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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
El estudio consistió en administrar metil-nitrosourea a ratones C57BL/6 para inducir daño retiniano, seguido de un tratamiento con activadores e inhibidores de ALDH2 junto con SIRT1 y moduladores de estrés retículo endoplásmico (ERS). El protocolo tenía como objetivo investigar los efectos protectores de estos tratamientos sobre la degeneración retiniana y su influencia en el metabolismo de los aldehídos.
Este estudio investigó los efectos protectores de la activación de aldehído deshidrogenasa 2 (ALDH2) (a través de Alda-1), la inhibición de ALDH2 (a través de Daidzin) y la modulación de la sirtuína 1 (SIRT1) y el estrés del retículo endoplasmático (ERS) sobre el daño retiniano inducido por metilnitrosora (MNU) en ratones C57BL/6. Setenta y dos ratones fueron asignados aleatoriamente a ocho grupos, incluyendo un grupo de control, un grupo con MNU solo y varios grupos de combinación de tratamiento. Se administraron ratones con inyecciones intraperitoneales de agonistas e inhibidores dirigidos respectivamente al eje ALDH2-SIRT1-ERS. Se evaluaron el peso corporal, el grosor de la capa retiniana y los biomarcadores del metabolismo de aldehídos en el segundo y cuarto día tras el tratamiento. La administración de MNU indujo degeneración retiniana, lo que resultó en una pérdida significativa de peso corporal en todos los grupos excepto en el control. El tratamiento con Alda-1 atenuó el daño retiniano, mientras que Daidzin lo agravó. La inhibición farmacológica de SIRT1 (a través de EX-527) disminuyó los efectos protectores de Alda-1, y la inducción por ERS (mediante TUN) casi abolió sus beneficios. Por el contrario, la activación de SIRT1 (a través de SRT1720) mitigó los efectos adversos de Daidzin, mientras que la inhibición de ERS (mediante 4-PBA) alivió parcialmente el impacto de Daidzin. Además, el MNU aumentó los niveles de marcadores metabólicos de aldehídos (malondialdehído [MDA] y 4-hidroxi-2-nonenal [4-HNE]), con Alda-1 reduciendo y Daidzin elevando estos niveles. Además, la modulación farmacológica de las vías SIRT1/ERS intervino en los efectos regulatorios de Alda-1 y Daidzin sobre el metabolismo de los aldehídos. En general, la activación de ALDH2 protegió la estructura retiniana y reguló el metabolismo de los aldehídos, lo que pone de manifiesto el papel crítico del eje de señalización ALDH2-SIRT1/ERS en la mitigación de la degeneración retiniana.
La degeneración retiniana, una de las principales causas de ceguera a nivel mundial, incluye afecciones como la retinitis pigmentar (RP), la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la retinopatía diabética (DR), que en conjunto afectan a millones de personas e imponen cargas socioeconómicasconsiderables 1,2,3. Sin embargo, actualmente hay una falta de terapias farmacológicas altamente efectivas para frenar la progresión de estas enfermedades retinianas cegantes en la práctica clínica. La patogénesis de la degeneración retiniana es multifactorial, implicando estrés oxidativo, inflamación crónica y estrés del retículo endoplasmático (SER), que altera la homeostasis de las células retinianas. Estos factores de estrés suelen ser desencadenados por una desregulación metabólica interna (por ejemplo, disfunción mitocondrial), lo que finalmente conduce a la apoptosis y daño irreversible de laretina 4. La metil-nitrosourea (MNU), un potente agente alquilante del ADN, ha surgido como un inductor químico ampliamente utilizado para modelar la degeneraciónretiniana 5. El modelo de enfermedad retiniana inducida por MNU sirve como una herramienta valiosa para investigar los mecanismos de la enfermedad y evaluar posibles intervenciones terapéuticas. Mecanísticamente, el MNU induce estrés oxidativo al generar especies reactivas de oxígeno (ROS) y alterar el equilibrio redox, dañando así las membranas y orgánulos de los fotorreceptores. Esto también podría afectar al metabolismo de los aldehídos, dificultando la desintoxicación de la peroxidación lipídica. La acumulación posterior de aldehídos tóxicos podría agravar el daño oxidativo, amplificando la apoptosis de losfotorreceptores 6.
La aldehído deshidrogenasa 2 (ALDH2), una enzima mitocondrial dependiente de NAD+, desempeña un papel fundamental en la desintoxicación de aldehídos tóxicos como el 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) y el malondialdehído (MDA) al convertirlos en ácidos carboxílicos menos reactivos, previniendo así el dañooxidativo 7. Una actividad robusta de ALDH2 es crucial para mantener la homeostasis redox, y la función deteriorada de ALDH2 se ha relacionado con envejecimiento acelerado y patologíasneurodegenerativas 8. Se ha demostrado que la activación farmacológica de ALDH2, especialmente a través del agonista de moléculas pequeñas Alda-1, ejerce efectos citoprotectores en varios modelos 9,10. La sirtuina 1 (SIRT1), una deacetilasa dependiente de la nicotinamida adenina de dinucleótido + (NAD+), regula las respuestas al estrés y el metabolismo energético modulando factores de transcripción, incluyendo p53 y el factor nuclear kappa B (NF-κB)11. La activación de SIRT1 ha mostrado potencial para promover la función mitocondrial y la supervivencia celular, con estudios que vinculan su regulación al alza con la reducción del daño oxidativo y la inflamación en la degeneraciónretiniana 12. El estrés del retículo endoplásmico (ERS), desencadenado por la acumulación de proteínas mal plegadas, activa la respuesta proteica no plegada (UPR), que puede convertirse en una cascada pro-apoptótica bajo estrés crónico. El ERS ha sido implicado en la degeneración retiniana, contribuyendo a la apoptosis de losfotorreceptores 13. A pesar de estos hallazgos, la interacción específica entre ALDH2, SIRT1 y ERS en el contexto del modelo de degeneración retiniana inducida por MNU sigue siendo poco comprendida. Además, los roles coordinados de estas vías interconectadas requieren una investigación sistemática adicional.
Por ello, el estudio actual pretendía investigar los efectos de componentes clave del eje ALDH2-SIRT1-ERS —ALDH2 (a través de Alda-1 o Daidzin), SIRT1 (a través de SRT1720 o EX527) y ERS (a través de 4-PBA o TUN)— sobre el daño retiniano inducido por MNU en ratones C57BL/6. Utilizando análisis histopatológicos y bioquímicos, examinamos cómo la selección de este eje afectaba la supervivencia de los fotorreceptores y el metabolismo de los aldehídos. Planteamos la hipótesis de que la activación coordinada de ALDH2, la mejora de SIRT1 y la supresión del ERS mitigarían sinérgicamente la degeneración retiniana inducida por MNU, proporcionando así una justificación para dirigirse a este eje en enfermedades degenerativas retinianas.
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Declaración ética
Todos los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Experimental de Animales del Fuzong Clinical Medical College de la Universidad Médica de Fujian y se realizaron en estricta conformidad con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en la Investigación Oftalmológica y Visual.
Animales y asignación de grupos
Se obtuvieron un total de 72 ratones machos C57BL/6 (de 8 a 10 semanas de edad, peso corporal de 20 a 25 g) del proveedor certificado, cumpliendo con los estándares nacionales para la cría de animales de laboratorio. Los ratones fueron alojados en jaulas ventiladas individualmente bajo condiciones ambientales estandarizadas, incluyendo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, temperatura controlada (22 ± 2 °C) y humedad relativa (50% ± 10%), con acceso improvisado a comida y agua. Para investigar los efectos moduladores de las vías ALDH2, SIRT1 y ERS sobre el daño retiniano inducido por MNU, los ratones fueron asignados aleatoriamente en ocho grupos experimentales (n = 9 por grupo; n = 5 para el grupo del segundo día; n = 4 para el grupo del cuarto día) utilizando una secuencia de aleatorización generada por ordenador para minimizar el sesgo de selección. El resumen gráfico del estudio se mostró en la Figura 1.
Preparación y regímenes de tratamiento de los reactivos
Los reactivos experimentales utilizados en este estudio se listaron en la Tabla de Materiales, con información detallada sobre la preparación y dosificación de la siguiente manera. (1) MNU (50 mg/kg): Se disolvieron 100 mg de MNU en 2 mL de solución fisiológica normal para preparar una solución de 50 mg/mL. Luego, se diluyó 1,4 mL de esta solución con 5,6 mL de solución fisiológica normal hasta una concentración final de 10 mg/mL para la administración animal. (2) Alda-1 (10 mg/kg): Se disolvieron 50 mg de polvo de Alda-1 en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar una solución de 50 mg/mL, que se diluyó con 24 mL de solución fisiológica normal hasta una concentración final de 2 mg/mL. (3) Daidzin (10 mg/kg): Se disolvieron 50 mg de polvo de Daidzin en 1 mL de DMSO para preparar una solución de 50 mg/mL, que luego se diluyó con 24 mL de solución fisiológica normal hasta una concentración final de 2 mg/mL. (4) EX-527 (10 mg/kg): Se disolvieron 5 mg de polvo de EX-527 en 0,1 mL de DMSO para preparar una solución de 50 mg/mL, que se diluyó con 2,4 mL de solución salina normal hasta una concentración final de 2 mg/mL. (5) SRT1720 (10 mg/kg): 5 mg de polvo de SRT1720 se disolvieron en 0,1 mL de DMSO y se mezclaron bien. Luego, se añadieron 400 μL de PEG300, 50 μL de Tween-80 y 450 μL de solución fisiológica normal para preparar una solución de trabajo de 2 mg/mL. (6) TUN (10 mg/kg): Se disolvieron 5 mg de polvo de TUN en 0,1 mL de DMSO para preparar una solución de 50 mg/mL, que luego se diluyó con 2,4 mL de solución salina normal hasta una concentración final de 2 mg/mL. (7) 4-fenilbutirato (4-PBA; 10 mg/kg): 2 mg de polvo de 4-PBA se disolvieron en 1 mL de solución salina normal para preparar una solución de 2 mg/mL. Todos los volúmenes de administración anteriores fueron de 5 × M mililitros (donde M = peso corporal animal en kg). Después de eso, los ratones se dividieron en ocho grupos con los siguientes protocolos de tratamiento:
Grupo de control: Una única inyección intraperitoneal de solución salina normal.
Grupo MNU: Una única inyección intraperitoneal de MNU.
Grupo MNU + Alda-1: Inyección intraperitoneal de Alda-1, seguida de una única administración de MNU 2 horas después. Después, Alda-1 se administró intraperitonealmente una vez al día.
Grupo MNU + Daidzin: Inyección intraperitoneal de Daidzin, seguida de una única inyección de MNU administrada 2 horas después. Después, el Daidzin se administró intraperitonealmente una vez al día.
Grupo MNU + Alda-1 + EX-527: Inyección intraperitoneal de Alda-1, seguida de inyección de EX-527 una hora después e inyección de MNU una hora después (administración única). Después, Alda-1 se administró intraperitonealmente una vez al día.
MNU + Alda-1 + grupo TUN: inyección intraperitoneal de Alda-1, seguida de inyección TUN una hora después e inyección de MNU una hora después. Después, Alda-1 se administró intraperitonealmente una vez al día.
Grupo de MNU + Daidzin + SRT1720: inyección intraperitoneal de Daidzin, seguida de SRT1720 inyección una hora después y inyección de MNU una hora después. Después, el Daidzin se administró intraperitonealmente una vez al día.
Grupo MNU + Daidzin + 4-PBA: Inyección intraperitoneal de Daidzin, seguida de inyección de 4-PBA una hora después, e inyección de MNU una hora después. Después, el Daidzin se administró intraperitonealmente una vez al día.
Monitorización del peso corporal
La toxicidad sistémica y los efectos fisiológicos relacionados con el tratamiento se monitorizaron registrando el peso corporal de cada ratón diariamente durante cuatro días consecutivos tras la administración de MNU. Los pesos se midieron utilizando una báscula digital de precisión con una precisión de ±0,1 g, y se documentaron datos para seguir las tendencias en la pérdida o ganancia de peso entre grupos, lo que sirvió como indicadores indirectos de tolerancia al tratamiento y estrés sistémico.
Examen histopatológico de la retina
En los momentos del segundo y cuarto día tras el experimento, los ratones fueron eutanasiados por luxación cervical tras anestesia con inyección intraperitoneal (i.p.) de pentobarbital sódico a una dosis de 50–60 mg/kg de peso corporal, cumpliendo estrictamente las directrices institucionales de eutanasia. Los ojos, concretamente el izquierdo, fueron inmediatamente enucleados. Antes de la enucleación, se realizó una pequeña incisión en el limbo nasal para marcar la orientación. Las esferas se sumergieron luego en paraformaldehído al 4% (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) durante 24 horas a 4 °C para su fijación. Los ojos fijos se deshidrataron mediante una serie graduada de etanol (70%, 80%, 95% y 100%), eliminados con xileno e incrustados en bloques de parafina para su procesamiento histológico. Durante la incrustación, la orientación se estandarizó posicionando el lado nasal marcado hacia abajo.
Se prepararon secciones seriadas (de 5 μm de grosor) utilizando un microtomo rotatorio a través de la cabeza del nervio óptico (ONH) para asegurar un muestreo representativo de la región central de la retina. Específicamente, se cortaron secciones desde la parte superior hacia el punto nasal marcado, asegurando que todas las secciones pasaran por el ONH. Las secciones se montaron entonces sobre correderas de cristal cargadas positivamente. La tinción de hematoxilina y eosina (HE) se realizó según protocolos estándar. La morfología retiniana fue evaluada mediante microscopía óptica a un aumento de 400×. Las mediciones se tomaron sistemáticamente desde la retina temporal a distancias predeterminadas del ONH: 200, 400, 600, 800, 1000 y 1200 μm. En cada ubicación se midieron el grosor total de la retina, la longitud de los segmentos interno y externo (IS/OS), el grosor de la capa nuclear externa (ONL), el grosor de la capa plexiforme externa (OPL) y la capa nuclear interna (INL).
Para garantizar la objetividad y minimizar el sesgo de medición, se implementó un riguroso protocolo de control de calidad. Específicamente, cada uno de los ocho grupos experimentales se subdividió en cinco o cuatro subgrupos (por ejemplo, Subgrupos 1, 2, 3, 4, 5). Cinco o cuatro observadores independientes, cegados ante las asignaciones de grupos, fueron asignados para medir el mismo subgrupo correspondiente en todos los grupos experimentales (por ejemplo, el Observador A siempre midió el Subgrupo 1 de cada grupo). En cada punto de medición se tomaron tres lecturas dentro de un rango de ~5 μm (por ejemplo, a 200 μm, 195 μm y 205 μm) y se promediaron para minimizar el error técnico. Se realizaron mediciones cuantitativas utilizando el software ImageJ (versión 1.54g), y se calculó el valor medio del grosor de cada punto para asegurar la reproducibilidad.
Marcadores del metabolismo de aldehídos
Para evaluar el estrés oxidativo y el metabolismo de aldehídos, se analizaron muestras séricas para determinar los niveles de MDA y 4-HNE, que son biomarcadores clave de la peroxidación lipídica y el estrés aldehídico. Específicamente, todos los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal (p) de pentobarbital sódico a una dosis de 50–60 mg/kg de peso corporal. Tras la anestesia profunda de los ratones, se realizó la eutanasia mediante dislocación cervical. Inmediatamente después de la eutanasia, los globos oculares fueron enucleados y se recogió rápidamente sangre retrobulbar. Las muestras se dejaron coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de centrifugación a 3.000 × g durante 10 minutos. La fracción sérica se transfirió cuidadosamente a tubos de microcentrífuga libres de enzimas y se almacenó a -80 °C hasta un análisis posterior. Los niveles de MDA en suero se midieron utilizando kits comerciales de inmunosorbente enzimático (ELISA) siguiendo los protocolos del fabricante. En resumen, se añadieron estándares y muestras a microplacas prerecubiertas, incubados con anticuerpos primarios específicos, lavados para eliminar materiales no unidos y reaccionaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP). A continuación, se añadió sustrato de tetrametilbenzidina (TMB), y la reacción terminó con ácido sulfúrico. Los valores de densidad óptica (OD) se leyeron a 450 nm usando un lector de microplacas, y las concentraciones de MDA/4-HNE se determinaron comparando los valores de OD con curvas estándar generadas usando concentraciones conocidas de los analitos.
Análisis estadístico
Todos los datos se presentaron como medio ± error estándar (SE). Dado el pequeño tamaño de muestra (n = 5 para el grupo del segundo día; n = 4 para el grupo del cuarto día), se emplearon los métodos estadísticos de la prueba Bootstrap. Específicamente, se utilizó el método de remuestreo Bootstrap (1.000 iteraciones con reemplazo) para estimar intervalos de confianza (IC) del 95% para medias de grupo y para comparar diferencias entre grupos. Para cada resultado (por ejemplo, peso, grosor retiniano, niveles de MDA/4-HNE), se extrajeron muestras Bootstrap del conjunto de datos original y se calculó la media para cada remuestreo. El IC del 95% se derivó delos percentiles 2,5y 97,5 de la distribución bootstrap. La importancia se evaluó indirectamente mediante el siguiente enfoque examinando el intervalo de confianza. Si el IC de los resultados de Bootstrap no incluía cero, esto típicamente indicaba que la diferencia era significativa (suponiendo una comparación de medias entre dos o más grupos). Las figuras se generaban usando el software Graphpad (versión 5.01).
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Cambios en el peso corporal
Antes del experimento, no había diferencias significativas en el peso corporal entre los grupos. En el segundo día tras el experimento, excepto en el grupo de control, que mostró un aumento del peso corporal de 17,0 ± 0,5 g a 17,4 ± 0,4 g, el peso corporal de ratones en todos los demás grupos disminuyó significativamente. Específicamente, el grupo MNU disminuyó de 17,4 ± 0,3 g a 16,2 ± 0,2 g, el grupo MNU + Alda-1 de 17,3 ± 0,3 g a 16,7 ± 0...
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Estudios previos sugirieron que los agonistas de ALDH2 podrían ofrecer efectos protectores contra la degeneraciónretiniana 14 inducida por MNU. Sin embargo, los efectos de intervención de su inhibidor, junto con posibles vías posteriores como SIRT1 y ERS, no se habían explorado en detalle. Se han realizado estudios que indican la implicación de SIRT1 y ERS en modelos de degeneración retiniana, incluyendo la degeneración retiniana inducida por la luz y ratones gené...
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Los autores no declararon posibles conflictos de interés respecto a la investigación, autoría o publicación de este artículo.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 82301245), los Fondos Conjuntos para la Innovación en Ciencia y Tecnología de la provincia de Fujian (Nº 2024Y9653), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Fujian, China (Nº 2024J011148) y la Fundación Postdoctoral de Ciencias del Hospital General de Fuzhou (Número de subvención: 48678).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4HNE Kit | Elabscience, China | E-EL-0128 | Para la medición de niveles de 4HNE en suero |
| Ácido 4-fenilbutírico (4-PBA) | MCE, EE. UU. | HY-A0281 | Reactivo para la inhibición de ERS |
| Alda-1 | MCE, EE. UU. | HY-18936 | Activador de ALDH2 para investigación |
| Daidzina | MCE, EE. UU. | HY-N0018 | Inhibidor de ALDH2 para investigación |
| Sodio de fluoresceína | Guangzhou | N/A | Utilizado para adquirido usando un sistema de angiografía con fluoresceína. Las imágenes angiográficas se analizaron para detectar la presencia de cualquier fuga, áreas no perfundidas o cambios en la morfología de los vasos retinianos. |
| Software ImageJ | Institutos Nacionales de Salud, EE. UU. | Versión 1.53t | |
| Kit de MDA | Beyotime, China | S0131S | Para la medición de niveles de MDA en suero |
| N-Nitroso-N-metilurea (MNU) | MCE, EE. UU. | HY-34758 | Agente alquilante del ADN para inducir degeneración retiniana |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich, EE. UU. | 30525-89-4 | Utilizado para secciones de tejido retiniano |
| Báscula digital de precisión | Báscula electrónica, China | SF-400 | CAPACIDAD: 5000 g ´ 1 g/177ozX0.10z, utilizada para registrar el peso corporal de cada ratón |
| Prism | GraphPad | Versión 5.01 | Software de análisis estadístico |
| Microtomo rotatorio | LEICA, Alemania | RM2016 | Utilizado para la preparación de secciones retinianas |
| Selisistat (EX-527) | MCE, EE. UU. | HY-15452 | Inhibidor de SIRT1 para investigación |
| Pentobarbital sódico | Sigma-Aldrich, EE. UU. | 1.93248 | Utilizado para anestesiar para futuras investigaciones mediante inyección intraperitoneal (IP) |
| SRT1720 | MCE, EE. UU. | HY-10532 | Activador de SIRT1 para investigación |
| Sumianxin | Jilin Shengda Animal Pharmaceutical Co | N/A | Utilizado para anestesiar para futuras investigaciones mediante inyección intraperitoneal (IP) |
| Tunicamicina (TUN) | MCE, EE. UU. | HY-A0098 | Reactivo para la inducción de ERS |
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