Farmacología Integrada de Redes, Metabolómica y Validación in vivo de la Decocción Liangxue Dihuang en ratones de colitis ulcerosa inducida por DSS

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo reproducible que integra farmacología en red, metabolómica no dirigida y validación in vivo para esclarecer los mecanismos multicomponentes de la Decocción Liangxue Dihuang en un modelo murino de colitis ulcerosa inducido por sulfato de sodio de dextran.

Resumen

La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria crónica del intestino caracterizada por una inflamación intestinal persistente y una desregulación metabólica. Las fórmulas de la medicina tradicional china (MTC) se utilizan ampliamente en la práctica clínica para trastornos inflamatorios; sin embargo, los enfoques experimentales sistemáticos para dilucidar sus mecanismos multicomponente y multi-objetivo siguen siendo limitados. Este artículo presenta un protocolo experimental reproducible que integra farmacología en redes, metabolómica no dirigida y validación in vivo para investigar los efectos antiinflamatorios de la Decocción Liangxue Dihuang (LXDHD) en un modelo murino de UC inducido por dextrano sulfato sódico (DSS). El flujo de trabajo incluye la preparación de la decocción herbal, modelado de colitis inducida por DSS, evaluación de la actividad de la enfermedad, evaluación histopatológica y hematológica, medición de citocinas séricas, perfilado metabolómico basado en LC–EM y análisis computacional de redes. Utilizando este enfoque integrado, se estableció con éxito la colitis inducida por DSS, y el tratamiento con LXDHD resultó en mejoras medibles en el índice de actividad de la enfermedad, la longitud del colon, el daño histopatológico, los niveles de citocinas inflamatorias y los perfiles metabólicos. Los análisis de farmacología de redes y metabolómica demostraron además que este protocolo permite identificar objetivos clave, vías y metabolitos asociados a la intervención terapéutica. Este flujo de trabajo visualizado y estandarizado proporciona un marco metodológico práctico para estudiar los mecanismos farmacológicos de fórmulas de MTC multicomponente en enfermedades inflamatorias intestinales y puede adaptarse a otras prescripciones herbales y modelos de enfermedades.

Introducción

La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria crónica del intestino caracterizada por una inflamación mucosa continua del colon¹, que provoca síntomas como dolor abdominal, diarrea, sangrado rectal y pérdida^{de peso 2}. La incidencia de la CU ha ido aumentando en todo el mundo, imponiendo una carga considerable a los sistemas sanitarios y afectando significativamente la calidad de vida de los^{pacientes 3}. Aunque la etiología de la CU sigue siendo incompletamente comprendida, la evidencia acumulada indica que las respuestas inmunitarias desreguladas, la producción excesiva de citocinas inflamatorias, el estrés oxidativo y las alteraciones metabólicas desempeñan un papel central en la patogénesis de^{la enfermedad 4,5}.

Las estrategias terapéuticas actuales para la CU incluyen principalmente aminosalicilatos, corticosteroides, agentes inmunosupresores y biológicos que actúan en citocinas^{inflamatorias 6}. Aunque estos tratamientos pueden aliviar los síntomas e inducir la remisión, su uso a largo plazo suele estar asociado a efectos adversos, altos costes y respuestas terapéuticas variables ^7,8,9. Además, una proporción considerable de pacientes no logra una remisión sostenida, lo que pone de manifiesto la necesidad de enfoques terapéuticos alternativos o complementarios con mayor seguridad y eficacia multi-objetivo.

La medicina tradicional china (MTC) se ha utilizado ampliamente para el tratamiento de trastornos gastrointestinales durante siglos y cada vez es más reconocida por sus posibles beneficios en enfermedades inflamatorias complejas como la UC¹⁰. A diferencia de las terapias de un solo objetivo, las fórmulas de MTC suelen ejercer efectos terapéuticos a través de múltiples componentes que actúan sobre múltiples objetivos y vías, lo que puede abordar mejor la naturaleza multifactorial de la UC¹¹. Estudios clínicos y experimentales han sugerido que ciertas prescripciones de MTC pueden modular las respuestas inmunes, suprimir la inflamación, proteger la integridad de la barrera intestinal y regular la homeostasis^metabólica 12,13,14,15.

La Decocción Liangxue Dihuang (LXDHD) es una fórmula clásica de MTC tradicionalmente utilizada para "enfriar la sangre y eliminar el calor" y se ha aplicado clínicamente para trastornos inflamatorios y hemorrágicos¹⁶. La prescripción consiste en varias hierbas, incluyendo Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis y Glycyrrhiza uralensis. Estudios farmacológicos modernos han demostrado que varias hierbas constituyentes y sus compuestos activos poseen propiedades antiinflamatorias, antioxidantes e^{inmunomoduladoras} 17,18,19. Sin embargo, los efectos terapéuticos generales y los mecanismos subyacentes de la LXDHD en la CU aún no han sido esclarecidos sistemáticamente.

La farmacología de redes ha surgido como un enfoque eficaz para explorar las complejas interacciones entre fórmulas herbales multicomponentes y dianas moleculares relacionadas con^{enfermedades 20}. Al integrar información de múltiples bases de datos, la farmacología de redes puede predecir compuestos activos potenciales, dianas terapéuticas y vías de señalización, proporcionando una comprensión a nivel sistémico de los mecanismos de la^{MTC 21}. No obstante, la farmacología de redes se basa principalmente en predicciones de bases de datos y no refleja directamente los cambios metabólicos in vivo .

La metabolómica, como herramienta poderosa para perfilar alteraciones metabólicas globales, ofrece perspectivas complementarias sobre la fisiopatología de la enfermedad y las respuestas terapéuticas²². En la CU, los análisis metabolómicos han revelado alteraciones significativas en el metabolismo lipídico y aminoácidos, así como vías relacionadas con el estrés^oxidativo 23,24,25. Integrar la metabolómica con la farmacología en redes puede ayudar a cerrar la brecha entre los objetivos moleculares predichos y los fenotipos metabólicos reales, mejorando así la fiabilidad de las interpretaciones mecanicistas.

En el presente estudio, se empleó una estrategia integrada que combina farmacología de redes, metabolómica no dirigida y validación experimental para investigar los efectos antiinflamatorios y los posibles mecanismos de la LXDHD en un modelo murino de UC inducido por sulfato de dextrano sódico (DSS) (Figura 1A). Este diseño metodológico global, que integra predicciones in silico con validación metabolómica y fenotípica in vivo , está de acuerdo con los rigurosos marcos de investigación^{establecidos 26}. Se utilizó el análisis de farmacología de redes para identificar compuestos activos, posibles objetivos terapéuticos y vías de señalización enriquecidas por el tratamiento con LXDHD. Se realizó metabolómica no dirigida para caracterizar alteraciones metabólicas inducidas por la CU y su modulación por LXDHD. Además, los hallazgos clave se validaron mediante experimentos in vivo , incluyendo evaluaciones de la actividad de la enfermedad, cambios histopatológicos, parámetros hematológicos y niveles de citocinas inflamatorias.

Al integrar predicciones computacionales, perfilado metabólico y validación biológica, este estudio pretende proporcionar una comprensión integral de los mecanismos multicomponente, multiobjetivo y multivía que subyacen a los efectos terapéuticos de LXDHD en la CU. Este trabajo no solo ofrece evidencia experimental que apoya el uso de la LXDHD como una posible terapia complementaria para la CU, sino que también proporciona un marco metodológico para investigar los mecanismos de otras fórmulas complejas de la MTC.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Nankín (Aprobación nº #2025DW-034-01; Fecha de aprobación: 24 de marzo de 2025). La preparación de la Decocción Liangxue Dihuang se realizó de acuerdo con los procedimientos descritos en la Farmacopea^{China 27}. Los reactivos, productos químicos y software utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la Decocción Liangxue Dihuang (LXDHD)

1. Prepara los materiales herbales secos según la formulación estándar de LXDHD. La composición exacta de las hierbas, los nombres botánicos y las dosis exactas prescritas de las once hierbas constituyentes se especifican en la Tabla 1.
   NOTA: Autentica todos los materiales herbales por un farmacéutico cualificado antes de usarlos para garantizar la identidad botánica y la coherencia de la calidad. Conservar los registros de autenticación para garantizar su reproducibilidad.
2. Preparación en pólvora
   1. Seca al aire todos los materiales herbales a temperatura ambiente en un entorno limpio y bien ventilado.
   2. Pulveriza cada hierba individualmente usando un molinillo mecánico hasta obtener un polvo fino.
   3. Combina los polvos según las proporciones prescritas.
   4. Pasa el polvo mezclado por un tamiz de 80 mallas (diámetro interior 180 μm ± 7,6 μm) para asegurar un tamaño uniforme de las partículas.
   5. Homogeneiza completamente el polvo tamizado.
      NOTA: Un tamaño de partícula uniforme es esencial para una eficiencia de extracción consistente. La molienda incompleta o la mezcla desigual pueden resultar en variabilidad en la composición química.
3. Preparación del extracto acuoso LXDHD
   1. Pesa con precisión el polvo de hierbas mezclado y añade agua destilada en una proporción de 1:10 (p/v).
   2. Calienta la mezcla hasta que hierva y descóctale durante 20 minutos.
   3. Filtra el extracto y recoge el filtrado.
   4. Añade agua destilada fresca al residuo y repite la decocción durante 20 minutos más.
   5. Combina los dos filtrados para obtener el extracto acuoso final LXDHD.
      NOTA: La doble decocción es esencial para asegurar la extracción eficiente tanto de componentes solubles en agua como moderadamente solubles.
4. Concentración y almacenamiento
   1. Concentra la decocción combinada bajo presión reducida o calentamiento suave hasta alcanzar la concentración deseada.
   2. Deja que el extracto se enfríe hasta la temperatura ambiente.
   3. Guarda el extracto de LXDHD preparado a 4 °C y úsalo en un plazo de 48 horas.
      NOTA: Evitar ciclos repetidos de congelación-deshielo, ya que pueden degradar compuestos bioactivos y reducir la reproducibilidad experimental.
5. Administración
   1. Lleva el extracto a temperatura ambiente antes de administrarlo.
   2. Administrar la decocción acuosa concentrada de LXDHD a ratones mediante gavage oral en las dosis designadas según el grupo experimental.

2. Diseño de experimentos con animales

1. Animales y condiciones de alojamiento
   1. Obtén ratones machos C57BL/6 (de 6 a 8 semanas, 20–25 g) de un proveedor certificado de animales de laboratorio.
   2. Ratones domésticos en condiciones estándar de laboratorio con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, temperatura controlada (22–25 °C) y humedad relativa (50%–60%).
   3. Proporciona a los ratones acceso libre a comida y agua estándar durante todo el experimento.
   4. Permite que los ratones se aclimaten al menos 7 días antes de la experimentación.
      NOTA: Incluye solo ratones sanos con actividad y peso corporal normales en los experimentos posteriores.
2. Agrupación y cálculo de dosis
   1. Calcular la dosis en ratón de LXDHD según el principio de conversión de dosis humano–animal descrito en la Metodología de Experimentos Farmacológicos, basándose en un peso corporal estándar adulto de 70 kg y una dosis clínica diaria de 8,4 g²⁸.
   2. Dividir aleatoriamente los ratones en los siguientes grupos (n = 6 por grupo): grupo control normal, grupo modelo UC inducido por DSS, grupo LXDHD de baja dosis (1,09 g/kg), grupo de LXDHD de dosis altas (2,18 g/kg) y grupo control positivo 5ASA (100 mg/kg⁾²⁹.
      NOTA: Realizar aleatorización usando una tabla de números aleatorios para minimizar el sesgo de selección.
   3. Inducción de la UC y administración de medicamentos
      1. Prepara una solución DSS al 2,5% (p/v) en agua potable.
      2. Administrar la solución DSS ad libitum a ratones en los grupos modelo, tratados con LXDHD y 5ASA durante 7 días^{consecutivos y 30}.
      3. Proporciona agua potable purificada a los ratones del grupo de control normal.
      4. Administrar LXDHD y 5ASA a los grupos de tratamiento una vez al día mediante gavage oral en las dosis correspondientes durante todo el periodo experimental.
      5. Administrar un volumen igual de solución vehicular que los grupos de modelos normales de control y DSS.
         NOTA: Prepara la solución DSS desde cero y cámbiyela cada 2 días. Los lotes de DSS pueden variar en potencia inducidora de colitis; realiza pruebas piloto cuando se utiliza un lote nuevo. El establecimiento exitoso del modelo de CU inducido por el DSS se caracteriza por una pérdida progresiva de peso corporal, diarrea con sangre, puntuaciones elevadas de DAI y un marcado acortamiento del colon. Estos criterios y el diseño metodológico de los experimentos con ratones son coherentes con los estándares de referencia^{establecidos 31}.
3. Preparación de suero en blanco y que contenga fármacos para metabolómica exógena
   1. Utiliza una cohorte separada de ratones machos sanos C57BL/6.
   2. Divide aleatoriamente los ratones en dos grupos: el grupo en blanco y el grupo LXDHD.
   3. Administrar LXDHD al grupo LXDHD por gavage oral a 2,18 g/kg una vez al día durante 7 días consecutivos.
   4. Administrar un volumen igual de agua destilada al grupo en blanco.
   5. Recoge muestras de sangre 1 hora después de la administración final.
   6. Procesar muestras de sangre para obtener suero según se describe más adelante en la Sección 3.5.

3. Evaluación de la actividad de la enfermedad

1. Controla diariamente el peso corporal, la consistencia de las heces y el sangrado fecal durante el experimento.
2. Calcula el Índice de Actividad de la Enfermedad (DAI) en función de la pérdida de peso corporal, la consistencia de las heces y el sangrado fecal. El marco específico de puntuación se detalla en la Tabla 3. Calcular el
   puntuación final del DAI como la media (o suma) de estos tres^{parámetros 32}.
3. Al final del día 8, anestesiar ratones de cada grupo con pentobarbital sódico al 1% (30 mg/kg). Recoge aproximadamente 400 μL de sangre del plexo venoso retroorbitario de cada ratón. Posteriormente, se sacrifican los animales por dislocación cervical para asegurar la muerte, de acuerdo estricta con las Directrices para la Eutanasia de Animales de la Asociación Americana de Veterinarios Médicos (AVMA) (Figura 1B).
   NOTA: Confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente los dedos y la superficie plantar de las patas traseras; La ausencia de una respuesta de retirada indica suficiente profundidad de anestesia.
4. Recoge tejidos de colon y mide la longitud del colon como indicador de la gravedad de la enfermedad.
   NOTA: La reducción de la longitud del colon se considera una característica distintiva de la gravedad 33 de la colitis inducida por el^DSS.
5. Obtención de suero sanguíneo
   1. Deja que una parte de las muestras de sangre recogidas coagule a temperatura ambiente durante 1 hora.
   2. Centrifugar muestras a 1.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para obtener suero.
   3. Cuantificar los niveles séricos de interleucina (IL)-1β, IL-6, IL-17, factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) e IL-10.
   4. Recoger muestras de tejido de colon para análisis histopatológico.
   5. Utiliza muestras de sangre restantes para análisis periféricos.
   6. Reserva muestras adicionales de suero para análisis metabolómico.

4. Tinción de hematoxilina–eosina (H&E)

1. Corrige los tejidos de colon con un 4% de paraformaldehído durante al menos 24 horas.
2. Deshidrata los tejidos mediante una serie de etanol graduado.
3. Limpia los tejidos con xileno e insígelos en parafina.
4. Corta secciones de tejido (3–5 μm de grosor) usando un microtomo.
5. Desparafinizar secciones con xileno.
6. Rehidrata las secciones con etanol clasificado.
7. Tinción secciones con hematoxilina para visualización nuclear.
8. Contratinción secciones con eosina para tinción citoplasmática.
9. Observa los cambios histopatológicos bajo un microscopio óptico y captura imágenes representativas utilizando el software de imagen asociado.
10. Evalúa las puntuaciones histológicas (SCH) en función de la gravedad de la inflamación, la profundidad de la lesión y el daño de la cripta.
11. Consulte la Tabla 4 para criterios detallados de puntuación histológica.
    NOTA: Captura imágenes representativas de incrustación, seccionamiento y tinción de tejidos para mejorar la visualización del protocolo.

5. Análisis de sangre periférica

1. Recoger muestras de sangre periférica en tubos anticoagulantes EDTA-K2 (1,5 mg de EDTA por mL de sangre).
2. Invierte suavemente los tubos 8–10 veces para asegurar una mezcla adecuada.
3. Analizar los recuentos de células sanguíneas utilizando un analizador hematológico veterinario de tres partes (Mindray BC-2600vet) con calibración específica por especie.
4. Transportar muestras a 4 °C.
5. Analizar las muestras en un plazo de 4 horas tras la recogida.
   NOTA: Excluir muestras que muestren hemólisis o coagulación del análisis.

6. Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA)

NOTA: IL-6, IL-17, IL-1β y TNF-α son citocinas proinflamatorias clave, mientras que IL-10 es una citoquina antiinflamatoria clave. Estas citocinas reflejan la presencia y gravedad de las respuestas^{inflamatorias 34}.
La medición de estas citocinas es crucial para comprender los procesos inflamatorios y evaluar la eficacia de los tratamientos antiinflamatorios.

1. Recoge muestras de sangre del plexo venoso retroorbitario.
2. Deja que las muestras coagulen a temperatura ambiente durante 1 hora.
3. Centrifugar muestras a 1.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para obtener suero.
4. Mida los niveles séricos de IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α e IL-10 utilizando kits ELISA comerciales.
5. Mide la absorbancia usando un lector de microplacas equipado con software estándar de adquisición de datos.
6. Calcula las concentraciones de citocinas basándote en curvas estándar.
   NOTA: Analizar todas las muestras y estándares en duplicado para reducir la variabilidad técnica.

7. Análisis LC–MS de la Decocción Liangxue Dihuang

1. Preparación de muestras
   1. Pesa con precisión 10 g del polvo herbal crudo mezclado LXDHD.
   2. Disuelve el polvo en 30 mL de agua caliente.
   3. Realiza extracción ultrasónica durante 30 minutos.
   4. Mezcle 100 μL del extracto con 400 μL de metanol.
   5. Vórtice durante 10 minutos.
   6. Centrifugar a 14.000 × g durante 10 minutos.
   7. Recoge el sobrenadante como solución de prueba.
2. Condiciones LC–MS
   1. Realizar la separación cromatográfica utilizando un sistema LC acoplado a un espectrómetro de masas Q.
   2. Utiliza una columna C18 (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   3. Ajusta la fase móvil de la siguiente manera: disolvente A, 0,1% de ácido fórmico en agua; disolvente B, metanol.
   4. Ajusta el caudal a 0,30 mL/min.
   5. Ajusta la temperatura de la columna a 35 °C.
   6. Ajusta el volumen de inyección a 5 μL.
   7. Aplica el siguiente programa de elución de gradientes:
      0–2 min, 5% B;
      2–15 min, 5–95% B;
      15–18 min, 95% B;
      18–18,1 min, 95–5% B;
      18,1–22 min, 5% B.
   8. Establece los parámetros de espectrometría de masas de la siguiente manera: caudal de gas de la vaina, 35 arb; caudal de gas auxiliar, 10 arb; voltaje de pulverización, 3,5 kV (positivo) y 2,8 kV (negativo); temperatura capilar, 320 °C; temperatura del calentador de gas auxiliar, 350 °C.
   9. Adquiere datos MS tanto en modos de iones positivos como negativos con un rango completo de escaneo MS de m/z 100–1500 (resolución: 70.000).
   10. Realizar escaneos MS2 (dd-MS2) dependientes de datos con una resolución de 17.500.
   11. Procesa datos en bruto e identifica compuestos usando la base de datos mzCloud.

8. Análisis metabolómico suero no dirigido

1. Preparación de muestras de suero y control de calidad (QC)
   1. Muestras de suero de descongelación en hielo.
   2. Transfiere 50 μL de suero a un tubo centrífugo de 1,5 mL.
   3. Añade 200 μL de metanol/acetonitrilo frío (1:1, v/v).
   4. Vórtice durante 1 minuto para precipitar proteínas.
   5. Incubar en hielo durante 15 minutos.
   6. Centrifugar a 14.000 × g durante 15 minutos a 4 °C.
   7. Transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo.
   8. Seca el extracto usando un concentrador de vacío.
   9. Reconstituir en 100 μL de acetonitrilo/agua (1:1, v/v).
   10. Vórtice a fondo.
   11. Centrifugar de nuevo a 14.000 × g durante 15 minutos a 4 °C.
   12. Recoge el sobrenadante para el análisis LC-MS.
   13. Prepara muestras de control de calidad agrupando 10 μL de alicotas de cada muestra.
   14. Inyectar una muestra de control de calidad por cada 8–10 muestras experimentales para monitorizar la estabilidad y repetibilidad del instrumento.
2. Ajustes de adquisición LC-MS
   1. Realizar la separación cromatográfica utilizando el sistema LC con una columna C18 (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   2. Ajusta la temperatura de la columna a 35 °C.
   3. Ajusta el caudal a 0,30 mL/min.
   4. Ajusta el volumen de inyección a 2 μL (modo positivo) o 5 μL (modo negativo).
   5. Utiliza el disolvente A (0,1% de ácido fórmico en agua) y el disolvente B (acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico).
   6. Aplica un programa de elución por gradiente lineal.
   7. Operar el espectrómetro de masas en modos HESI positivo y negativo.
   8. Ajusta el rango de masa de escaneo a m/z 100–1500.
   9. Ajusta el voltaje de pulverización a 3,5 kV (positivo) y 2,8 kV (negativo).
   10. Ajusta la temperatura capilar a 320 °C.
3. Procesamiento de datos e identificación diferencial de metabolitos
   1. Importa datos en bruto de LC-MS (archivos .raw) al software.
   2. Realiza alineación de picos, selección de picos y corrección de línea base.
   3. Normalizar las características del área máxima extraída a la intensidad total de iones.
   4. Identificar metabolitos comparando con precisión los patrones de fragmentación masa (tolerancia a masa < 5 ppm) y MS/MS con bases de datos mzCloud y ChemSpider.
   5. Realizar análisis estadísticos multivariantes (PCA y OPLS-DA/PLS-DA).
   6. Definan metabolitos diferenciales basándose en los siguientes umbrales: VIP > 1,0 y p < 0,05 (test t de Student).

9. Análisis de farmacología de redes

NOTA: Se empleó farmacología de redes para predecir componentes activos y objetivos clave de LXDHD en UC ^35,36. La metodología incluye minería de bases de datos, procesamiento de información química, adquisición de datos de bioactividad, recuperación de blancos proteicos, perfilado de expresión génica, construcción de redes de interacción y análisis de enriquecimiento de^{vías 37,38}.

1. Cribado activo de compuestos
   1. Recuperar compuestos activos de la base de datos y análisis de sistemas de medicina tradicional china (TCMSP) (consultada el 10 de diciembre de 2025) usando OB ≥ 30% y DL ≥ 0,18.
   2. Suplementar compuestos mediante búsquedas bibliográficas en PubMed y Web of Science (10–15 de diciembre de 2025).
   3. Estandarizar los objetivos usando la base de datos UniProt (consultado el 15 de diciembre de 2025).
2. Identificación de objetivos de enfermedades
   1. Recopila objetivos relacionados con la UC de las bases de datos GeneCards, OMIM, TTD y DrugBank (consultado el 15 de diciembre de 2025).
3. Construcción y análisis de la red
   1. Identificar objetivos que se intersectan usando el paquete VennDiagram en el software R.
   2. Construye la red usando el software Cytoscape.
   3. Analiza la topología usando el plugin NetworkAnalyzer y el plugin CytoNCA.
4. Identificación de redes PPI y objetivos principales
   1. Importar los objetivos que se intersectan en la base de datos STRING.
   2. Restringe las especies a Homo sapiens.
   3. Elimina nodos aislados.
   4. Aplica un umbral de puntuación PPI > 0,9.
   5. Exportar datos y analizarlo en el software.
   6. Calcula DC, BC, EC, CC, NC y LAC.
   7. Realizar filtrado basado en medianas para generar subredes e identificar objetivos principales³⁹.
5. Análisis de enriquecimiento de GO y KEGG
   1. Realizar enriquecimiento GO y KEGG usando paquetes R y Bioconductor.
   2. Usa paquetes R, incluyendo org. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, enrichplot, stringi y ggplot2.
   3. Establezca umbrales de significación en p = 0,05 y q = 0,05.
   4. Realiza análisis GO para las categorías MF, BP y CC.
   5. Realizar el enriquecimiento y clasificación de la vía^{KEGG 40}.
6. Acoplamiento molecular
   1. Descarga estructuras compuestas desde TCMSP en formato SDF.
   2. Descarga estructuras proteicas de AlphaFold en formato PDB.
   3. Realizar acoplamiento usando el servidor web CB-DOCK2 (CADD Lab, Universidad de Sichuan, Chengdu, China).
   4. Define los archivos receptores y ligandos en consecuencia.
   5. Registra la postura óptima de la unión y la energía de la ligazón.
      NOTA: El acoplamiento se realizó utilizando un algoritmo^{genético 41}. Los resultados se clasificaron por energía de vinculación.

10. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos utilizando el software GraphPad Prism.
2. Expresa los datos cuantitativos como media ± desviación estándar (DS).
3. Prueba la normalidad usando la prueba de Shapiro–Wilk.
4. Prueba la homogeneidad de la varianza usando la prueba de Brown–Forsythe.
5. Realizar ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey para datos distribuidos normalmente.
6. Realizar la prueba de Kruskal–Wallis con la prueba de Dunn para datos no paramétricos.
7. Consideremos p < 0,05 como estadísticamente significativo.
   NOTA: Un valor p menor indica una mayor diferencia estadística entre grupos.

Resultados

Análisis de farmacología de redes de LXDHD en la UC

Se aplicó la farmacología de redes para predecir los posibles objetivos terapéuticos y los mecanismos moleculares de la LXDHD en la CU. Se analizaron un total de 211 compuestos con propiedades farmacocinéticas favorables a partir de la base de datos TCMSP, incluyendo 36 de Scutellaria baicalensis, 37 de Phellodendron chinense, 10 de Rehmannia glutinosa, 11 de Pa...

Discusión

Este método presenta un flujo de trabajo experimental visualizado y reproducible que integra farmacología de redes, metabolómica no dirigida y validación in vivo para investigar los efectos antiinflamatorios de fórmulas de MTC en un modelo murino de CU inducido por DSS. A diferencia de los estudios farmacológicos convencionales que se centran principalmente en conclusiones mecanicistas aisladas, este protocolo enfatiza la solidez del propio marco metodológico al tiempo que revel...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido 5-aminosalicílico (5-ASA)	Sigma-Aldrich	A3537	Fármaco control positivo para colitis ulcerosa; administrado a 100 mg/kg por gavage oral.
Acetonitrilo (grado LC-MS)	Merck	100030	Utilizado para la preparación de muestras de metabolómica y la fase móvil LC-MS.
Base de Datos de Estructura de Proteínas AlphaFold	EMBL– Instituto Europeo de Bioinformática	https://alphafold.ebi.ac.uk/	Base de datos utilizada para obtener estructuras tridimensionales predichas de proteínas objetivo.
Angelica sinensis (Dang Gui)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de LXDHD (dosis: 1,6 g).
CB-Dock2	Laboratorio CADD	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	Plataforma web utilizada para acoplamiento molecular y predicción de ligandos y guiños; modos de unión a proteínas.
Citrus aurantium (Zhi Ke)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de la LXDHD (dosis: 0,5 g).
Software Descubridor de Compuestos	Thermo Fisher Scientific	Versión 3.3	Utilizado para el procesamiento de datos de LC–MS e identificación de compuestos.
CTAn Software	Bruker	Versión 1.17	Utilizado para la reconstrucción de imágenes 3D Micro-CT y análisis de erosión ósea.
Cytoscape	Consorcio Cytoscape	Versión 3.8.0	Software utilizado para la construcción y visualización de redes.
Sulfato de Dextrano Sódico (DSS)	MP Biomedicina	160110	Peso molecular 36.000– 50.000 Da; Se utiliza para inducir colitis ulcerosa en ratones.
Tubos anticoagulantes EDTA-K2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Se usa para la recogida de sangre periférica.
Solución de tinción con eosina	Biosharp	N/A	Utilizado para contratinción citoplasmática en H& Tinción de E.
Etanol	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	64-17-5	Se usa para la deshidratación de tejidos.
Ácido fórmico (grado LC-MS)	Merck	5.33002	Utilizado para la preparación de la fase móvil LC-MS.
Glycyrrhiza uralensis (Gan Cao)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de la LXDHD (dosis: 0,5 g).
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versión 9.0	Utilizado para análisis estadístico y presentación gráfica.
Analizador hematológico	Mindray	BC-2600vet	Analizador veterinario de hematología de tres partes para análisis de sangre de rutina.
Solución de tinción de hematoxilina	Biosharp	BL700B	Usado para H& Tinción con E de secciones de tejido de colon.
Centrifugadora de alta velocidad	Hitachi	CT15E/CT15RE	Se usa para la preparación de suero y muestras.
Kit IL-10 ELISA (ratón)	MEIMIANA	MM-0176M2	Se utiliza para evaluar los niveles séricos de IL-10.
Kit IL-17 ELISA (ratón)	Abclonal	RK00039	Se usa para medir los niveles séricos de IL-17.
IL-1 y beta; Kit ELISA (ratón)	Abclonal	RK00006	Utilizado para la detección de IL-1 y beta séricos; niveles.
Kit IL-6 ELISA (ratón)	Abclonal	RK00008	Se usa para cuantificar los niveles séricos de IL-6.
Software ImageJ (Fiyi)	Institutos Nacionales de Salud (NIH)	Versión 1.53c	Software de código abierto utilizado para el procesamiento y cuantificación de imágenes.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	Versión 3.7	Software de imagen utilizado para capturar láminas histopatológicas.
Metanol (grado LC-MS)	Merck	106035	Utilizado para la preparación de muestras de metabolómica y la fase móvil LC-MS.
Ratones (Macho C57BL/6)	Anokang Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Animales de experimento (6 años y ndash; 8 semanas, 20 y ndash; 25 g) usado para el modelo UC inducido por DSS.
Base de datos mzCloud	Thermo Fisher Scientific	https://www.mzcloud.org/	Base de datos utilizada para la correspondencia espectral MS/MS.
Microscopio óptico	Leica	DM500	Usado para observación histopatológica.
Paeonia lactiflora (Chi Shao)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de LXDHD (Dosis: 0,6 g).
Corteza sufragiosa de la Paeonia (Mu Dan Pi)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de la LXDHD (dosis: 0,5 g).
Paraformaldehído (4%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Se utiliza para fijar tejidos de colon.
Microtomo Patológico	Leica	RM2016	Se utiliza para la preparación de secciones de tejido de parafina.
Chinés de feledendro (Huang Bo)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de la LXDHD (dosis: 0,5 g).
Platycladus orientalis (Ce Bai Ye Tan)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de LXDHD (dosis: 0,7 g).
Espectrómetro de Masas de Alta Resolución Q Exactivo	Thermo Fisher Scientific	P Exactivo	Espectrómetro de masas basado en Orbitrap para análisis LC–MS.
R Software	Fundación R para la Computación Estadística	Versión 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	Software utilizado para análisis de enriquecimiento GO y KEGG.
Rehmannia glutinosa (Sheng Di Huang)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de la LXDHD (dosis: 2,1 g).
Sanguisorba officinalis (Di Yu Tan)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de LXDHD (Dosis: 0,6 g).
Saposhnikovia divaricata (Fang Feng)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de la LXDHD (dosis: 0,3 g).
Scutellaria baicalensis (Huang Qin)	Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu	Lote: 2409001	Hierba constituyente de la LXDHD (dosis: 0,5 g).
Pentobarbital sódico (1%)	Sigma-Aldrich	P3761	Se utiliza para anestesia animal antes de la recogida de muestras.
SoftMax Pro Software	Dispositivos moleculares	Versión 7.1	Software de adquisición y análisis de datos utilizado con el lector de microplacas para ELISA.
Base de datos STRING	Consorcio STRING	https://string-db.org/	Base de datos utilizada para proteínas– Análisis de interacciones proteicas.
Base de Datos TCMSP	Plataforma TCMSP	https://tcmsp-e.com/	Base de datos utilizada para analizar compuestos activos y predecir objetivos de fármacos.
TNF-& alfa; Kit ELISA (ratón)	Abclonal	RK00027	Se utiliza para determinar TNF-y alfa séricos; concentraciones.
Sistema Ultimate 3000 RS LC	Thermo Fisher Scientific	Ultimate 3000 RS	UHPLC acoplado con espectrometría de masas.
Limpiador ultrasónico	Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd	KQ3200E	Utilizado para la extracción ultrasónica de LXDHD.
Base de datos UniProt	Consorcio UniProt	https://www.uniprot.org/	Base de datos utilizada para la estandarización de nombres de genes y proteínas.
Mezclador de vórtices	Beijing PowerStar Technology Co., Ltd	LC-Vórtice-P1	Se usa para mezclar samples.
Columna Welch AQ-C18 (150 y veces 2,1 mm, 1,8 y mu; m)	Materiales de Welch	AQ-18-15021	Columna utilizada para la separación de metabolitos y componentes herbales.
Xileno	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	1330-20-7	Se utiliza para la limpieza de tejidos durante el procesamiento histológico.