Desarrollo de un modelo de fusión intersombódica caudal de rata: un estudio piloto de viabilidad

Resumen

Este estudio demostró la viabilidad técnica de un modelo piloto de fusión caudal intercorporal con rata usando fijación posterior de jaula y placa. El análisis histomorfométrico a las 12 semanas confirmó un puente óseo continuo y patrones de maduración ósea intra-jaula distintos. Este modelo técnico sirve como base preliminar para futuros estudios a gran escala.

Resumen

Las vértebras caudales de rata se utilizan ampliamente en la investigación sobre regeneración ósea y fusión espinal como lugares convenientes para analizar materiales de injertos óseos e implantes. Los modelos previos de fusión de cola de rata han logrado la fusión intervertebral mediante la extracción de discos y el injerto óseo, o con dispositivos de fijación externos. No obstante, no se ha desarrollado ningún modelo de animales pequeños que utilice una jaula de fusión intersomática análoga a la que se utiliza clínicamente. Se hipotetizó que un entorno de fusión ósea evaluable podría establecerse sin complicaciones neurológicas realizando una inserción posterior de jaula que imita procedimientos clínicos, complementados con fijación de placas, en las vértebras caudales de la rata. Este estudio piloto preliminar (n = 1) fue diseñado para evaluar la viabilidad técnica. Se desarrolló un enfoque quirúrgico en el que se insertaba con precisión una jaula miniaturizada de titanio en el espacio del disco resecado entre las vértebras caudales adyacentes, reflejando de cerca el procedimiento quirúrgico humano. El titanio fue seleccionado para la jaula debido a su amplio uso clínico y su biocompatibilidad. Los resultados iniciales demostraron la viabilidad técnica de este enfoque. La jaula implantada mantuvo la altura del disco y la alineación de la columna. Se observó un crecimiento óseo progresivo a través de la jaula, que culminó en un puente óseo continuo confirmado a través del espacio intervertebral a las 12 semanas postoperatorias. Se confirmó radiológica e histológicamente la presencia de estructura trabecular continua y la ausencia de tejido fibroso intermedio. En conjunto, este modelo de fusión de cola de rata basado en jaula proporciona una plataforma prometedora para evaluar biomateriales novedosos e investigar los mecanismos de fusión ósea intervertebral. Sin embargo, la falta de un grupo de control y de un análisis estadístico, debido al diseño de sujeto único, limita la generalizabilidad de estos hallazgos y requiere una validación adicional.

Introducción

La fusión intersomática es un tratamiento quirúrgico establecido para diversas trastornos de la columna, incluyendo la inestabilidad, la espondilolistesis y las enfermedades degenerativas; Cabe destacar que ha evolucionado a lo largo de aproximadamente 70 años como un procedimiento estándar ^1,2. El procedimiento consiste en extraer el disco intervertebral e insertar una jaula o injerto óseo para promover la fusión sólida entre vértebras^{adyacentes 3,4}. Además, añadir instrumentación posterior con jaulas reduce las tasas de pseudartrosis y amplía sus indicaciones^{clínicas 5}. No obstante, complicaciones como la pseudoartrosis y el hundimiento en jaula siguen siendo desafíos clínicos significativos, lo que requiere el desarrollo fiable de modelos preclínicos para evaluar nuevos materiales y factores promotores^{de fusión 6,7}.

Las ratas se han utilizado ampliamente en la investigación de fusión espinal debido a su viabilidad económica, rápida reproducción, cicatrización rápida y facilidad de manejo ^8,9. No obstante, los modelos actuales de fusión intersoplana con ratas presentan limitaciones significativas. Específicamente, el enfoque de fusión intersomática lombar anterior (ALIF) en ratas requiere manipulación importante de vasos y órganos abdominales, lo que resulta en una alta invasividad quirúrgica y riesgos sustanciales de^{complicaciones 10,11}. El enfoque de fusión intersomática posterior lumbar (PLIF) implica un riesgo inevitable de lesión neurológica debido a los conductos espinales y elementos neuronales extremadamente pequeños, lo que hace que la retracción neural sea casi^imposible. En consecuencia, la mayoría de los estudios con ratas se han limitado a la fusión posterolateral (PLF), que estructuralmente no investiga los mecanismos de fusión ósea dentro de la jaula, un aspecto crítico en entornos^{clínicos 13}. Además, aunque existen modelos caudales, carecen de un sistema de evaluación que integre una jaula intersomática de tipo clínico con la fijación de placas posteriores.

La columna caudal de las ratas ofrece ventajas únicas en la investigación de fusión intercorporal. Los discos caudales muestran fuertes similitudes geométricas, compositivas y mecánicas con los discos lumbares humanos, lo que los hace cada vez más populares en la investigación de discos^14,15. Además, la cirugía de columna caudal proporciona un fácil acceso quirúrgico, rentabilidad y recuperación postoperatoria rápida en comparación con los enfoques^lumbares. Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha reportado una inserción exitosa en jaula posterior en la columna caudal de la rata con una evaluación histológica detallada de la formación ósea dentro y alrededor de la jaula.

La evaluación histológica, especialmente de la histomorfometría ósea no calcificada, sigue siendo el estándar de oro para evaluar la osseointegración y la fusión^{ósea 17,18}. Específicamente, permite el análisis cuantitativo de parámetros críticos de formación ósea, incluyendo el volumen óseo/volumen tisular (BV/TV), el número trabecular y el grosor trabecicular, al tiempo que permite una evaluación cualitativa de madurez ósea distinguiendo el tejido del hueso^{lamelar 19,20}. Una evaluación histomorfométrica tan detallada puede revelar los patrones de osteoconducción espacial y temporal dentro de la jaula y en las interfaces^{jaula-vértebra 21,22}. No obstante, falta una evaluación histomorfométrica exhaustiva de la osteoconducción en jaula en modelos de rata.

Este estudio tenía como objetivo desarrollar un modelo piloto de fusión caudal intersomática de rata utilizando inserción posterior en jaula y fijación suplementaria de placas para demostrar su viabilidad técnica. Este estudio presenta una técnica quirúrgica detallada y una evaluación histológica exhaustiva de la formación ósea dentro de la jaula y en las interfaces de las placas terminales vertebrales. Se hipotetizó que un entorno de fusión ósea evaluable podría establecerse sin complicaciones neurológicas realizando una inserción posterior de jaula que imita procedimientos clínicos, complementados con fijación de placas, en las vértebras caudales de la rata. Este modelo proporciona una plataforma eficiente para evaluar materiales de fusión intersoparte y, en la literatura existente, representa una exploración técnica inicial de la colocación exitosa de jaulas posteriores mediante evaluación osteoconductiva histomorfométrica en un modelo de rata.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de la Universidad de Jikei (número de aprobación 2023–034C1). Este estudio fue diseñado como un estudio piloto de viabilidad. Para evaluar la viabilidad técnica de esta inserción posterior altamente delicada y novedosa en la jaula posterior de la columna caudal de la rata antes de la validación a gran escala, se utilizó un solo animal (n = 1), según las directrices éticas, para minimizar el uso durante la evaluación técnica inicial. Se seleccionaron ratas macho de Sprague-Dawley (SD) como cepa estándar para la investigación sobre fusión espinal. Los criterios de inclusión fueron machos sanos de entre 8 y 10 semanas, con un peso entre 200 y 250 g, para asegurar que la altura del disco intervertebral (1,8–2,2 mm) sea compatible con la jaula de 2 mm. Se excluyeron los animales que mostraron > pérdida de peso del 10% durante el periodo de aclimatación, disminución de la actividad o deformidades visibles en la cola. Para este estudio, un macho de rata Sprague–Dawley (8 semanas, con un peso de 221,8 g; Japón SLC, Shizuoka, Japón) se utilizó. El animal se alojó en un entorno controlado a 25°C y con una humedad relativa del 50% (rango permitido 30–70%) con un ciclo de 12 horas luz/oscuridad, y se le proporcionó acceso ad libitum a agua y una dieta estándar para roedores. Las ratas se alojaban en jaulas de fondo sólido equipadas con materiales para anidar y palos para morder para enriquecer el medio ambiente. Se implementó un periodo de aclimatación de 3 días antes de la intervención quirúrgica. Para evitar que las parejas de jaula royeran los implantes de cola, la rata se mantuvo en condiciones de alojamiento individual durante todo el estudio, lo que fue un factor crítico en este diseño experimental.

Preparación de tornillos y placas

Se prepararon materiales internos de fijación antes del procedimiento quirúrgico. Los tornillos de acero inoxidable disponibles comercialmente (diámetro original: 1,2 mm, longitud: 14 mm) se cortaron a una longitud precisa de 6 mm usando un cortador de alambre (Figura 1A). Estos tornillos se esterilizaban mediante autoclave estándar a vapor a 121 °C durante 20 minutos. En una placa de fijación interna de polioximetileno (POM) (18 mm de longitud, 3 mm de ancho, 1 mm de grosor), se perforaron agujeros de tornillo con un diámetro de 1,2 mm a intervalos de 12 mm usando un taladro manual (Figura 1B–D). Posteriormente, las esquinas de las placas POM se redondearon con un alicate para minimizar la irritación en los tejidos blandos circundantes (Figura 1E). Las placas se esterilizaban utilizando gas de óxido de etileno (EtO) o plasma de gas peróxido de hidrógeno, dada la sensibilidad térmica del polímero. La jaula de titanio presenta una estructura de celosía interconectada con canales longitudinales que miden entre 300 y 500 μm de diámetro. Su superficie fue preparada utilizando tecnología lameladar de titanio 3D para lograr una rugosidad microsuperficial de 3–5 μm, lo que facilita el crecimiento óseo directo.

Anestesia y procedimiento quirúrgico

No se realizó ayuno preoperatorio para evitar un estrés metabólico innecesario. La anestesia se indujo mediante una mezcla triple de anestesia que consistía en medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (2 mg/kg) y butorfanol (2,5 mg/kg), que se administró mediante inyección subcutánea en el dorso con una aguja^{calibre 25 23}. Se evaluó el plano quirúrgico adecuado de anestesia cada 15 minutos confirmando la pérdida del reflejo de retirada del pedal (pellizco en el dedo), manteniendo las membranas mucosas rosadas y monitorizando la frecuencia respiratoria (70–110 respiraciones/min). Posteriormente se realizó el procedimiento quirúrgico para la fusión intermonóctica de las vértebras caudales. El animal fue colocado en posición prona (Figura 2A) y toda la cola fue desinfectada siguiendo un protocolo de tres rondas alternadas de fregado (70% etanol, fregado povidona-yodo y 70% etanol) para asegurar un campo estéril. Para identificar las vértebras objetivo, se realizó una palpación manual comenzando desde el sacro distalmente. La primera articulación móvil fue identificada como la unión sacro-Co1, y el segmento inmediatamente distal fue designado como Co2, definiendo el sitio objetivo CO2–Co3. Se realizó una incisión longitudinal de aproximadamente 2 cm en la parte dorsal, que abarca desde la segunda hasta la tercera vértebra caudal (Co2–Co3) (Figura 2B), para exponer la superficie posterior de cada vértebra. Durante la exposición, se tuvo cuidado para identificar y evitar daños en la vena caudal dorsal; Se utilizaron la disección contundente y la electrocauterización bipolar para tratar hemorragias leves. Para preparar el sitio de fusión, se incisó el anillo fibroso entre las vértebras de CO2 y Co3 con un bisturí (Figura 2C). El anillo fibroso y el núcleo pulposo se retiraron meticulosamente mediante cureteta utilizando una cureta y pequeñas pinzas (Figura 2D). Este paso se realizó bajo aumento quirúrgico de alta potencia (≥3,5x). La completitud de la extracción se definió objetivamente por la confirmación visual de sangrado puntuado (el signo de "placa terminal sangrienta") y la ausencia total de tejido blando residual. El daño inaceptable en la placa terminal se definió como erosiones profundas que implicaban > el 25% del área total o la penetración en el hueso esponjoso > 0,5 mm. Posteriormente, se insertó una jaula de titanio (2 × 2 mm de sección, 2 mm de altura) (Figura 2E) en profundidad en el espacio intervertebral hasta alcanzar un tope físico y confirmarse visualmente el contacto total con ambas placas terminales, creando un ajuste firme por interferencia (Figura 2F, 2G).

Fijación y cierre de heridas

Para facilitar la fijación de placas, la superficie ósea alrededor de los orificios designados en las vértebras de CO2 y CO3 se aplanó usando un router eléctrico de mano que operaba a 7.800 RPM, equipado con una mueva esférica de 2,0 mm (Figura 2H). Los agujeros óseos se perforaban individualmente a intervalos correspondientes a los agujeros de tornillo de la placa de fijación interna de plástico usando un taladro manual equipado con una broca de 1,2 mm de diámetro (Figura 2I). Luego se precargaban dos tornillos de acero inoxidable de 6 mm en los agujeros. de la placa de plástico (Figura 2J). Los tornillos se insertaban en un ángulo de 90° a una profundidad estandarizada de 5 mm con un espaciado centro a centro de 12 mm (Figura 2K). Finalmente, la incisión cutánea se cerró con suturas de nailon 4-0 y la cola fue desinfectada de nuevo con etanol al 70% para completar el procedimiento.

Manejo postoperatorio y eutanasia

Durante la fase de recuperación inmediata (Día 0), el animal fue monitorizado cada 15 minutos y se mantuvo la temperatura rectal hasta alcanzar la reclinación esternal completa y una caminación intencionada. Para la evaluación a largo plazo (Semanas 1–12), se implementó un sistema diario de puntuación basado en la Puntuación de Condición Corporal (BCS), el estado de peluquería y la actividad general, junto con el seguimiento diario del sitio quirúrgico para detectar infección o dehiscencia. Durante las primeras 48 horas se proporcionó comida húmeda en el suelo de la jaula. El peso corporal se medía semanalmente. Los criterios humanos para la eutanasia temprana se definieron estrictamente como: pérdida de peso ≥20%, BCS ≤2,0, incapacidad persistente para alcanzar comida/agua > 12 horas, signos de dolor/dispnea severa o complicaciones graves en el sitio quirúrgico (por ejemplo, necrosis). Los animales que cumplían estos criterios eran sacrificados humanamente en un plazo de 24 horas. La atención postoperatoria incluyó la administración de cefalexina (15 mg/kg) por vía intramuscular inmediatamente después de la cirugía y a las 24 horas postoperatorias para prevenir infecciones. Para la analgesia, se administró carprofeno (2 mg/kg) por vía subcutánea inmediatamente después de la cirugía y a las 12, 24 y 48 horas postoperatorias, para un total de cuatro dosis. A las 12 semanas tras la implantación, la rata fue sacrificada mediante una sobredosis de isoflurano. El segmento de la segunda a la tercera vértebra caudal se extrajo en bloque y se fijó en un 70% de etanol.

Recomendaciones de formación, resolución de problemas y tamaño de muestra. Para facilitar la adopción exitosa de este exigente protocolo, los nuevos operadores deben realizar de 3 a 5 procedimientos de práctica en cadáveres de rata, alcanzando la competencia cuando tres colocaciones consecutivas no muestran mala posición radiográfica. Las soluciones habituales incluyen medir previamente la altura del disco mediante rayos X para optimizar la selección del tamaño de la jaula y volver a verificar la planitud del hueso dorsal para evitar la migración de la jaula. Si la compra de tornillos es insuficiente, se recomienda utilizar velocidades de taladro más bajas. Para futuros estudios de validación, se recomienda un tamaño mínimo de muestra de n = 6 a 10 por grupo (con un 10–20% adicional por la rotación) para alcanzar suficiente potencia estadística. Además, los estudios futuros deben incorporar grupos de control (por ejemplo, jaula vacía o autoinjerto) para validar el rendimiento del biomaterial.

Análisis radiográfico e histológico

Se realizaron tomografías microcomputarizadas (TC) y radiografía digital utilizando un sistema de micro-TC con un voltaje de tubo de 80 kV y una corriente de 0,1 mA. Durante la adquisición se utilizó un filtro de aluminio de 1,0 mm de grosor para minimizar artefactos de endurecimiento por haz causados por el implante de titanio. Para la evaluación longitudinal, se realizó imagen in vivo a 1 y 4 semanas postoperatorias con un tamaño de vóxel de 120 μm. La imagen ex vivo se realizó a las 12 semanas postoperatorias utilizando un soporte para muestras de 24 mm con un tamaño vóxel de 24 μm. Los datos de TC e imágenes radiográficas se reconstruyeron utilizando un algoritmo estándar de retroproyección filtrado y se analizaron con un visor DICOM. Se definieron criterios cuantitativos para evaluar la unión ósea. Radiológicamente, la fusión exitosa se confirmó cuando se observó una estructura trabecular continua que conecta las placas terminales vertebrales craneal y caudal en al menos tres cortes consecutivos en la micro-TC. Durante la segmentación de imagen se aplicó un umbral global de 700 Unidades de Hounsfield (HU). Histomorfométricamente, se consideró que una proporción BV/TV del 70% o más dentro de la jaula fue el umbral para el cumplimiento y fusión espacial física. Histológicamente, la unión ósea se definió por un puente óseo completo desde el lado craneal al caudal sin la interposición de tejido fibroso. Para el análisis histológico, se realizó marcaje secuencial con fluorocromo mediante inyección subcutánea de calceína (8 mg/kg) dos días antes de la eutanasia para identificar la distribución espacial de la mineralización activa en el punto final de 12 semanas. Las vértebras caudales extirpadas se fijaron en etanol al 70% durante 7 días y se teñieron en bloque con tinte ósea de Villanueva. Los ejemplares fueron deshidratados mediante grados ascendentes de etanol, incrustados en resina metacrilato de metilo, y seccionados a mitad de sagital en el centro geométrico preciso de la jaula, según la guía Micro-CT de pre-sección, utilizando un microtomo de sierra de diamante. Se prepararon muestras de suelo no calcificadas (de 5 μm de espesor) en el Instituto de Histomorfometría Ósea de Ito (Niigata, Japón). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de campo claro y un microscopio láser confocal para la fusión de fluorescencia. Se realizó un examen adicional bajo un microscopio de luz polarizada y el análisis histomorfométrico se realizó utilizando un analizador de imágenes computarizado. La Región de Interés (ROI) se definió como el volumen interno total de la jaula, excluyendo los puntales metálicos, y se subdividió en ROI intrajaula craneal y caudal intracage. El tejido óseo fue identificado por su color púrpura/magenta bajo la tinción de Villanueva. El hueso lamelar (Lm.V) se definía por su estructura altamente organizada y paralela bajo luz polarizada, mientras que el hueso tejido (Wo.V) mostraba patrones de fibras desorganizados.

Resultados

Peso corporal (Tabla 1)

El peso corporal se midió hasta 12 semanas después de la operación, demostrando un aumento constante (de 221,8 g a 346,8 g), indicando homeostasis fisiológica y apoyando indirectamente la ausencia de un malestar crónico severo. Esto se corroboró mediante evaluaciones multimodales diarias que confirmaron la actividad normal y la cicatrización sencilla de la herida.

Herida (Figura 3

Discusión

Aquí se estableció un modelo novedoso de fusión intercorporal de la columna caudal de la rata. Este modelo consiste en insertar una jaula de titanio mediante un enfoque posterior aumentado con fijación por placa y tornillo. Posteriormente, se evaluó la formación ósea intrajaula mediante análisis histomorfométricos detallados. Las características distintivas de este modelo son tres: 1) imita estrechamente los procedimientos clínicos de fusión intersomal lumbar posterior o transforaminal c...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4-0 nylon sutures	Natsume	ER-25-30N2
Microscopio de campo brillante	Keyence. (Osaka, Japón)	BZ-X800
Butorfanol	FUJIFILM	021-19001
Calceína	FUJIFILM	76082
Carprofeno	FUJIFILM	037-19761
Cefalexina	FUJIFILM	036-11051
Analizador de imágenes computarizado	System Supply Co. (Nagano, Japón)	Histometry RT CSS-840
Microscopio confocal de barrido láser para fusión de fluorescencia	Carl Zeiss. (Jena, Alemania)	LSM 980
Cureta	Natsume	E-8-00
Microtomo de sierra de diamante	Leica. (Wetzlar, Alemania)	SP1600
Taladro eléctrico	TAMIYA	N/A	https://www.amazon.co.jp /%E3%82%BF%E3%83% 9F%E3%83%A4-%E3% 82%AC%E3%83%A9% E3%83%95%E3%83% 88%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%A3% E3%82%B7%E3%83% AA%E3%83%AB%E3% 82%BA-No-42-%E9%9B %BB%E5%8B%95%E3% 83%8F%E3%83%B3%E3 %83%87%E3%82%A1%E3 %83%AB%E7%94%A8/dp/B 01LZ05WWY/ref=sr_1_2?ad grpid=54785347873&dib=eyJ 2IjoiMSJ9.f61YHQv80N0nxws VOdlrIFtTsQoJICvSb4t4rVt97 FEBWkOo4ilX5O2lZH-5vADU HT9CRXO308QpVFqdBNli0C osd4iBSfSzEcKxP9HMX4DhiI S-Qko5ix33W7FjPQqpgTWbj3 CV_vBytnvfqvSyoGN9IB8445o 5Kc0pjeKPG-SRR3Ixpqr2-FT_ ZgUyWstoyQVFTcv_Rq_K4-E OWnuT41BBYtBh757EOAoBe z2lkCd6Psz99wZxfUuvzRUAH Ecq9QV6EmiT9LAY8dYYq08k aLt7Klqx2k-MdV8XbWRxgKk. 7TWzXBGA1PeNmB4me_Cz4 mMFAKBAv5H3YXAw_HPuLd E&dib_tag=se&hvadid=651687 588880&hvdev=c&hvexpln=0& hvlocphy=1009309&hvnetw=g& hvocijid=5538300633798619650 --&hvqmt=e&hvrand=55383006 33798619650&hvtargid=kwd-33 4267191534&hydadcr=4289_13 319726&jp-ad-ap=0&keywords= %E3%82%AF%E3%83%AB%E3% %83%BC%E3%83%90%E3%83% %83%A9%E3%83%90%E3% %83%83%E3%83%A0%E3% 83%87%E3%83%A9%E3% %83%BC%E3%83%87%E3% %83%AB&mcid=6b8ff8c984ba3d45 be477b407ef2d1ba&qid=1767395 580&sr=8-2
Taladro manual	VEAGIA	N/A	https://www.amazon.co.jp/dp/B0D2 9B4W18/ref=sspa_dk_detail_5?pd _rd_i=B0D29B4W18&pd_rd_w=xe kNz&content-id=amzn1.sym.f293b e60-50b7-49bc-95e8-931faf86ed1e &pf_rd_p=f293be60-50b7-49bc-95e8 -931faf86ed1e&pf_rd_r=HPW6B367R QC0VPB7WTTS&pd_rd_wg=E8mAS &pd_rd_r=dbeb0aa7-1bea-4f40-99dd -38bcb05c8234&sp_csd=d2lkZ2V0T mFtZT1zcF9kZXRhaWw&th=1
Medetomidina	FUJIFILM	135-17473
Midazolam	FUJIFILM	135-13791
Pinza de banco	ANEX	N/A	https://www.amazon.co.jp/%E3%82% A2%E3%83%8D%E3%83%83%E3% 82%AF%E3%82%B9-ANEX-%E3% 83%A9%E3%83%90%E3%83%BA %E3%82%B0%E3%83%A9%E3% 83%83%E3%83%97-%E3%83%94 %E3%83%B3%E3%83%90%E3% 82%A4%E3%82%B9%E5%8F%