Un modelo de cultivo tridimensional que apoya el desarrollo del folículo secundario a antral humano in vitro

Resumen

Este estudio estableció un modelo de cultivo tridimensional (3D) que sostiene el desarrollo del folículo humano desde la etapa secundaria hasta la antral in vitro. Este sistema permite el crecimiento de folículos y la formación de antros mientras preserva las características moleculares de las células somáticas, proporcionando un modelo fundamental para la investigación en foliculogénesis humana.

Resumen

La foliculogénesis ovárica humana es un proceso complejo y estrictamente regulado que resulta difícil de estudiar directamente in vivo. Aunque los modelos in vitro son esenciales para la investigación mecanicista, los sistemas existentes siguen siendo subóptimos porque no pueden recapitular la dinámica espaciotemporal del desarrollo folículolar. Este estudio presenta un modelo de cultivo 3D que apoya el desarrollo del folículo humano desde la etapa secundaria hasta la antral. Este modelo recapitula con éxito eventos morfológicos clave in vivo , incluyendo el crecimiento folicular sostenido, una fase de expansión de diámetro distinto desde el día 10 y la formación de cavidades antrales alrededor del día 20. Es importante destacar que esta progresión del desarrollo culminó en la extracción exitosa de ovocitos viables en la etapa de vesícula germinal (VG). Además, el análisis de inmunofluorescencia reveló patrones de expresión distintos de receptores de gonadotropina en células somáticas, consistentes con la identidad de la granulosa y la teca. Las células internas tipo granulosa mostraron un alto receptor de hormona folículo-estimulante (FSHR), mientras que las células externas tipo teca mostraron una alta expresión de receptores de hormona luteinizante (LHR). Este modelo ofrece una plataforma valiosa para estudiar la foliculogénesis humana y la toxicología reproductiva, y proporciona una referencia para optimizar los sistemas de cultivo folicular in vitro para el desarrollo de la etapa secundaria a la antral.

Introducción

El proceso fisiológico del desarrollo del folículo ovárico, desde la etapa primordial hasta la preovulatoria, es fundamental para la fertilidad^femenina. Este proceso implica una serie de eventos altamente coordinados, incluyendo el crecimiento/maduración de los ovocitos y la proliferación/diferenciación de las células^{de la granulosa 2}. Las alteraciones en estos intrincados mecanismos representan una causa importante de infertilidad y disfunción ovárica. Por tanto, una comprensión detallada de las redes reguladoras que subyacen a la foliculogénesis—que abarca la señalización paracrina, las interacciones ovocito-célula somática y la dinámica de la matriz extracelular—es, por tanto, de importancia fisiopatológica crítica. Sin embargo, la investigación directa de la foliculogénesis humana in vivo sigue estando limitada por limitaciones éticas y prácticas, lo que impulsa la necesidad de modelos in vitro fiables para esclarecer estos mecanismos. A pesar de los avances, sigue existiendo una falta crítica de un modelo de cultivo a largo plazo que apoye el desarrollo del folículo humano, especialmente desde la etapa secundaria hasta la antral.

Aunque el cultivo folicular humano en matrices bidimensionales (2D) o tridimensionales (3D) ha avanzado en el conocimiento del desarrollo folicular^{temprano 3,4}, estos sistemas siguen limitados en apoyar la progresión hacia etapas posteriores. Cabe destacar que lograr la foliculogénesis humana in vitro a través de etapas posteriores de desarrollo sigue siendo especialmente complicado debido a su mayor tamaño folicular y a la mayor extensión del calendario de maduración⁵. Incluso entre el número limitado de sistemas de cultivo folicular in vitro humanos que han producido con éxito ovocitos MII, las tasas de maduración siguen siendo bajas (aproximadamente un 20% como máximo⁾6,7,8,9. Quizá un desafío más fundamental sea la recapitulación de la transición secundaria a antral, una fase crítica y estructuralmente compleja que aún no se ha modelado adecuadamente in vitro.

Este estudio estableció un modelo de cultivo 3D que apoya el desarrollo in vitro de folículos secundarios humanos en folículos antrales con estructuras cavitarias distintas. Este modelo proporciona una base fundamental para una investigación más profunda de los mecanismos reguladores subyacentes al desarrollo del folículo humano y sirve como referencia para la futura optimización de sistemas de cultivo folicular dirigidos al desarrollo secundario a antral.

Protocolo

Este protocolo de estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Tercer Hospital de la Universidad de Pekín (Aprobación nº M2024151). Todos los tutores legales de menores que participan en el estudio han firmado el formulario de consentimiento informado.

Fuente de tejido
El tejido medular ovárico humano utilizado en este protocolo se obtuvo de cuatro pacientes pediátricos diagnosticados con teratoma ovárico (de 2, 6, 13 y 16 años) que donaron tejido ovárico con fines de investigación (Tabla 1). La corteza ovárica se utilizó para estudios de criopreservación del tejido ovárico, mientras que el tejido medular restante se empleó para el cultivo folicular in vitro en este estudio. Se aislaron un total de 33 folículos secundarios, asignados 16 folículos al grupo control y 17 al grupo de cultivo 3D.

Preparación del reactivo
El medio de transporte consistía en el medio L-15 de Leibovitz, suplementado con un suplemento sustituto sérico al 10%, y se almacenaba a 4 °C. La solución digestiva completa se preparó suplementando MEMα con 0,04 mg/mL de Liberasa DH, 10 UI/mL de DNasa I y 100 UI/mL de penicilina-estreptomicina, y se almacenó a -20 °C. La solución para detener la digestión fue DPBS suplementada con un suplemento sustituto sérico al 10% y almacenada a 4 °C. El medio de crecimiento completo se preparó suplementando MEMα con un suplemento sustituto sérico al 10%, insulina transferrina-selenio al 1%, ácido L-ascórbico 50 μg/mL, 2 mM piruvato sódico y 100 UI/mL penicilina-estreptomicina. El medio se almacenaba a 4 °C. La hormona folículo-estimulante humana recombinante (FSH) se añadió a una concentración final de 100 mIU/mL en el inicio del cultivo, como se describió en un estudio^{anterior 10}. Tras la detección visual de la formación temprana de antro (alrededor del día 20), la hormona luteinizante humana recombinante (LH) se suplementó hasta una concentración final de 10 mIU/mL durante los cambios de medio. La matriz de cultivo sólido se preparó mezclando la matriz de membrana basal al 70% (v/v) con un medio de crecimiento completo al 30% (v/v) y se mantuvo en hielo durante todos los pasos de manipulación.

Digestión tisular y aislamiento secundario del folículo
El tejido ovárico se colocó en un medio de transporte y se transportó al laboratorio a 4 °C. En condiciones estériles, la médula ovárica se diseccionaba con un bisturí. El tejido se seccionaba en piezas finas (~3 × 3 × 1 mm) y se picaba en pequeños fragmentos (~0,5 × 0,5 × 1 mm) con un cortador de tejido, manteniendo el tejido húmedo en todo momento. El tejido picada se transfirió a un plato de 35 mm, y se añadió solución digestiva completa precalentada a 2 mL por tejido de 100 mg. La incubación se realizó a 37 °C durante 45–80 minutos (media: 60 ± 15 minutos), con una mezcla suave cada 10 minutos. La digestión se interrumpió cuando el examen microscópico reveló el aflojamiento de la matriz estromal y la liberación de folículos individuales (Figura 1). Se seleccionaron folículos secundarios sanos (diámetro 100–200 μm, con ≥ 2 capas celulares de granulosa y un ovocito visible) bajo un estereomicroscopio usando una pipeta de vidrio controlada por la boca (diámetro interior 200 μm) y se lavaron dos veces con medio de crecimiento completo previamente calentado.

Incrustación 3D y cultura a largo plazo
Se colocó un inserto de cultivo celular en una bandeja de 35 mm humedecida con 2 mL de medio de crecimiento completo y se preequilibró en una incubadora (37 °C, 5% CO₂) durante 2 horas. Algunos folículos secundarios seleccionados se transfirieron al inserto y se precultivaron durante la noche bajo las mismas condiciones. Al final del precultivo, los folículos del grupo control se cultivaron directamente dentro del inserto (cultivo 2D). En contraste, los folículos designados para el grupo de cultivo 3D se prepararon para ser incrustados en una matriz basal de membrana reducida por factor de crecimiento (proteína total 8~12 mg/mL). La matriz se descongeló sobre hielo y se mezcló con un medio de crecimiento completo al 30% (v/v) de hielo. Se colocaron gotas de 40 μL de la mezcla en un recipiente de 35 mm (máximo seis gotas por plato), para formar una capa de gel uniforme de aproximadamente 1,5 mm de altura. Luego, se transfirió un folículo secundario a cada gota mediante una pipeta de vidrio controlada por la boca, colocada cuidadosamente en el tercio medio a superior de la gota para evitar que se hunda. El plato se colocó en una incubadora (37 °C, 5% CO₂) durante 30 minutos para permitir la gelificación. Tras la solidificación, se añadieron suavemente 2 mL de medio de crecimiento completo al recipiente para iniciar el cultivo a largo plazo.

Mantenimiento y seguimiento de la cultura
Se realizó un cambio del 50% del medio con medio de crecimiento completo fresco (que contiene FSH) cada 48 horas. Los folículos se observaron diariamente bajo un estereomicroscopio, y se registraron sus diámetros y características morfológicas. Tras la detección visual de la formación temprana de antros (alrededor del día 20), se añadió LH humano recombinante al medio durante los cambios posteriores. El cultivo se mantuvo hasta 30 días o hasta que los folículos alcanzaron la etapa antral (diámetro > 400 μm con una cavidad claramente definida llena de líquido).

Disociación celular posterior al cultivo
Al final del cultivo, los folículos antrales se transfirieron a un recipiente con DPBS fresco y se disociaron mecánicamente usando una jeringuilla estéril de calibre 29. Los complejos cúmulo-ovocito aislados (COCs) se transfirieron a un plato separado para su análisis posterior. La suspensión restante de la granulosa y la célula teca se transfirieron a una nueva placa de 35 mm que contenía 2 mL de medio de crecimiento completo precalentado, se giró suavemente para una distribución uniforme y se incubó durante 48 horas (37 °C, 5% CO₂).

Análisis de inmunofluorescencia
Tras el cultivo, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, las muestras se lavaron tres veces con PBS, permeabilizaron con 0,5% de Triton X-100 durante 20 minutos y se bloquearon durante la noche a 4 °C usando 1% de BSA en PBS. Las células se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios. Los anticuerpos principales utilizados fueron anti-FSHR (conejo, 1:200) y anti-LHR (ratón, 1:100). Tras la incubación, las células se lavaron tres veces durante 15 minutos cada una con PBS que contenía un 1% de BSA. Posteriormente, fueron incubados con anticuerpos secundarios fluorescentes (anti-conejo y anti-ratón, 1:200) durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, las células pasaron por tres lavados finales, cada uno de 20 minutos. Los núcleos se teñieron con DAPI durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después, las muestras se lavaron tres veces durante 5 minutos con PBS que contenía un 1% de BSA. La imagen se realizó utilizando un sistema de imagen de alto contenido Operetta CLS en modo confocal. Las señales de fluorescencia se capturaron utilizando los siguientes canales: DAPI (405 nm), Alexa Fluor 488 (LHR) y Alexa Fluor 647 (FSHR), con ajustes de exposición consistentes en todas las muestras.

Análisis estadístico
Se realizaron comparaciones del diámetro del folículo entre el grupo control y el grupo de cultivo 3D en los días 5, 10 y 15 utilizando una prueba t de muestras independientes. Se consideró estadísticamente significativo un valor p < 0,05. El análisis estadístico del diámetro del folículo no se realizó más allá del día 15, ya que casi todos los folículos del grupo control no sobrevivieron después del día 15. Esto resultó en un tamaño de muestra inadecuado, lo que impidió comparaciones de grupo fiables y significativas. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 9.0).

Resultados

Desarrollo de un modelo de cultivo 3D que apoye el crecimiento folicular humano hasta la etapa antral
Un gran desafío en la investigación sobre folículos ováricos es desarrollar un sistema de cultivo in vitro que apoye el desarrollo completo del folículo, siendo la formación de la cavidad antral un hito clave. Por ello, este estudio estableció un modelo de cultivo 3D para folículos humanos in vitro (Figura 2).

Discusión

El mantenimiento exitoso de los folículos ováricos humanos in vitro mediante la transición de secundario a antral representa un avance técnico significativo. En este estudio, un sistema de cultivo 3D que proporcionaba apoyo biofísico adecuado y señales hormonales específicas de cada etapa permitió esta progresión. Estos resultados coinciden con la evidencia reciente que subraya la necesidad de sistemas de cultivo 3D para recapitular la fisiología tisular. Aunque las monocapas 2D...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-FSHR	HuaBio	ER1909-08
Anti-LHR	Santa Cruz	sc-293165
Anti-mouse(secondary)	Abcam	AB150113
Anti-rabbit(secondary)	Abcam	AB205718
Basement membrane matrix for organoid culture	MCE	K6004
BSA	Sigma	A1933
Cell culture insert	Millipore	PICMORG50
Culture dish	Corning	430165
DAPI	Beyotime	C1006
DNase I	Thermo	EN0525
DPBS	Gibco	14190144
FSH	Merck	F4021
Incubator	Thermo	Heracell 3111
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	41400045
L-Ascorbic acid	MCE	HY-B0166
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	11415064
LH	Merck	L6420
Liberase DH	Roche	5401054001
McIlwain Tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.	MP10180-220
MEMα	Gibco	41061029
Paraformaldehyde	Solarbio	P1110
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Serum substitute supplement	FUJiFILM Irvine	90194
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270
The high-content imaging system	PerkinElmer	Operetta CLS
Triton X-100	Sigma	X100