte del filtro.
   2. Sumerge todos los extremos de la tubería en la solución de lejía al 10% hasta que sea necesario. Sacude el exceso de solución de lejía. Conecta el soporte del filtro a la línea de riego de la maceta.
   3. Conecta la otra pieza larga de tubo de silicio del dispensador de tapa de botella al puerto inferior del portafiltros.
   4. Dispensa 150 mL de medios Murashige y Skoog 0,5X. Desconecta el tubo de silicio del soporte del filtro.
      NOTA: El volumen de riego es de 120 mL para arena y 360 mL para arcilla.
   5. Sustituye el filtro de la línea de riego por un barril de jeringuilla después de sacudir el exceso de lejía.
      NOTA: Si cambia el volumen de riego, debe incorporar aproximadamente 20 mL de medio para cebar la línea de riego.
5. Riega las macetas una vez a la semana. Ajusta el volumen y la frecuencia de riego según el objetivo del experimento y el sustrato del suelo utilizado. Si se utiliza 100% arena, aumenta la frecuencia de riego a dos veces por semana.

5. Cosecha

NOTA: Este protocolo de cosecha se siguió durante las pruebas y optimizaciones del sistema gnotobiótico. El protocolo de cosecha debe modificarse para adaptarse a objetivos específicos de investigación y al volumen de muestras que se procesan.

1. Prepara y esteriliza todas las soluciones y materiales al menos un día antes de la cosecha.
   1. Autoclave 4 L de agua desionizada y 500 mL de 0,145 M NaCl, en un ciclo líquido a 121 °C durante 30 minutos al día de antelación.
   2. Tijeras y pinzas de autoclave en ciclo seco a 121 °C durante 30 minutos al día de antelación.
      NOTA: Salvo que se indique lo contrario, los siguientes pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar utilizando técnica aséptica. Si la esterilidad no es necesaria para la recogida de la muestra, todos estos pasos pueden realizarse fuera de una campana de flujo laminar.
2. Transfiere los sistemas gnotobióticos de la cámara de crecimiento al laboratorio y colócalos cerca de la campana de flujo laminar.
3. Retira el cilindro de cristal de la olla y coloca rápidamente la olla en la campana de flujo laminar. Saca el potenciómetro de la base impresa en 3D.
4. Sujeta la planta en la base y vierte el sustrato de tierra en un recipiente. Sacude suavemente grandes grumos de sustrato de tierra de las raíces.
   NOTA: Las muestras de sustrato del suelo pueden recogerse y procesarse según el objetivo específico de investigación en esta etapa de la cosecha. El protocolo descrito brevemente aquí se utilizó para comprobar la esterilidad de los suelos.
5. Cosecha de suelo para conteo bacteriano²⁷ usando dilución en serie de placa única^{manchando 28}.
   1. Llenar los pozos de una placa de 96 pozos con 270 μL de 0,145 M NaCl. Deja la primera fila vacía. Añade 1 g de sustrato de tierra a un tubo cónico de 15 mL con 9 mL de 0,145 M de NaCl.
   2. Vórtice a máxima velocidad durante 5 minutos. Transfiere 30 μL de la muestra a un pozo vacío de la placa de 96 pozos.
   3. Prepara siete diluciones en serie de cada muestra pipeteando 30 μL de cada muestra en el pozo inferior que contiene 270 μL de solución de NaCl.
   4. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo entre cada transferencia.
   5. Preparar el spotting de dilución serial de una sola placa de cada muestra enchapando 10 μL de cada dilución serial en una sola placa R2A.
   6. Inclina las placas para repartir las gotas. Incuba las placas a temperatura ambiente.
   7. Cuenta las unidades formadoras de colonias (UFC) y calcula la UFC/g del suelo.
6. Separa los brotes de las raíces usando tijeras estériles. Registrar el peso de la nueva sesión.
7. Limpia las raíces agitándolas suavemente en un vaso con agua desionizada. Seca las raíces con seca y registra el peso fresco.
   NOTA: En este punto se puede recoger material tanto superficial como subterráneo y procesar según la metodología más adecuada para el análisis posterior de interés.

Resultados

Desarrollamos GNOVA, un nuevo sistema gnotobiótico para plantas, que permite el entorno estéril y controlado necesario para examinar las interacciones planta–microbio. Este nuevo sistema ofrece 24,4 pulgadas (62 cm) de espacio vertical para los brotes y una maceta de 1,3 L compatible con varios sustratos de suelo. El sistema completamente ensamblado mide aproximadamente 3 pies de altura (92,4 cm) y 4,57 pulgadas (11,6 cm) de ancho (Figura 5A–C). En comparación con otros sistemas, tiene la mayor capacidad vertical para el crecimiento de brotes y la segunda cámara radicular más grande (Tabla Suplementaria 1). GNOVA solo requiere 0,0135^m2 de superficie en la cámara de crecimiento, lo que hace que este sistema sea compacto y maniobrable. Este sistema puede utilizarse en cámaras de crecimiento de alcance con un espacio libre vertical de 1,22 m. Todos los componentes de este sistema, excepto la base impresa en 3D, son autoclavables y compatibles con autoclaves con dimensiones de 24 pulgadas × 24 pulgadas × 36 pulgadas (ancho × largo × alto; 61 cm × 61 cm × 91 cm). Esto agiliza la configuración experimental al evitar la esterilización manual de piezas individuales. Además, la mayoría de los componentes de este sistema son reutilizables, lo que mantiene el coste de uso por experimento en aproximadamente 6 USD tras el coste inicial de instalación de 54 USD por unidad (Tabla Suplementaria 2). Las condiciones ambientales dentro de GNOVA se determinaron siguiendo la temperatura y la humedad relativa del sistema con una planta de maíz de una semana durante tres días. La temperatura dentro de GNOVA fue, de media, +1,3 °C superior a la de la cámara de crecimiento (Figura suplementaria 1). Las diferencias de temperatura dentro del sistema y la cámara fueron mayores durante el ciclo de luz (media +2,5 °C) que durante el ciclo oscuro (media +0,4 °C). La humedad relativa dentro de GNOVA era de media del 63%, en contraste con el 34% en la cámara de crecimiento.

Figura 5: Renderizados del sistema GNOVA. (A) Modelo 3D del diseño final de la base de soporte (B) Sección transversal del modelo 3D de la base de soporte (C) Sección transversal del modelo 3D de GNOVA completamente ensamblado Haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Para asegurar la esterilidad dentro del sistema, realizamos un ensayo de cuatro semanas con sistemas no irrigados y sin plantas. La contaminación en el cilindro de vidrio se determinó mediante muestreo por encima y por debajo del anillo de algodón mediante un recubrimiento directo de basopos. No se observó crecimiento microbiano detectable por encima de tres colonias (es decir, una sola colonia por tercio de la superficie muestreada) por encima del anillo algodonero tanto para muestras no irrigadas (n=4) como para las irrigadas (n=6) (Figura suplementaria 2A). Por debajo del anillo algodonero, se observó crecimiento en una réplica no irrigada, mientras que no se detectó crecimiento en sistemas irrigados (Figura suplementaria 2B). Esto sugiere un bajo potencial de contaminación por parte del cilindro de vidrio, ya que el crecimiento microbiano solo estaba presente en réplicas limitadas bajo el anillo de algodón, que no está en contacto con la planta. La contaminación del suelo se evaluó detectando diluciones en serie en placas R2A (Figura suplementaria 2C). No se detectó un crecimiento microbiano sustancial en ninguna de las dos condiciones, salvo una única réplica irrigada con un recuento unitario formador de colonias no marcable a partir de diluciones seriadas (es decir, < 30 colonias). Además de las pruebas de esterilidad, realizamos una comparación de rendimiento entre trigo y maíz cultivados dentro de GNOVA con nuestro protocolo estándar de crecimiento gnotobiótico de dos semanas en un sistema^{de bolsa 19}. Para entender el efecto del tamaño reducido y la falta de riego en el rendimiento de las plantas, ampliamos los periodos de crecimiento en la bolsa para igualarlos a los de GNOVA. Aunque el contenido inicial de agua del suelo utilizado durante la instalación de ambos sistemas coincidió, GNOVA recibió fertigación semanal, mientras que las bolsas no. Para todas las comparaciones, usamos el sistema de bolsas como referencia, ya que era la configuración inicial de nuestro laboratorio para gnobióticos. Tanto el trigo como el maíz alcanzaron el 100% de germinación dentro de GNOVA, mientras que en el sistema de sacos el trigo solo alcanzaron el 67% (n = 3) y el maíz el 75% (n = 8) (Figura 6).

Figura 6: Germinación del trigo (n = 3) y el maíz (n = 8) dentro de GNOVA (púrpura) y sistema de sacos (verde). El resultado de germinación de cada réplica se representa por puntos en el eje y, ya sea como No germinación o Germinado para cada sistema gnotobiótico. Las barras representan la tasa de germinación (%) de cada especie vegetal dentro de diferentes sistemas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

También se realizó una prueba de crecimiento de trigo y maíz para determinar el periodo máximo viable de crecimiento y el rendimiento de la planta dentro del GNOVA. Aunque nuestro protocolo estándar de bolsas solo exige dos semanas de crecimiento, ampliamos el periodo de crecimiento dentro de las bolsas más allá de dos semanas para una mejor comparación entre ambos sistemas. Tras dos semanas, el trigo cultivado dentro de GNOVA (n=3) ya había alcanzado la etapa de crecimiento de Zadock (GS) 13 (Figura 7A), mientras que en la bolsa permanecía en GS11. En la quinta semana, las plantas habían alcanzado GS21 dentro de los sistemas GNOVA, como indica la aparición de los cultivadores (Figura 7B). En cambio, los cultivadores no estaban presentes en los sistemas de bolsas y las plantas permanecieron en GS13. Este retraso en el crecimiento y la ausencia de cambios fenológicos dentro del sistema de bolsas llevaron a la terminación de las plantas en este sistema en la sexta semana. Las plantas de trigo continuaron creciendo durante otras cinco semanas dentro de GNOVA, donde se observó un aumento en el número de hojas y biomasa (Figura 7C). Aunque la biomasa de trigo aumentó visualmente tras 12 semanas de crecimiento dentro de GNOVA, las plantas también empezaron a mostrar más hojas cloróticas, y el volumen del cilindro de vidrio se llenó con biomasa vegetal (Figura 7D). El trigo se cultivó durante otras dos semanas después (Figura 7E,F). Sin embargo, no hubo aumento visual de biomasa, por lo que la prueba de crecimiento se suspendió a las 17 semanas de crecimiento. El crecimiento del maíz también se evaluó dentro de GNOVA durante cuatro semanas y se comparó con el maíz cultivado en sacos (Figuras 8A, B). En este experimento, las semillas de maíz fueron esterilizadas y pregerminadas antes de sembrar dentro del sistema GNOVA o en el sistema de bolsa. El brote fresco y el peso de las raíces del maíz diferían significativamente entre ambos sistemas (prueba t de dos muestras, valor p < 0,05, Tabla suplementaria 3). El maíz cultivado en GNOVA tenía brotes y raíces frescas que pesaban de media 11,2 g y 5,7 g, respectivamente (Figura 8C,D). En cambio, los brotes y raíces de maíz cultivados dentro de la bolsa tenían pesos frescos de 1,29 g y 1,15 g, respectivamente. En general, la biomasa fresca de maíz cultivada dentro de GNOVA aumentó un 593% en comparación con el maíz cultivado en el sistema de sacos. Además, la longitud del brote y la raíz fueron significativamente mayores dentro de GNOVA que en las bolsas en un 89% y un 57%, respectivamente (Figuras 8E,F).

Figura 7: Crecimiento del trigo dentro del prototipo GNOVA. (A) Trigo a las dos semanas en la etapa de crecimiento (GS) 13 de Zadock. (B) Comparación del trigo tras cinco semanas de crecimiento en bolsa y GNOVA. Los cultivadores están presentes dentro de GNOVA (GS21) y ausentes en la bolsa (GS13). (C) Aumento de la biomasa de trigo a las 10 semanas de crecimiento. (D) Aumento de biomasa de trigo a las 13 semanas de crecimiento con la aparición de hojas cloróticas. (E) Aumento adicional de biomasa de trigo a las 15 semanas de crecimiento. F) La biomasa de trigo ocupa la mayor parte del volumen de crecimiento disponible a las 17 semanas de crecimiento. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: Crecimiento del maíz dentro del prototipo GNOVA (púrpura) en comparación con el sistema de sacos (verde). Las barras indican valores medios ± error estándar (n=4) (A) Maíz cultivado durante cuatro semanas en GNOVA y sistema de capturas. (B) Comparación de tamaño de plantas cosechadas cultivadas en GNOVA y sistema de bolsas. (C) Peso de brote fresco (Medio±SE). (D) Peso de raíz fresca (Medio±SE). (E) Longitud del disparo (Media±SE). F) Longitud de raíz (Media±SE). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Dinámica temporal de la humedad relativa y la temperatura medida dentro de GNOVA (púrpura) y la cámara de crecimiento (naranja). Los datos se registraron a intervalos de cinco minutos durante tres días. Se registraron datos dentro de GNOVA con una planta de maíz de siete semanas. Las zonas sombreadas en azul claro corresponden a periodos nocturnos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Crecimiento microbiano resultante de la prueba de esterilidad de la GNOVA sin que las plantas no reciban riego (Control) y con riego (Irrigado). (A) Muestras de cilindro de vidrio sobre el anillo de algodón. (B) Muestras de cilindro de vidrio debajo del anillo de algodón. (C) Placaje de dilución en serie de placas individuales de muestras de suelo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Comparación de características de GNOVA con otros gnotobióticos vegetales existentes (EcoFAB, cajas magenta, bolsas, FlowPot, GnotoPot y EcoFAB 3.0). Los sistemas se comparan entre parámetros clave relevantes para el diseño experimental, como la capacidad de altura de la planta, la capacidad del volumen radicular y el control de riego. La información se recopiló a partir de la literatura publicada y de las descripciones disponibles del sistema; cuando los datos no se han reportado explícitamente, se indican estimaciones. † Mejor aproximación cuando no se especifica en la literatura; ‡ El sistema no necesita ser desmontado ni trasladado a una campana de flujo laminar para realizar la tarea; * Posible con modificaciones al sistema; Categorías de costes definidas como: bajo (< 30 USD por unidad), medio (30-100 USD por unidad), alto (> 100 USD por unidad) Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla Suplementaria 2: Lista de materiales (BOM) y costes estimados para el ensamblaje y operación de una única unidad GNOVA. Los materiales se clasifican como componentes reutilizables o de un solo uso, con el coste unitario correspondiente, las cantidades requeridas por sistema y el coste total por sistema. Los componentes reutilizables contribuyen al coste inicial de montaje, y los materiales de un solo uso representan el coste consumible por experimento. * calculado a partir de precios al por mayor negociados para tarifas rentables; ** La cantidad necesaria varía según la duración del experimento, el sustrato del suelo utilizado y el objetivo de investigación. Vale la pena un experimento de cuatro semanas con un horario semanal de riego usando la mezcla de arcilla y arena; † Coste aproximado de la cantidad de material necesario por sistema; ‡ No incluye el precio de la solución nutritiva ni del sustrato del suelo, ya que esto varía según el objetivoexperimental. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 3: Los valores p resultantes de la prueba t de dos muestras para el crecimiento del maíz midieron variables cultivadas dentro de GNOVA y el sistema de bolsas. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El sistema gnotobiótico vegetal presentado aquí, GNOVA, proporciona una herramienta accesible y versátil para estudiar las interacciones planta-microbio en cultivos cerealíferos. Sus características clave incluyen una mayor capacidad de crecimiento y riego incorporado, que prolonga el crecimiento de cereales más allá de la fase de plántulas en condiciones estériles. El rendimiento de este sistema es comparable al EcoFAB 3.0 y proporciona un sistema gnomiobiótico alternativo vegetal accesible. El sistema está construido con componentes disponibles comercialmente seleccionados por coste, simplicidad y compatibilidad con autoclaves de tamaño medio, facilitando la adopción en laboratorios. El montaje y la operación son sencillos y no requieren equipos especializados, lo que reduce las barreras para su implementación. GNOVA puede adaptarse para servir a diferentes objetivos de investigación debido a su compatibilidad con una amplia gama de sustratos del suelo, protocolos de esterilización de semillas, inoculantes microbianos (libres de gérmenes, SynCom o comunidad natural) y diversos análisis aguas abajo.

Una contaminación mínima es esencial en los experimentos gnotobióticos de plantas para asegurar que los efectos observados puedan atribuirse a microbios de interés y no a contaminantes. La simple operación de GNOVA reduce el riesgo de contaminación. El estricto cumplimiento de la técnica aséptica y las siguientes recomendaciones clave garantizarán que la esterilidad se mantenga constante. Durante la instalación del experimento, recomendamos la desinfección de la campana laminar entre inoculantes microbianos para minimizar la contaminación cruzada de tratamientos. El orden en que se aplican los tratamientos también puede disminuir la contaminación cruzada. Aplicar tratamientos libres de gérmenes antes de cualquier tratamiento con microbios vivos es lo ideal. También pueden introducirse microbios extranjeros a través de semillas. Por tanto, los protocolos de esterilización superficial de semillas deben optimizarse para cada especie de planta o fuente de semilla, para equilibrar esterilidad y^{germinación 26}. Los protocolos de esterilización para cereales no modelo, como sorgo²⁴,^{cebada 29}, switchgrass y^{avena 23} , pueden implementarse fácilmente en GNOVA. Si la esterilización afecta negativamente a la germinación, se pueden utilizar semillas pregerminadas en su lugar. El riego representa una fuente importante de contaminación en los sistemas gnotobióticos. El punto más crítico durante este proceso es la fijación de los filtros a las líneas de riego. Los extremos de los tubos de las líneas de riego y los filtros deben permanecer estériles durante este proceso. La esterilización con llama requiere destreza y puede ser laboriosa, especialmente en experimentos de gran tamaño (n >50). Por ello, se recomienda el método alternativo a base de lejía para experimentos grandes o cuando la esterilización con llama no es práctica. También se recomienda mantener filtros estériles adicionales y disponer de lejía o etanol durante el riego en caso de contaminación durante la manipulación de materiales del sistema. Además, se recomienda encarecidamente la inclusión de unidades de control de contaminación (es decir, sin plantas, sin tratamiento microbiano y riego receptor) para monitorizar la esterilidad e identificar contaminantes.

Para superar el riesgo de contaminación por riego, los primeros sistemas gnotobióticos de plantas estaban completamente cerrados y carecían de capacidad de riego, lo que limitaba la duración de los experimentos. El maíz se cultivó gnotobóticamente en bolsas^19,30, tubos de vidrio y^{placas de Petri 15} entre dos y cuatro semanas. Para reponer agua y nutrientes durante el crecimiento de las plantas, sistemas alternativos como EcoFAB²³, FlowPot y^{GnotoPot 21} permitieron el riego mediante desmontaje parcial dentro de campanas laminares de flujo. Esto limitaba su tamaño y compatibilidad con plantas más grandes. Como las líneas de riego son fácilmente accesibles fuera de GNOVA, no es necesario desmontar y el sistema no está limitado a los tamaños de las campanas laminar. Esto no solo permite un suministro continuo de nutrientes y agua, sino que también aumenta el espacio de crecimiento disponible. La reducción del espacio en los brotes puede disminuir la capacidad fotosintética y contribuir al retraso^{en el crecimiento 24}, y la restricción de volumen radicular puede conducir a la unión radicular y reducir la absorción de agua y^{nutrientes 31}. La combinación de un pequeño espacio de crecimiento y la falta de riego en el sistema de sacos podría explicar la disminución de biomasa y la falta de progresión fenológica del maíz y el trigo en comparación con el sistema GNOVA. Este nuevo sistema permitió el crecimiento gnotobiótico del maíz durante una duración comparable a la del sorgo en EcoFAB 3.0²⁴. Además, supera el crecimiento gnotobiótico del trigo durante cuatro semanas en un sistema hidropónico (20) en un sistema de suelos más representativo. Además de las limitaciones físicas, los sistemas gnotobióticos suelen depender de un flujo de aire restringido para mantener la esterilidad. Un flujo de aire limitado puede provocar un aumento de temperatura y humedad, así como tasas de intercambio de gases más bajas, lo que podría afectar a la fisiología de la planta^. Se ha reportado un aumento en el crecimiento en sistemas con mayor flujo de aire, como las cajas magenta equipadas con filtros^{HEPA 33}, que funcionan de forma similar al filtro DW4 usado en GNOVA. Asimismo, EcoFAB 3.0 mostró aumento de temperatura y humedad relativa, pero seguía considerándose una plataforma robusta para el crecimiento gnobibótico del^{sorgo 24}. Esto sugiere que, aunque persisten limitaciones físicas y ambientales dentro de los sistemas gnotobióticos, los avances en el diseño de sistemas presentados aquí siguen proporcionando condiciones mejoradas que apoyan de forma más eficaz el crecimiento gnotobiótico de los cereales.

La facilidad de modificación es otra característica clave de GNOVA. La modularidad de su diseño permite a los usuarios realizar cambios en piezas individuales para adaptarlas mejor a sus necesidades de investigación y presupuesto. Este sistema es compatible con cualquier sustrato de suelo, incluidos los suelos naturales. Las modificaciones en el volumen de instalación, la concentración de la solución nutritiva y el volumen y frecuencia de riego deben basarse en las propiedades físico-químicas del suelo, ya que influyen directamente en la disponibilidad y distribución de nutrientes y agua³⁴. La sequía puede inducirse monitorizando el peso de todo el sistema GNOVA y determinando gravimétricamente el contenido de agua del suelo^{en 35}. Los exudados radiculares pueden recogerse de forma destructiva incubando plantas cosechadas en agua^{ultrapura 36} o mediante el lavado del sistema para obtener leachates no^{estériles 37}. Si se requieren exudados estériles, el potenciómetro y la base de soporte impresa en 3D de GNOVA pueden modificarse para incorporar una función integrada de recogida de exudatos similar a la del diseño de EcoFAB 3.0²⁴. Los científicos interesados en comprender los efectos^{prioritarios 38} sobre el ensamblaje de comunidades microbianas pueden instalar líneas de riego adicionales alrededor de la maceta. Esto permite aplicaciones posteriores de inoculantes microbianos manteniendo la esterilidad de la línea principal de riego. Las condiciones ambientales podrían monitorizarse colocando sensores inalámbricos desinfectados de temperatura y humedad relativa dentro de GNOVA. Alternativamente, reemplazar el cilindro de vidrio por una cámara de policarbonato y perforar los puertos de^{muestreo 24} permitiría medir el entorno y muestrear gases. Esto podría permitir cuantificar gases y compuestos volátiles, como CO₂,_O2 y etileno, con potencial para influir en el rendimiento de la planta³³. El flujo de aire al sistema también puede aumentarse retirando el anillo de algodón en el cilindro de vidrio. Sin embargo, cualquiera de estas modificaciones podría aumentar el riesgo de contaminación y aún no ha sido validada ni optimizada dentro de GNOVA.

A pesar de las ventajas y versatilidad de GNOVA, hay algunas limitaciones que deben tenerse en cuenta. Cabe señalar que este sistema es más adecuado para su uso en cámaras de crecimiento controlado, ya que las condiciones no controladas en el invernadero o el campo pueden afectar su rendimiento. Aunque el trigo pudo crecer en el sistema durante 17 semanas, se observaron signos de estrés alrededor de las 12 semanas de crecimiento. Por lo tanto, el trigo no debe cultivarse más allá de las 12 semanas. Además, el mantenimiento de la esterilidad solo se confirmó mediante cuatro eventos semanales de riego durante un periodo de crecimiento de cuatro semanas; Los experimentos más largos conllevan un mayor riesgo de contaminación. Aunque GNOVA tiene una mayor capacidad de volumen radicular, la restricción radicular sigue siendo posible, y una evaluación temporal de la morfología radicular puede ayudar a determinar duraciones óptimas de crecimiento que minimicen la unión radicular. Además, algunas modificaciones al sistema, como la sustitución del cilindro de cristal por uno de policarbonato, pueden aumentar el coste de instalación a más de 100 USD por unidad. Actualmente, GNOVA solo permite muestreo destructivo de endpoints, lo que incrementa los requisitos de trabajo y replicación para estudios temporales de dinámica microbiana, patrones de exudación o monitorización de esterilidad. Por último, mantener la esterilidad durante la instalación, riego y cosecha es laborioso, e incluso sistemas simplificados como GNOVA requieren un esfuerzo dedicado, lo que incrementa los costes operativos totales. En conjunto, estas limitaciones deben tenerse en cuenta al adoptar este sistema. Además, las restricciones ambientales causadas por el crecimiento gnobbiótico deben tenerse en cuenta al planificar experimentos e interpretar los resultados, ya que pueden influir en la fisiología vegetal y, a su vez, en su microbioma asociado.

GNOVA proporciona una plataforma gnotobiótica versátil compatible con cultivos cerealicos. El sistema permite la recuperación de sistemas radiculares casi intactos adecuados para herramientas de análisis de arquitectura radicular como RhizoVision explorer³⁹ y ARIA⁴⁰, permitiendo caracterizar la morfología radicular en respuesta a diversos inoculantes microbianos y condiciones ambientales. Cuando se combina con SynComs y análisis multiómicos, GNOVA facilita la identificación de vínculos mecanicistas entre efectores microbianos y respuestas de plantas. SynComs más grandes (>100 miembros) combinados con análisis metagenómicos 41,42,43 pueden utilizarse para examinar patrones de co-ocurrencia e identificar microbios de relevancia ecológica bajo diferentes ^{condiciones 5,44}. En cambio, los SynComs más pequeños (45,46, metaproteómica^19,47,48 y metabolómica 49,50,51 permiten una caracterización detallada de la respuesta funcional tanto en plantas como^{en microbios 44}. En conjunto, estas capacidades posicionan a GNOVA como una herramienta valiosa para la identificación de rasgos microbianos clave que pueden acelerar el desarrollo de nuevos bioinoculantes que mejoren la sostenibilidad de los sistemas agrícolas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Powerconnect cordless drill & 100-Piece Kit	Black+Decker	BDC120VA100	Se necesitan brocas de 1/4" y 1/8".
Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards	3M	471	Material consumible
Sterling Rubber bands size #32  (2 rubber bands per system)	Amazon	B001I1QO00	Material consumible.
Wheat seed			Cultivar utilizado en este experimento: Catawba
Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick  (2 pre-cut circles per system)	Lowe's	28930	Corte en 2 círculos de 7/8 " (7.3 cm) de diámetro. Material consumible. Para una producción de alto rendimiento de círculos, desrolle el aislamiento de envoltura de tubo y use el borde abierto de la maceta para cortar el círculo colocando la maceta encima del aislamiento de envoltura y aplicando presión y giro.
DW4 Filter media, Pre-cut to 15" x 75 yards  (1 cut circle per system)	Class Biological Clean, Ltd	NA	Corte en círculos de 6.3 " (16.02 cm) de diámetro. CBC tiene otros tamaños de rollo precortados o estándar que se pueden comprar en su lugar si lo desea.  Material consumible. corte una plantilla del círculo en cartón y úsela para dibujar círculos en toda el área del medio DW4 y corte con tijeras.
Silicon tubing, Versilon SPX-50 High-strength, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wall thickness	Saint-Gobain	ABX00007	Corte en dos piezas largas ( 16" // 40.64 cm) y tres piezas cortas (2.5" // 6.35 cm)
Sodium hypoclorite 5% available chlorine in aqueous solution	VWR	JT9416-1	Diluido a 2% v/v y usar para el protocolo de esterilización de maíz
Murashige & Skoog medium, micro and macro elements. 25 L	Research Products International	M10200-25.0	Diluir a 0.5x de fuerza
Ethanol, 100%, Deacon Labs	Fisher scientific	04-355-451	Diluido a 95% v/v
Syringe 3 mL, luer lock unsterile  (2 per system)	Fisher scientific	14-817-117	Deseche el émbolo y solo mantenga el barril, llene con lana de vidrio y tape con papel de aluminio.
Glass beakers, 250 mL	VWR	470191-150	Se necesitan cinco para la esterilización de semillas de trigo
Maize seed			Genotipo utilizado en este experimento: Mexico 21–22 B73XMo17
Aluminum baking tray 18" x 26"	Amazon	B01FIK54LQ	Asegúrese de que se ajuste a las dimensiones de su campana de flujo
Sodium Chloride	Fisher scientific	BP358-1	Prepare una solución de 0.145 M.
3D printed base, polylactic acid (PLA) filament used (1 per system)	Protolabs	NA	La impresión y los archivos editados se pueden encontrar en los materiales suplementarios. Los archivos están disponibles en Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. NO AUTOCLAVE si se utilizó PLA como filamento para producir la base. PLA se derrite por encima de 150 °C y puede deformarse por encima de 60 °C. Se recomienda que se pruebe la integridad de la base impresa en 3D de PLA si se va a utilizar a temperaturas superiores a 40 °C. Para materiales de mayor resistencia al calor, como PETG (polietileno tereftalato glicol) o PC (policarbonato), se puede utilizar en su lugar; esto aumentará el costo de la pieza y es posible que aún no sea autoclavable. La impresión 3D de los prototipos de base se realizó en una impresora personal con volúmenes de construcción de 256 × 256 × 256 mm (largo × ancho × alto). Para mayor rapidez y eficiencia en costos, recomendamos imprimir en grandes cantidades en proveedores de servicios de impresión 3D comerciales locales.
Male luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polypropelene  (2 per system)	Cole-Parmer	EW-50114-69	Referido como ajuste 1 en el protocolo
Male slip luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polyproylene  (1 per system)	Cole-Parmer	EW-50114-63	Referido como ajuste 2 en el protocolo
201 Stainless steel worm gear hose clamps, 1 1/2" -3 1/2" clamping diameter (1 per system)	Grainger	5CZF2	Referido como abrazaderas de manguera en el protocolo
Airstream Gen 3 Laminar flow cabinet with simple switch, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 "	ESCO Lifesciences	2120707	Referido como campana de flujo laminar en el protocolo. Cualquier campana de flujo laminar con dimensiones similares funciona. Se pueden necesitar modificaciones en campanas de flujo más pequeñas.
Play sand, Quikrete Premium. 50 lb	The Home Depot	1001709466	Referido como arena en el protocolo
304 Stainless steel woven wire, 120 mesh (1 per system)	Amazon	B09KRS5F7T	Referido como malla de alambre de acero inoxidable en el artículo. Corte en círculos de 4.7" (11.9 cm) de diámetro. Para una alta producción de alto rendimiento o círculos, corte una plantilla del círculo en cartón y úsela para dibujar círculos en toda el área de la malla tejida de la malla tejida y corte con tijeras.
Clay (Montmorillonite), OIL-DRI Loose Sorbent, 50 lb Wt, not scented	Grainger	44Z111	Referido en el protocolo como arcilla. Material consumible.
Clear hurricane candle shade chimney tube without a bottom 4" OD x 30" length (1 per system)	WCG International	HST0430	Referido en el protocolo como cilindro de vidrio
Clear plastic cap, 3" (7.6 cm) diam  (1 per system)	ClearTec Packaging	PCC3.000	Referido en el protocolo como tapa de plástico
Clear Polycarbonate tubing, 3" OD x 2 7/8" ID x 1/16' wall thickness x 12" length  (1 per system)	ePlastics	PCTUB3.000X2.875	Referido en el protocolo como olla. Puede solicitar a la empresa que corte a otras longitudes deseadas.
Cleanroom