Este protocolo presenta una técnica simplificada de anastosis de sutura extremo a lado para el trasplante de corazón cervical murino, proporcionando un modelo robusto y reproducible para estudiar la inmunología de trasplantes.
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Artículo de método
Trasplante cardíaco heterotópico de ratón cervical utilizando la técnica de anastomosis de extremo a lado para estudiar la inmunología del trasplante
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
El trasplante de corazón heterotópico murino es un modelo preclínico fundamental en la investigación en trasplantes. El trasplante de corazón heterotópico cervical en ratones ofrece ventajas claras, incluyendo un seguimiento visual directo y palpable de la viabilidad del injerto, reducción del trauma quirúrgico y una recuperación postoperatoria más rápida. Por ello, se ha convertido en una plataforma cada vez más valiosa para estudiar la inmunología de trasplantes, especialmente para animales con malas condiciones fisiológicas debidas a modificaciones genéticas o inducción de fármacos, y para experimentos que requieren trasplante secundario o combinado de órganos, la región cervical a menudo se convierte en el único sitio factible. Las técnicas convencionales de trasplante cervical, ya sea mediante sutura extremo a extremo o métodos basados en manguito, requieren una ligadura permanente de la arteria carótida común y la vena yugular externa del receptor, lo que puede comprometer la perfusión cerebral e introducir materiales extraños o alteraciones hemodinámicas. Para abordar estas limitaciones, este artículo detalla una técnica refinada de trasplante de corazón cervical utilizando una anastomosis vascular de extremo a lado. El método preserva la arteria carótida común y la vena yugular externa del receptor, manteniendo una perfusión cerebral normal y evitando complicaciones asociadas a la ligadura permanente de los vasos. Este protocolo detalla los pasos desde la extracción de corazón con donante hasta la anastomosis del receptor y el cuidado postoperatorio. Los resultados representativos demuestran una alta tasa de éxito quirúrgico (96,7%) y la eficacia del modelo en el estudio del rechazo de aloinjertos. Esta técnica ofrece un modelo fisiológicamente relevante y técnicamente accesible para los investigadores en inmunología de trasplantes.
Introducción
Durante el último medio siglo, la inmunología de trasplantes ha seguido siendo un foco central para inmunólogos y especialistas en trasplantes. Hoy en día, el trasplante de órganos sólidos se realiza ampliamente y representa el tratamiento más eficaz para las enfermedades de órganos en fase terminal. Sin embargo, el rechazo de injertos no se ha resuelto fundamentalmente y sigue representando uno de los principales obstáculos en el trasplante y una de las principales causas de pérdidade injerto 1. En consecuencia, superar o mitigar el rechazo mientras se reduce o evita la inmunosupresión sistémica sigue siendo un desafío importante y un objetivo clave de investigación en el campo.
Los modelos vascularizados de trasplante de órganos animales, especialmente los murinos, han desempeñado un papel crucial en el avance de la inmunología del trasplante y han proporcionado una base científica esencial para la traducciónclínica 2. Por ejemplo, muchos agentes inmunosupresores utilizados clínicamente hoy en día —como la ciclosporina, el tacrolimus y la rapamicina— fueron validados con éxito por primera vez en modelos de trasplantemurino 3,4.
El modelo de trasplante cardíaco heterotópico (TH) en ratón es uno de los modelos preclínicos más utilizados, favorecido por la abundancia de cepas genéticas disponibles y reactivos de investigación, así como por su procedimiento relativamente sencillo y su fácil monitorización postoperatoria. Como tal, sirve como una plataforma clave para estudiar los mecanismos de rechazo agudo, inducir tolerancia inmunitaria y evaluar nuevos inmunosupresores in vivo 5,6.
El primer modelo HT heterotópico murino fue establecido por Corry et al.7 en 1973. En este modelo, el corazón donante se coloca en la cavidad abdominal del receptor, con la aorta del injerto y la arteria pulmonar (PA) anastomosadas de extremo a lado a la aorta abdominal y la vena cava inferior (VIC) del receptor, respectivamente. Este método se mantuvo como la técnica estándar para la TH abdominal durante décadas. Impulsado por la necesidad de acomodar aloinjertos de terceros en estudios de tolerancia, se exploró un segundo sitio para la HT. Esto llevó al desarrollo de modelos de TH cervical en ratones, que ofrecen otras ventajas como la evaluación visual directa de la viabilidad del injerto, menor traumatismo quirúrgico y menor riesgo de infección postoperatoria 5,8,9. En 1991, Chen et al.8 describieron por primera vez un modelo de HT cervical heterotópico en ratones, que consistía en la anastomosis de sutura manual de extremo a extremo de la aorta donante y la PA a la arteria carótida común (CCA) y la vena yugular externa (EJV) del receptor, respectivamente. Sin embargo, este modelo no tuvo una adopción generalizada debido al importante desafío técnico que suponía la grave desadaptación entre la aorta donante y la ACC receptora, lo que dificultaba extremadamente la anastosis vascular.
También en 1991, Matsuura et al.9 introdujeron una técnica de manguito sin sutura para la anastomosis vascular en el modelo de HT cervical. Este método simplifica el procedimiento al eliminar la exigente sutura vascular manual técnica, facilitando su dominio. Posteriormente, se han reportado numerosas mejoras técnicas en la técnica del manguito10,11. Actualmente, el método del manguito se utiliza ampliamente en la TH cervical, especialmente por investigadores sin experiencia previa en suturas microvasculares. Sin embargo, la técnica del manguito introduce materiales artificiales, que pueden inducir inflamación local e interferir con las evaluaciones inmunológicas, además de plantear desafíos técnicos en vasos de pequeñocalibre 5,6. Recientemente, Liao et al.12 propusieron una técnica de manga sin manga en la TH cervical, en la que los vasos donantes y receptores son anastomizados directamente mediante un método de manga. Al evitar materiales artificiales y acomodar vasos pequeños, este enfoque ofrece una plataforma fisiológica y reproducible para el trasplante cardíaco secundario.
No obstante, tanto las técnicas de sutura extremo a extremo como las de manguito sin sutura requieren una ligadura permanente de la CCA y EJV unilaterales del receptor. Esto compromete el suministro unilateral de sangre cerebral al sistema nervioso central, lo que puede provocar complicaciones neurológicas, como trastorno direccional y hemiplejía 13,14,15. Además, estos enfoques de extremo a extremo pueden provocar alteraciones hemodinámicas, como los chorros arteriales de alta velocidad, y conllevar un mayor riesgo de trombosis y estenosis, que son perjudiciales para la supervivencia a largo plazo del injerto. Además, la técnica del manguito también conlleva un riesgo inherente de trombosis debido a la presencia del manguito.
Para abordar estas limitaciones, adoptamos una técnica refinada de sutura manual de extremo a lado donde la aorta ascendente y la PA del donante se anastomizan a la CCA y EJV del receptor, respectivamente. Este método preserva la integridad y continuidad de los principales vasos cervicales del receptor, manteniendo así una perfusión cerebral normal y siguiendo el principio 3R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento) de la investigación con animales. Con esta técnica, logramos una tasa de éxito quirúrgico de aproximadamente el 96,7% (29/30, con solo una mortalidad por hemorragia). No se observaron complicaciones relacionadas con isquemia cerebral en ningún ratón receptor tras la cirugía. Este método se asemeja mucho a los modelos abdominales estándar y es especialmente adecuado para cirujanos con experiencia en suturas vasculares para establecer modelos de TH cervical.
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Protocolo
El cuidado animal cumplió con las directrices internacionales y todos los procedimientos se realizaron en el Instituto de Trasplante de Órganos, Hospital Tongji, Colegio Médico Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología Huazhong, China. La aprobación ética para el estudio se obtuvo del Comité de Ética Animal del Hospital Tongji (número de aprobación: TJH-202310010). Los instrumentos apropiados utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación preoperatoria
- Esteriliza el quirófano con una lámpara ultravioleta durante 30 minutos. Desinfecta la mesa de operaciones con etanol al 70% y autoclave de todos los instrumentos quirúrgicos (121 °C durante 20 minutos).
- Utiliza ratones machos adultos C57BL/6 y BALB/c (que pesan 20–25 g; de 8 a 10 semanas). Para trasplantes singénicos, utiliza ratones C57BL/6 tanto como donantes como receptores. Para trasplantes alogénicos, utiliza ratones BALB/c como donantes y ratones C57BL/6 como receptores.
- Administrar analgesia preoperatoria al ratón receptor mediante inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) 1 hora antes de la cirugía.
NOTA: No se realiza analgesia preoperatoria al ratón donante, ya que el donante se sacrifica inmediatamente después del procedimiento de extracción del corazón. - Prepara la solución anestésica que contiene ketamina (20 mg/mL) y xilazina (2 mg/mL). Anestesiar al ratón con anestesia de ketamina preparada mediante inyección intraperitoneal con un volumen de dosis de 5 μL/g. Confirma la eficacia de la anestesia observando la respiración lenta y regular, la pérdida del reflejo de enderezamiento y la ausencia del reflejo pedal.
- Afeita el pelo de las zonas torácica y abdominal. Sujeta al ratón en posición supina sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal. Desinfectar el lugar quirúrgico alternando povidona-yodo y etanol al 70% durante tres ciclos. Extiende el cuello del receptor retrayendo los incisivos superiores hacia arriba con un hilo de seda 6-0 para optimizar la exposición.
- Lleva guantes quirúrgicos estériles. Haz una abertura ovalada ligeramente mayor que el sitio de la incisión en un drapeado estéril. Luego úsalo para cubrir el ratón receptor.
2. Extracción de corazón por donante
- Realiza una incisión abdominal en la línea media seguida de una incisión transversal (cruciforme) para exponer completamente la cavidad peritoneal.
- Retrae suavemente el intestino delgado hacia la izquierda usando un hisopo de algodón estéril humedecido con solución salina para exponer la aorta abdominal y la VCI.
- Inyectar 0,3 mL de solución fisiológica heparinizada (300 UI/mL) en la VI y esperar 1 minuto para la heparinización sistémica. Transectar la aorta abdominal y la VCI para exsanguinar al donante.
- Incire el diafragma junto con la pared torácica anterior para realizar una incisión en forma de U a través de la caja torácica usando tijeras para exponer la cavidad torácica.
- Inyecta 2 mL de solución salina fría (4 °C) en el corazón a través de la VI intratorácica para eliminar la sangre residual.
NOTA: El propósito principal de este paso es inducir hipotermia y hacer que el corazón deje de latir rápidamente. El segundo objetivo es eliminar completamente la sangre del corazón, especialmente de las arterias coronarias. - Cubre el corazón con una gasa estéril remojada en suero fisiofisiológico (4 °C). La suave tracción descendente de esta gasa facilita la exposición óptima de la aorta y la PA. Además, la gasa empapada en solución salina fría sirve para mantener la hipotermia del injerto durante la posterior disección.
- Identificar y aislar la CCI intratorácica. Liga con una sutura de seda 6-0 y transecta distal a la ligadura con microtijeras.
- Identifica y extirpa el timo para exponer el arco aórtico y la PA. Identificar y aislar la vena cava superior. Liga con una sutura de seda 6-0. Transecta la ligadura distal.
- Identificar y aislar la aorta ascendente. Transecta la aorta proximal a la arteria innominada para maximizar la longitud del vaso.
- Identifica y aísla la AP. Transectarlo justo al proximo de su bifurcación. Liga todos los vasos posteriores al corazón (las venas pulmonares) con una seda 6-0. Elimina cuidadosamente el corazón con tijeras micro.
- Mueve suavemente el corazón y sumérgelo en suero frío (4 °C) colocado sobre hielo para su almacenamiento hasta el trasplante.
3. Operación receptora
- Aislamiento del recipiente receptor
- Realizar una incisión longitudinal de 1 cm en el lado derecho del cuello, que se extiende desde el borde superior del punto medio de la clavícula derecha hasta el borde inferior de la mandíbula.
- Extirpe el lóbulo derecho de la glándula submandibular. Transectar el músculo esternocleidomastoideo derecho para crear un bolsillo suficiente para la implantación del corazón donante.
- Identifica y aísla el EJV correcto y el CCA adecuado. Movilizar la EJV cauterizando sus ramas. Luego, aísla la ACC de los tejidos circundantes. Evita dañar el nervio vago acompañante al diseccionar el CCA.
- Anastomosis arterial
- Simultáneamente, ocluir el VEJ y el CCA utilizando dos pinzas microvasculares, aplicando una pinza en los extremos craneales de ambos vasos y la otra en los extremos caudales. Aplica primero la pinza craneal, seguida de la pinza caudal.
NOTA: Las pinzas microvasculares se introducen preferiblemente desde el lado derecho del ratón hacia la izquierda, con las asas de las pinzas situadas en el lado derecho. Esta orientación facilita la posterior anastomosis vascular y ayuda a reducir la compresión de la tráquea. - Gira el ratón 90° en sentido horario. Realiza una incisión longitudinal en la CCA, asegurando que la longitud coincida con el diámetro de la aorta ascendente donante. Enjuaga la luz con solución salina heparinizada para eliminar a fondo cualquier coágulo residual.
- Para crear la ventana anastomótica, utiliza una sutura 11-0. Pasa la aguja a través de la pared del vaso a una distancia aproximadamente igual al diámetro del vaso donante, levanta suavemente la pared del vaso con la sutura y luego extirpa una pequeña porción con unas microtijeras.
- Coloca el corazón donante en el bolsillo cervical. Ancla la aorta ascendente del donante al CCA receptor colocando dos suturas 11-0 con agujas en los extremos proximal y distal. Coloca el corazón donante en el lado derecho del receptor y cúbrelo con gasas estériles húmedas.
- Utilizando la sutura distal, realiza una sutura continua en las paredes posteriores en dirección distal a proximal con 6–8 puntos.
- Tras completar la sutura de la pared posterior, gira el ratón 180°. Refleja el corazón del donante hacia la izquierda del receptor y cúbrelo con gasas estérils húmedas. Completar la anastomosis suturando las paredes del vaso anterior en dirección proximal a distal con 6–8 puntos. Enjuaga la lúmen con solución salina antes de hacer el nudo final para eliminar las burbujas de aire.
- Simultáneamente, ocluir el VEJ y el CCA utilizando dos pinzas microvasculares, aplicando una pinza en los extremos craneales de ambos vasos y la otra en los extremos caudales. Aplica primero la pinza craneal, seguida de la pinza caudal.
- Anastomosis venosa
- Haz una incisión longitudinal en el EJV, coincidiendo con el diámetro del PA donante. Enjuaga la luz con solución salina heparinizada para eliminar a fondo cualquier coágulo residual.
- Ancla la PA del donante al EJV receptor colocando dos suturas 11-0 con agujas en los extremos proximal y distale.
- Utilizando la sutura proximal, sutura continuamente las paredes posteriores en dirección proximal a distal con 5–7 puntos.
- Continúa con la misma sutura para cerrar las paredes anteriores desde fuera en dirección distal a proximal con 5–7 puntos. Ata la sutura en el ápice proximal. Enjuaga la lúmen con solución salina antes de hacer el nudo final para eliminar las burbujas de aire.
- Reperfusión
- Suelta primero la pinza distal, seguida de la pinza proximal, para iniciar la reperfusión. Al momento de la reperfusión, el injerto cardíaco debe ponerse rojo de inmediato. El ritmo normal y la contracción suelen recuperarse en 1–2 minutos.
- Una vez confirmada la hemostasia, se coloca cuidadosamente el injerto cardíaco dentro del bolsillo subcutáneo, asegurando que no haya torsión de los vasos. Cierra la incisión cutánea con suturas 5-0.
- Cuidados postoperatorios
- Coloca al ratón en una jaula limpia y ponlo en una incubadora para bebés ajustada a 34 °C para facilitar la recuperación. Vigila al ratón cada 1–2 horas hasta que despierte espontáneamente, y luego devólvelo a la jaula de alojamiento.
NOTA: El recalentamiento es necesario para prevenir la depresión respiratoria inducida por hipotermia y facilitar la recuperación tras la anestesia. - Administrar analgesia postoperatoria mediante inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) cada 12 horas durante las primeras 48 horas tras la cirugía.
- Monitoriza diariamente las pulsaciones del injerto cardíaco y registra el estado de supervivencia del injerto.
- Coloca al ratón en una jaula limpia y ponlo en una incubadora para bebés ajustada a 34 °C para facilitar la recuperación. Vigila al ratón cada 1–2 horas hasta que despierte espontáneamente, y luego devólvelo a la jaula de alojamiento.
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Resultados
Se realizaron treinta casos usando este modelo modificado; La tasa de éxito de las operaciones fue del 96,7% (29/30). Solo se produjo una mortalidad debido a una hemorragia intraoperatoria. Los 29 casos restantes se incluyeron para el análisis de los tiempos de intervención y los resultados del injerto. No se observaron complicaciones relacionadas con la isquemia cerebral en ningún receptor tras la cirugía. La extracción del corazón del donante se completó en 6,4 ± 0,7 minutos, y la oper...
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Discusión
El modelo de TH cervical mediante la técnica de anastomosis de extremo a lado ofrece varias ventajas. En comparación con la sutura de extremo a extremo o el método de manguito, este enfoque preserva completamente la continuidad de la ACC y la VEJ, manteniendo así una hemodinámica cerebral normal y evitando eficazmente complicaciones relacionadas con la isquemia cerebral. La anastomosis de extremo a lado también evita dificultades técnicas causadas por una discrepancia en el diámetro de l...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81700571).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1mL Syring | Becton Dickinson Medical Devices Co., Ltd | B309628 | |
| 11-0 sutures with needles | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | H1101 | Para anastomosis vascular |
| 3mL Syring | Becton Dickinson Medical Devices Co., Ltd | B309657 | |
| 5-0 sutures with needles | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | CR537 | Para cierre de piel |
| 6-0 silk suture | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 2650182 | |
| Blood Stop Cautery | Ningbo Shunye Medical Co., Ltd. | BDD-YE-DT-1 | |
| Buprenorphine | Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Co., Ltd | H12020275 | Analgésico |
| Cotton swabs | Fuqing Health & Integral Medical | 20230R | |
| Curved micro forceps | RWD life Science Co. | F11031-11 | Instrumento quirúrgico |
| Curved micro scissors | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54108B | Instrumento quirúrgico |
| Gauze swabs | Yubei Medical Materials Co., LTD | 21080274 | |
| Heparin sodium injection | North China Pharmaceutical Co., LTD | 2101131-2 | |
| Micro needle holder | World Precision Instruments Co., Ltd. | 555408NT | Instrumento quirúrgico |
| Micro vessel clip | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5481T | |
| Micro Vessel clip applicator | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5480 | |
| Needle holder | RWD life Science Co. | F31025-13 | Cierre abdominal |
| Saline | Zhejiang Tianrui Pharmaceutical Co.,Ltd | 716092103 | |
| Straight micro forceps | RWD life Science Co. | F11029-11 | Instrumento quirúrgico |
| Surgical microscope | Leica | M650 | |
| Surgical platform | Personalizado, magnético | ||
| Tissue forceps | RWD life Science Co. | F12002-12 | Instrumento quirúrgico |
| Tissue scissor | RWD life Science Co. | S12003-09 | Instrumento quirúrgico |
Referencias
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