Aislamiento, síntesis y caracterización de nanopartículas CD47 e integrina α4/β1 modificadas por membrana de macrófagos y nanopartículas de ácido poli(ácido láctico-coglicólico)

Summary

Este protocolo permite la preparación y caracterización de nanopartículas de poli(ácido láctico-coglicólico) recubiertas de membrana con α4/β1 CD47 e integrina para aplicaciones dirigidas a la administración de fármacos.

Abstract

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica y un factor importante en la morbilidad y mortalidad cardiovascular. La administración dirigida de agentes antiinflamatorios a los sitios ateroscleróticos sigue siendo un desafío importante. Presentamos un protocolo detallado para la preparación y caracterización de nanopartículas de membrana recubiertas de colchicina (MMM/COL) con fibrofago CD47 e integrina α4/β1 comodificadas con membrana y recubiertas de colchicina (MMM/COL NPs). El protocolo incluye modificación de macrófagos mediante transfección de plásmidos y estimulación con endotelina-1, aislamiento de membrana, fabricación de NP y recubrimiento de membrana. Los NP MMM/COL resultantes se evalúan mediante caracterización fisicoquímica, análisis de expresión proteica y ensayos in vitro e in vivo . La validación funcional incluye la evaluación de la asociación celular con células endoteliales activadas, la captación de macrófagos, los efectos antiinflamatorios en las células de espuma y la biodistribución en un modelo murino de aterosclerosis. Además, se destacan parámetros experimentales clave y pasos de control de calidad para garantizar la reproducibilidad y consistencia entre laboratorios. Este protocolo proporciona un enfoque robusto y escalable para generar NPs biomiméticos para aplicaciones dirigidas de administración de fármacos en la investigación de la aterosclerosis.

Introduction

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica que conduce a eventos cardiovasculares fatales y accidentes cerebrovasculares a través de estenosis arterial de la luz y ruptura inestable de placas, lo que supone una carga significativa para la salud^{global 1,2,3}. La regulación a la baja de las respuestas inflamatorias en el sitio aterosclerótico es un objetivo terapéutico^{principal 4,5}. La colchicina, un potente antiinflamatorio, ha demostrado ser prometedora en la reducción de....

Protocol

Todos los procedimientos animales descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales del Hospital Torre de Tambores de Nanjing y siguieron las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio establecidas por los Institutos Nacionales de Salud.

1. Modificación de los macrófagos RAW 264.7

1. Preparar las células RAW 264,7, completar el Medio Águila Modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina–estreptomicina, plásmido de sobreexpresión CD47, reactivo de transfección de lipofec....

Results

Las mediciones DLS se realizaron utilizando un sistema Zetasizer Nano ZS a 25°C con un ángulo de retrodispersión de 173°. Las muestras se diluyeron 20 veces en agua desionizada (concentración final de aproximadamente 0,1 mg/mL) y se equilibraron durante 2 minutos antes de la medición. Cada muestra se midió en triplicado y los resultados se presentan como media ± SD. DLS y TEM revelan un aumento en el tamaño de NP tras el recubrimiento de membrana y confirman la formación de una estructur.......

Discussion

Este protocolo proporciona un método integral para construir y aplicar NPs comodificados por membrana de macrófagos CD47 e integrina α4/β1 para la terapia dirigida de aterosclerosis. Las principales ventajas de este sistema incluyen la dirección activa mediante la interacción integrina α4/β1–VCAM-1 y la reducción de la captación de macrófagos asociada a la señalización mediada por CD47, como respaldan los ensayos in vitro (Figura 3) y los resultados de biodi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomicina D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	A1310	Colorante de viabilidad para la discriminación viva/muerta de citometría de flujo
Alexa Fluor 488-conjugado para la cabra anti-conejo IgG	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	A-11008	Anticuerpo secundario para la tinción de inmunofluorescencia CD68
Anticuerpo anti-ratón CD47	Abcam (EE. UU.)	ab214453	Utilizado para el análisis de Western blot para verificar la expresión de CD47
Integrina antiratón y alfa; 4 anticuerpos (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (EE. UU.)	SC-376334	Utilizado para análisis de Western blot para verificar integrina y alfa; 4 Expresión
Integrina anti-ratón y beta; 1 anticuerpo (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (EE. UU.)	SC-374429	Utilizado para análisis de Western blot para verificar integrina y beta; 1 Expresión
ApoE-/- ratones	El Laboratorio Jackson (EE. UU.)	N/A	Utilizado para modelos de aterosclerosis in vivo
Kit de ensayo BCA	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	23225	Utilizado para determinar la concentración de proteínas
Placa de silicona negra	N/A	N/A	Se utiliza para montar aorta en imágenes ex vivo
Plásmido CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (China)	G0177361-1	Contiene el gen Cd47 del ratón para sobreexpresión
Colchicina	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	C9754	Carga útil terapéutica en nanopartículas
Microscopio láser de barrido confocal	Leica Microsystems	TCS SP8	Utilizado para imágenes de fluorescencia y análisis de colocalización
Tampón de citrato (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	N/A	Utilizado para la obtención de antígenos en tinción por inmunofluorescencia
Tubería de diálisis (MWCO 3.500 Da)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	PURD35030	Utilizado para la purificación de nanopartículas
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	D2447	Disolvente para la preparación de nanopartículas
DiI (1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-perclorato de tetrametilindocarbocianina)	Beyotime (China)	C1036	Marcado fluorescente del núcleo de nanopartículas
DiO (3,3′-dioctadeciloxacarbociano perclorato)	Beyotime (China)	C1038	Marcado fluorescente de la membrana de macrófagos
DiR	Beyotime (China)	Y239280	Utilizado para imágenes de fluorescencia in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	D3571	Contratinción nuclear para imagen de fluorescencia
Dulbecco' s Eagle Medio Modificado (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	11965092	Medio de cultivo celular
Analizador dinámico de dispersión de luz (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Reino Unido)	N/A	Utilizado para mediciones de dispersión dinámica de luz (DLS) del tamaño de nanopartículas, PDI y potencial zeta
Kit ELISA	R& D Systems (EE. UU.)	Depende de la citoquina objetivo	Utilizado para cuantificar citocinas inflamatorias
Endotelina-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	E7764	Se usa para estimular integrina y alfa; 4/y beta; 1 Expresión
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.)	10091148	Suplemento para medio de cultivo celular
Citómetro de flujo	BD en Biociencias (EE. UU.)	FACSCalibur	Utilizado para la adquisición de señales de fluorescencia
Software de análisis de citometría de flujo (FlowJo v10.8.1)	BD en Biociencias (EE. UU.)	N/A	Utilizado para el análisis de datos de citometría de flujo
Células endoteliales de la vena umbilical, humana (HUVEC)	FuHeng Biotechnologies (China)	FH1122	Utilizado en ensayos de selección in vitro
Software de análisis de imágenes (ImageJ)	Institutos Nacionales de Salud (EE. UU.)	N/A	Utilizado para análisis cuantitativo de imágenes
Sistema de imagen in vivo	PerkinElmer (EE. UU.)	IVIS Lumina III	Utilizado para imágenes de fluorescencia de cuerpo entero
Isopropanol (60%)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	34863	Usado para diferenciación durante la tinción con Oil Red O
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	L3000001	Reactivo de transfección
Agitador magnético y barra agitadora	N/A	N/A	Utilizado para la preparación de nanopartículas
Masson' s Kit de tinte tricromo	Abcam (EE. UU.)	ab150686	Utilizado para la tinción de colágeno
Mini extrusora	Lípidos polares Avanti (EE. UU.)	610000	Utilizado para extrusión de membrana
Línea celular Murine RAW 264.7	FuHeng Biotechnologies (China)	FH0328	Origen de los macrófagos
Línea celular de músculo liso murino	FuHeng Biotechnologies (China)	FH-Y063	Utilizado para la evaluación de seguridad
Oil Red O	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	O0625	Usado para tinción lipídica
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	31985062	Medio suero reducido para transfección
Lipoproteína oxidada de baja densidad (Ox-LDL)	Yiyuan Biotechnologies (China)	YB-002	Utilizado para inducir la formación de células de espuma
Penicilina– Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	15140122	Suplemento antibiótico para cultivo celular
Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	78830	Inhibidor de proteasa
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	10010023	Lavado y amortiguador de dilución
Poli(ácido láctico-coglicólico) (PLGA, 50:50; MW 90,000)	Dalian Meilun Biotecnología (China)	MB5649-1	Polímero para fabricación de nanopartículas
Filtros de membrana de policarbonato (200 nm, 400 nm)	Whatman (Reino Unido)	800282	Utilizado para extrusión
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	P9333	Componente del tampón de lisis
Reactivo P3000	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	L3000001	Potenciador de transfección
Microtomo rotatorio	Leica Biosystems (Alemania)	RM2235	Utilizado para seccionar parafina
Bomba de jeringuilla	Aparato de Harvard (EE. UU.)	70-3007	Utilizado para la formación controlada de nanopartículas
Microscopio electrónico de transmisión (TEM)	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	Talos F200S	Utilizado para la imagen de nanopartículas
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	T2663	Componente búfer
Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-&alfa)	R& D Systems (EE. UU.)	410-MT	Utilizado para activar células endoteliales
Agua ultrapura	Milli-Q (Merck, EE. UU.)	ZMQSV0T01	Utilizado para la preparación y diálisis de nanopartículas