Aislamiento, síntesis y caracterización de nanopartículas CD47 e integrina α4/β1 modificadas por membrana de macrófagos y nanopartículas de ácido poli(ácido láctico-coglicólico)

Summary

Este protocolo permite la preparación y caracterización de nanopartículas de poli(ácido láctico-coglicólico) recubiertas de membrana con α4/β1 CD47 e integrina para aplicaciones dirigidas a la administración de fármacos.

Abstract

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica y un factor importante en la morbilidad y mortalidad cardiovascular. La administración dirigida de agentes antiinflamatorios a los sitios ateroscleróticos sigue siendo un desafío importante. Presentamos un protocolo detallado para la preparación y caracterización de nanopartículas de membrana recubiertas de colchicina (MMM/COL) con fibrofago CD47 e integrina α4/β1 comodificadas con membrana y recubiertas de colchicina (MMM/COL NPs). El protocolo incluye modificación de macrófagos mediante transfección de plásmidos y estimulación con endotelina-1, aislamiento de membrana, fabricación de NP y recubrimiento de membrana. Los NP MMM/COL resultantes se evalúan mediante caracterización fisicoquímica, análisis de expresión proteica y ensayos in vitro e in vivo . La validación funcional incluye la evaluación de la asociación celular con células endoteliales activadas, la captación de macrófagos, los efectos antiinflamatorios en las células de espuma y la biodistribución en un modelo murino de aterosclerosis. Además, se destacan parámetros experimentales clave y pasos de control de calidad para garantizar la reproducibilidad y consistencia entre laboratorios. Este protocolo proporciona un enfoque robusto y escalable para generar NPs biomiméticos para aplicaciones dirigidas de administración de fármacos en la investigación de la aterosclerosis.

Introduction

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica que conduce a eventos cardiovasculares fatales y accidentes cerebrovasculares a través de estenosis arterial de la luz y ruptura inestable de placas, lo que supone una carga significativa para la salud^{global 1,2,3}. La regulación a la baja de las respuestas inflamatorias en el sitio aterosclerótico es un objetivo terapéutico^{principal 4,5}. La colchicina, un potente antiinflamatorio, ha demostrado ser prometedora en la reducción de eventos cardiovasculares^{adversos 6,7}. Sin embargo, su utilidad clínica está limitada por una ventana terapéutica estrecha y efectos secundarios sistémicos, lo que requiere sistemas de administración dirigida para mejorar la acumulación en el lugar de la placa minimizando^{la toxicidad 8}.

Las nanopartículas (NPs) recubiertas de membrana celular han surgido como una plataforma poderosa para la administración dirigida de fármacos, aprovechando las funciones biológicas naturales de las células fuente ^9,10,11. Entre los tipos celulares implicados en la aterosclerosis, los macrófagos desempeñan un papel fundamental 12,13,14. La integrina α4/β1, expresada en macrófagos, media el reclutamiento en placas ateroscleróticas al unirse a la molécula de adhesión de células vasculares-1 (VCAM-1) expresada en células endoteliales (CE) activadas. CD47, una señal de "no me comas", permite la evasión de la fagocitosis por el sistema de fagocitos^{mononucleares 15,16}. Al diseñar las membranas de los macrófagos para sobreexpresar estas proteínas en comparación con las macrófagas nativas, se pueden crear NPs con un mejor objetivo mediante la interacción integrina α4/β1–VCAM-1 y una reducción de la fagocitosis mediante la señalización^{mediada por CD47 6}. La estrategia de doble modificación mejora los NPs nativos recubiertos de membrana y los sistemas de segmentación basados en ligandos, al aumentar simultáneamente la segmentación a los ECs activados y reducir la eliminación fagocítica. A diferencia de las membranas macrófagas nativas, que expresan solo niveles basales de estas proteínas, nuestra membrana diseñada proporciona una funcionalidad mejorada sin introducir ligandos sintéticos que puedan desencadenar inmunogenicidade.

Este protocolo detalla la preparación y caracterización de NPs poli(ácido láctico-coglicólico) cargados de colchicina (NPs COL) recubiertos con membranas de macrófagos co-modificadas CD47- e integrina α4/β1, generando NPs recubiertas de membrana de macrófagos modificados (NPs MMM/COL). Describimos métodos para la modificación genética y farmacológica de los macrófagos RAW 264.7, el aislamiento de membranas modificadas, la preparación y recubrimiento de NPs PLGA, y ensayos funcionales integrales in vitro e in vivo . Este método proporciona un marco reproducible para preparar y evaluar NPs biomiméticos para aplicaciones dirigidas de administración de fármacos en la investigación de la aterosclerosis.

Protocol

Todos los procedimientos animales descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales del Hospital Torre de Tambores de Nanjing y siguieron las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio establecidas por los Institutos Nacionales de Salud.

1. Modificación de los macrófagos RAW 264.7

1. Preparar las células RAW 264,7, completar el Medio Águila Modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina–estreptomicina, plásmido de sobreexpresión CD47, reactivo de transfección de lipofectamina 3000, endotelina-1 (ET-1), suero salino tamponado con fosfato (PBS) y suministros de cultivo de tejido estéril.
2. Cultiva 264,7 células RAW en una incubadora humidificada a 37°C con un 5% de CO₂ y mantén las células hasta que alcancen aproximadamente 4–5 × 10^{5 células} por pozo en una placa de 6 pozos.
3. Realizar la modificación CD47
   1. Preparar la solución de ADN plásmido mezclando 2,5 μg de ADN plásmido con 5 μL de reactivo P3000 en un medio libre de suero Opti-MEM de 125 μL.
   2. Preparar la solución del reactivo de transfección diluyendo 3,75 μL de reactivo de transfección en 125 μL de medio libre de suero.
   3. Utiliza estos volúmenes para un formato de placa de 6 pozos. Escalar todos los componentes proporcionalmente para otros formatos manteniendo una proporción ADN:P3000 de 1:2 (μg:μL) y una proporción ADN:reactivos de transfección de 1:1,5 (μg:μL).
      NOTA: Por ejemplo, utiliza 10 μg de ADN, 20 μL de P3000 y 15 μL de reactivo de transfección para platos de 10 cm.
   4. Combina la solución de ADN con la solución de reactivo de transfección e incuba durante 15 minutos a 25°C.
   5. Añadir los complejos de transfección a las células en DMEM libre de antibióticos suplementado con un 10% de FBS aproximadamente entre 2–2,5 × 10⁶ células por plato de 10 cm.
   6. Sustituye el medio por un medio fresco completo que contenga antibióticos 6 horas después de la transfección.
4. Realizar la modificación de integrina α4/β1
   1. Estimular células transfectadas o no transfectadas con 100 nM ET-1 en un medio libre de suero durante 24 horas para regular al alza la expresión de integrina α4/β1.
      NOTA: Verificar la eficiencia de la modificación mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) y análisis por Western blot para CD47, integrina α4 e integrina β1.

2. Aislamiento de la membrana de macrófagos modificados (MMM)

1. Cosecha las celdas modificadas RAW 264.7 usando un raspador de celdas.
2. Centrifuga las celdas a 900 × g durante 5 minutos a 4°C.
3. Lava el pellet de células tres veces con PBS frío de 1×.
4. Resuspende el pellet celular en 2 mL de tampón de lisis hipotónica preenfriado (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM de KCl, 1,5 mM de_MgCl2 y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo) e incuba la suspensión en hielo durante 15 minutos.
5. Congela la suspensión en nitrógeno líquido durante 2 minutos y luego déjala en un baño maría a 37°C durante 5 minutos. Repite el ciclo de congelación-deshielo cinco veces para lisar completamente las células.
   PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar quemaduras criogénicas graves. Manipula con guantes aislantes adecuados y protección facial.
6. Centrifuga el lisado a 850 × g durante 10 minutos a 4°C para eliminar núcleos y células no fracturadas.
7. Centrifugar el sobrenadante recogido a 15.000 × g durante 30 minutos a 4°C. Para obtener una mayor pureza de membrana, transfiere el sobrenadante obtenido tras una centrifugación de 15.000 × g a tubos ultracentrífugas y centrifuga a 100.000 × g durante 1 hora a 4°C usando una ultracentrífuga.
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de que los tubos de ultracentrífuga estén correctamente equilibrados y estén homologados para centrifugación a alta velocidad para evitar desequilibrios o fallos del rotor.
   NOTA: La ultracentrifugación produce membranas plasmáticas purificadas con una contaminación intracelular reducida por orgánulos.
8. Recoge el pellet que contiene fragmentos de MMM y resuspende en 300 μL de 1× PBS o tampón de lisis para obtener una concentración proteica de aproximadamente 1–2 mg/mL.
9. Determina la concentración de proteínas de membrana utilizando un kit de cuantificación de proteínas BCA.
   NOTA: Las membranas aisladas pueden almacenarse a −80°C para su uso posterior.

3. Preparación de NPs de PLGA cargados con colchicina (NPs COL)

1. Disuelva 10 mg de PLGA (50:50, MW 90,000) y 1 mg de colchicina en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
   PRECAUCIÓN: El DMSO puede penetrar en la piel y mejorar la absorción de otras sustancias. Lleva el equipo de protección personal adecuado (guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas de seguridad) al manipularlo. Recoge soluciones que contienen DMSO como residuos orgánicos y deshazte a través de servicios autorizados de eliminación de residuos peligrosos. La colchicina es tóxica y potencialmente teratogénica. Recoger todos los materiales contaminados con colchicina (soluciones, guantes y tubos) como residuos farmacéuticos peligrosos y deshacerse a través de servicios autorizados de eliminación de residuos peligrosos según la normativa institucional y local.
2. Remueve la solución a 500 rpm usando un agitador magnético con una barra agitadora recubierta de teflón de 10 mm a 25°C.
3. Añade 4 mL de agua ultrapura gota a gota a aproximadamente 1 mL/min usando una bomba de jeringuilla equipada con una jeringuilla de 5 mL y una aguja de 26 g a 25°C.
4. Continúa removiendo la mezcla durante 3 horas para permitir la formación de NP.
5. Transfiere la suspensión NP a una bolsa de diálisis (MWCO 3.500 Da).
6. Diálisa con 2 L de agua destilada a 4°C bajo una suave agitación a 200 rpm.
7. Continúa con la diálisis durante 24 horas y reemplaza completamente el buffer de diálisis a las 6, 12 y 24 horas para eliminar la colchicina libre y el DMSO.
   PRECAUCIÓN: Recoge todos los disolventes y reactivos orgánicos, incluidos los de la diálisis, como residuos químicos orgánicos. No lo tires por el desagüe. Sigue los protocolos institucionales de eliminación de residuos peligrosos.
8. Recoge la suspensión COL NP dializada y guarda a 4°C.
   NOTA: Los NP de COL pueden almacenarse a 4°C para uso a corto plazo (hasta 3 días). Para el marcaje fluorescente, incorpora el 0,1% (p/w) de 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-perclorato de tetrametilindocarbocianina (DiI) en la solución de PLGA durante el paso 3.1.
9. Verifica la eliminación de DMSO y colchicina gratuita
   1. Recoger el diálisado final (el tampón tras el último cambio a las 24 horas) y analízalo usando espectrofotometría ultravioleta–visible (UV–vis).
   2. Escanea el diálisis de 200 a 400 nm y compáralo con una muestra de control (tampón de diálisis fresco).
   3. Confirmar que no hay un pico de absorbancia presente aproximadamente en 210 nm (característico de la DMSO) ni en 345 nm (característico de la colchicina), indicando la eliminación exitosa del disolvente residual y del fármaco libre.
   4. Alternativamente, determina la concentración residual de DMSO usando un kit de ensayo DMSO según las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que el DMSO residual esté por debajo del 0,1% (v/v) para evitar citotoxicidad en los ensayos posteriores.

4. Fabricación de NPs recubiertos de membrana (NP MMM/COL)

1. Sonica la suspensión aislada del MMM (del paso 2.7) durante 20 minutos usando un sonicador de baño maria a 40 kHz y 110 W. Mantén el volumen de muestra en 1 mL en un tubo de 1,5 mL y temperatura por debajo de 25°C usando baño de hielo según sea necesario.
2. Extruir la suspensión de membrana sonicada a través de un filtro de membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 400 nm utilizando un mini extrusor para formar vesículas de membrana.
3. Mezcla las NP de COL (del paso 3.5) con las vesículas MMM en una proporción de masa de proteína membrana a PLGA de 1:1.
   1. Utiliza una suspensión de membrana que contenga 10 mg de proteína para 10 mg de PLGA según el ensayo de cuantificación de proteínas.
   2. Haz una pipeta suave y mezcla las NPs de COL con las vesículas MMM arriba y abajo 15 veces usando una pipeta de 1 mL.
4. Coextruye la mezcla a través de un filtro de membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 200 nm y repite la extrusión durante 15 pasadas.
5. Recoge la suspensión resultante que contiene NPs MMM/COL y guárdala a 4°C para su uso inmediato.

5. Caracterización de los NP

1. Mide el diámetro hidrodinámico, el índice de polidispersión (PDI) y el potencial zeta usando dispersión dinámica de la luz (DLS) bajo las siguientes condiciones: temperatura, 25°C; ángulo de retrodispersión, 173°; tiempo de equilibrio, 2 minutos; y tres mediciones replicadas por muestra.
2. Diluir las muestras 20 veces en agua desionizada (concentración final, aproximadamente 0,1 mg/mL).
   NOTA: La dilución minimiza los efectos de dispersión múltiple.
3. Visualiza la estructura núcleo-capa de los NP MMM/COL utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM).
   1. Colocar 5 μL de suspensión NP (aproximadamente 0,1 mg/mL) sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono con descarga glow-glow (malla de 300).
   2. Deja que la muestra adsorba durante 2 minutos a 25°C.
   3. Elimina el exceso de líquido tocando suavemente el borde de la rejilla con papel de filtro.
   4. Aplica 5 μL de solución de acetato de uranilo al 1% sobre la rejilla e incuba durante 1 minuto a 25°C.
   5. Elimina el exceso de mancha con papel de filtro.
   6. Deja que la rejilla se seque completamente al aire durante al menos 10 minutos antes de la imagen.
      PRECAUCIÓN: El acetato de uranilo es tóxico y radiactivo. Manipular con el equipo de protección individual adecuado (guantes, bata de laboratorio y protección ocular) y desechar los residuos según las directrices institucionales sobre materiales peligrosos.
4. Marque la membrana con colorante perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO) durante el paso 2 o marcando células intactas antes del aislamiento de membrana, y marque el núcleo PLGA con DiI.
5. Analizar la colocalización de señales DiO (verde) y DiI (rojo) utilizando microscopía láser confocal de barrido (CLSM).
   1. Establecer los parámetros de excitación/emisión de la siguiente manera: DiO (verde), excitación 488 nm, emisión 550 nm; DiI (rojo), excitación 561 nm, emisión 620 nm.
   2. Utiliza un objetivo de inmersión en aceite del 60× (apertura numérica, 1,4).
   3. Ajusta el orificio estenopeico a 1 unidad Airy.
   4. Ajusta la ganancia del detector para evitar la saturación de píxeles.
   5. Adquirir imágenes con una resolución de 1024 × 1024 píxeles con promedia de línea de 2×.
   6. Mantén la potencia láser por debajo del 5% para minimizar el fotoblanqueo.
6. Analizar la presencia de CD47, integrina α4 e integrina β1 en la superficie np del MMM/COL utilizando análisis de Western blot.
7. Determinar la carga y liberación de la droga
   1. Lisar un volumen de 100 μL de NPs en DMSO y medir la absorbancia de colchicina a 345 nm para determinar la carga de fármacos y la eficiencia de encapsulación.
   2. Coloque 1 mL de suspensión de NP de MMM/COL (que contiene aproximadamente 100 μg de colchicina) en una bolsa de diálisis (MWCO, 3.500 Da).
   3. Sella la bolsa y sumérgelo en 50 mL de PBS (pH 7,4) que contenga un 20% de FBS en un vaso de cristal de 100 mL.
   4. Mantener el medio liberador a 37°C bajo agitación constante a 100 rpm usando un agitador magnético con una barra agitadora recubierta de Teflón de 20 mm.
   5. Mantener las condiciones de sumergimiento durante todo el experimento.
      NOTA: La solubilidad de la colchicina en PBS con un 20% de FBS es de >1 mg/mL; La concentración máxima de colchicina en el medio de liberación es del <10% de la saturación.
   6. En los tiempos predeterminados (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 y 62 h), extraer 500 μL de medio de liberación.
   7. Sustituye el volumen retirado por un volumen igual de PBS fresco precalentado (37°C) que contenga un 20% de FBS.
   8. Mide la concentración de colchicina en las muestras extraídas usando espectrofotometría UV–Vis a 345 nm.
   9. Realiza todas las mediciones en triplicado.

6. Ensayos funcionales in vitro

1. Semillas de células endoteliales de la vena umbilical, HUVEC. Estimular las células con 10 ng/mL factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) durante 24 horas para aumentar el VCAM-1.
2. Asociación celular de NPs MMM/DiI con HUVECs
   1. Incubar las células con NPs MMM/COL marcados con DiI (MMM/DiI NPs) a una concentración de 50 μg/mL (basada en la masa central de PLGA) durante 4 horas a 37°C en una atmósfera con 5% de CO₂.
   2. Lava las células tres veces con PBS preenfriado. Centrifuga las celdas a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C tras cada lavado.
   3. Resuspende las células lavadas en PBS que contienen albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%. Ajusta la concentración final de la celda a 1 × 10⁶ células/mL.
   4. Establece los parámetros del instrumento para citometría de flujo o CLSM. Detectar fluorescencia DiI usando excitación a 549 nm y emisión a 565 nm (canal PE).
   5. Obtén datos de las muestras. Adquirir al menos 10.000 eventos por muestra para citometría de flujo o capturar campos representativos para CLSM.
   6. Selecciona cinco campos representativos por muestra de regiones distintas, excluyendo los bordes, usando una lente de inmersión en aceite del 60×. Asegúrate de que las células estén intactas y no se solapen.
   7. Cega las muestras antes de la adquisición de la imagen. Selecciona los campos moviendo aleatoriamente el escenario en lugar de elegir manualmente áreas específicas.
   8. Aplicar parámetros de umbral y análisis idénticos a todas las muestras en condiciones de cegado.
   9. Excluye los residuos celulares usando el filtro FSC-A/SSC-A. Selecciona las celdas singlete usando la puerta FSC-A/FSC-H.
   10. Selecciona células vivas usando tinción con tinte viable. Añade 7-aminoactinomicina D (7-AAD) a 1 μg/mL, incuba durante 5 minutos a 4°C en la oscuridad y úsala para la filtración de células vivas.
   11. Analizar la intensidad de la fluorescencia para cuantificar la asociación celular. Utiliza la intensidad media de fluorescencia como métrica de cuantificación. Realizar análisis de datos utilizando el software de análisis de citometría de flujo FlowJo (v10.8.1).
3. Captación celular de NPs MMM/DiI por macrófagos RAW 264.7
   1. Incubar NPs MMM/COL marcados con DiI (MMM/DiI NPs) con macrófagos RAW 264,7 sin modificar a una concentración de 50 μg/mL (basada en la masa central del PLGA) durante 4 horas a 37°C en una atmósfera con 5% de CO₂.
   2. Preparar las células para el análisis tal y como se describe en los pasos 6.2.2–6.2.3.
   3. Establecer parámetros del instrumento para la detección de DiI usando excitación a 549 nm y emisión a 565 nm (canal PE).
   4. Obtén datos de las muestras. Adquiere al menos 10.000 eventos por muestra.
   5. Excluye los residuos celulares usando el filtro FSC-A/SSC-A. Selecciona las celdas singlete usando la puerta FSC-A/FSC-H.
   6. Selecciona células vivas usando tinción con tinte viable. Añade 7-AAD a 1 μg/mL, incuba durante 5 minutos a 4 °C en la oscuridad y úsalo para la filtración de células vivas.
   7. Analizar la intensidad de fluorescencia para cuantificar la captación celular. Utiliza la intensidad media de fluorescencia como métrica de cuantificación. Realizar análisis de datos utilizando software de análisis de citometría de flujo.
4. Ensayo con celda de espuma
   1. Diferenciar las células RAW 264.7 en células de espuma incubándolas con lipoproteína oxidada de baja densidad (oxLDL) a 50 μg/mL durante 48 horas. Confirmar la formación de células de espuma mediante tinción de Oil Red O, indicada por acumulación intracelular de lípidos.
   2. Tratar las células de espuma con colchicina libre, COL NPs o MMM/COL NPs a una concentración equivalente de colchicina de 1 μM. Incubar las células durante 24 horas a 37°C en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de CO₂.
      NOTA: Seleccione esta concentración en base a experimentos preliminares de dosis-respuesta que evalúen la viabilidad celular y la eficacia antiinflamatoria.
   3. Mide los niveles de citocinas inflamatorias utilizando un ensayo inmunoabsorbente enzimático (ELISA).
      1. Recoger los supernadantes de cultivo celular inmediatamente después del tratamiento (24 horas después del tratamiento).
      2. Centrifuga las placas a 300 × g durante 5 minutos a 4°C para eliminar los restos de las celdas.
      3. Transfiere los supernadantes clarificados a tubos limpios y guarda a −80°C hasta el análisis.
      4. Mide los niveles de TNF-α e interleucina-6 usando kits ELISA según las instrucciones del fabricante.
      5. Realiza todas las mediciones en pozos triplicados y repite el experimento tres veces de forma independiente.
      6. Informa las concentraciones de citocinas como valores absolutos (pg/mL) sin normalización adicional, ya que la densidad de siembra celular y las condiciones de tratamiento son consistentes en todos los grupos.

7. Aplicación terapéutica in vivo en un modelo de aterosclerosis

NOTA: Todos los procedimientos animales deben ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales correspondiente.

1. Establecer el modelo animal
   1. Establecer un modelo de placa aterosclerótica vulnerable en ratones machos de 8 semanas con apolipoproteína E knockout (ApoE⁻/⁻) (C57BL/6 fondo).
   2. Alimenta a los ratones con una dieta alta en grasas que contenga un 15% de grasa y un 0,25% de colesterol ad libitum durante una semana antes de la cirugía y continúa durante 4 semanas después de la operación.
   3. Anestesiar ratones con isoflurano (2%–3% para inducción y 1,5%–2% para mantenimiento) y administrar buprenorfina (0,1 mg/kg, subcutánea) para analgesia durante la cirugía de constricción de la arteria carótida.
   4. Constriñe la arteria carótida común izquierda con una aguja de 0,3 mm de diámetro colocada junto a la arteria. Ata una ligadura de seda 6-0 alrededor de la arteria y la aguja, y luego retira la aguja para crear una constricción parcial.
   5. Confirmar la formación de la placa vulnerable a las 4 semanas postoperatorias mediante una evaluación histológica.
   6. Realizar hematoxilina y eosina (H&E), Oil Red O y tinción tricroma de Masson para evaluar la morfología de la placa, la deposición lipídica y el contenido de colágeno.
   7. Defina las placas vulnerables por el área de la placa > el 40% del área de la sección transversal del vaso, el grosor de la capa fibrosa < 120 μm, el área del núcleo lipídico > el 40% del área total de la placa y una infiltración sustancial de macrófagos CD68-positivos.
2. Inyectar 100 μL de NPs MMM/COL marcados con DiI por vía intravenosa a través de la vena caudal a una dosis de 2 mg/kg (según la masa central del PLGA).
   1. Fotografía de ratones al día siguiente de la inyección utilizando un sistema de imagen in vivo para evaluar la biodistribución de todo el cuerpo.
      1. Anestesiar ratones con isoflurano (3% para inducción y 1,5%–2% para mantenimiento, con caudales de oxígeno de 1 y 0,5 L/min, respectivamente). Monitoriza la profundidad de la anestesia por frecuencia respiratoria y reflejo de pellizco en los dedos del pie.
      2. Colocar a los ratones en posición supina en un escenario calefactado a 37°C para mantener la temperatura corporal durante la imagen.
      3. Adquiere imágenes de fluorescencia usando ajustes DiI (excitación 549 nm y emisión 565 nm) con un filtro CY3 o TRITC. Utiliza el modo de exposición automática (normalmente 50–200 ms) y la adquisición de epifluorescencia.
      4. Capturar imágenes de campo claro correspondientes simultáneamente para referencia anatómica a una resolución de 1024 × 1024 píxeles.
   2. Extraer órganos principales y arterias carótidas para imágenes de fluorescencia ex vivo.
      1. Anestesiar ratones con isoflurano (3% para inducción y 2,5%–3% para mantenimiento).
      2. Perfundir ratones con 20 mL de PBS helado (pH 7,4) mediante punción ventricular izquierda a un caudal de 5 mL/min para eliminar sangre residual y NPs no ligadas.
      3. Extraer órganos (corazón, aorta, hígado, bazo, riñón y pulmón) inmediatamente después de la perfusión a las 24 horas de la inyección.
      4. Enjuaga los órganos extraídos con PBS bien frío para eliminar la sangre superficial.
      5. Abre la aorta longitudinalmente y sujeta con fijadores planos (con el lado endotelial hacia arriba) sobre una placa de silicona negra usando pasadores de acero inoxidable.
      6. Mantén los tejidos en PBS bien frío y realiza imágenes de fluorescencia ex vivo en un plazo de 30 minutos tras la cosecha. Elimina el exceso de PBS de la superficie del tejido inmediatamente antes de la imagen.
3. Realizar dosificación y tratamiento
   1. Determinar la dosis de colchicina en el estudio preliminar dosis-respuesta (0,01–0,45 mg/kg, n = 7/grupo). Selecciona 0,05 mg/kg de colchicina como dosis terapéutica.
   2. Administrar 100 μL mediante inyección en la vena caudal, correspondiente a una dosis NP de 2 mg/kg (masa central de PLGA) y una dosis de colchicina de 0,05 mg/kg. Inyecta una vez al día durante 14 días consecutivos.
   3. Asigna aleatoriamente los ratones en grupos de tratamiento (PBS, colchicina libre y enfermeros NP MMM/COL) usando un generador de números aleatorios. Realizar todas las cuantificaciones por dos observadores ciegos ante los grupos de tratamiento.
   4. Aplica criterios humanos, incluyendo pérdida de >20% de peso corporal, movilidad reducida o signos de malestar.
4. Realizar análisis de puntos finales
   1. Eutanasia a ratones 24 horas después de la inyección final. Cosechar arterias carótidas y aortas. Evalúa la carga de placa mediante la mancha en cara de Oil Red O en las aortas.
   2. Cuantificar el área de la placa
      1. Cuantifique el área de la placa como porcentaje de área O-positiva en Oil Red O-posito del área total de luz aórtica en secciones transversales (cinco secciones por ratón) utilizando software de análisis de imágenes.
      2. Abre la imagen en el software de análisis de imágenes ImageJ.
      3. Haz clic en Imagen → Escribe → 8 bits para convertir la imagen a escala de grises.
      4. Haz clic en la imagen → ajustar → umbral. Selecciona el método Otsu y aplica el umbral para identificar regiones de Oil Red O-positivas.
      5. Aplica los mismos parámetros umbral a todas las imágenes de muestra y registra la configuración de umbral para verificación.
      6. Haz clic en Analizar → Establecer Medidas y selecciona Área.
      7. Haz clic en Analizar → Medir para cuantificar las regiones seleccionadas.
      8. Exporta los datos cuantificados.
   3. Evaluar la estabilidad de la placa
      1. Evalúa la estabilidad de la placa mediante tinción histológica de secciones eficaces carotídeas usando H&E, Oil Red O y la tinción tricroma de Masson. Cuantifique el colágeno como el porcentaje de área azul tricromo-positiva de Masson en el área de placa.
      2. Preparar secciones incrustadas con parafina con un grosor de 5 μm y secciones congeladas incrustadas a temperatura óptima de corte con un espesor de 8 μm.
      3. Realiza la tinción H&E desparafinizando y rehidratando secciones, seguida de la tinción por hematoxilina durante 5 minutos y la tinción con eosina durante 2 minutos a temperatura ambiente (RT; 23°C ± 2°C).
      4. Realiza la tinción con aceite rojo O en secciones congeladas incubando con solución de trabajo de aceite rojo durante 15 minutos en RT. Diferencia las secciones con isopropanol al 60% durante 2 segundos y enjuaga con agua destilada.
      5. Realiza la tinción tricroma de Masson según las instrucciones del kit incubando secciones con hematoxilina de hierro de Weigert durante 10 minutos, fucisina de ponceau-ácido durante 5 minutos, ácido fosfomolíbdico durante 5 minutos y azul de anilina durante 5 minutos en RT.
      6. Imágenes histológicas abiertas en software de análisis de imágenes.
      7. Aplica umbral de color para identificar regiones positivas para colágeno. Realiza un umbral automático y aplica los mismos parámetros a todas las imágenes de muestra.
      8. Configuración de umbrales de registro para verificación.
      9. Define el área total de la placa como la suma de todas las áreas de placa dentro de la vagina vascular.
      10. Mide el área de la placa trazando manualmente los límites de la placa o utilizando la segmentación automática de umbrales para identificar todas las regiones de la placa.
      11. Mide el área positiva para colágeno.
      12. Calcula el contenido de colágeno como área positiva para colágeno dividida por el área total de la placa × 100%.
   4. Evaluar el contenido de macrófagos
      1. Realizar tinción de inmunofluorescencia CD68 para evaluar el contenido de macrófagos. Cuantifique el contenido de macrófagos como el porcentaje de área de placa positiva para CD68.
      2. Prepara secciones de tejido (5 μm de espesor para secciones incrustadas en parafina). Realiza la extracción de antígenos usando tampón de citrato (pH 6,0) bajo alta presión durante 2 minutos.
      3. Secciones de bloque con un 5% de BSA durante 30 minutos en RT.
      4. Incubar secciones con anticuerpo primario monoclonal anti-ratón CD68 (clon D4B9C, dilución 1:200 en 1% de BSA) durante la noche a 4°C.
      5. Incubar secciones con anticuerpo secundario anti-conejo IgG conjugado con Alexa Fluor 488 (dilución 1:500) durante 1 hora en RT.
      6. Contratinción de núcleos con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 minutos.
      7. Imágenes de fluorescencia abiertas en software de análisis de imágenes.
      8. Identificar regiones CD68 positivas mediante umbral. Realiza un umbral automático y aplica los mismos parámetros a todas las imágenes de muestra.
      9. Configuración de umbrales de registro para verificación.
      10. Mide el área CD68-positiva.
      11. Calcular el contenido de macrófagos como área CD68-positiva dividida por el área total de la placa × 100%.

Results

Las mediciones DLS se realizaron utilizando un sistema Zetasizer Nano ZS a 25°C con un ángulo de retrodispersión de 173°. Las muestras se diluyeron 20 veces en agua desionizada (concentración final de aproximadamente 0,1 mg/mL) y se equilibraron durante 2 minutos antes de la medición. Cada muestra se midió en triplicado y los resultados se presentan como media ± SD. DLS y TEM revelan un aumento en el tamaño de NP tras el recubrimiento de membrana y confirman la formación de una estructur...

Discussion

Este protocolo proporciona un método integral para construir y aplicar NPs comodificados por membrana de macrófagos CD47 e integrina α4/β1 para la terapia dirigida de aterosclerosis. Las principales ventajas de este sistema incluyen la dirección activa mediante la interacción integrina α4/β1–VCAM-1 y la reducción de la captación de macrófagos asociada a la señalización mediada por CD47, como respaldan los ensayos in vitro (Figura 3) y los resultados de biodi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomicina D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	A1310	Colorante de viabilidad para la discriminación viva/muerta de citometría de flujo
Alexa Fluor 488-conjugado para la cabra anti-conejo IgG	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	A-11008	Anticuerpo secundario para la tinción de inmunofluorescencia CD68
Anticuerpo anti-ratón CD47	Abcam (EE. UU.)	ab214453	Utilizado para el análisis de Western blot para verificar la expresión de CD47
Integrina antiratón y alfa; 4 anticuerpos (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (EE. UU.)	SC-376334	Utilizado para análisis de Western blot para verificar integrina y alfa; 4 Expresión
Integrina anti-ratón y beta; 1 anticuerpo (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (EE. UU.)	SC-374429	Utilizado para análisis de Western blot para verificar integrina y beta; 1 Expresión
ApoE-/- ratones	El Laboratorio Jackson (EE. UU.)	N/A	Utilizado para modelos de aterosclerosis in vivo
Kit de ensayo BCA	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	23225	Utilizado para determinar la concentración de proteínas
Placa de silicona negra	N/A	N/A	Se utiliza para montar aorta en imágenes ex vivo
Plásmido CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (China)	G0177361-1	Contiene el gen Cd47 del ratón para sobreexpresión
Colchicina	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	C9754	Carga útil terapéutica en nanopartículas
Microscopio láser de barrido confocal	Leica Microsystems	TCS SP8	Utilizado para imágenes de fluorescencia y análisis de colocalización
Tampón de citrato (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	N/A	Utilizado para la obtención de antígenos en tinción por inmunofluorescencia
Tubería de diálisis (MWCO 3.500 Da)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	PURD35030	Utilizado para la purificación de nanopartículas
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	D2447	Disolvente para la preparación de nanopartículas
DiI (1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-perclorato de tetrametilindocarbocianina)	Beyotime (China)	C1036	Marcado fluorescente del núcleo de nanopartículas
DiO (3,3′-dioctadeciloxacarbociano perclorato)	Beyotime (China)	C1038	Marcado fluorescente de la membrana de macrófagos
DiR	Beyotime (China)	Y239280	Utilizado para imágenes de fluorescencia in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	D3571	Contratinción nuclear para imagen de fluorescencia
Dulbecco' s Eagle Medio Modificado (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	11965092	Medio de cultivo celular
Analizador dinámico de dispersión de luz (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Reino Unido)	N/A	Utilizado para mediciones de dispersión dinámica de luz (DLS) del tamaño de nanopartículas, PDI y potencial zeta
Kit ELISA	R& D Systems (EE. UU.)	Depende de la citoquina objetivo	Utilizado para cuantificar citocinas inflamatorias
Endotelina-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	E7764	Se usa para estimular integrina y alfa; 4/y beta; 1 Expresión
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.)	10091148	Suplemento para medio de cultivo celular
Citómetro de flujo	BD en Biociencias (EE. UU.)	FACSCalibur	Utilizado para la adquisición de señales de fluorescencia
Software de análisis de citometría de flujo (FlowJo v10.8.1)	BD en Biociencias (EE. UU.)	N/A	Utilizado para el análisis de datos de citometría de flujo
Células endoteliales de la vena umbilical, humana (HUVEC)	FuHeng Biotechnologies (China)	FH1122	Utilizado en ensayos de selección in vitro
Software de análisis de imágenes (ImageJ)	Institutos Nacionales de Salud (EE. UU.)	N/A	Utilizado para análisis cuantitativo de imágenes
Sistema de imagen in vivo	PerkinElmer (EE. UU.)	IVIS Lumina III	Utilizado para imágenes de fluorescencia de cuerpo entero
Isopropanol (60%)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	34863	Usado para diferenciación durante la tinción con Oil Red O
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	L3000001	Reactivo de transfección
Agitador magnético y barra agitadora	N/A	N/A	Utilizado para la preparación de nanopartículas
Masson' s Kit de tinte tricromo	Abcam (EE. UU.)	ab150686	Utilizado para la tinción de colágeno
Mini extrusora	Lípidos polares Avanti (EE. UU.)	610000	Utilizado para extrusión de membrana
Línea celular Murine RAW 264.7	FuHeng Biotechnologies (China)	FH0328	Origen de los macrófagos
Línea celular de músculo liso murino	FuHeng Biotechnologies (China)	FH-Y063	Utilizado para la evaluación de seguridad
Oil Red O	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	O0625	Usado para tinción lipídica
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	31985062	Medio suero reducido para transfección
Lipoproteína oxidada de baja densidad (Ox-LDL)	Yiyuan Biotechnologies (China)	YB-002	Utilizado para inducir la formación de células de espuma
Penicilina– Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	15140122	Suplemento antibiótico para cultivo celular
Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	78830	Inhibidor de proteasa
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	10010023	Lavado y amortiguador de dilución
Poli(ácido láctico-coglicólico) (PLGA, 50:50; MW 90,000)	Dalian Meilun Biotecnología (China)	MB5649-1	Polímero para fabricación de nanopartículas
Filtros de membrana de policarbonato (200 nm, 400 nm)	Whatman (Reino Unido)	800282	Utilizado para extrusión
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	P9333	Componente del tampón de lisis
Reactivo P3000	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	L3000001	Potenciador de transfección
Microtomo rotatorio	Leica Biosystems (Alemania)	RM2235	Utilizado para seccionar parafina
Bomba de jeringuilla	Aparato de Harvard (EE. UU.)	70-3007	Utilizado para la formación controlada de nanopartículas
Microscopio electrónico de transmisión (TEM)	Thermo Fisher Scientific (EE. UU.)	Talos F200S	Utilizado para la imagen de nanopartículas
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (EE. UU.)	T2663	Componente búfer
Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-&alfa)	R& D Systems (EE. UU.)	410-MT	Utilizado para activar células endoteliales
Agua ultrapura	Milli-Q (Merck, EE. UU.)	ZMQSV0T01	Utilizado para la preparación y diálisis de nanopartículas