Artículo de método

Ensayo de aislamiento de fibra única para la evaluación del comportamiento oxidativo de miofibras

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DOI:

10.3791/70637

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31 de marzo de 2026

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1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento de fibras musculares individuales intactas del sóleo oxidativo y el establecimiento de cultivos de mioblast altamente purificados derivados de estas fibras. El procedimiento optimizado proporciona de forma fiable aproximadamente 300–500 miofibras intactas por ratón, permitiendo análisis moleculares y celulares posteriores.

Resumen

El músculo esquelético está compuesto por miofibras multinucleadas cuya integridad y función son esenciales para el movimiento y la salud general. En los trastornos neuromusculares, los grupos musculares pueden verse afectados de forma diferencial según los tipos y estadios de la enfermedad, por lo que es importante aislar fibras individuales viables de músculos representativos para estudios mecanicistas. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método fiable para aislar un alto rendimiento de miofibras individuales intactas del músculo sóleo murino (SOL), que resulta difícil de disociar debido a la longitud y fragilidad de las fibras. Al optimizar la concentración de colagénasa y el tiempo de digestión, el protocolo minimiza la pérdida de fibra y preserva la viabilidad durante la disociación. El flujo de trabajo optimizado reduce notablemente la unión residual del tejido a fibras aisladas, limitando así la transferencia de células no fibrosas y minimizando la contaminación entre células intercelulares. Esta técnica es adecuada tanto para análisis de fibra única como para el aislamiento de células satelitales y posterior expansión en condiciones de mínima contaminación. Utilizando este flujo de trabajo optimizado, obtenemos rutinariamente ~300–500 miofibras individuales intactas derivadas de SOL que pueden ser inmunomarcadas con alta eficiencia y que además producen una población de células satélite de alta calidad con una contaminación mínima por fibroblastos. Utilizando análisis comparativos con el músculo Extensor Digitorum Longus (EDL), subrayamos el valor de un enfoque personalizado y específico para cada músculo para evaluar terapias en la investigación de enfermedades neuromusculares, permitiendo que intervenciones farmacéuticas candidatas se prueben en ventanas experimentales pequeñas y ajustables.

Introducción

El músculo esquelético es el tejido más abundante del cuerpo humano, representando aproximadamente entre el 40 y el 50% de la masa corporaltotal. El músculo esquelético actúa como un reservorio de energía en forma de glucógeno. Durante la exposición al frío, proporciona calor mediante la termogénesis y, lo que es importante, proporciona locomoción. El músculo esquelético está compuesto por miofibras postmitóticas multinucleadas. Para sostener la maduración y reparación muscular, nuevos mionúcleos son generados por la célula madre residente de nuestro músculo esquelético, la célula satélite (SC). Los SC se encuentran en la periferia de las fibras musculares esqueléticaspostnatales 2,3,4. Los SC se identifican mediante el factor de transcripción Pax7, que se expresa tanto en estados de reposo comoactivado 3,5. En caso de lesión o estimulación hipertrófica, los SC activan y regulan al alza la MioD, entran en el programa miogénico, proliferan y, finalmente, se fusionan con miofibras existentes o recién formadas para restaurar la funciónmuscular 6,7,8. Los SC son heterogéneos en su capacidad de tallo, origen embrionario (somiótico vs no somítico), etapa de crecimiento posnatal (jóvenes vs viejos) y composición muscular (fibras rápidas vs lentas)9,10,11.

Dependiendo de la región del cuerpo, el músculo esquelético se adapta para satisfacer las demandas energéticas y funcionales de esa región. Esta heterogeneidad en las fibras musculares es posible debido a su contractilidad y capacidad oxidativa. De hecho, las fibras musculares están compuestas por fibras oxidativas de contracción lenta (denominadas tipo I y IIa) y fibras glicolíticas de contracción rápida (denominadas IIx, en roedores IIb)12,13. Este hermoso y funcional mosaico de tipos de fibras nos permite movernos libremente en nuestra vida cotidiana. Por ejemplo, los músculos posturales como la sóleo (SOL) y la espina erectora están en un estado de activación crónica y de bajo nivel, y por tanto contienen una alta proporción de fibras musculares tipo I y tipo IIa de oxidación lenta. En cambio, los músculos cortos pero de acción rápida, como el extensor largo de los dedos (EDL), están compuestos principalmente por fibras glicolíticas tipo IIx y tipo IIb. Sin embargo, la composición de la fibra no es fija; más bien, las fibras musculares son estructuras dinámicas capaces de pasar de rápidas a lentas y viceversa, dependiendo de los requisitos funcionales que se les impongan. La diferencia en la contractilidad del tipo de fibra es posible debido al contenido de la proteína miosina. Esta es la proteína principal dentro del músculo esquelético, compuesta por isoformas de miosina en cadenas ligeras ypesadas 12,14.

Dentro de un sarcómero (la unidad funcional más pequeña del músculo que genera fuerza), las cabezas de miosina y la actina interactúan para formar una estructura conocida como puente transversal. Mediante la hidrólisis del ATP, la energía se libera mediante el ciclo de las interacciones entre miosina yactina 15,16. La cadena pesada de miosina (MyHC) es el marcador más adecuado para la identificación del tipo de fibra12,13. Dependiendo de la isoforma de MyHC expresada, la tasa de contractilidad muscular variará. Como se ha mencionado, las fibras tipo I son fibras oxidativas lentas, a diferencia de las fibras tipo II. Los grupos musculares dominantes tipo I contienen una mayor abundancia de enzimas oxidativas, son más ricos en mitocondrias y tienen una densa red capilar que perfunde el músculo17,18 (piensa en un corredor de maraton). Las fibras tipo I están codificadas por el gen MYH7 13,19. Las fibras tipo II se fatigan rápido, contienen una alta proporción de enzimas glucolíticas y tienen una mayor velocidad máxima de acortamiento, lo que las hace ideales para ráfagas cortas de potencia o movimiento (piensa en powerlifter). Las fibras tipo II para los tipos IIa, IIx y IIb (en roedores) están codificadas por los genes MYH2, MYH1 y MYH4, respectivamente20,21. No es de extrañar que cualquier ofensa fisiopatológico que afecte la integridad muscular altere la composición de los tipos de fibras y provoque efectos perjudiciales en la función muscular, lo que podría disminuir la calidad de vida. De hecho, muchas distrofias musculares comienzan en la célula satélite (opatías celulares satélite) o en la fibra muscular (derivada de neuronas motoras o tejido muscular), y pueden provocar un cambio en la composición de los tipos defibras 22,23,24,25. Por ejemplo, los estudios de lesión medular, el reposo absoluto y los vuelos espaciales (microgravedad) muestran que la inactividad a largo plazo puede provocar que los músculos posturales pasen de un fenotipo de fibra lenta a rápida 26,27,28,29,30. Por el contrario, en la distrofia muscular de Duchenne, tanto en modelos humanos como murinos (mdx), las fibras glucolíticas rápidas se ven afectadas en mayor medida y con mayor gravedad que sus contrapartes máslentas 31,32,33,34. De manera similar, en la distrofia muscular facioscapulohumeral (FSHD), se observa una transición de contracciones rápidas a lentas con una mayor proporción de fibras tipo I junto con menor producción de fuerza en las fibras tipoII 24,35,36.

Sigue sin estar claro por qué ciertos tipos de fibras musculares se ven afectados o se salvan selectivamente en diferentes enfermedades. El hecho de que estos patrones sean no aleatorios subraya la importancia de diseccionar los mecanismos subyacentes, para los cuales el aislamiento de fibra única ha surgido como una técnica poderosa y ampliamente utilizada. De hecho, desde que fue introducida por primera vez a mediados de los años 80 por Bischoff37, esta herramienta indispensable ha sido continuamente refinada y adaptada, permitiendo una investigación cada vez más precisa de la biología muscular 38,39,40. Es importante destacar que el aislamiento de una sola fibra mantiene los SC lo más cerca posible de su nicho fisiológico, permitiendo un escrutinio adecuado de su actividad molecular. Aunque grupos musculares como los del flexor corto de los dedos (FDB) y EDL pueden extraerse con relativafacilidad 41,42,43, el músculo SOL sigue siendo uno de los músculos más difíciles de obtener una población rica de fibras intactas. Esto se debe a su rigidez, longitud extensa de la fibra y susceptibilidad a daños. Para abordar esto, en el presente estudio se ha optimizado una técnica que produce de forma robusta una población viable y de alta calidad de fibras a partir del músculo SOL, notoriamente difícil de aislar. Cuando se combina con el aislamiento de fibras EDL, este enfoque permite cultivar fibras y células derivadas (células satélite, mioblastos y miotubos) a partir de grupos musculares distintos. De forma crucial, esta plataforma permite la investigación sistemática de los factores moleculares que pueden contribuir de forma diferencial a diversas patologías musculares y proporciona un medio potente para probar intervenciones farmacéuticas de manera que puedan revelar respuestas específicas por tipo muscular y, en última instancia, apoyar el desarrollo de tratamientos eficaces para las enfermedades del músculo esquelético.

Protocolo

Todos los animales se alojaron en la instalación veterinaria de la Universidad Metropolitana de Tokio (Números de permiso: A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). Todos los animales se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos (FPS). El manejo de animales y los procedimientos experimentales empleados en este estudio se ajustaron estrictamente a las directrices del Comité de Seguridad y Ética de la Universidad Metropolitana de Tokio.

1. Preparación del reactivo

  1. Lleva guantes durante todo el encuentro. En un tubo centrífuga de 25 mL, prepare un 0,5% de solución de colagénasa tipo I en el Medio Águila Modificado (DMEM) + GlutaMAX de Dulbecco's con suspensión al 1% de penicilina-estreptomicina-anfotericina B (AB). Después de que la colagenasa esté bien disuelta (golpee ligeramente el tubo si es necesario), esteriliza la solución filtrando a través de un filtro de baja unión a proteínas de 0,22 μm.
    NOTA: 2,5 mL de solución de colagénasa son suficientes para dos sóleos (un ratón).
  2. Prepare 10 mL de albúmina sérica bovina al 5% (BSA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Inactivar el calor a 60 °C durante 30 minutos y luego filtrar la solución a través de un filtro de baja unión a proteínas de 0,22 μm.
    NOTA: El 5% de BSA en la solución de PBS puede almacenarse a 4 °C durante hasta 10 días.

2. Disección de los músculos sóleo

  1. Equipo de diseño para disección muscular (Figura 1A).
  2. Anestesiar a ratones C57BL/6 mediante inyección intraperitoneal de una mezcla anestésica triple (0,5 mL/g de peso corporal) que contiene 1 mg/mL de clorhidrato de medetomidina, 5 mg/mL de midazolam y 5 mg/mL de butorfanol tartrato, y luego eutanasiar a los ratones mediante una luxación cervical.
  3. Haz incisiones secuenciales en la extremidad trasera y despega la piel. Quita la fascia superficial.
  4. Separa el tendón plantar (PLA) de los haces de tendones del gastrocnemio (GAS) y del sóleo (SOL). Retira suavemente el PLA tirando de su tendón (Figura 1B).
  5. Corta los haces de tendones GAS y SOL y expone los músculos. Inserta un pasador en el espacio entre el tendón proximal del GAS y el SOL (Figura 1C).
  6. Deslica cuidadosamente la aguja hacia el extremo distal para separar el músculo SOL y el GAS (Figura 1D).
  7. Corta los haces de tendones desde el lado GAS (Figura 1E).
  8. Descansa el tiempo de espera sobre el GAS. Ajusta cuidadosamente la posición del SOL para exponer el tendón proximal y córtalo con un par de microtijeras (Figura 1F).
  9. Coloca el SOL sobre la mesa de disección y retira el tendón restante (Figura 1G).
    NOTA: Este paso es opcional; el tendón restante no afecta al resultado.

3. Digestión de los músculos sóleo

  1. Transfiere el sóleo intacto a un tubo centrífugo de 25 mL que contiene la solución preparada de colagénasa al 0,5%. Incuba a 37 °C durante 130 minutos.
    NOTA: Cada 15–20 minutos, se puede agitar manualmente la muestra para separar ligeramente las fibras y apoyar la actividad de la colagenasa.

4. Aislamiento de fibras individuales bajo un estereomicroscopio

  1. Corta dos pipetas Pasteur para crear una con un calibre ancho y otra con abertura estrecha (Figura 2A). Bajo llamas, esteriliza y alisa los agujeros para evitar daños musculares durante la trituración.
  2. Para evitar la adhesión de fibras durante el aislamiento, recubre pipetas Pasteur y tres placas de Petri de 50 mm con 5% de BSA/PBS.
    NOTA: Se utilizó un estereomicroscopio (Figura 2B) durante los pasos de aislamiento.
  3. Tras la digestión muscular, descarta el exceso de solución de colagénasa y transfiere el sóleo al primer recipiente que contenga DMEM con un 1% de AB (Figura 2C).
  4. Utilizando la pipeta Pasteur de gran diámetro, enjuaga suavemente arriba y abajo para disociar las fibras (Figura 2D).
  5. Con la pipeta Pasteur de calibre estrecho, transfiere fibras simples intactas a lo largo de la longitud de la fibra muscular al segundo plato. Aprovecha para eliminar residuos y/o fibras reducidas (Figura 2E,F).
  6. Transfiere fibras simples de alta calidad (de longitud completa/intactas) a un tercer plato para asegurar la pureza con la pipeta Pasteur de ánima estrecha (Figura 2G,H).
  7. Recoge las fibras en un tubo centrífugo de 25 mL recubierto con BSA. Remueve suavemente la suspensión y déjala reposar 5 minutos a temperatura ambiente para que las fibras se precipiten hasta el fondo del tubo.
  8. Utilizando la pipeta Pasteur de calibre estrecho, descarta cuidadosamente el sobrenadante, eliminando cualquier resto restante. Deje aproximadamente 500 μL de DMEM con una solución de AB al 1%. Este precipitado contendrá una población altamente purificada de fibras musculares individuales (Figura 2G,H).
    NOTA: Esta técnica puede obtener > 300 fibras individuales, que luego pueden utilizarse para la extracción de proteínas y ARNm y su posterior análisis.

5. Establecimiento de cultivos de mióblastos altamente purificados a partir de fibras de sóleo

  1. Diluye la matriz Matrigel a 0,1 mg/mL y úsala para cubrir un plato de cultivo de 100 mm. Incuba el plato a 37 °C durante 30–60 minutos hasta que el recubrimiento se polimerice de forma uniforme.
  2. Añade un volumen igual de Accutasa a la suspensión de las fibras musculares y incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente, añadir 10 mL de medio de crecimiento (compuesto por DMEM sin glucosa que contiene 30% de suero bovino fetal, 1% GlutaMAX, 1% extracto de embrión de pollo, CEE, 1% AB y 0,01 μg/mL factor de crecimiento fibroblasto básico, bFGF)44.
    NOTA: Una cantidad igual de Accutasa en este caso es los 500 μL descritos en la Sección 4.8. Accutasa facilita la suave disociación de las fibras musculares y ayuda a liberar células satélite, apoyando la posterior expansión del cultivo de mióblastos.
  3. Transfiere los 10 mL de suspensión de fibras musculares tratadas con Accutase a un plato recubierto de Matrigel. Se añaden aproximadamente 4 fibras individuales/cm 2 a un plato de cultivo de 100 mm. Asegúrate de que las fibras estén distribuidas de forma uniforme por todo el plato de cultivo.
  4. Tras 3 días en medio de cultivo, se pueden observar colonias de mióblastos. Reemplaza el medio de crecimiento diariamente hasta que los mioblastos alcancen la población requerida. Normalmente, al día 6, los cultivos de mióblastos se vuelven lo suficientemente confluentes para la fase experimental (Figura 3A).
  5. Despega mioblastos de su plato de cultivo original usando tripsina e incuba la muestra a 37 °C durante 2 minutos. Utilizando un hemocitometro, cuenta las células y semillas según el tamaño del pozo y la confluencia celular necesaria para la progresión miogénica.
    NOTA: Para un plato de 100 mm, añade 1 mL de tripsina.

Resultados

Nuestra técnica demuestra que las fibras aisladas del sóleo (SOL) y del extensor largo del dedo (EDL) pueden ser inmunomarcadas eficazmente contra Pax7 (Figura 3B). Estas fibras aisladas pueden mantenerse en un medio de cultivo flotante (compuesto por DMEM + GlutaMAX con suero de caballo al 10%, 1% AB, 0,5% CEE) durante 3 días, seguidos de inmunomarcaje (Figura 3B). No se recomienda mantener las fibras flotantes más de 4 días. Bajo las condiciones descritas de fibra flotante, las miofibras tienden a agregarse después de este tiempo, comprometiendo el análisis posterior de inmunomarcaje.

La técnica presentada puede utilizarse además para la inmunoblot en todo el programa miogénico (Figura 3C). De hecho, los mioblastos derivados de SOL y EDL se agruparon en placas de 24 pozos con una confluencia aproximada del 70%. Las células se mantuvieron en medio de crecimiento durante 1 día (mioblastos) o se indujo a diferenciarse durante dos o cuatro días (miotubos de formación temprana y miotubos diferenciados, respectivamente). Se cargaron cinco μg de proteína para el análisis de inmunoabsorbente.

La expresión de MyHC I se expresó casi específicamente en fibras musculares derivadas de SOL, con una expresión mínima en miotubos y despreciable en mioblastos (Figura 3C). MyHC II se expresó tanto en fibras musculares SOL como EDL. Esta expresión refleja el SOL, compuesto principalmente por los tipos I e IIa, mientras que el EDL está compuesto principalmente por fibras IIx e IIb. Los mioblastos no expresaron MyHC II, pero su expresión aumentó progresivamente durante la diferenciación. Las proteínas relacionadas con la oxidación PGC-1α y COXIV demostraron la mayor expresión esperada en fibras derivadas de SOL. Además, se detectó una mayor expresión de GLUT4 en fibras aisladas de SOL en comparación con fibras EDL. Un problema al que pueden enfrentarse los biólogos de músculos esqueléticos es que las proteínas de mantenimiento y controles de carga ampliamente utilizados, como la α-tubulina, la β-actina, GAPDH y las tinciones de proteínas totales incluyendo Ponceau S, no permanecen estables en mioblastos, miotubos y fibras musculares aisladas, cada una mostrando una variabilidad distinta. La intensidad de señal de α-tubulina y β-actina fue mayor en miotubos, mientras que la tinción con S de Ponceau fue relativamente débil en mioblastos. En contraste, el GAPDH mostró una mayor expresión en las fibras musculares de la EDL. No obstante, dependiendo del propósito experimental, una de estas proteínas de mantenimiento puede seguir siendo aplicable; alternativamente, se pueden explorar factores de normalización como la proteína de choque térmico 70 (HSP70).

Figura 1
Figura 1. Disección del músculo sóleo. (A) Equipo necesario para la disección. 1: microtijeras, 2: pinzas finas, 3: tijeras diseccionadoras y 4: pinos de disección. (B) El tendón PLA fue cortado de los haces de tendones GAS y SOL (flecha amarilla). El tendón distal de PLA (flecha blanca) fue levantado con pinzas. (C) Se insertó un pasador de disección en el espacio entre el tendón proximal del SOL (flecha roja) y el GAS (flecha verde). (D) El SOL se separó del GAS mediante un pasador de disección. (E) Los haces de tendones GAS y SOL se cortaron en el lado de GAS. (F) Luego se cortó el tendón proximal SOL con microtijeras. (G) Se retiraron haces tendinosos distales adicionales. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Aislamiento de fibras sóleo. (A) Equipo necesario para aislamiento. 1: de calibre estrecho y 2: pipetas Pasteur de ánima ancha. (B) Estereomicroscopio usado para aislamiento. (C) El sóleo digerido por colagenasa se transfirió al DMEM con un 1% de AB. (D) Las fibras del sóleo se disociaron del músculo tras las primeras 10 sesiones de enjuague. (E) Fibras individuales transferidas al segundo plato. (F) Imagen que muestra fibras limpias retiradas de restos y fibras reducidas. (G) Fibras simples libres de restos transferidas al tercer plato. (H) Fibras simples intactas claramente visibles. Barra de escala = 10 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Expansión del cultivo celular y análisis de muestras derivadas de EDL y SOL. (R) Tras 6 días tras el aislamiento, las muestras cultivadas con medio de proliferación muestran un cultivo de mióblastos puros obtenidos de fibras de sóleo aisladas. Barra de escala = 100 μm. (B) SOL y fibras individuales derivadas de EDL, inmediatamente o 3 días después del aislamiento, muestran células satélite inmunomarcadas para Pax7 (verde). La ausencia de MyoD (rojo) confirma que las células satélite aún no se han comprometido a activarse miogénicas. Las fibras se contrateñieron con DAPI (azul). Posteriormente, las células fueron observadas mediante un microscopio de fluorescencia. Barra de báscula = 20 μm. (C) Se utilizó 5 μg de proteína para la inmunoabsorción de mioblastos, miotubos y muestras derivadas de miofibras. Los paneles de inmunoblot muestran la expresión de MyHC I, MyHC II, PGC-1α, COX IV, GLUT4, α-tubulina, β-actina y GAPDH se utilizaron como objetivos de mantenimiento y normalización. Se utilizó la tinción Ponceau S como control total de la carga de proteínas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

La primera clave para aislar un gran número de fibras musculares del sóleo (SOL) es mantener la integridad estructural del músculo durante la disección. Si el epimisio del SOL se desgarra o si el músculo es tirado con fuerza, especialmente a lo largo de su eje longitudinal, durante la disección, el rendimiento del aislamiento se verá gravemente comprometido. Estos errores de disección suelen ser fáciles de identificar después. De hecho, tras la digestión de la colagenasa, el músculo se encoge uniformemente y forma una masa blanca y compacta. Bajo tales condiciones, solo un número muy pequeño de fibras viables puede disociarse.

El segundo factor decisivo para el éxito del aislamiento del sóleo es la eficiencia de la digestión de la colagenasa tipo I. Cuando la colagenasa funciona de forma óptima, se pueden obtener aproximadamente entre 100 y 200 fibras de sóleo durante las primeras 10 sesiones de enjuague. En cambio, cuando la digestión es subóptima, incluso después de los primeros 20 enjuagues, pueden liberarse menos de 50 fibras. Para obtener un mayor rendimiento de fibra, se requiere un enjuague más vigoroso y ciclos adicionales de enjuague. Sin embargo, dado que las fibras SOL son excepcionalmente frágiles, esto suele provocar encogimiento durante el enjuague.

Para establecer un cultivo de mióblastos primarios puros derivados de SOL, la digestión de la colagénasa vuelve a desempeñar un papel crucial. Cuando la digestión es eficiente, quedan menos fibras adheridas al tejido residual y transferir las fibras al medio de cultivo resulta en una contaminación mínima por fibroblastos. En cambio, cuando el SOL está mal digerido, las fibras disociadas permanecen adheridas al tejido residual, contaminando el cultivo de mióblastos con fibroblastos. Los investigadores deben buscar los signos típicos de contaminación por fibroblastos en las muestras de células sembradas; estas incluyen un tamaño celular mucho mayor y protuberancias del citoesqueleto extensas, en comparación con las células satélite mucho más pequeñas y en forma de huso en platos recubiertos de Matrigel adheridos. En caso de que se produzca contaminación, los investigadores pueden someter a las células a pasos previos al placado como se describe en otrolugar 45. Brevemente, los SC se cultivan durante 3 días tras el aislamiento, luego se tripsinizan y se emplatan brevemente en platos recubiertos de colágeno. Durante 15–30 minutos de incubación, los fibroblastos se adhieren mientras los SC permanecen suspendidos y se transfieren a placas frescas recubiertas de Matrigel.

Como se mencionó antes y en consonancia con nuestra experiencia, las fibras SOL son más largas y frágiles que las fibras del extensor largo de los dedos (EDL) y del flexor corto (FDB). Esto dificulta la transferencia de fibras con pipetas Pasteur. Es esencial aspirar fibras a lo largo de su eje longitudinal en lugar de dibujarlas desde el centro; de lo contrario, las fibras se pliegan y se contraen bajo el esfuerzo. Además de los factores decisivos que determinan directamente si el aislamiento de la fibra tiene éxito, algunos pasos técnicos adicionales son esenciales para mejorar el rendimiento de la fibra del sóleo. Una de ellas es recubrir todas las pipetas, platos y tubos de recogida Pasteur con un 5% de BSA. Esto evita que las fibras musculares recién disociadas se adhieran a las superficies, evitando así el plegamiento de las fibras y su posterior contracción. Se recomienda preparar nuevas pipetas Pasteur esterilizadas con calor y recubiertas de BSA cada vez que se aíslen muestras musculares. Alternativamente, los investigadores podrían preparar un juego de pipetas Pasteur para uso a largo plazo. Si es así, esteriliza con calor cada vez y aplica una capa fresca de BSA antes de usarla.

El protocolo convencional para el aislamiento de fibras musculares individuales estaba principalmente optimizado para músculos glicolíticos como FDB y EDL37. Sin embargo, los músculos oxidativos, como el SOL, son estructuralmente distintos. Los análisis transcriptómicos han demostrado que la expresión génica relacionada con la matriz extracelular (ECM) difiere entre el SOL y el EDL46, incluyendo genes como la distrofina, una proteína enlazadora del citoesqueleto del músculoesquelético 44. En consecuencia, la condición estándar para la digestión muscular EDL con colagenosa al 0,2% (2 mg/mL) durante 60–90 minutos no es óptima para los músculos SOL, lo que resulta en haces compactos de fibras o fibras reducidas tras la digestión. En este estudio, optimizamos varios pasos clave para adaptar el protocolo a los músculos SOL oxidativos. Ajustando la concentración de colagenasa tipo I al 0,5% (5 mg/mL), ampliando el periodo de incubación a 130 minutos y minimizando el estrés mecánico durante el enjuague, se pueden obtener de forma consistente entre 300 y 500 fibras intactas de un solo ratón. En comparación con la EDL, el número y el rendimiento de las muestras de SOL siguen siendo menores (la EDL puede obtener > 500 fibras); sin embargo, el número de fibras y, lo que es importante, la alta calidad de nuestras fibras derivadas de SOL son robustos y adecuados para aplicaciones posteriores como el inmunomarcado y el inmunobloting. Aunque nuestros resultados de inmunoblot consistieron en muestras de fibra única agrupadas, la técnica presentada en este informe es capaz de extraer fibras individuales intactas de forma fiable, haciéndolas adecuadas para aplicaciones posteriores como inmunobloting, proteómica y secuenciación deARN 47 a resolución de fibra única. Los investigadores en el campo pueden utilizar esta técnica para estudiar diferencias metabólicas y contráctiles entre fibras musculares oxidativas y glicolíticas.

En conjunto, este protocolo proporciona un método reproducible y accesible para aislar fibras oxidativas intactas del músculo sóleo, ampliando el conjunto de herramientas disponible para investigar la fisiología y los mecanismos moleculares específicos de los tipos de fibras musculares.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el establecimiento de becas universitarias para la creación de innovación en tecnología científica (JST, subvención nº JPMJFS2139 a T.H.) y subvenciones de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (KAKENHI 23H00457 otorgado a N.L.F., 20J12849 a Y.Mi., 24K22254 a Y. Ma). Este estudio también contó con el apoyo de la Subvención de Investigación Avanzada del Gobierno Metropolitano de Tokio [R2-2] para Y.Ma., N.L.F., y del fondo de investigación estratégica de la TMU para un proyecto de investigación innovador [R3] a N.L.F. Gracias a Yasuro Furuichi por sus consejos y comentarios útiles.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12Nombre del producto: Vetorphale inyección
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816Nombre del producto: Dorbene Inyección
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100Nombre del producto: Dormicum Inyección
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Equipment
Centrifuge tubes (25 mL)IWAKI2362-025
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Pasteur pipettesIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomicroscopeLeicaM165C
Sterilin dishes (100-mm)Thermo Scientific3020-100Referenciado como placa de Petri en el manuscrito
Antibodies for immunolabelling
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Antibodies for immunoblotting
HRP-conjugated Anti-mouse IgGCytivaNA9311:1000/ horseradish peroxidase
HRP-conjugated Anti-Rabbit IgGCytivaNA9341:1000/ horseradish peroxidase
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg coactivator 1 alpha
Mouse Anti-α-tubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Alpha tubulin
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochrome c oxidase IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glucose Transporter 4
Rabbit Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Nonmuscle Beta-actin

Referencias

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