Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de investigación
Este estudio retrospectivo presenta un flujo de trabajo reproducible para la recogida temprana de sangre tras la admisión, la medición de citocinas séricas y receptores tipo Toll, la genotipificación de polimorfismos génicos inflamatorios y la evaluación del riesgo de infección en pacientes con hemorragia intracerebral espontánea.
La infección pulmonar nosocomial es una complicación frecuente tras una hemorragia intracerebral espontánea y puede empeorar la recuperación neurológica, prolongar la hospitalización y aumentar la carga clínica. Este estudio clínico-laboratorio retrospectivo presenta un flujo de trabajo reproducible para evaluar perfiles inmunogenéticos inflamatorios de biomarcadores inflamatorios y del huésped asociados a la infección pulmonar nosocomial tras una hemorragia intracerebral espontánea primaria. Los pacientes se clasifican según si la infección pulmonar nosocomial ocurre tras el ingreso. La sangre venosa periférica se recoge en el periodo inicial de post-admisión bajo condiciones preanalíticas estandarizadas. El suero se separa, se alicota y se almacena para la medición de inmunoenzimas ligadas a enzimas de IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, TLR2, TLR4 y TLR9. Paralelamente, se extrae ADN genómico de la sangre entera anticoagulada y se utiliza para el genotipado de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción por reacción en cadena de la polimerasa de loci seleccionados relacionados con receptores de citocinas y Toll. El flujo de trabajo también incluye procedimientos de control de calidad para el manejo de muestras, mediciones ELISA duplicadas, evaluación de la pureza del ADN, llamada de genotipos y genotipado repetido. El análisis estadístico incluye la comparación entre grupos de características clínicas y niveles de biomarcadores, pruebas de equilibrio Hardy-Weinberg, análisis de regresión logística para asociaciones entre genotipo y alelo, ajuste por covariables clínicas relevantes y corrección por tasa de descubrimiento falso para comparaciones genéticas múltiples. Este flujo de trabajo combinado clínico, inflamatorio e inmunogenético puede ayudar a caracterizar los perfiles de riesgo de infección tras una hemorragia intracerebral espontánea, aunque aún se requiere una validación multicéntrica prospectiva antes de la aplicación clínica rutinaria.
La hemorragia intracerebral espontánea (ICH) es un subtipo grave de ictus causado por la rotura no traumática de los vasos cerebrales y sigue siendo una fuente importante de muerte y discapacidad neurológica. Clínicamente, la ICH se clasifica comúnmente como primaria o secundaria. La ICH primaria representa la mayoría de los casos y está principalmente relacionada con la arteriopatía hipertensiva o la angiopatía amiloidecerebral 1. En cambio, la CHI secundaria está asociada a causas estructurales o hematológicas, incluyendo aneurismas, malformaciones arteriovenosas, enfermedad de Moyamoya y trastornos de la coagulación. Aunque el ICO representa una proporción menor de todos los eventos de ictus que el ictus isquémico, conlleva una mortalidad a corto plazo desproporcionadamente alta y una carga funcional alargo plazo 2,3,4,5.
Entre las principales complicaciones hospitalarias tras la ICH, la infección pulmonar nosocomial es especialmente frecuente y de consecuencias clínicas. Estudios previos han demostrado que la infección pulmonar puede producirse en una proporción considerable de pacientes hospitalizados tras un ictus o una hemorragia intracerebral y se asocia con hospitalizaciones más prolongadas, mayor carga médica, peor recuperación neurológica y un aumento de lamortalidad 6,7,8. La importancia clínica de esta complicación va más allá del manejo respiratorio por sí solo. La disminución de la conciencia, los reflejos de deglución y tos alterados, la inmovilización, el soporte mecánico de las vías respiratorias y los procedimientos invasivos de drenaje pueden aumentar el riesgo de infección durante la fase aguda posterior a la CHI. Al mismo tiempo, la infección pulmonar puede agravar aún más la inflamación sistémica, dificultar el suministro de oxígeno y complicar los cuidados neurocríticos, amplificando así los procesos de lesión secundaria.
Esta relación es biológicamente plausible porque la PCI no solo es un evento cerebrovascular focal, sino también un desencadenante de una desregulación inmunitaria sistémica. La hemorragia cerebral aguda puede activar cascadas inflamatorias, alterar la señalización inmunitaria innata y alterar el equilibrio entre la neuroinflamación y la defensa periférica del huésped. En este contexto, algunos pacientes pueden volverse más susceptibles a infecciones hospitalarias incluso bajo un manejo clínico similar. Por lo tanto, la infección pulmonar tras la CHI no debe considerarse únicamente como consecuencia de la exposición al paciente o de cuidados de apoyo; También puede reflejar diferencias en la activación inflamatoria del huésped y en la respuesta inmunitaria.
A pesar de la relevancia clínica de esta complicación, los enfoques prácticos para la estratificación temprana del riesgo siguen siendolimitados 9. Los enfoques clínicos existentes de estratificación de riesgo para la infección pulmonar post-ICH generalmente dependen de variables relacionadas con la cama de paciente y la admisión, como la gravedad neurológica, la edad, la dificultad para deglutición, comorbilidades, procedimientos invasivos y la duración de la exposición del dispositivo. Estas herramientas son clínicamente útiles porque pueden aplicarse rápidamente en entornos de urgencias, cuidados intensivos o cuidados neurocríticos. Sin embargo, las variables clínicas por sí solas pueden no explicar completamente por qué pacientes con gravedad neurológica comparable y exposición a cuidados similares presentan resultados de infección diferentes. Por tanto, los biomarcadores inflamatorios y los factores inmunogenéticos del huésped pueden proporcionar información adicional sobre la susceptibilidad biológica, especialmente durante el periodo inicial posterior al ingreso, cuando se toman decisiones de vigilancia preventiva y manejo respiratorio.
Las citocinas son mediadoras centrales de las respuestas inmunitarias e inflamatorias, y las vías del receptor tipo Toll (TLR) desempeñan un papel clave en el reconocimiento de patógenos y la activación inmunitaria innata. Las mediciones de citocinas séricas y proteínas TLR pueden proporcionar una instantánea de la activación inflamatoria sistémica temprana, mientras que algunos polimorfismos de genes inmunitarios seleccionados pueden reflejar diferencias más estables en la producción de citocinas, la señalización de receptores o la regulación inflamatoria. En comparación con la evaluación clínica sola, un flujo de trabajo combinado de biomarcadores y polimorfismo puede capturar tanto el estado inflamatorio actual como la respuesta inmunitaria subyacente de cada paciente. Este enfoque no pretende sustituir la evaluación clínica junto a la cama, sino complementarla añadiendo información de laboratorio y genética del huésped que pueda ayudar a identificar pacientes que requieren una vigilancia más estricta de la infección tras una ICI espontánea.
Sobre esta base, planteamos la hipótesis de que los pacientes con PCI espontánea que desarrollan infección pulmonar nosocomial exhibirían un perfil inflamatorio distinto junto con una distribución diferente de polimorfismos genéticos relacionados con el sistema inmunitario seleccionados en comparación con los pacientes que permanecen libres de infección. Para poner a prueba esta hipótesis, el presente estudio clínico-laboratorio retrospectivo analizó citocinas séricas posadmisión tempranas, niveles de proteínas séricas de TLR2, TLR4 y TLR9, y seleccionó polimorfismos génicos inflamatorios en pacientes con CHI espontánea primaria. El flujo de trabajo utiliza sangre periférica recogida durante hospitalización aguda, cuantificación de proteínas basada en ELISA, genotipado basado en PCR-RFLP y comparación estadística entre pacientes con y sin infección pulmonar nosocomial. El objetivo era proporcionar un marco reproducible para caracterizar los perfiles inflamatorios y genéticos del huésped asociados al riesgo de infección, apoyando así el reconocimiento más temprano de pacientes de alto riesgo en el entorno hospitalario agudo.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Afiliado de la Universidad de Jiaxing, el Primer Hospital de Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, China (Aprobación nº 2025-LP-599). Todos los procedimientos que involucraron a participantes humanos se llevaron a cabo de acuerdo con los requisitos institucionales y los principios de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito para la recogida de sangre y el uso de datos de todos los participantes y/o de sus representantes legalmente autorizados antes de la recogida de muestras.
Todos los kits comerciales, reactivos, consumibles, instrumentos, software, fabricantes, números de catálogo y especificaciones operativas clave utilizados en este flujo de trabajo se enumeran en la Tabla de Materiales.
Alcance del estudio, elegibilidad y agrupación de pacientes
Este estudio se realizó como un análisis retrospectivo de cohortes clínico-laboratorio monocéntrico de pacientes con hemorragia intracerebral espontánea primaria (PCI) ingresados en el Centro de Urgencias y Cuidados Críticos o en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Afiliado de la Universidad de Jiaxing, el Primer Hospital de Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, China, entre mayo de 2019 y septiembre de 2024. El diagnóstico de PCI fue confirmado mediante tomografía computarizada craneal o resonancia magnética de acuerdo con las Directrices chinas para el Diagnóstico y Tratamiento de la Hemorragia Cerebral (2019)10.
Los pacientes eran elegibles si tenían una CHI primaria espontánea confirmada por imagen, eran admitidos en los 3 días posteriores al inicio de los síntomas y disponían de variables clínicas clave completas, junto con muestras de sangre periférica disponibles para la medición de biomarcadores inflamatorios y análisis genéticos. Se excluyeron pacientes si presentaban hemorragia intracraneal traumática, CHI secundaria, infección pulmonar antes del ingreso o dentro de las 48 horas posteriores al ingreso, alta contra recomendación médica o fallecimiento en un plazo de 48 horas posteriores al ingreso, antecedentes de malignidad o enfermedad autoinmune, o registros clínicos, de laboratorio o genotipados clave incompletos. Tras el cribado, 360 pacientes cumplieron los criterios de elegibilidad y fueron incluidos en el análisis final. De ellos, 180 pacientes desarrollaron infección pulmonar nosocomial durante la hospitalización y 180 no. Los pacientes fueron asignados al grupo de infección pulmonar o al grupo sin infección pulmonar en función de si ocurrió una infección pulmonar nosocomial tras el ingreso.
Antes de la agrupación final, se comprobaron el diagnóstico por imagen, el momento de ingreso, el momento de la infección, la disponibilidad de muestras de sangre y la completitud de los registros clínicos y de laboratorio. Este paso se utilizó para reducir la clasificación errónea y asegurar que todos los casos incluidos tuvieran datos completos para comparación clínica, medición de biomarcadores inflamatorios y genotipado.
Definición de infección pulmonar nosocomial
La infección pulmonar nosocomial se definió sobre la base de la evidencia radiológica combinada con los criteriosclínicos 11. La confirmación radiológica requirió una nueva o progresiva lesión infiltrativa, consolidadora o de vidrio esmerilado en radiografía de tórax o tomografía computarizada. Además, debían estar presentes al menos dos de los siguientes criterios: temperatura corporal > 38 °C, secreciones respiratorias purulentas o recuento periférico de glóbulos blancos anormal con leucocitos < 4 × 109/L o > 10 × 109/L.
La infección pulmonar presente antes del ingreso o diagnosticada en las primeras 48 horas posteriores al ingreso no se clasificó como infección pulmonar nosocomial. La clasificación de la infección se verificó mediante informes radiológicos, registros de temperatura corporal, documentación de secreciones respiratorias, resultados de hemogramas periféricos y registros clínicos de diagnóstico.
Bioseguridad y eliminación de residuos
La sangre humana, suero y ADN derivado de sangre se manipularon bajo las precauciones estándar de bioseguridad nivel 2. El personal de laboratorio llevaba guantes, batas de laboratorio, mascarillas y gafas protectoras durante la manipulación de sangre, la alicuación sérica, las pruebas ELISA, la extracción de ADN, la preparación por PCR, la electroforesis en gel, la digestión por restricción y la visualización UV. Se revisaron los tubos de sangre antes de la procesión para detectar fugas o roturas. La centrifugación se realizaba utilizando tubos tapados o, cuando estaban disponibles, cubos de centrifugadora sellados.
Los objetos punzantes se desechaban inmediatamente en recipientes aprobados para objetos punzantes. Tubos, puntas de pipeta, guantes, placas ELISA y otros consumibles desechados contaminados con sangre fueron descartados como residuos biológicos de laboratorio. Los residuos biológicos líquidos se desinfectaban conforme a los procedimientos institucionales antes de su eliminación. Los geles de agarosa, geles de poliacrilamida, reactivos de tinción y materiales relacionados con la electroforesis fueron descartados conforme a los requisitos institucionales de productos químicos y de residuos de laboratorio.
Se separaron en la medida de lo posible la preparación de reactivos por PCR, la adición de plantillas de ADN, el manejo amplificado del producto, la digestión por restricción y la electroforesis en gel para reducir la contaminación. Se usaron puntas de pipeta resistentes a aerosoles para PCR y manejo de ADN. La visualización UV se realizó únicamente con un escudo protector o un sistema de documentación en gel, evitando la exposición directa de ojos o piel a la luz ultravioleta.
Recogida de sangre periférica y procesamiento de muestras
Para reducir la variación preanalítica, se recogieron 10 mL de sangre venosa periférica a las 08:00 de la mañana siguiente al ingreso, tras un ayuno nocturno de al menos 12 horas. Se extrajeron 5 mL de sangre en un tubo de vacío simple para la preparación del suero, y los 5 mL restantes se extrajeron en un tubo heparinizado para la extracción de ADN genómico.
Antes del procesamiento, se comprobó cada tubo para identificar el paciente, el tiempo de recogida, el tipo de tubo, el volumen sanguíneo, las fugas, la coagulación visible y la hemólisis macroscópica. Las muestras con etiquetado incorrecto, volumen sanguíneo insuficiente, fuga de la trompa o coágulos visibles en la trompa anticoagulada fueron excluidas del análisis posterior. La sangre en el tubo normal se dejó coagular a temperatura ambiente durante 60 minutos, luego se centrifugó a 1.500 × g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante sérico se transfirió a tubos estériles de polipropileno de baja unión a proteínas sin alterar la capa celular, se alicuó en fracciones de 0,5 mL y se almacenó a −80 °C hasta el análisis.
Las muestras que mostraron hemólisis moderada o grave visible fueron excluidas de la cuantificación basada en ELISA. Se registraron muestras ligeramente hemolizadas que no se utilizaron para el análisis primario de citocinas. Se señalaron muestras con turbidez visible, lipemia evidente, volumen residual insuficiente o exposición repetida por congelación y descongelación antes de la prueba. Ninguna alícuota sérica pasó por más de un ciclo de congelación y deshielo antes del análisis.
Cuantificación de citocinas por ELISA
Se midieron concentraciones séricas de IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ y TNF-α utilizando kits ELISA sándwich humanos disponibles comercialmente validados para muestras de suero. Las alicuotas séricas se descongelaron, mezclaron suavemente y se inspeccionaron para detectar hemólisis, turbidez, lipemia, volumen insuficiente e historial de congelación-deshielo antes de cargar.
Se cargaban estándares, pozos en blanco y muestras de suero en duplicado. Se generaban curvas estándar en cada placa utilizando diluciones en serie de concentraciones estándar y un control en blanco, según las instrucciones del kit. La densidad óptica se midió a 450 nm, con una corrección de referencia a 570 nm, utilizando un lector de microplacas calibrado. Las concentraciones se calcularon mediante ajuste de curvas logísticas de cuatro parámetros.
Los resultados del ensayo solo se aceptaron cuando la curva estándar mostró un patrón de concentración-respuesta adecuado, los pozos en blanco mostraron un fondo bajo y el coeficiente de variación de la muestra duplicada fue ≤ 10%. Las muestras con duplicado de CV > 10% se reanalizaron a partir de la alícuta sérica original cuando hubo suficiente volumen disponible. Las muestras fuera del rango fiable de curvas estándar se diluyeron o repetieron según las instrucciones del kit. Se repetían las planchas que mostraban estándares inconsistentes, fondos excesivos o efectos de borde evidentes.
Los límites analíticos más bajos de detección utilizados para la aceptación de datos fueron 2,0 pg/mL para IL-1β, 1,5 pg/mL para IL-6, 2,0 pg/mL para IL-10, 3,0 pg/mL para IL-17, 4,0 pg/mL para IFN-γ y 2,5 pg/mL para TNF-α. Los valores finales de las citocinas se comprobaron con identificadores de muestras, mapas de placas, registros de lecturas duplicadas y notas de calidad muestral antes del análisis estadístico.
Cuantificación de TLR2, TLR4 y TLR9 séricos por ELISA
Se midieron los niveles de proteínas séricas TLR2, TLR4 y TLR9 utilizando kits ELISA humanos disponibles comercialmente validados para muestras de suero. Las muestras de suero se descongelaron, mezclaron suavemente e inspeccionaron utilizando los mismos criterios de calidad de muestra aplicados a la medición de citocinas.
Se analizaron en duplicado los estándares, pozos en blanco y muestras de suero. Las placas se leyeron a 450 nm con corrección de referencia a 570 nm, y las concentraciones se calcularon mediante regresión logística de cuatro parámetros. Los resultados se aceptaron cuando la curva estándar era válida, los pozos en blanco estaban dentro del rango de fondo esperado y el CV duplicado era ≤ 10%. Las muestras que superaban este umbral de CV duplicado se volvieron a analizar cuando quedaban suficientes muestras.
Los límites analíticos inferiores de detección utilizados para la aceptación de resultados fueron 0,10 ng/mL para TLR2, 0,12 ng/mL para TLR4 y 0,15 ng/mL para TLR9. Los valores finales de TLR2, TLR4 y TLR9 se comprobaron frente a identificadores muestrales, mapas de planchas, registros de lectura duplicada y notas de calidad muestral antes del análisis estadístico.
Extracción de ADN genómico
El ADN genómico se extrajo de sangre entera heparana anticoagulada utilizando un kit de extracción de ADN genómico sanguíneo basado en columna de sílice. Antes de la extracción, se comprobaron muestras de sangre anticoaguladas para comprobar si estaban correctamente marcados, volumen suficiente, coagulación visible, fugas y condiciones de almacenamiento.
La pureza y concentración del ADN se evaluaron mediante espectrofotometría. Solo se aceptaron muestras con una relación A260/A280 entre 1,80 y 2,00 para amplificación PCR descendente. Las muestras fuera de este rango se volvieron a medir tras una mezcla suave. Si la razón de pureza anormal persistía, la extracción de ADN se repetía cuando quedaba suficiente sangre total.
El ADN se diluyó con agua libre de nucleasas hasta alcanzar una concentración operativa de 50 ng/μL y se almacenó a -20 °C hasta la amplificación por PCR. Antes de la instalación de la PCR, cada muestra de ADN se comprobaba para determinar la concentración, pureza, identificador de la muestra y historial de congelación-descongelación.
Genotipado por PCR-RFLP y llamada de genotipos
La genotipado se realizó utilizando polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción por reacción en cadena de la polimerasa (PCR-RFLP) para IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, TNF-α-308 G/A, TLR2-196 a 174 ins/del, TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile, TLR9 rs187084, IFN-γ +874 A/T e IFN-γ +2108 A/G. Las secuencias cebadoras específicas del locus, tamaños esperados de amplicones, enzimas de restricción y patrones digestivos específicos del genotipo se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1.
La amplificación por PCR se realizó en un volumen de reacción final de 25 μL que contenía 2,5 μL de 10 × tampón, 2,0 μL de mezcla dNTP a 2,5 mM cada uno, 1,0 μL de cebador directo a 10 μM, 1,0 μL de cebador inverso a 10 μM, 0,25 μL de ADN polimerasa Taq a 5 U/μL, 2,0 μL de ADN genómico a 50 ng/μL, y 16,25 μL de agua libre de nucleasa. La mezcla maestra PCR se preparó en una zona limpia de pre-PCR, y la plantilla de ADN se añadió al final. En cada prueba de PCR se incluía un control negativo sin plantilla.
El perfil térmico consistió en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, recocido a 58–62 °C durante 30 s dependiendo del par de cebadores, y extensión a 72 °C durante 30 s, con una extensión final a 72 °C durante 7 min. Los productos PCR se confirmaron primero con gel de agarosa al 1,5% antes de la digestión por restricción.
La amplificación por PCR solo se aceptaba cuando la banda esperada del amplicón era visible, y el control sin plantilla mostraba amplificación. Las reacciones que mostraron bandas débiles, amplificación inespecífica, interferencia cebador-dímero o contaminación en el control negativo se repetieron a partir de la plantilla original de ADN.
Los productos de PCR se digerieron con la endonucleasa de restricción correspondiente a 37 °C durante 3 horas en un volumen digestivo total de 15 μL según las instrucciones del fabricante. Los fragmentos digeridos se resolvieron con gel de agarosa al 2,5% para la mayoría de los loci. El locus TLR2-196 a -174 ins/del se resolvió en gel de poliacrilamida al 8% para mejorar la discriminación de fragmentos.
La digestión por restricción solo se aceptó cuando los patrones de fragmentos coincidían con el perfil de digestión específico del genotipo esperado. Se repetían reacciones que mostraban digestión incompleta, bandas difuminadas, tamaños inesperados de fragmentos o separación poco clara. Las bandas se visualizaron bajo iluminación ultravioleta tras la tinción de ácidos nucleicos. Las imágenes del gel se guardaban con el identificador de la muestra, nombre del locus, fecha de ejecución y número de gel.
La asignación de genotipos fue realizada de forma independiente por dos investigadores de laboratorio ciegos. Las llamadas de genotipo discordantes o ambiguas se revisaron utilizando la imagen original en gel y se repitieron mediante amplificación por PCR cuando fue necesario. El diez por ciento de las muestras seleccionadas al azar fue re-genotipado para control de calidad, y la tasa de concordancia fue del 99,2%. Los datos finales de genotipo se introdujeron en el conjunto de datos de análisis solo después de que se hubieran comprobado los identificadores de muestras, nombres de locus, llamadas de genotipos y registros de control de calidad.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un software de análisis estadístico adecuado. Los conjuntos de datos clínicos, ELISA y genotípicos se fusionaron utilizando códigos de pacientes desidentificados. Los códigos de los pacientes se comprobaron antes del análisis para detectar duplicación, desajuste y valores ausentes. Se utilizó una estrategia de casos completos porque todos los pacientes incluidos disponían de datos clave clínicos, inflamatorios y de genotipado.
En un software de análisis estadístico adecuado, el estado de infección pulmonar se codificó como la variable de agrupación, utilizando el grupo sin infección pulmonar como categoría de referencia. Las variables continuas se probaron primero para comprobar su normalidad mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Las variables continuas normalmente distribuidas se expresaron como media ± desviación estándar y se compararon utilizando la prueba t de Student con muestras independientes. Las variables continuas no distribuidas normalmente se informaron como medianas con rangos intercuartílicos y se compararon utilizando la prueba U de Mann-Whitney. Las variables categóricas se expresaron como conteos y porcentajes y se compararon usando la prueba del chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher, según correspondá.
Las distribuciones de genotipos en el grupo sin infección pulmonar se evaluaron para el equilibrio de Hardy-Weinberg antes del análisis de asociación. Las frecuencias de genotipo y alelo se resumieron en n (%). Se estimaron razones de probabilidad y intervalos de confianza del 95% para el riesgo de infección pulmonar utilizando modelos de regresión logística multivariable. El estado de infección pulmonar se introdujo como variable dependiente. Las variables genotipo, alelo o biomarcador se introdujeron como variables independientes, según se especificara para cada análisis.
La edad y el sexo se introducían en el modelo principal a priori. IMC, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad cardíaca, fuga de líquido cefalorraquídeo, tiempo de permanencia del drenaje y la categoría de ingreso en la Escala de coma de Glasgow se introdujeron simultáneamente en el modelo completamente ajustado porque estas variables eran clínicamente relevantes o mostraban desequilibrio basal entre grupos. La multicolinealidad se evaluó utilizando factores de inflación de la varianza (VIFs), y se consideraron aceptables los VIFs <5,0.
Debido a que se probaron múltiples polimorfismos, se aplicó la corrección de la tasa de descubrimiento de errores de Benjamini-Hochberg a los análisis de asociacióngenética 12. Los valores P de las pruebas de asociación genética se clasificaron de menor a mayor, y se determinó la significación corregida según el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Todas las pruebas fueron bilaterales, y P <0,05 se consideró estadísticamente significativa salvo que se especifique lo contrario tras el ajuste por comparación múltiple.
Los resultados finales se comprobaron con el conjunto de datos fuente, los registros de control de calidad de ELISA, los registros de llamada de genotipos y los valores de las tablas antes de la preparación del manuscrito. Los resultados se interpretaron como asociaciones más que como efectos causales porque el estudio utilizó un diseño observacional retrospectivo.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Indicadores clínicos
Las características clínicas basales se resumen en la Tabla 1. En el análisis final se incluyeron un total de 360 pacientes con hemorragia intracerebral espontánea, comprendiendo 180 pacientes que desarrollaron infección pulmonar nosocomial durante la hospitalización y 180 pacientes que no la tuvieron. No hubo diferencias significativas entre grupos en edad (62,4 años ± 6,8 años frente a 63,6 años ± 7,0 añ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
La hemorragia intracerebral espontánea (CHI) sigue siendo uno de los subtipos de ictus más graves y sigue imponiendo una mortalidad temprana sustancial y cargas de discapacidad a largoplazo 13. En la práctica clínica, los pacientes con PCI son especialmente vulnerables a complicaciones hospitalarias porque la lesión neurológica puede debilitar la protección de las vías respiratorias, reducir la eficacia de la tos, restringir la movilidad y aumentar la exposición a...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni otros conflictos de interés relacionados con esta obra.
Los autores agradecen al personal clínico implicado en la atención al paciente y a las personas que ayudaron con la recuperación de la literatura y la organización de datos. Este estudio fue apoyado por el Proyecto de Planificación de Ciencia y Tecnología de la Salud de la Ciudad de Jiaxing (Grant No. JWKJ-25005).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Human TNF-α ELISA Kit | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | KHC3011 | Kit ELISA para la medición cuantitativa de TNF-α humano en suero. |
| Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA Kit | Sigma-Aldrich / Merck | RAB0744-1KT | Kit ELISA de 96 pocillos para la medición de TLR2 humano en muestras de suero o plasma. |
| Human TLR4 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP3-11807 | Kit ELISA sándwich colorimétrico para la medición de TLR4 humano en suero, plasma u otros fluidos biológicos. |
| Human TLR9 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP2-76574 | Kit ELISA colorimétrico para la medición de TLR9 humano en muestras de suero. |
| Absorbance microplate reader | Agilent BioTek | 800 TS | Lector de microplacas para medición de la densidad óptica ELISA a 450 nm con corrección de referencia a 570 nm. |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | QIAGEN | 51104 | Kit basado en membrana de sílice para la extracción de ADN genómico de sangre total anticoagulada. |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Espectrofotómetro de microvolumen para la concentración de ADN y evaluación de pureza A260/A280. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific | A24811 | Ciclador térmico utilizado para amplificación PCR de punto final en genotipado PCR-RFLP. |
| PCR Master Mix, 2X | Thermo Scientific | K0171 | Reactivos PCR premezclados que contienen ADN polimerasa Taq, dNTPs, MgCl2 y tampón de reacción; utilizados para amplificación PCR convencional. |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0401 | Fuente alternativa de enzimas para reacciones PCR específicas de locus cuando se utilizan componentes PCR separados en lugar de mezcla maestra 2X. |
| Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | Agua de grado molecular para biología utilizado para la configuración de PCR, dilución de ADN y controles sin plantilla. |
| Custom DNA primers | Sangon Biotech | Síntesis personalizada | Primers específicos del locus para genotipado PCR-RFLP; las secuencias de los primers están listadas en la Tabla Suplementaria S1. |
| Restriction endonucleases for PCR-RFLP | Thermo Scientific / New England Biolabs | Enzimas específicas del locus listadas en la Tabla Suplementaria S1 | Enzimas de restricción utilizadas para la digestión específica del genotipo de productos PCR. La enzima seleccionada para cada locus debe coincidir con el patrón de digestión listado en la Tabla Suplementaria S1. |
| Agarose I, molecular biology grade | Thermo Scientific | 17850 | Agarosa para la preparación de geles al 1,5% y 2,5% utilizados para confirmar productos PCR y resolver la mayoría de los fragmentos RFLP. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0371 | Marcador de tamaño de ADN para amplicones PCR y estimación del tamaño de fragmentos RFLP. |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | S33102 | Tinte para gel de ácidos nucleicos para la visualización de ADN en geles de agarosa o acrilamida; utilizado como una alternativa de menor peligro al bromuro de etidio. |
| Horizontal agarose gel electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-Sub Cell GT system / 1704360 base | Sistema de electroforesis para la separación en gel de agarosa de productos PCR y RFLP. |
| Vertical PAGE electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001 | Sistema de electroforesis vertical para la separación en gel de poliacrilamida al 8% cuando se requiere una mayor discriminación de fragmentos. |
| Gel documentation system with UV or blue-light transillumination | Bio-Rad / equivalent laboratory system | Gel Doc XR+ o equivalente | Sistema de imagen para documentar bandas de ADN teñidas después de la electroforesis en gel. Utilice protección UV o modo de luz azul cuando esté disponible. |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf / equivalent laboratory centrifuge | 5424 R o equivalente | Centrífuga refrigerada utilizada para la separación de suero a 1,500 × g y 4 °C. |
| −80 °C ultra-low temperature freezer | Thermo Scientific / equivalent laboratory freezer | Forma 900 Series o equivalente | Almacenamiento de alícuotas de suero antes del análisis ELISA. |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Versión 25.0 | Software estadístico utilizado para estadísticas descriptivas, pruebas de normalidad, comparaciones de grupos, regresión logística y exportación de salida del modelo. |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel para Microsoft 365 | Utilizado para la verificación de datos, organización de mapas de placas, revisión de valores duplicados y preparación de archivos de análisis combinados antes del análisis SPSS. |
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.