Evaluación de crecimiento no detectable basada en cultivos y perfilado antioxidante del extracto fresco de gel de aloe vera

Resumen

Este protocolo describe la preparación aséptica del extracto fresco de gel interno de Aloe vera, la medición potenciométrica del pH, la evaluación total de la capacidad antioxidante mediante un ensayo colorimétrico automatizado basado en ABTS, la evaluación de crecimiento no detectable basada en cultivo bajo condiciones de incubación definidas y el cribado preliminar antimicrobiano de un Aloe vera 70:30 (v/v).Mezcla de prueba de /N-acetil-L-cisteína por difusión de disco y dilución cualitativa en tubos dobles.

Resumen

El aloe vera (Aloe barbadensis Miller) se utiliza ampliamente en productos de medicina tópica y complementaria. Sin embargo, los flujos de trabajo estandarizados de laboratorio para la evaluación simultánea de la capacidad antioxidante total (TAC), el comportamiento del pH, el estado de crecimiento no detectable basado en cultivos bajo condiciones definidas y el cribado antimicrobiano preliminar siguen siendo limitados. El extracto fresco de gel interno de aloe vera se preparó asépticamente y se formuló con 5%, 10%, 15% y 20% (p/v). El pH se midió potenciométricamente y el TAC se determinó mediante un ensayo colorimétrico automatizado basado en cationes de radicales ABTS. Se realizó una evaluación de crecimiento no detectable basada en cultivo inoculando el extracto sobre ágar de sangre, agar azul de metilena eosina y agar de Sabouraud dextrosa, seguida de incubación aeróbica e inspección visual a las 24 horas, 48 horas y 72 horas. Se realizó un cribado antimicrobiano de una mezcla de prueba 70:30 (v/ v) de Aloe vera/N-acetil-L-cisteína contra cepas de referencia estándar mediante difusión de discos y ensayos cualitativos de dilución en tubos dobles. TAC difería significativamente entre grupos (Kruskal-Wallis, p = 0,014), con los valores más altos observados en la formulación del 20%. No se observó crecimiento bacteriano o fúngico visible bajo las condiciones de cultivo analizadas durante el periodo de observación de 72 horas. La mezcla de prueba de Aloe vera/N-acetil-L-cisteína produjo zonas de inhibición que oscilaban entre 11 mm y 17 mm, siendo la zona más grande observada contra Pseudomonas aeruginosa. Este flujo de trabajo proporciona un enfoque práctico de laboratorio para preparar y caracterizar preliminarmente el Aloe vera fresco.formulaciones basadas en la investigación en medicina complementaria en fase temprana.

Introducción

El aloe vera ha seguido atrayendo una considerable atención científica debido a su uso prolongado en la medicina tradicional y su creciente relevancia en la investigación farmacéutica, biomédica, cosmética y^{alimentaria 1,2,3}. Esta planta medicinal contiene una amplia variedad de componentes biológicamente activos, incluyendo polisacáridos, compuestos fenólicos, antraquinonas, vitaminas, minerales, enzimas y otros metabolitos de bajo peso molecular que pueden contribuir a sus propiedades terapéuticas y ^{funcionales 1,2,3}. Entre estos componentes, el acemanano ha sido destacado debido a su potencial biomaterial y a sus roles reportados en la reparación tisular, inmunomodulación y aplicaciones^{regenerativas 4,5}. Paralelamente, los compuestos fenólicos y otros antioxidantes activos se han asociado con los efectos de eliminación de radicales libres, protectores y biológicamente de apoyo del Aloe vera. Preparaciones ^2,3.

En los últimos años se ha visto un interés creciente en la incorporación del aloe vera en sistemas avanzados de formulación y materiales bioactivos. Se han investigado hidrogeles basados en aloe vera, tintas biomateriales, nanocompuestos y andamios impresos en tres dimensiones para aplicaciones de cicatrización de heridas y soporte tisular debido a su alta capacidad de hidratación, biocompatibilidad y propiedades biológicas^{multifuncionales} 4,6,8,9,10,11. Estudios experimentales han demostrado que los materiales que contienen aloe vera pueden apoyar el manejo de la herida contribuyendo a un ambiente húmedo, mejorando las propiedades fisicoquímicas de la formulación y proporcionando apoyo antioxidante o antimicrobiano bajo condiciones seleccionadas in vitro, in vivo y dependientes de^{la formulación} 4,7,8,9,10,11. Además, se ha explorado el aloe vera en aplicaciones de conservación y formulación de alimentos, donde los recubrimientos a base de gel y sistemas relacionados se han asociado con una mayor estabilidad oxidativa, mejor calidad sensorial y un mejor rendimiento^{microbiológico 12,13}. Estos avances indican que el Aloe vera se considera cada vez más no solo como un producto herbal tradicional, sino también como un material natural multifuncional con un amplio potencial orientado a la^formulación 2,3,12,13.

La relevancia biológica del aloe vera también se extiende a aplicaciones de orientación antimicrobiana y microbiológica. Estudios recientes han descrito efectos inhibitorios de Aloe vera o preparados que contienen Aloe vera contra microorganismos clínicamente importantes, incluyendo Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis, especies de Candida y aislados clínicos de infecciones de^{heridas 14,15,16,17}. La evidencia in vitro anterior también ha mostrado actividad de Aloe vera en gel interno contra cepas de referencia y aislados clínicos de Helicobacter ^{pylori 18}. Además, se ha reportado que sistemas híbridos que contienen Aloe vera exhiben capacidades combinadas de antimicrobianos, antioxidantes y cicatrización de heridas, lo que respalda aún más la naturaleza multifuncional de este material derivado de la planta¹⁹. Sin embargo, el rendimiento biológico del Aloe vera está influenciado por varias variables metodológicas, incluyendo la fracción vegetal utilizada, el procedimiento de extracción, la concentración, las condiciones de manipulación, la frescura del gel y si la preparación probada contiene solo gel interno o contiene componentes asociados al^{látex 2,20}. Estos factores son especialmente importantes porque las fracciones del gel interno y de las hojas externas difieren tanto en composición como en perfil^{toxicológico 20}.

A pesar del creciente cuerpo de literatura, persisten importantes lagunas metodológicas. En muchos estudios publicados, el comportamiento antioxidante, las propiedades fisicoquímicas, la evaluación microbiológica y el rendimiento antimicrobiano suelen evalúarse por separado en lugar de dentro de un único flujo de trabajo integrado. Sin embargo, para la investigación centrada en la formulación, estos parámetros están estrechamente interrelacionados. Una preparación puede mostrar una actividad antioxidante favorable pero aun así requerir una cuidadosa evaluación microbiológica y caracterización fisicoquímica antes de considerarse adecuada para un desarrollo experimental posterior. Por lo tanto, los flujos de trabajo de laboratorio que combinen evaluación relacionada con redox, evaluación del pH, pruebas de crecimiento no detectable basadas en cultivos bajo condiciones definidas y cribado antimicrobiano preliminar pueden proporcionar una base más práctica e informativa para la caracterización en fase inicial de formulaciones frescas de Aloe vera .

En consecuencia, este estudio tuvo como objetivo evaluar formulaciones frescas de extractos de Aloe vera en gel interno preparadas a diferentes concentraciones en cuanto a características de pH, capacidad antioxidante total, estado de crecimiento no detectable basado en cultivo bajo condiciones de laboratorio definidas y cribado antimicrobiano preliminar mediante difusión en disco y dilución cualitativa en tubos dobles. Al integrar estas evaluaciones en un único flujo de trabajo experimental, el estudio se diseñó para proporcionar un enfoque de referencia práctico para la caracterización preliminar del Aloe vera.formulaciones basadas en la investigación en medicina complementaria.

Protocolo

1. Preparación de Aloe vera. Extracto y serie de dilución

1. Cosecha las hojas maduras de una planta de aloe vera cultivada a temperatura ambiente y enjuágalas bien bajo agua corriente para eliminar cualquier residuo.
2. En un armario de bioseguridad nivel 2 (BSL-2), desinfecta la superficie de las hojas con etanol al 70% usando guantes estériles. Después de aplicar un 70% de etanol, deja que la superficie de la hoja se seque completamente al aire durante al menos 2 minutos antes de la incisión aséptica.
3. Con un bisturí estéril, retira la punta y los bordes distales de la hoja, deja que el exudado amarillo de látex drene completamente durante aproximadamente 30 minutos y luego filetea la hoja longitudinalmente. Separa cuidadosamente y recoge solo el gel interior transparente, evitando la cáscara exterior y la capa residual de látex.
4. Transfiere cuidadosamente el gel interno de Aloe vera a un recipiente estéril y homogeneize mediante vórtices intermitentes durante aproximadamente 5-10 minutos a aproximadamente 2.500 rpm (o un vórtice equivalente medio-alto); realizar el procedimiento a temperatura ambiente salvo que sea necesario un control de temperatura para el instrumento específico.
5. En condiciones asépticas, preparar formulaciones frescas de extracto de Aloe vera en gel interno al 5%, 10%, 15% y 20% (p/v) utilizando agua destilada estéril; por ejemplo, preparar un 5% (p/v) como gel de 5 g llevado a un volumen final de 100 mL, y ajustar las concentraciones restantes de forma análoga.

2. Medición del pH

1. Realizar la calibración de medidores de pH de tres puntos utilizando soluciones tampón estándar de pH 4.01, 7.00 y 10.01 con trazabilidad NIST antes de cada serie de mediciones.
2. Medir el pH de cada concentración a temperatura ambiente (20–25 °C); Registrar al menos tres réplicas técnicas por concentración.

3. Medición de la capacidad total de antioxidantes (TAC)

1. Utiliza las formulaciones de extracto de Aloe vera preparadas en el Paso 1 (5%, 10%, 15% y 20%) para la medición del TAC.
2. Lleva todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente (20–25 °C) antes del análisis para asegurar la consistencia analítica.
3. Calibrar el analizador bioquímico automatizado (Rel Assay, Turquía) según los procedimientos operativos estándar del fabricante antes de iniciar el ensayo.
4. Carga los reactivos de capacidad antioxidante total (TAC) basados en el método Erel en los compartimentos de los reactivos del analizador.
5. Pipete el Aloe vera. Extrae muestras en los vasos o pozos de reacción adecuados utilizando micropipetas calibradas. (Volumen de muestra: 5 μL)
6. Inicia la ejecución del ensayo TAC usando el protocolo programado del analizador para el método basado en cationes radicales ABTS, siguiendo los volúmenes de reactivos y los ajustes de incubación especificados por el fabricante.
7. Permite que la reacción avance automáticamente, durante la cual los antioxidantes presentes en la muestra reducen el catión radical ABTS coloreado, lo que resulta en una disminución de la absorbancia.
8. Mide el cambio en la absorbancia espectrofotométricamente a la longitud de onda especificada definida por el método TAC. (Longitud de onda: 660 nm)
9. Calcula los valores de capacidad total de antioxidantes utilizando el software del analizador comparando los cambios en la absorbancia de la muestra con la curva de calibración equivalente a Trolox.
10. Expresa los resultados del TAC como equivalentes de mmol Trolox / L por unidad de volumen de extracto.
11. Realizar todas las mediciones en duplicado para garantizar la fiabilidad analítica.

4. Evaluación de crecimiento no detectable basada en cultivo de Aloe vera. Gel interno

1. Inocular 10 μL de cada extracto sobre ágar de sangre, agar azul de metileno de eosina y agar de dextrosa Sabouraud usando un lazo calibrado (10 μL) (método de recuento de colonias).
2. Para una evaluación de crecimiento no detectable basada en cultivos, se dispensa asépticamente una alitería estandarizada de 50 μL usando una micropipeta calibrada sobre placas de agar sanguíneo, agaro de azul de metileno eosina y placas de agar de dextrosa Sabouraud, y extiéndela suavemente usando un lazo estéril desechable (10 μL) (evaluación de reproducción basada en cultivo mediante el método de goteo directo).
3. Incubar las placas de agar sanguíneo y de azul de metileno eosina aeróbicamente a 37 °C y placas de agar de dextrosa Sabouraud aeróbicamente a 25–28 °C, luego inspeccionar visualmente las placas para detectar crecimiento a las 24, 48 y 72 horas. Incubar una placa no inoculada de cada medio en paralelo como control negativo.

5. Evaluación de la actividad antimicrobiana de la mezcla de prueba de Aloe vera

1. En condiciones estériles, preparar una solución de prueba homogénea mezclando extracto de gel interno de Aloe vera al 70% con solución de N-acetil-L-cisteína al 30% (10% p/v en agua estéril).
   NOTA: Esta mezcla reduce la alta viscosidad del gel extraído de la hoja y obtiene una consistencia más fluida. Considera esta formulación compuesta como una mezcla preliminar de cribado. Por lo tanto, interpreta los hallazgos antimicrobianos para reflejar la actividad combinada de ambos componentes.
2. Pulveriza la mezcla homogeneizada a fondo hasta obtener una solución uniforme.
3. Subcultivo de las existencias bacterianas estándar previamente criopreservadas de Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Escherichia coli. ATCC 25922, almacenado a -80 °C, sobre agar sanguíneo estándar (para bacterias Gram positivas) y agar estándar de eosina y azul de metileno (para bacterias Gram negativas), e incubar a 37 °C durante 18-24 horas.
4. Al final de la incubación, preparar suspensiones bacterianas ajustadas a 0,5 de turbidez McFarland usando solución salina estéril de las colonias cultivadas, siguiendo las recomendaciones estándar de preparación de inoculos para la prueba de susceptibilidad^{antimicrobiana 38}.
5. Inocular uniformemente las placas de agar Mueller-Hinton con cada suspensión bacteriana estandarizada utilizando un hisopo estéril.
6. Aplicar un volumen estandarizado de 15 μL de la mezcla estéril de prueba Aloe vera/NAC sobre cada disco antimicrobiano estéril de 6 mm utilizando una micropipeta calibrada. Se aplicó el mismo volumen de carga, tiempo de absorción (al menos 2 minutos) y tiempo de secado al aire (aproximadamente 5 minutos) a todos los discos entre réplicas para garantizar la consistencia del procedimiento. Este volumen se seleccionó como una cantidad práctica de carga para discos de 6 mm en el cribado de difusión de discos basado en extracto vegetal y se mantuvo constante en todos los experimentos.
7. Coloca los discos impregnados con extracto sobre la superficie de las placas de agar inoculadas usando pinzas estériles.
8. Incubar las placas a 37 °C durante 18–24 horas en condiciones aeróbicas.
9. Tras la incubación, mide manualmente el diámetro de cada zona de inhibición, incluido el diámetro del disco, hasta el milímetro más cercano usando una regla. Realizar el experimento como una única medición descriptiva, informando los diámetros de las zonas registradas como valores observados individualmente. Realizar mediciones inspeccionando visualmente las placas según las recomendaciones estándar de lectura de difusión^{de discos 38}.
10. Preparar diluciones en serie dobles (1/2, 1/4, 1/8 y 1/16) de la mezcla de prueba 70:30 (v/v) de Aloe vera/NAC en caldo Mueller-Hinton.
11. Inocular cada tubo con 500 μL de la correspondiente suspensión bacteriana estandarizada de 0,5 McFarland preparada en solución salina estéril. Preparar una serie de dilución separada para cada cepa de referencia e incubar los tubos inoculados bajo las condiciones especificadas a continuación.
12. Incubar los tubos inoculados a 37 °C durante 18–24 horas.
13. Evaluar el crecimiento microbiano visualmente por turbidez en relación con el caldo controlado; interpretar el ensayo de forma cualitativa en lugar de como una determinación formal de CIM.
14. Utiliza un disco de ciprofloxacina (5 μg) como control positivo en paralelo con discos impregnados de aloe vera/NAC. Aplicar el mismo disco de control positivo para Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Escherichia coli ATCC 25922 para confirmar la susceptibilidad bajo condiciones de difusión del disco.
    NOTA: Realizar todos los procedimientos microbiológicos bajo condiciones BSL-2 y registrar todas las observaciones de diámetro de zona y turbidez inmediatamente después de la incubación para su posterior análisis descriptivo. Este protocolo combina la preparación aséptica de A. vera.extraer con ensayos bioquímicos y microbiológicos complementarios para apoyar el desarrollo de formulaciones de origen vegetal para uso en medicina tópica y complementaria. El flujo de trabajo está diseñado para ser práctico en laboratorios rutinarios: el cribado de pH y redox (TAC) puede realizarse junto con el cultivo de esterilidad y dos ensayos antimicrobianos comúnmente utilizados (difusión de disco y dilución en tubo).

Resultados

valores de pH del extracto de aloe vera en diferentes concentraciones

El perfil de pH mostró un patrón no monótono entre concentraciones. Los valores medios de pH fueron 6,47, 6,60, 6,26 y 6,28 para las formulaciones del 5%, 10%, 15% y 20%, respectivamente. Las diferencias generales entre grupos fueron significativas (p = 0,024). Las formulaciones del 5% y 10% mostraron valores de pH relativamente altos, mientras que las del 15% y 20%...

Discusión

El presente estudio ofrece un flujo de trabajo integrado de laboratorio para la caracterización preliminar de formulaciones frescas de extracto de Aloe vera en gel interno, combinando la medición del pH, el análisis de la capacidad antioxidante total (TAC), la evaluación de crecimiento no detectable basada en cultivos y el cribado descriptivo antimicrobiano. El aumento de las concentraciones de Aloe vera en gel interno fresco se asoció con valores más altos de TAC, mien...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(-)80 C Deep Freezer	Thermofisher/USA	Almacenamiento de muestras	TSX40086A
Vortex	Thermofisher/USA	Preparación de muestras	88882010
Blood Agar	RTA/Turkey	Inoculación de cultivo	2001
Eosine Methilene Blue Agar	RTA/Turkey	Inoculación de cultivo	2010
SDA Agar	RTA/Turkey	Inoculación de cultivo	2036
Müller Hinton Agar	RTA/Turkey	Inoculación de cultivo	2022
Müller Hinton Broth	RTA/Turkey	Dilución de cultivo	1018
Pipetas	Thermofisher/USA	Preparación de muestras	4642090N
Hanna pH Meters	Hitachi/JAPAN	Análisis de muestras	HI2211-02
Rel Assay Plate Reader	Rel Assay(Turkey)	Análisis de TAC de muestras	M201 (Smart Model)
TAC Kits	Rel Assay(Turkey)	Kit	RL0017