Farmacología en red y verificación experimental para explorar la corteza cinnamomia frente a osteonecrosis inducida por esteroides de la cabeza femoral

Resumen

Este estudio tiene como objetivo explorar los posibles mecanismos de la corteza de Cinnamomi en el tratamiento de la osteonecrosis de la cabeza femoral mediante la integración de farmacología de redes, simulaciones de dinámica molecular y experimentos con animales.

Resumen

La osteonecrosis de la cabeza femoral inducida por esteroides (SONFH) provoca dolor intenso y movilidad limitada, lo que afecta significativamente la calidad de vida de los pacientes. Se ha demostrado que la corteza cinnamomia (CC) alivia eficazmente esta condición, pero su mecanismo de acción sigue siendo incierto. Este estudio tiene como objetivo identificar los compuestos activos de la CC y explorar sus mecanismos en la SONFH. Los constituyentes activos fueron evaluados utilizando las bases de datos HERB 2.0, PubCem y SwissADME, y sus objetivos correspondientes se predijeron usando la base de datos Swiss Target Prediction. Los objetivos para SONFH se identificaron intersectando objetivos de bases de datos GEO, DisGeNET, GeneCards y OMIM con los objetivos relacionados con el compuesto. Se construyó una red de interacción proteína-proteína (PPI) utilizando la base de datos STRING, y se realizaron análisis de enriquecimiento GO y KEGG mediante la base de datos DAVID. Las interacciones compuesto y objetivo más prometedoras se validaron mediante acoplamiento molecular (MD) y simulaciones de dinámica molecular. Los investigadores identificaron 563 objetivos potenciales, incluidos 61 relacionados con SONFH, con AKT1, HIF-1α y STAT3 como nodos centrales. El análisis de enriquecimiento KEGG destacó la vía de señalización HIF-1α como un mecanismo clave. Además, experimentos con animales demostraron que la fracción activa de CC mitigaba eficazmente el daño estructural femoral en la cabeza en un modelo murino con SONFH. Los hallazgos sugieren que la CC puede mejorar la SONFH coordinando la adaptación a la hipoxia y regulando la angiogénesis y osteogénesis.

Introducción

La osteonecrosis de la cabeza femoral inducida por esteroides (SONFH) es un trastorno osteoarticular grave, causado por la interrupción o reducción del suministro sanguíneo a la cabeza femoral por varios¹. La muerte de las células ósea y de los componentes de la médula ósea provoca daños estructurales en la cabeza femoral y deterioro funcional de la articulación^{de la cadera 2}. Clínicamente, los pacientes suelen presentar dolor de cadera y movilidad^{limitada 3}. Sin un tratamiento eficaz, el 80% de los pacientes con SONFH progresarán al colapso femoral de la cabeza, requiriendo un reemplazo total^{de cadera 4}. Supone una fuerte presión psicológica y una gran carga económica sobre^{los pacientes 5}. La práctica clínica recomienda el uso de una combinación de anticoagulantes, medicamentos fibrinolíticos, vasodilatadores y fármacos que reducen los lípidos para tratar la SONFH, que han demostrado cierto potencial clínico pero generalmente una eficacia terapéutica limitada⁶.

La medicina tradicional china (MTC) ha demostrado cada vez más su impacto positivo en el tratamiento de la^{SONFH 7}. La MTC muestra potencial para aliviar los síntomas, controlar la enfermedad y mejorar la movilidad articular y la calidad de vida de los^{pacientes 8}. Clínicamente, la CC y sus componentes se han utilizado ampliamente para mejorar la SONFH, mostrando una eficacia^{notable 9}. Numerosas sustancias bioactivas encontradas en el CC tienen diversas acciones biológicas, incluyendo propiedades antiinflamatorias, antioxidantes, promotoras de la angiogénesis y mejoradoras de la^{microcirculación.} Investigaciones previas en ingeniería tisular ósea y metabolismo han establecido que el cinalaldehído, un componente activo principal de la CC, puede modular las vías de señalización relacionadas con la remodelación^{ósea 11}. El estudio inicial indicó que las Pastillas de Yougui (YGP) tienen potencial terapéutico para la SONFH al promover la angiogénesis y potenciar las respuestas^{inflamatorias 12}. Como fármaco soberano en los YGP, el CC puede calentar el yang y beneficiar el qi y desbloquear los meridianos, produciendo efectos terapéuticos beneficiosos sobre^{SONFH 13}. No obstante, los mecanismos precisos que subyacen a su eficacia siguen sin estar claros. Aclarar la red reguladora multi-objetivo que utiliza el CC para mejorar la SONFH no solo ayudaría a comprender su naturaleza farmacológica, sino que también fomentaría su uso clínico sensato y la creación de mejoras relacionadas. Integrar la bioinformática con la farmacología de redes proporciona un enfoque eficaz para esclarecer los mecanismos de acción¹⁴.

La farmacología en redes puede identificar componentes bioactivos en las hierbas y predecir las asociaciones entre estos componentes farmacéuticos y los objetivos^{génicos 15}. La DM se emplea para validar las interacciones de unión entre compuestos activos candidatos y objetivos terapéuticos clave. La dinámica molecular utiliza la mecánica newtoniana para evaluar la estabilidad y flexibilidad de unión ligando-receptor mediante la simulación^{de movimiento 16}. Los autores investigaron de forma exhaustiva los posibles efectos de la CC sobre SONFH utilizando farmacología de redes, MD y simulaciones de dinámica molecular. Los hallazgos proporcionan una referencia para futuras investigaciones profundas sobre la base y mecanismo farmacodinámico de los materiales de la CC para mejorar la SONFH. El diagrama de flujo del estudio se muestra en la Figura 1.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Experimental Animal de la Universidad de Medicina China de Zhejiang (IACUC-20240708-22) y cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio emitida por los Institutos Nacionales de Salud. En este experimento se utilizaron veinte ratones hembras C57BL/6J de 10 semanas de edad que pesaban entre 20 y 22 g. Estos ratones fueron obtenidos del centro animal de la Universidad Médica China de Zhejiang. Consulte la Tabla de Materiales para una lista de todos los reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.

Cribado de compuestos activos y objetivos de CC
Se identificaron compuestos químicos de CC utilizando la hierba 2.0¹⁷ con la palabra clave "CC". Los químicos sin ID de PubChem o con el mismo ID fueron filtrados. Luego fusiona y elimina duplicados para obtener los sitios objetivo correspondientes a CC. Realiza un cribado inicial usando la base de datos^{PubChem 18} basada en la regla de cinco de Lipinski (Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹. Los autores utilizan la base de datos PubChem para determinar la representación SMILES de cada compuesto químico. Utilizando la base de datos SwissADME, los autores seleccionan compuestos con restricción de absorción "alta" de IG y valores de ≥2 "Sí" en la similitud de^{fármacos 20}. Utiliza la base de datos Swiss-Target^{Prediction 21} para extraer proteínas objetivo con probabilidad superior a cero. Luego fusiona y elimina duplicados para obtener los sitios destino correspondientes a CC.

Compilación de dianas génicas asociadas a SONFH
Los objetivos relacionados con SONFH se obtuvieron de bases de datos: base de datos^{DisGeNET 22}; Base de datos^{GeneCards 23}; Base de datos^{OMIM 24} y base de datos^{GEO 25}. Los autores descargaron y deduplicaron los genes SONFH de las bases de datos OMIM y DisGeNET. Un total de 233 objetivos relacionados con enfermedades se obtuvieron de la base de datos GeneCards tras eliminar duplicados. Todos los objetivos recuperados tenían puntuaciones de relevancia superiores a 0 y se incluyeron para análisis posteriores. La puntuación mínima de relevancia entre los genes recuperados fue de 6,48. Los genes diferencialmente expresados (DEGs) relacionados con SONFH se obtuvieron de la serie GSE123568 en la plataforma GPL15207 en la base de datos GEO. Los efectos en lote se corrigieron usando el paquete limma en R, y se identificaron genes diferencialmente expresados (DEGs) con criterios de |logFC| > 1 y P < 0,05²⁶. El paquete ggplot2 se utilizó para crear un gráfico volcánico que visualizara la distribución de los DEGs, y se produjo un mapa de calor para presentar los hallazgos. La biblioteca de objetivos de la enfermedad SONFH se estableció eliminando objetivos duplicados usando el paquete de Venn en R.

Establecimiento de la red PPI
Basándose en los objetivos anticipados de los componentes activos de los objetivos relacionados con CC y SONFH, Venny 2.1.0²⁷ creó un diagrama de Venn. Con el objetivo de adquirir datos de PPI, los autores importaron los objetivos a la base de datos^{STRING 28}. La limitación del criterio de cribado del organismo era "Homo sapiens" con el índice de confianza ≥0,4. Los autores utilizaron Cytoscape 3.7.2 para establecer los objetivos clave de la red PPI. La centralidad de grado (DC) se utilizó para examinar objetivos clave de red PPI. El filtro de parámetros es más del doble del valor mediano. Con el propósito de especificar más a fondo los objetivos clave, se empleó el complemento de Cytoscape.

Se realizaron análisis de enriquecimiento utilizando bases de datos de ontología génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG)
Los objetivos comunes de CC y SONFH se analizaron para análisis de enriquecimiento GO y KEGG a través de la base^{de datos DAVID 29}. Para visualizar los 10 términos GO principales y las 20 mejores rutas KEGG, se utilizó Wei Sheng^{Xin 30} para dibujar el gráfico de burbujas de puntos de enriquecimiento.

Construcción de la red
Los mecanismos moleculares de la CC en la mejora de la SONFH se elucidaron a través de las redes hierba-compuesto-objetivo (H-C-T) y vía compuesto-objetivo (C-T-P). El software Cytoscape 3.10.3 ilustraba las redes. La red H-C-T se desarrolló utilizando los compuestos activos de CC y sus objetivos compartidos. Luego usa la herramienta Analizar Red. Para mejorar la comprensión de las relaciones entre vías, compuestos y objetivos, las 20 principales vías, junto con sus objetivos y compuestos relacionados, se organizaron en una red C-T-P mediante Network Tools.

Verificación de MD
Los objetivos principales: HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3 y EGFR se obtuvieron a partir del análisis de IBP. El objetivo fue buscado por la base de datos^{Uniport 31} con la limitación de Human y revisado por la base de datos RCSB^{PDB 32}. Se seleccionaron estructuras proteicas humanas con resolución relativamente alta. Los principios activos se identificaron a partir de la red C-T-P. Sus estructuras 3D correspondientes se descargaron en formato mol2 desde la base de datos PubChem. Cada archivo se abría en Chem3D y se minimizaba la energía. Después, los autores utilizaron el software^{AutoDockTools 33} para realizar la deshidratación, hidrogenación y cálculo de las cargas de Gasteiger de la proteína receptora. Tanto ligandos como receptores se mantuvieron en formato PDBQT. Basándose en la ubicación espacial y la capacidad de acoplamiento, los autores evalúan la viabilidad y estabilidad del acoplamiento. A través del AutoDock Vina, se predijo la caja de la rejilla de acoplamiento y la macromolécula. En esta investigación, todos los enlaces rotativos del ligando se permitieron rotar libremente, mientras que los receptores se establecieron como rígidos. La puntuación de acoplamiento indica la afinidad de unión entre el receptor y el ligando; cuanto menor sea la puntuación, mayor será la afinidad de vinculación. De acuerdo con este principio, los autores seleccionan las conformaciones con la energía de unión más favorable para investigar las interacciones de unión de ligandos con proteínas. Los resultados visuales fueron exhibidos por PyMOL.

Simulación de dinámica molecular
Las simulaciones de dinámica molecular se realizaron utilizando GROMACS³⁴ con el campo de fuerzas CHARMM36. El complejo proteína-ligando se centró en una caja cúbica periódica de simulación con una distancia mínima entre la caja de soluto y 1,0 nm, y el sistema se resolvió utilizando el modelo de agua SPC216. El sistema fue neutralizado añadiendo contraiones Na⁺ y Cl⁻ apropiados. La minimización de energía se realizó secuencialmente utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado, seguido del método del gradiente conjugado para eliminar contactos atómicos desfavorables. Las interacciones electrostáticas a largo alcance se calcularon utilizando el método de malla de partículas de Ewald (PME) con una distancia de corte de 10 Å. Todos los enlaces covalentes que involucraban átomos de hidrógeno estaban restringidos mediante el algoritmo LINCS. La temperatura se mantenía en 300 K usando el termostato de reescala en V, y la presión se controlaba a 1 bar usando el baróstato de Berendsen con acoplamiento isotrópico. Se aplicaron restricciones de posición al ligando con una constante de fuerza de 1000 kJ·mol⁻¹·nm⁻² durante la etapa de equilibrio. Tras la minimización de energía, el sistema se equilibró con simulaciones de 2 ns NVT y 2 ns NPT, seguidas de una simulación de dinámica molecular de producción de 100 ns con un paso de tiempo de 2 fs. Las coordenadas atómicas se registraban cada 10 ps para el análisis posterior de la trayectoria.

Validación experimental en un modelo de ratón SONFH
Animales y el establecimiento modelo SONFH
Se obtuvieron veinte ratones hembras C57BL/6J, de 10 semanas y con un peso de 20 a 22 g, del centro veterinario de la Universidad Médica China de Zhejiang. Los ratones pasaron por un periodo de aclimatación de 7 días en un entorno controlado y se les dio acceso sin restricciones a comida y agua. Todos los ratones fueron asignados aleatoriamente a los grupos (n = 5 por grupo): el grupo de control, el grupo SONFH, el grupo de baja dosis SONFH + CC (CC-Bajo, 7,5 g/kg/d) y el grupo de alta dosis SONFH + CC (CC-Alto, 15 g/kg/día). El modelo SONFH se estableció tal y como se describió anteriormente. En resumen, los ratones de los grupos SONFH, SONFH + CC-Low y SONFH + CC-High recibieron dos inyecciones intravenosas de lipopolisacáridos (LPS; 20 μg/kg) en el día 0. Posteriormente, se administraron tres inyecciones intramusculares de metilprednisolona (MPS; 40 mg/kg) cada 24 horas, comenzando 24 horas después de las inyecciones LPS. A los ratones de los grupos de tratamiento se les administró extracto de CC mediante gavage oral diariamente durante 6 semanas, a partir del día de la última inyección de MPS. Los ratones del grupo de control recibieron volúmenes equivalentes de solución salina en los momentos correspondientes.

Recogida y preparación de muestras
Al final del periodo de tratamiento de 6 semanas, los ratones fueron sacrificados. Las cabezas femorales bilaterales fueron cuidadosamente diseccionadas y extraídas. Para cada animal, la cabeza femoral izquierda se fijó durante 48 horas a 4 °C para posterior descalcificación e incrustación de parafina. Se fijó la cabeza femoral derecha y luego se utilizó directamente para la micro-TC sin descalcificación.

Análisis histológico (Tinción ABH)
Tras la descalcificación y la incrustación de parafina, se teñieron secciones femorales de la cabeza utilizando un protocolo de Alcian Blue/Hematoxilina (ABH) para evaluar los cambios en osteonecrosis. Brevemente, se teñieron secciones con azul alciano al 1% (pH 2,5) durante 30 minutos, se enjuagaron y luego se contra-tinturaron con hematoxilina Harris. Tras la deshidratación y el montaje, se tomaron las láminas bajo un microscopio óptico. La cuantificación de la osteonecrosis fue realizada por dos observadores cegados utilizando el software ImageJ. La proporción de lagunas vacías se calculó como (número de lagunas vacías/número total de lagunas) × 100% en tres campos de alta potencia seleccionados aleatoriamente por muestra dentro de la región subcondral. La proporción de núcleos picnóticos se determinó de manera similar.

Análisis por tomografía microcomputarizada (Micro-CT)
La microestructura ósea tridimensional de la cabeza femoral se analizó mediante un escáner micro-TC de alta resolución. Las muestras fijas se escaneaban a una resolución de 10 μm (70 kV, 114 μA). Se reconstruyó y analizó un volumen esférico de interés (VOI) estandarizado que abarcaba la región primaria de carga de peso utilizando software CTAn. Se cuantificaron los siguientes parámetros morfométricos: Volumen Óseo/Volumen Total (BV/TV), Grosor Trabecular (Tb.Th) y Separación Trabecular (Tb.Sp).

Tinción por inmunofluorescencia (IF)
Para evaluar el microambiente óseo, se realizó tinción por inmunofluorescencia en secciones de parafina. Tras la extracción y bloqueo de antígenos, se incubaron secciones durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-HIF-1α (1:200), anti-ALP para conejo (1:300) y anti-VEGF para conejo (1:150). Tras el lavado, se incubaron secciones con una mezcla de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos: IgG anticonejo marcado con Alexa Fluor 488, IgG anticonejo marcado con Alexa Fluor 555. Los núcleos se contra-tinturaron con DAPI. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia bajo ajustes de exposición consistentes. La intensidad relativa de fluorescencia para cada marcador se cuantificó utilizando el software ImageJ en tres campos por muestra.

Análisis estadístico
Todos los datos cuantitativos se presentan en media ± desviación estándar (DS). El análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey se realizó utilizando el software GraphPad Prism (versión 9.0) para determinar la significación estadística entre grupos. Se consideró estadísticamente significativo un valor P inferior a 0,05.

Resultados

Identificación de componentes activos y objetivos predichos de CC y desarrollo de la red "H-C-T".
Para explorar los mecanismos de los componentes clave y objetivos de la CC en la mejora de SONFH, los autores utilizaron la base de datos HERB 2.0 para identificar todos los componentes de CC evaluados. Se encontraron 85 compuestos bioactivos probables de los 209 constituyentes activos candidatos de CC (Tabla Suplementaria 1). Utilizando la plataforma suiza de predicción de objetivos y eliminando entradas duplicadas e inválidas, se obtuvieron 563 objetivos supuestos correspondientes a estos componentes de CC (Tabla Suplementaria 2). Los autores han identificado los componentes activos y objetivos de la CC.

Investigar los mecanismos moleculares implicados en el inicio y progresión de SONFH e identificar posibles blancos biomarcadores. El análisis del conjunto de datos GSE123568 en la base de datos GEO identificó DEGs asociados a SONFH, incluyendo 207 genes regulados al alza y 216 a la baja. El gráfico volcánico de los 425 DEGs se muestra en la Figura 2A, mientras que los patrones de expresión de los 60 DEGs principales ordenados por nivel de expresión se presentan como un mapa de calor en la Figura 2B, con la intensidad del color reflejando los valores de expresión transformados en logaritmómetro. Las bases de datos DisGeNET, OMIM y GeneCards proporcionaban 711 objetivos vinculados a SONFH. Combinando los 425 DEGs de la base de datos GEO, un total de 1136 objetivos están vinculados a SONFH. Tras la eliminación de duplicados, se confirmaron 1115 objetivos relacionados con SONFH, como se ilustra en la Figura 2C. Los autores han establecido preliminarmente una biblioteca de objetivos de enfermedades para SONFH.

Para identificar objetivos y componentes principales, un análisis de intersección entre los 563 objetivos de CC y los 1115 objetivos relacionados con SONFH identificó 61 objetivos comunes (Figura 3A y Tabla Suplementaria 3), que se incorporaron a Cytoscape 3.10.3 para construir la red "H-C-T" (Figura 3B). Esta red constaba de 147 nodos y 413 aristas. El análisis topológico indicó que (s)-4-nonanolido (grado:16), isohomogenol (grado:15), acetato de neril (grado:14), melilotocarpano A (grado:14), 3-metoxicinnamaldehído (grado:13) mostraron la mayor conectividad con los blancos proteicos.

Desarrollo y evaluación topológica de la red PPI.
Para explorar más a fondo los objetivos de CC en la mejora de SONFH. Cytoscape 3.10.3 se utilizó para visualizar la red PPI después de que se introdujeran 61 objetivos idénticos en la base de datos STRING. Había 463 aristas y 60 nodos en la red. En la Figura 4A, los nodos pasan en color y tamaño de más claro y pequeño a más oscuro y grande, lo que indica un aumento de grado de bajo a alto. El complemento MCODE facilitó la agrupación de estos objetivos en dos módulos funcionales (Figura 4A), entre los cuales el clúster 1 contenía 23 nodos y 216 aristas, con una puntuación de 19,636. Para caracterizar aún más la arquitectura de la red, se utilizaron DC, BC y CC como métricas topológicas. Con los valores medianos de estos parámetros establecidos como puntos de corte, los autores identificaron 8 objetivos activos (Figura 4B). El plugin CytoHubba utilizaba el algoritmo MCC para clasificar los nodos, identificando los 10 genes principales. (Figura 4C).

Análisis de enriquecimiento GO
Para explorar más a fondo los mecanismos de la CC en la mejoría de la ONFH, se realizó un análisis de enriquecimiento de GO en 61 posibles objetivos, utilizando BP, CC y MF. Se enriquecieron un total de 435 mandatos de GO, incluyendo 293 mandatos BP, 41 mandatos CC y 101 mandatos MF. Estos hallazgos se muestran en las Tablas Suplementarias 4, 5 y 6. La Figura 5A presenta visualmente los 10 términos más enriquecidos de BP, CC y MF usando un gráfico de burbujas. Los hallazgos indicaron que los términos BP estaban principalmente asociados con la transducción de señales, regulación positiva de la transcripción por ARN polimerasa II, regulación negativa del proceso apoptótico, regulación positiva de la transcripción con plantilla de ADN y regulación negativa de la transcripción por ARN polimerasa II. El análisis reveló que los términos MF estaban principalmente implicados en la unión a proteínas, la unión a iones metálicos y la unión idéntica a proteínas. Los resultados de la CC demostraron que la mayoría de los objetivos estaban ubicados principalmente en el citoplasma, la membrana y la membrana plasmática.

Análisis de KEGG
Para obtener información sobre los posibles mecanismos bioquímicos por los cuales la CC podría mejorar la SONFH, se realizó un análisis de enriquecimiento de vías KEGG para esclarecer los mecanismos bioquímicos a través de los cuales la CC podría mejorar la SONFH. Utilizando un criterio de cribado de P < 0,05 y FDR < 0,05, se identificaron 48 entradas de enriquecimiento KEGG (Tabla Suplementaria 7). Las 20 vías más enriquecidas significativamente, determinadas por el enriquecimiento y el recuento de pliegues, se visualizaron usando diagramas de burbujas y barras (Tabla 1, Figuras 5B y 5C). Utilizando Cytoscape 3.10.3, se construyó una red C-T-P con 167 nodos y 589 aristas (Figura 5D). Los efectos de CC sobre SONFH están principalmente relacionados con la infección por herpesvirus asociada al sarcoma de Kaposi, la vía de señalización de HIF-1 y la vía lipídica y aterosclerosis, según los análisis de enriquecimiento de la vía funcional GO y KEGG.

Verificación de MD
Para evaluar las posibles interacciones entre compuestos activos y objetivos clave, los 10 compuestos de la red C-T-P, incluyendo anethole, melilotocarpano A, acetato de nerilo, ácido caprílico, isohomogenol, 3-metaxicinamaldehído, (s)-4-nonanolido, miristicina, borneolo y acetato de cinamilo, se acoplaron con los objetivos clave AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC y EGFR. Los resultados completos de acoplamiento para todos los pares compuesto–objetivo se resumen en la Tabla Suplementaria 8, y la información detallada sobre los compuestos, objetivos y parámetros de acoplamiento se proporciona en la Tabla Suplementaria 9. La Figura 6 presenta un mapa de calor de la distribución de energía de enlace.

En general, varios pares compuso-objetivo mostraron afinidades de unión relativamente favorables, con valores de energía de unión más bajos que indican interacciones predichas más estables. Cabe destacar que los resultados del acoplamiento mostraron una clara heterogeneidad en las afinidades de unión tanto entre compuestos como entre objetivos. Ciertos compuestos, como el melilotocarpano A, mostraron de forma consistente afinidades de unión relativamente fuertes entre múltiples objetivos, mientras que otros mostraron interacciones más moderadas o débiles, lo que sugiere que diferentes compuestos pueden contribuir de forma desigual a los efectos farmacológicos previstos.

Además, también se observó variabilidad entre los objetivos. Por ejemplo, ciertos objetivos como STAT3 y EGFR mostraron afinidades de unión relativamente moderadas o débiles con múltiples compuestos, con algunos valores que se acercan a -5,0 kcal/mol, en comparación con objetivos como AKT1 o SRC. Este patrón indica que no todos los objetivos centrales funcionan necesariamente como socios directos de alta afinidad de los compuestos identificados y pueden desempeñar roles reguladores indirectos dentro de la red de interacción. Estas diferencias pueden estar relacionadas con variaciones en la compatibilidad estructural entre ligandos y sitios de unión a proteínas, así como con las características inherentes de los objetivos.

Entre los pares evaluados, AKT1 mostró la menor energía de unión con melilotocarpano A (-9,6 kcal/mol), lo que sugiere una interacción potencialmente favorable. La Figura 7 ilustra el modo de enlace previsto de este complejo. Específicamente, SER205 de AKT1 forma enlaces de hidrógeno con melilotocarpano A, anethole y miristicina. Además, se predijo que el melilotocarpano A formaría enlaces de hidrógeno con GLY309 de HIF-1α, LEU438 y THR440 de STAT3, SER433 y ARG412 de ESR1, y ARG500 y GLU510 de SRC.

Para identificar compuestos candidatos representativos, se utilizó la energía de unión más baja para cada objetivo, y se estableció un umbral de energía de enlace de ≤ -5,0 kcal/mol para indicar interacciones relativamente estables. Según estos criterios, se identificaron como compuestos clave potenciales el melilotocarpano A, el anetario y la miristicina. En general, la mayoría de los componentes activos de CC mostraron posibles interacciones con los objetivos terapéuticos seleccionados, con algunos compuestos mostrando tendencias de unión relativamente más fuertes entre múltiples dianas. Sin embargo, debe señalarse que la DM es un enfoque computacional simplificado que proporciona predicciones preliminares de posibles interacciones y puede no tener en cuenta completamente la flexibilidad de las proteínas y los complejos entornos biológicos. Por lo tanto, estos resultados deben interpretarse con cautela, y las interacciones observadas no constituyen evidencia definitiva de unión directa.

Simulación de dinámica molecular
Para evaluar más a fondo la estabilidad de los complejos, los autores seleccionaron los complejos AKT1-melilotocarpano A, HIF-1α-melilotocarpano A y STAT3-melilotocarpano A para simulaciones de dinámica molecular. Entre los objetivos previstos, STAT3 y HIF-1α fueron seleccionados para simulaciones de MD basándose en sus roles centrales en la red de IBP y su relevancia biológica para la patología de SONFH. STAT3 mostró uno de los grados de conectividad más altos en la red PPI, lo que indica un posible papel regulatorio en múltiples vías de señalización. HIF-1α fue seleccionado porque el análisis de enriquecimiento KEGG identificó la vía de señalización HIF-1 como una de las vías más relevantes asociadas a la angiogénesis y la adaptación a la hipoxia en osteonecrosis.

Al mismo tiempo, los autores se centraron en AKT1 como objetivo representativo debido a sus fuertes puntuaciones de acoplamiento y su relevancia directa para las características patológicas de SONFH, especialmente la angiogénesis inducida por hipoxia y la regeneración ósea. Debido a limitaciones de recursos computacionales, se seleccionaron tres complejos representativos para simulaciones detalladas de MD, que es una estrategia comúnmente adoptada en estudios de simulación molecular basados en farmacología de redes. La desviación cuadrática media de la raíz (RMSD) evalúa eficazmente la estabilidad conformacional de los complejos proteína-ligando, donde valores más bajos indican mayor estabilidad estructural. Como se muestra en la Figura 8A, el complejo AKT1-melilotocarpano A completó su relajación en los primeros 12 ns y posteriormente alcanzó una meseta estable, observándose solo una fluctuación transitoria alrededor de 50-55 ns antes de volver rápidamente al equilibrio. El RMSD total durante toda la simulación fue de aproximadamente 0,369 nm. La Figura 8B ilustra que el complejo HIF1A-melilotocarpano A experimentó relajación en los primeros 16 ns, seguida del mantenimiento de una meseta estable. Se produjo una breve fluctuación entre 38 y 42 ns, tras lo cual se observó una rápida reestabilización. La RMSD total para este complejo era de 0,25 millas náuticas. En la Figura 8C, el complejo STAT3-melilotocarpan A experimentó relajación en 0,3 ns y luego alcanzó una meseta estable. La breve fluctuación ocurrió entre 5 ns y 80 ns. La simulación total fue de unos 0,21 nm. Como se muestra en los complejos AKT1-melilotocarpano A, HIF-1α-melilotocarpano A y STAT3-melilocarpano, mantuvieron la estabilidad sin alteraciones notables, lo que indica una combinación relativamente estable.

La flexibilidad de los residuos de aminoácidos en las proteínas se evaluó utilizando la fluctuación cuadrática media (RMSF). En la Figura 9A, la fluctuación global media del residuo fue de unos 0,17 nm, lo que sugiere que la estabilidad se mantuvo principalmente gracias al núcleo estructural y al bolsillo de unión. La mayor flexibilidad se limitaba en gran medida a regiones intrínsecamente móviles como segmentos terminales y regiones de bucle en lugar del núcleo bolsillo. Es bien sabido que estas regiones son flexibles por naturaleza. La Figura 9B muestra que aproximadamente el 94% de los residuos presentaron valores de RMSF por debajo de 0,20 nm, y solo alrededor del 6% superaron los 0,30 nm, lo que indica que la columna vertebral total de la proteína y los residuos internos fluctuaron dentro de un rango estable. La Figura 9C muestra que el residuo global medio era de aproximadamente 0,17 nm. No se identificaron fluctuaciones superiores a 0,15 nm en los datos, lo que indica que el bolsillo de unión mantuvo una conformación estable durante toda la simulación. Se ha demostrado que tanto los complejos AKT1-melilotocarpano A como HIF-1α-melilotocarpano A interactúan de forma fuerte y estable.

Los enlaces de hidrógeno son fundamentales para promover las interacciones proteína-ligando. La Figura 10A muestra que los complejos AKT1-melilotocarpano A formaban típicamente un enlace de hidrógeno, con un número de enlaces de hidrógeno que variaba entre 0 y 2. Entre melilotocarpano A y HIF-1α están separados por menos de 0,35 nm. AKT1 interactúa frecuentemente en proximidad con melilotocarpano A. Los complejos HIF-1α-melilotocarpano A forman de 0 a 2 enlaces de hidrógeno, principalmente un enlace de hidrógeno, como se muestra en la Figura 10B. En la Figura 10 C, el número de enlaces de hidrógeno del complejo STAT3-melilotocarpano A es de cero a cuatro. La mayoría de las veces, los átomos de A entre melilotocarpano A y HIF-1α están separados por menos de 0,35 nm. Los complejos HIF-1α-melilotocarpano A establecen 1-3 pares de contactos estrechos y a veces incluso 7-9 pares. Esto sugiere interacciones efectivas de enlace de hidrógeno entre la molécula pequeña y las proteínas objetivo. En resumen, tanto los complejos AKT1-melilotocarpano A como HIF-1α-melilotocarpano A demuestran estabilidad y resistencia.

La CC inhibe la reacción inflamatoria y la apoptosis de los ratones con SONFH
El análisis histológico con tinción ABH reveló cambios osteonecróticos pronunciados en el grupo SONFH, caracterizados por un aumento de lagunas vacías, núcleos picnóticos y arquitectura trabecular alterada, mientras que estas características patológicas se aliviaron notablemente tras el tratamiento con CC (Figura 11A). El análisis cuantitativo confirmó que las proporciones de lacunas vacías y núcleos picnóticos se redujeron significativamente en los grupos tratados con CC en comparación con el grupo SONFH (Figura 11B–C). El análisis micro-TC demostró una pérdida ósea trabecular severa en el grupo SONFH, que fue parcialmente revertida por la administración de CC (Figura 11D). De forma constante, el tratamiento con CC aumentó significativamente la VB/TV y la TB. Mientras disminuye Tb.Sp en relación con el grupo SONFH (Figura 11E–G). La tinción por inmunofluorescencia mostró una expresión elevada de HIF-1α y niveles reducidos de ALP en el grupo SONFH, acompañados de una expresión alterada de VEGF. El tratamiento con CC moduló la expresión de HIF-1α y VEGF y aumentó las señales ALP, indicando una mejora del microambiente óseo y de la actividad osteogénica (Figura 11H).

DISPONIBILIDAD DE DATOS:
Los conjuntos de datos utilizados o analizados durante el estudio actual están disponibles en el enlace: https://zenodo.org/records/19730455.

Figura 1: Diagrama de flujo de la estrategia de estudio de farmacología en redes para la mejora de CC de SONFH. La Figura 1 muestra que el estudio identifica posibles objetivos de los ingredientes activos de la CC a partir de la base de datos, siendo la SONFH la enfermedad central. Tras intersectar estos con objetivos relacionados con la enfermedad, se construyó una red de "componente–objetivo–vía" y términos GO, KEGG. A continuación, se emplean acoplamientos moleculares y simulación de dinámica molecular para evaluar la afinidad de unión entre componentes clave y objetivos centrales, realizándose la confirmación final mediante verificación experimental. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Cribado de objetivos intersectantes asociados con SONFH. (A) Gráfico volcánico que representa la distribución de genes expresados diferencialmente en muestras de enfermedad. Los puntos rojos denotan genes regulados al alza, los puntos azules indican genes regulados a la baja y los puntos grises representan genes que carecen de expresión diferencial significativa. (B) Mapa de calor que muestra los patrones de expresión de los 60 genes expresados diferencialmente, con columnas correspondientes a muestras y filas correspondientes a genes. (C) Diagrama de Venn que muestra la superposición de objetivos relacionados con enfermedades obtenidos de diferentes bases de datos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Cribado de objetivos intersectantes entre CC y SONFH. (A) Diagrama de Venn que ilustra la distribución de 61 objetivos comunes compartidos entre los objetivos predichos de compuestos activos en CC (amarillo) y objetivos relacionados con SONFH (morado). (B) La red Herb-Compound-Target (H-C-T) ilustra las interacciones entre compuestos y sus respectivos objetivos. El nodo cuadrado azul representa la enfermedad, los nodos cuadrados verdes denotan compuestos activos y los nodulos cuadrados naranjas indican objetivos comunes. Los bordes denotan las interacciones entre compuestos y sus objetivos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Identificación de objetivos candidatos mediante análisis PPI. (A) Red PPI agrupada con el plugin MCODE. (B) Flujo de trabajo esquemático de la cribado topológica dentro de la red PPI. (C) Genes clave extraídos de la red PPI mediante el plugin CytoHubba. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Resultados del análisis de enriquecimiento GO y análisis de enriquecimiento de vías KEGG para los 61 objetivos comunes. (A) Gráfico de burbujas que muestra los 10 principales términos de análisis de enriquecimiento GO para BP, CC y MF. (B) Gráfico de burbujas que representa las 20 vías KEGG más enriquecidas significativamente. (C) Distribución de las 20 vías enriquecidas más basadas en la clasificación funcional KEGG. (D) Red ilustrativa C-T-P que representa los posibles mecanismos por los cuales la CC puede mejorar la osteonecrosis de la cabeza femoral. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Mapa de calor de energía de unión de las interacciones entre los compuestos activos de CC y los objetivos clave (kcal/mol). Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Modos de unión de objetivos clave con compuestos activos específicos. AKT1-melilotocarpano A (A1), HIF-1α-melilotocarpano A (B1), STAT3-melilotocarpano A (C1), ESR1-melilotocarpano A (D1), CASP3-melilotocarpano A (E1), SRC-melilotocarpano A (F1), EGFR-melilotocarpano A (G1), AKT1-aniloto (H1), AKT1-miristicina (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) y (H2) ilustran respectivamente sus modos de unión 2D. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: RMSD de los valores de RMSD MD. (A) para complejos AKT1-melilotocarpano A. (B) Los valores RMSD de los complejos HIF-1α-Melilotocarpano A. (C) Los valores RMSD de los complejos STAT3-Melilotocarpan A. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 9: RMSF de MD. (A) Los valores RMSF de los complejos AKT1-melilotocarpano A. (B) Los valores RMSF de los complejos HIF-1α-Melilotocarpan A. (C) Los valores RMSF de los complejos STAT3-Melilotocarpan A. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 10: Enlaces H de MD. (A) Los valores de enlaces H de los complejos AKT1-melilotocarpano A. (B) Los valores de enlace H de los complejos HIF1A-melilotocarpano A. (C) Los valores de enlace H de los complejos AKT1-melilotocarpano A. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 11: La CC inhibe la respuesta inflamatoria y la apoptosis en la cabeza femoral, mejorando así la SONFH. (A) Secciones representativas de la cabeza femoral teñidas con ABH. Las lagunas vacías se indican con puntas de flecha negras, y los núcleos picnóticos con flechas. (B–C) Análisis cuantitativo de la proporción de lacunas vacías (B) y el número de núcleos picnóticos (C). n = 5. (D) Reconstrucciones micro-TC tridimensionales representativas de cabezas femorales. (E–G) Cuantificación de parámetros micro-CT, incluyendo fracción volumétrica ósea (BV/TV), separación trabecular (Tb.Sp) y grosor trabecular (Tb.Th). (H) Tinción representativa por inmunofluorescencia de HIF-1α, VEGF y ALP en secciones femorales de la cabeza; los núcleos se contra-tinturaron con DAPI. Los datos se presentan como media ± DS (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Término		Enriquecimiento de pliegues	Valor P	Conde	Identificadores de usuario
Cáncer de vejiga		28.44	1.23E-07	7	CREBBP, CXCL8, NOS2, MMP2, STAT3, F2, PTGS2, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, EP300, PPARG, NFE2L2, BCL2L1
Vía de señalización HIF-1		16.66	6.56E-10	11	SRC, MMP2, STAT3, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, KDR, PDCD4, PTPN6
Resistencia a los inhibidores de tirosina quinasa de EGFR		16.66	3.84E-07	8	CCR1, CREBBP, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3 ,EP300, TYK2, PTGS2, HIF1A, MTOR, VEGFA
Cruce de Adherens		12.54	1.64E-05	7	CREBBP, ABCB1, CASP3, ERBB2, STAT3, PDCD4, EP300, PTGS2, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA
Resistencia endocrina		11.78	2.35E-05	7	CREBBP, NOS2, NOS3, ERBB2, STAT3, SERPINE1, EP300, HIF1A, EGFR, MTOR, VEGFA
Vía de señalización AGE-RAGE en complicaciones diabéticas		11.55	2.63E-05	7	CCR1, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3, CXCR2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
Proteoglicanos en el cáncer		11.43	1.19E-10	14	CXCL8, SRC, NOS3, CASP3, STAT3, PPARG, MMP9, BCL2L1, NFE2L2
Vía de señalización de la relaxina		10.25	1.02E-05	8	OXTR, NOS2, NOS3, ERBB2, PTAFR, KDR, NOS1, EGFR, VEGFA
Infección por herpesvirus asociada al sarcoma de Kaposi		10.20	1.45E-08	12	SRC, ERBB2, STAT3, KDR, EGFR, MTOR, BCL2L1, VEGFA
Vía de señalización de la hormona tiroidea		9.56	7.64E-05	7	NOS2, SRC, NOS3, MMP2, NOS1, MMP9, EGFR, VEGFA
Esfuerzo cortante por fluidos y aterosclerosis		8.21	0.000177	7	CREBBP, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3, EP300, TYK2, MMP9
Hepatitis B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP, STAT3, EP300, PTPN6, TYK2, EGFR, MTOR, BCL2L1
Vía de señalización JAK-STAT		7.93	5.35E-05	8	SRC, VDR, STAT3, CYP3A4, ESR1, EGFR, MTOR, VEGFA
Infección por citomegalovirus humano		7.34	6.2E-06	10	CREBBP, CASP3, EP300, TYK2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
Lipídios y aterosclerosis		6.94	0.000035	9	CXCL8, SRC, MMP2, ERBB2, MMP9, EGFR, VEGFA
MicroARNs en el cáncer		6.25	2.06E-06	12	CREBBP, SRC, ERBB2, EP300, PTPN6, PTPRF, EGFR
Carcinogénesis química - activación de receptores		6.14	0.000265	8	SRC, MMP2, ERBB2, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR
Vías en el cáncer		5.94	6.64E-10	19	CXCL8, NOS3, CASP3, MMP2, STAT3, SERPINE1, VEGFA
Vía de señalización del calcio		5.90	0.00011	9	KAT2B, CREBBP, SRC, EP300, HIF1A, ESR1, MTOR
Infección por virus del papiloma humano		4.00	0.00324	8	SRC, NOS3, MMP2, KDR, MMP9, NFE2L2, VEGFA

Tabla 1: Resultados de enriquecimiento de KEGG de las 20 vías enriquecidas más importantes.

Tabla suplementaria 1: Información básica de compuestos activos en CC.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Los objetivos de 85 componentes activos en CC.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 3: Información sobre 61 objetivos comunes de CC-SONFH.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 4: Resultados de los términos de categorías de procesos biológicos del análisis de enriquecimiento GO.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 5: Resultados de los términos de categorización de componentes celulares a partir del análisis de enriquecimiento GO.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 6: Resultados de los términos de la categoría de función molecular a partir del análisis de enriquecimiento GO.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 7: Resultados de las vías del análisis de enriquecimiento KEGG.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 8: Energías de unión de acoplamiento molecular (kcal/mol) de pares compuso-objetivo.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 9: Detalles de objetivos y componentes para acoplamiento molecular.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este estudio, los autores obtuvieron 85 compuestos bioactivos de CC a través de varias bases de datos y realizaron cribados, entre los cuales los principales componentes químicos incluyen anethole, melilotocarpano A y miristicina. Para identificar objetivos, los autores intersectaron 563 dianas de CC de fármacos con 1116 dianas relacionadas con SONFH, obteniendo finalmente 61 dianas. Los autores importaron 61 objetivos comunes a las bases de datos STRING y DAVID para construir una red de IBP e investigar posibles vías farmacológicas. Los resultados revelaron 10 objetivos clave en la red de PPI, incluyendo HIF-1α y STAT3. La isquemia y la hipoxia son dos de las principales características patógenas de la SONFH, según investigaciones^{anteriores 35}. La CC puede ejercer efectos positivos en la SONFH a través de múltiples procesos biológicos, incluyendo la angiogénesis y la regulación transcripcional. Esto podría lograrse mediante la vía de señalización HIF-1α, el esfuerzo cortante de fluidos y la aterosclerosis, lípidos y aterosclerosis, la vía de señalización AGE-RAGE en complicaciones diabéticas y otras vías de señalización, según el análisis de enriquecimiento KEGG. Esto sugiere que la CC puede actuar sobre SONFH a través de estos objetivos clave y las vías asociadas. Para aclarar aún más si los componentes de CC están estrechamente acoplados con los objetivos, basándose en los resultados de investigación en farmacología de red mencionados anteriormente, es decir, los resultados de cribado de los ingredientes activos de la prescripción del compuesto y los resultados de cribado de los objetivos en la red de IBP, los autores realizaron simulaciones de dinámica molecular del melilotocarpano A-AKT1, melilotocarpano A-HIF-1α, y complejos STAT3-melilocarpano. Esto muestra que el melilotocarpano A se une de forma constante a AKT1, HIF-1α y STAT3, por lo que el CC puede efectivamente ejercer efectos positivos al actuar sobre estos objetivos clave. En conjunto, a través de un mecanismo multicomponente, multiobjetivo y multivía, la CC puede ejercer efectos protectores sobre la calidad de vida de los pacientes con SONFH.

El grupo de investigación se ha centrado en dilucidar los mecanismos por los cuales los YGP ejercen efectos terapéuticos en enfermedades relacionadas con los huesos. La investigación previa indicó que los YGP mejoran la formación ósea y la microarquitectura trabecular en la cabeza femoral al activar la β-catenina para inhibir la osteoclastogénesis y promover la osteogénesis durante el conejo SONFH³⁶. Además, los investigadores han descubierto que los YGP ejercen efectos terapéuticos sobre la SONFH principalmente al aliviar la inflamación y promover la^{angiogénesis 12}. Los YGP no solo pueden mejorar la SONFH, sino también mejorar la osteoporosis. Al inhibir la vía de señalización IL-17/NF-κB y disminuir las respuestas inmunitarias Th17, los YGP detienen con éxito la pérdida ósea^{inducida por ovariotomía 37}. Mediante experimentos con animales, los investigadores confirmaron que Cornus officinalis, uno de los componentes de los YGP, ejerce efectos sobre SONFH al inhibir la secreción de mediadores inflamatorios y la apoptosis de células^{óseas 38}. La CC, que puede calentar el yang, beneficiar el qi y desbloquear los meridianos, es la hierba principal en los YGP, desempeñando un papel crucial en la mejora de la SONFH y el alivio del sufrimiento del paciente. En resumen, estos estudios reflejan el enfoque de larga data en elucidar los mecanismos de las YGP en la osteonecrosis y en identificar la CC como una hierba principal que merece la pena investigar mecanicamente en la SONFH.

Entre los ingredientes activos previstos, el anethole, la miristicina y otros ingredientes han mostrado actividad biológica contra enfermedades relacionadas con los huesos. Se ha demostrado que la anetol inhibe la elevación de los marcadores de reabsorción ósea. La anetol reduce en última instancia la diferenciación osteoclasta y la función resorptiva al inhibir las vías posteriores y los factores reguladores^{clave 39}. Las investigaciones indican que el anetol presenta propiedades antiinflamatorias e inhibe la diferenciación adipogénica en las células madre mesenquimales de la médula ósea humana (hBMSC)⁴⁰. La miristicina inhibe la inflamación y protege las células del músculo liso vascular suprimiendo las vías PI3K/Akt y^{NF-κB 41}. La ferroptosis es uno de los mecanismos clave que subyacen a la patogénesis de la SONFH. La ferroptosis es un tipo de muerte celular programada causada por la peroxidación lipídica dependiente del hierro. La miristicina previene la ferroptosis, protegiendo así la homeostasis redox de las membranas celulares de^{los osteoblastos 42}. Se ha demostrado que otro ingrediente del borneol inhibe la formación de anillos de actina, que es una característica de los osteoclastos reabsorbentes que reflejan la polarización celular, en un plazo de 30^{minutos y 43}. Estos hallazgos indican que estos componentes pueden ser muy importantes para el efecto protector de la CC en SONFH, y merece la pena ser explorados más a fondo. Entre todos estos ingredientes, se seleccionó el Melilotocarpano A como ligando representativo porque mostró las afinidades de unión más estables con múltiples objetivos centrales en el análisis de MD. Entre los compuestos mejor valorados, Melilotocarpano A mostró interacciones de unión consistentemente fuertes con varias proteínas clave de la red de IBP, lo que sugiere que podría representar un componente bioactivo importante de CC.

Además, los resultados de la red PPI revelaron que, especialmente HIF-1α y STAT3, podrían ser los objetivos principales. HIF-1α es el mediador central de la respuesta celular a la hipoxia. En los experimentos con SONFH, activar HIF-1α mejora la angiogénesis y la reparación ósea, aliviando así la necrosis femoral^{de la cabeza 44}. Además, investigaciones han encontrado que HIF-1α puede ejercer un efecto protector sobre el tejido cartílago en condiciones^{hipóxicas 45}. La regulación al alza del HIF-1α suprime la ferroptosis y activa STAT3 para acelerar la diferenciación de los monocitos de médula ósea en osteoclastos⁴⁶. STAT3 es un activador de transducción de señales y transcripción. Los HBMSCs promueven la conversión de STAT3 a p-STAT3, aumentando así la proliferación, migración y efectos antiapoptóticos de condrocitos bajo condiciones^{hipóxicas 47}. STAT3 potencia la diferenciación osteogénica y los efectos antiapoptóticos de las hBMSC, al tiempo que incrementa su secreción de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) para promover la regeneración microvascular^{ósea 48}. AKT1 es una proteína quinasa que actúa como mediador clave de la señalización de angiogénesis. AKT1 está implicado en el acoplamiento angiogénesis ósea-osteogénesis y en la formación de hueso^{trabecular 49}. En conjunto, estos objetivos central convergen en la angiogénesis, la adaptación a la hipoxia, la inflamación y la remodelación ósea, lo que sugiere que la CC puede ejercer efectos protectores contra la SONFH al modular estos objetivos y sus vías de señalización asociadas.

Para explorar el mecanismo de la CC en la mejora de la SONFH, los investigadores realizaron análisis de GO y análisis de enriquecimiento KEGG. Los resultados de GO muestran que los genes objetivo están principalmente enriquecidos en funciones biológicas como la respuesta a la hipoxia, la respuesta celular al lipopolisacárido y la regulación positiva de la angiogénesis. El análisis de enriquecimiento KEGG sugirió que los efectos farmacológicos de la CC en SONFH están predominantemente relacionados con la vía de señalización AGE-RAGE en complicaciones diabéticas, la vía de señalización HIF-1α, la vía lipídica y aterosclerosis, y otras vías de señalización. La SONFH ocurre cuando el flujo sanguíneo hacia la cabeza femoral se interrumpe, lo que provoca una falta de soporte nutricional para la cabeza femoral y provoca la apoptosis celular⁵⁰. HIF-1 está formado por HIF-1α y HIF-1β, siendo HIF-1α un papel clave en la respuesta transcripcional a ambientes hipóxicos^{e isquémicos 47}. Estudios previos han demostrado que, a través de la cascada de señalización VEGF/AKT/mTOR, HIF-1α coordina la osteogénesis y la angiogénesis, mejorando así de forma crítica la diferenciación osteogénica de las células madre derivadas del adiposo. Tras la isquemia, se desarrolla hipoxia tisular, lo que conduce a una elevación marcada de HIF-1α dentro de las células. que aumenta los niveles de expresión de VEGF y, en consecuencia, promueve la reparación y regeneración vascular⁵¹. La hipoxia interrumpe la producción de energía mitocondrial y aumenta la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Estos cambios promueven la osteoclastogénesis, inhiben la actividad de los osteoblastos y, en última instancia, inducen la apoptosis osteocítica. Una alta expresión de HIF-1α desplaza el metabolismo energético celular de la fosforilación oxidativa a la glucólisis, reduce la producción de ROS y, por tanto, atenúa la apoptosis en osteoblastos y^{osteocitos 52,53}. El hueso esponjoso sostiene la función hematopoyética de la médula ósea y almacena minerales como el calcio. El aumento de la actividad de HIF-1α puede incrementar directamente la formación ósea^{cancelosa 54}. Además, HIF-1α mantiene la supervivencia y homeostasis de los condrocitos bajo condiciones^{hipóxicas 45}. En consecuencia, la vía de señalización HIF-1α se ha convertido en un objetivo terapéutico para la ONFH, con la posible aplicación terapéutica de la ONFH.

En la vía de señalización AGE-RAGE, los productos finales de glicación avanzada (AGEs) resultan del entrecruzamiento covalente no enzimático de carbohidratos con proteínas, grasas u otras macromoléculas^{biológicas 55}. Los AGE pueden dañar las células y los tejidos mediante daños inflamatorios y oxidantes. A través de cuatro vías, las señales son transducidas por la interacción AGE-RAGE. Estos son: 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK y (4) NADPH oxidasa-ROS⁵⁶. Finalmente, el NF-κB fosforilado entra en el núcleo para transcribir la expresión de citocinas proinflamatorias, factores de crecimiento, citocinas profibróticas y estrés oxidativo. El estudio ha demostrado que AGE-RAGE promueve la apoptosis de los osteoblastos a través de la vía de señalización MAPK y la activación del estrés oxidativo, e inhibe la diferenciación osteogénica suprimiendo los niveles de sensores de estrés del retículo endoplásmico, así como mediante la metilación del ADN/la vía^{Wnt 57}. Además, estudios han indicado que los AGE y los RAGEs participan en la calcificación^{vascular 58}.

En la vía de señalización lipídica y aterosclerosis, los lípidos oxidados activan PPARγ. Es un regulador maestro de la adipogénesis que inhibe la diferenciación^{osteogénica 59}. Además, varios estudios han demostrado que los lípidos afectan la diferenciación y maduración de osteoclastos y osteoblastos, alterando así la homeostasis^{ósea 60}. Múltiples estudios fundamentales han demostrado la implicación significativa de la apoptosis en los mecanismos fisiológicos y patológicos de la SONFH. Experimentos posteriores in vivo con animales confirmaron además que la fracción activa de CC suprime eficazmente la apoptosis y la inflamación en SONFH, mitigando así la progresión de la enfermedad.

En consonancia con estos hallazgos, la farmacología en redes y los análisis experimentales sugieren que la CC puede mejorar la SONFH coordinando la adaptación a la hipoxia, regulando la angiogénesis y modulando los procesos metabólicos. El análisis cuantitativo de micro-TC reveló que la intervención con CC restauraba significativamente la fracción volumétrica ósea (VB/TV), reducía la separación trabecular (Tb.Sp, Tb.Th) y promovía la recuperación de la microestructura ósea. El análisis de enriquecimiento KEGG destacó aún más la vía de señalización HIF-1α como un mecanismo clave subyacente a estos efectos. En conjunto, estos experimentos con animales indican que la CC puede aliviar la SONFH regulando procesos biológicos relacionados con la hipoxia y la inflamación, y promoviendo la angiogénesis y la remodelación ósea, potencialmente a través de vías clave como la vía de señalización HIF-1α.

Aunque se obtuvieron algunos hallazgos preliminares importantes, este estudio aún presenta algunas limitaciones. Los autores se basaron exclusivamente en métodos modernos de bioinformática, incluyendo la farmacología de redes y la medicina médica, así como algunos experimentos con animales, para explorar el papel de la CC en la SONFH. Por lo tanto, la fiabilidad y precisión de las predicciones deben verificarse aún más en experimentos in vivo e in vitro . Este estudio proporciona pistas preliminares sobre los mecanismos por los cuales el CC mejora la SONFH, que requieren una validación experimental adicional. Al integrar la farmacología de redes con la MD, los autores mapearon sistemáticamente los ingredientes bioactivos candidatos, los objetivos clave y las vías enriquecidas de la CC en SONFH. En conclusión, este estudio investigó los posibles efectos protectores de la CC en SONFH mediante farmacología integrativa de redes y validación in vivo . Los resultados indican que los mecanismos se asociaron principalmente con la modulación de la vía de señalización HIF-1 y la promoción de la regeneración osteogénica. Como se ilustra en la figura correspondiente, la mejora de CC moduló significativamente la expresión de proteínas clave, incluyendo HIF-1α, VEGF y ALP, de manera dependiente de la dosis, lo que reforzó su papel en la coordinación de la adaptación a la hipoxia, la angiogénesis y la actividad osteogénica. Estos hallazgos fueron corroborados por un análisis micro-CT, que demostró que la intervención CC restauraba eficazmente la fracción de volumen ósea y mejoraba la microestructura trabeculare.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4% PFA	Biosharp	BL539A
Ethenol absoluto	Grupo Sinopharm Co.Ltd	10009218
Kit de tinte azul alciano	Solarbio	G1563
ALP	ariggo	ARG57422
AutoDock Vina	Scripps Research		Versión 1.2.7
AutoDockTools	Scripps Research		Versión 1.5.7
Plataforma en línea de bioinformática			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 campo de fuerza			Uso para la parametrización MD
CTD			https://ctdbase.org
Cytoscape	Consorcio Cytoscape		Versión 3.10.3; plugins: CytoHubba, CytoNCA
Solución de tinción DAPI	Beyotime Biotech Inc	C1006-50mL
DAVID	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Visualizador de Discovery Studio	BIOVIA		BIOVIA Discovery Studio 2020; Visualización de acoplamiento
DisGeNET			https://disgenet.com
Descalcificación con EDTA	Beyotime Biotech Inc	C0167-3L
Solución bloqueadora de peroxidasa endógena	Beyotime Biotech Inc	P0100A
GeneCards			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Anti-conejo de cabra IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
Suero de cabra	Beyotime Biotech Inc	C0265
GraphPad Prism	GraphPad (Dotmatics)		Versión 10; Análisis estadístico y gráficos
GROMACS	GROMACS		Versión 2022; CHARMM36 campo de fuerza
Herb 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1 y alfa;	Hangzhou Huaan	HA721997
Equipos micro-CT de alta resolución	Bruker	SkyScan
Filtro de regla de Lipinski			Mw & le; 500; miLogP & le; 5; HBD & le; 5; HBA y LE; 10
Lipopolisacárido	Sigma-Aldrich	L4516
Metilprednisolona	Grupo Sinopharm Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
Balsámico neutro	Biosharp	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
Parafina	Grupo Sinopharm Co.Ltd	C416770020
Malla de partículas Ewald (PME)			Electrostática de largo alcance
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrö Jonron		Visualización y preparación de proteínas
R	CRAN		Versión 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
STRING			https://string-db.org
SwissADME	Instituto Suizo		http://www.swissadme.ch
SwissTargetPrediction	Instituto Suizo		http://www.swisstargetprediction.ch
Modelo acuático TIP3P			Uso para la solvatación
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	Hangzhou Huaan	ET1604-28
Weishengxin			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	Microsoft		Utilizado para procesamiento de datos, acoplamiento molecular y simulaciones MD
Xileno	Grupo Sinopharm Co.Ltd	10023418