Medición de la dinámica traduccional de mRNA en células vivas mediante etiquetado luminiscente dividido en células HEK293

Resumen

Aquí presentamos un método flexible y compatible con alta capacidad para medir dinámicas de traducción de ARNm en células vivas en HEK293, utilizando etiquetado luminiscente dividido. Este ensayo versátil distingue efectos estructurales, apoya la optimización de la transcripción in vitro y agiliza el desarrollo de terapias basadas en ARNm.

Resumen

El rápido desarrollo de vacunas para combatir la COVID-19 ilustró el potencial de los fármacos basados en ARN mensajero (ARNm) para transformar el desarrollo de medicamentos. Al igual que el ARNm maduro, el ARNm transcrito in vitro posee los mismos elementos, incluyendo un extremo 5’ con caperuza (5’ cap), regiones no traducidas (UTR), una secuencia codificante y una cola poli(A). Trabajos previos que estudiaron los efectos de estos componentes en la traducción del ARNm han utilizado principalmente proteínas reporteras altamente modificadas que exhiben una traducción eficiente y una gran estabilidad proteica. Dado que los elementos estructurales de cada ARNm afectan diferencialmente su traducción, es fundamental identificar el diseño óptimo relacionado con la proteína terapéutica de interés (POI). Para permitir la caracterización de la traducción de la POI, se empleó un sistema de complementación de luciferasa dividida. Una etiqueta peptídica corta (HiBiT), que puede fusionarse a cualquiera de los extremos de la POI, se asocia con su heterodímero complementario (LgBiT) para reconstituir la actividad enzimática en presencia de un sustrato permeable a la célula. Hasta la fecha, la etiquetación luminiscente dividida se ha utilizado principalmente en estudios de alto rendimiento sobre el recambio proteico. Anteriormente, hemos demostrado cómo esta técnica de etiquetación puede emplearse para cuantificar de forma de alto rendimiento la traducción del ARNm en el tiempo in cellulo en células HEK293 que expresan constitutivamente el heterodímero complementario. Aquí, demostramos además la versatilidad del ensayo y detallamos cómo puede utilizarse para optimizar la transcripción in vitro y reducir costos. El sistema de ensayo puede distinguir de forma única alteraciones en los componentes estructurales, destacando al mismo tiempo los efectos de la optimización de la secuencia codificante mediante genes no modificados. Además, demostramos que una reducción de cuatro veces en la concentración del caperuz 5’ para la transcripción in vitro produce una traducción equivalente in cellulo. Estos hallazgos ilustran cómo la etiquetación luminiscente dividida puede integrarse fácilmente en el flujo de trabajo de terapéuticos de ARNm, permitiendo el monitoreo en tiempo real de la dinámica de expresión proteica inducida por ARNm in cellulo, ofreciendo así un método versátil para el avance de los tratamientos basados en ARNm.

Introducción

Los fármacos y aplicaciones de investigación basados en ARN mensajero (ARNm) se han expandido rápidamente en los últimos años, impulsados por el éxito de las vacunas de ARNm^1,2 y por el creciente reconocimiento de la versatilidad del ARN como biomolécula programable. Un desafío central en este campo es la capacidad de evaluar cuantitativa y dinámicamente la eficiencia de la traducción del ARNm en diversos contextos. El método descrito aquí, que aprovecha un sistema de etiquetado luminiscente dividido, proporciona una plataforma flexible y escalable para estudiar la traducción de ARNm en células vivas in cellulo³. El objetivo general de este método es permitir a los investigadores medir cómo las características de la secuencia, las modificaciones químicas y los elementos estructurales influyen en la cinética de traducción y en la posterior degradación de la proteína, ofreciendo así una herramienta potente para optimizar los constructos de ARNm en aplicaciones terapéuticas y en la ciencia básica.

El ARNm transcrito in vitro refleja la arquitectura esencial de los transcritos maduros, incorporando un extremo 5′ con caperuza, regiones no traducidas (UTR), una secuencia codificante y una cola poli(A), además de incluir frecuentemente nucleótidos modificados para reducir la inmunogenicidad^4,5. Trabajos extensos han demostrado que cada uno de estos elementos, ya sea individualmente o en combinación, puede modificarse para influir fuertemente en la eficiencia de la traducción y el rendimiento proteico^6,7. Sin embargo, la mayoría de los estudios anteriores se han basado en proteínas reporteras altamente optimizadas, como la proteína verde fluorescente (GFP)⁷, NanoLuc⁸ o la proteína espiga del SARS-CoV-2^8,9, que están diseñadas para traducirse con alta eficiencia y producir proteínas muy estables, por lo que no reflejan los desafíos presentes en contextos terapéuticos. Dado que los ARNm terapéuticos codifican diversas proteínas de interés (POI), cada una sujeta a restricciones estructurales únicas y a regulación específica según el tipo celular, los principios de diseño que maximizan la traducción para un constructo determinado podrían no ser generalizables a otros, tal como se ha informado previamente³. Por lo tanto, identificar la configuración óptima para una POI terapéutica específica es fundamental y requiere métodos capaces de evaluar de forma sensible y sistemática cómo cada característica individual del transcrito contribuye a la producción proteica.

Los métodos centrados en el ribosoma, como el perfilado de polisomas, distinguen las fracciones de traducción mediante centrifugación en gradiente¹⁰, mientras que el perfilado de ribosomas (Ribo-seq) proporciona una resolución a nivel de nucleótidos de la ocupación ribosómica, los sitios de iniciación y las pausas¹¹. Al igual que Ribo-seq, otros enfoques basados en secuenciación, como la secuenciación de alto rendimiento del ARN aislado mediante inmunoprecipitación con reticulación cruzada (HITS-CLIP) y la purificación por afinidad de ribosomas en traducción (TRAP), caracterizan aún más la traducción de ARNs asociados a proteínas de unión al ARN o a ribosomas¹². Aunque potentes, estas técnicas requieren preparaciones complejas, equipos especializados y experiencia computacional, lo que las hace inadecuadas para el desarrollo de ARNm terapéuticos de alto rendimiento. La inmunoprecipitación de cadenas nacientes¹³ mide la eficiencia de traducción utilizando proteínas marcadas con la etiqueta FLAG que se inmunoprecipitan a partir de ribosomas y se cuantifican mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). Aunque adaptable a ARNm terapéuticos, este ensayo es laborioso, carece de resolución temporal y no es adecuado para aplicaciones de alto rendimiento. El sistema SunTag¹⁴ permite mediciones en células vivas de la producción de síntesis proteica y la regulación traduccional a partir de moléculas individuales de ARNm, y funciona mediante la interacción de un fragmento variable monocatenario (scFv) fusionado a GFP con repeticiones en tándem del epítopo peptídico. Este sistema permite mediciones dinámicas de la traducción y la localización con resolución a nivel de un solo ARNm, por lo que se ha aprovechado para desarrollar numerosos sistemas de seguimiento de cadenas nacientes^15,16. Sin embargo, este enfoque tiene un bajo rendimiento y requiere el uso de microscopios de alta potencia.

Aunque la etiquetación de la proteína recién sintetizada es inevitable, se identificó el uso potencial de una etiqueta peptídica pequeña derivada de la luciferasa NanoLuc para informar sobre la traducción del ARNm en células vivas. La luciferasa Nano se diseñó para dividirse en una subunidad pequeña de 11 aminoácidos (HiBiT) y una subunidad más grande de 158 aminoácidos (LgBiT), que pueden dimerizarse rápidamente y, en presencia de sustrato, reconstituir una luciferasa funcional^17,18. El sistema de etiquetado luminiscente dividido ofrece varias ventajas clave para estudios de la dinámica del ARNm. En primer lugar, el tamaño mínimo de la subunidad pequeña fusionada al POI permite que el constructo codificado se mantenga lo más cercano posible a la proteína de interés nativa. Dado que la longitud de la secuencia codificante puede afectar directamente las tasas de traducción¹⁹, minimizar la longitud de la etiqueta mejora nuestra predicción de la dinámica de traducción de ARNm sintéticos. Esencialmente, esta estrategia de etiquetado mínima permite detectar diferencias en la traducción impulsadas por variaciones sinónimas en la secuencia codificante, lo que permite investigar la eficiencia traduccional independientemente de la secuencia o estabilidad de la proteína³. Por esta razón, el uso de etiquetas más grandes, como proteínas fluorescentes o luciferasas completas, es subóptimo. En segundo lugar, el sistema de etiquetado luminiscente dividido empleado aquí permite una generación inmediata de señal. Su reacción de complementación rápida y eficiente in cellulo presenta una alta afinidad (K_D = 700 pM) y se ha utilizado para medir la modulación del recambio proteico con lecturas tan frecuentes como cada 30 s¹⁸. Aunque el sistema original de etiquetado luminiscente dividido se comparó principalmente con otros sistemas de luciferasa dividida^17,18, la ventaja clave en este contexto es que la generación de señal no está limitada por la maduración de la proteína. En contraste, las proteínas fluorescentes requieren la maduración del cromóforo, un proceso que puede tardar desde minutos hasta horas²⁰, limitando así la resolución temporal. Finalmente, el sistema de etiquetado luminiscente dividido aquí empleado supera las limitaciones de los sistemas de proteínas fluorescentes divididas, que normalmente requieren la formación del cromóforo tras la complementación²¹, lo que introduce un retraso adicional y limita su idoneidad para capturar procesos rápidos y dinámicos. Estudios previos han demostrado la utilidad del etiquetado luminiscente dividido en ensayos de recambio proteico y estudios de degradación^22,23,24. Extender esta tecnología consolidada a la cinética de traducción representa un avance metodológico significativo. Por ejemplo, aunque el perfilado de ribosomas puede revelar la densidad ribosómica a lo largo de los transcritos, no puede captar fácilmente cambios dinámicos en las tasas de iniciación o elongación de la traducción bajo diferentes condiciones. Como se ilustró previamente³, este sistema de etiquetado luminiscente dividido puede detectar diferencias al modificar la estructura del capuchón, la composición de la región no traducida 5′ (UTR), la optimización de codones, las modificaciones de nucleótidos y la longitud de la cola poli(A), todos los cuales son determinantes críticos de la eficiencia traduccional. Esta amplia aplicabilidad hace que el método sea excepcionalmente poderoso para desentrañar las contribuciones de características individuales del ARNm a la producción proteica total. Vale la pena señalar que, dependiendo del instrumento utilizado, esta tecnología puede capturar datos tanto a nivel de célula individual como de pocillo completo. Las plataformas de imagen capaces de adquirir imágenes basadas en luminiscencia pueden potenciar esta tecnología para estudiar la dinámica de traducción a nivel de célula individual. Aquí, nos centramos en una aplicación basada en lectoras de placas debido a su naturaleza de medio a alto rendimiento y su mínima necesidad de análisis de datos.

Los investigadores que consideren este método deben evaluar su idoneidad a la luz de sus objetivos experimentales específicos. El ensayo es particularmente valioso en contextos donde se requiere cribado de alto rendimiento de constructos de ARNm sintético, como en las líneas de diseño terapéutico basadas en ARNm. Es muy adecuado para análisis comparativos de características de secuencias de ARNm sintético, incluyendo regiones no traducidas, uso de codones o modificaciones de nucleótidos, en los que pueden detectarse diferencias sutiles en la eficiencia de traducción³. Debido a que el sistema es compatible con plataformas de traducción libres de células, ensayos en células vivas y un ensayo lítico específico por puntos temporales, ofrece flexibilidad a los investigadores que deseen adaptar su diseño experimental a estudios mecanicistas o a investigaciones aplicadas. Al mismo tiempo, es importante reconocer los límites de la técnica. Fundamentalmente, el ensayo de marcado con luminiscencia dividida no proporciona resolución de la ocupación de ribosomas, una capacidad que sigue siendo exclusiva de los enfoques de huella de ribosomas, ni mide directamente la estabilidad o degradación del ARN, lo cual podría necesitar evaluarse mediante métodos complementarios. Sin embargo, debido a las limitaciones de las técnicas existentes centradas en ribosomas, los investigadores dependen de ensayos basados en marcadores, como el sistema de luminiscencia dividida, para investigar la expresión proteica impulsada por ARNm con resolución temporal como proxy de la dinámica traduccional. Por lo tanto, aunque este sistema es una herramienta potente para monitorear la expresión proteica impulsada por ARNm sintético, su adecuación depende de si la pregunta de investigación se centra en la producción dinámica de proteínas más que en la posición fina de ribosomas o en la degradación del ARN.

En resumen, el sistema de etiquetado luminiscente dividido representa un método potente y versátil para estudiar la traducción del ARNm. Su objetivo general es proporcionar a los investigadores un sistema flexible, escalable, de alto rendimiento y capaz de detectar diferencias en la producción de proteínas derivadas de ARNm sintéticos con distintos elementos estructurales y de secuencia³. La justificación para su desarrollo radica en superar las limitaciones de las técnicas existentes, ofreciendo ventajas en sensibilidad, escalabilidad y resolución temporal. Ubicado dentro de la literatura más amplia sobre biología y terapéutica del ARN, este método constituye un valioso aporte al repertorio experimental, permitiendo avances tanto en conocimientos fundamentales como en aplicaciones traslacionales. Al considerar cuidadosamente las fortalezas y limitaciones del ensayo, los investigadores pueden determinar su idoneidad para sus aplicaciones específicas, maximizando así su impacto en el campo en rápida evolución de la ciencia del ARN.

Protocolo

Se muestra una representación gráfica de todo el protocolo en la Figura 1.

1. Preparación de la plantilla para la transcripción in vitro (IVT)

NOTA: Para preparar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro (IVT), asegúrese de que el ADN plasmídico contenga un promotor para la ARN polimerasa (generalmente T7 o SP6), las UTR 5’ y 3’, y el marco de lectura abierto del POI (Figura 1).

1. Linealice el ADN plasmídico utilizando una enzima de restricción con un sitio de corte único ubicado después de la UTR 3’ y prepare la reacción según las instrucciones del fabricante. Tras la incubación, purifique la reacción de digestión con enzima de restricción utilizando un kit de purificación de ADN basado en columnas giratorias. Cuantifique el ADN mediante un espectrofotómetro.
2. Para confirmar la linealización, prepare un gel de agarosa TAE al 1 % que contenga el colorante de ADN bromuro de etidio a 0,1 µg/mL. Mezcle 150 ng de ADN digerido con agua y colorante de carga. Cargue el gel de agarosa con la muestra, el plásmido sin digerir y una escalera de ADN, y corra el gel de agarosa a 100 V durante 40 minutos en un tampón 1× Tris-ácido acético-EDTA (TAE). Visualice con un sistema de imagen para geles.
   ADVERTENCIA: La solución de bromuro de etidio es un potente mutágeno y requiere manipulación cuidadosa utilizando equipo de protección personal (EPP) adecuado.
3. Si el ADN plasmídico no tiene una cola poli(A) inmediatamente después de la UTR 3’, introdúzcala mediante una PCR. Realice la PCR según las instrucciones del fabricante utilizando una polimerasa de alta fidelidad con cebadores diseñados adecuadamente. Asegúrese de que el amplicón incluya el promotor T7, el marco de lectura abierto y una cola poli(A).
   NOTA: Las tecnologías de caperuza pueden tener requisitos específicos de secuencia en el promotor T7; por lo tanto, estos requisitos pueden satisfacerse mediante un diseño adecuado del cebador directo. El cebador inverso se une al extremo de la UTR 3’ e introduce una cola poli(A) (longitud recomendada de al menos 80 T). Para construcciones con alto contenido de GC, se recomienda PCR con incremento de temperatura y/o 3 % de DMSO.
4. Para confirmar una PCR exitosa, prepare un gel de agarosa TAE que contenga bromuro de etidio (véase el paso 1.2). Si la longitud del constructo es ≥1 kb o <1 kb, prepare un gel al 1 % o al 2 %, respectivamente. Mezcle 5 µL de la reacción de PCR con agua y colorante de carga. Cargue el gel de agarosa con la muestra y una escalera de ADN, y corra el gel a 100 V durante 40 minutos en tampón TAE. Visualice con un sistema de imagen para geles.
5. Tras confirmar el tamaño por PCR, purifique la reacción de PCR utilizando un kit de purificación de ADN basado en columnas giratorias. Eluya en 15–20 µL de tampón de elución (a menudo proporcionado con el kit de purificación de ADN) o agua libre de nucleasas para concentrar la plantilla de ADN para su uso en la transcripción in vitro (IVT). Cuantifique el ADN mediante un espectrofotómetro.

2. Transcripción in vitro

1. Antes de comenzar, rocíe y limpie la superficie de trabajo, los guantes y las pipetas con una solución descontaminante de RNasas. Para mejorar el rendimiento y la calidad, realice este procedimiento en un entorno de cabina estéril.
2. Descongele y ensamble los componentes de un kit de transcripción in vitro (IVT) basado en T7 según las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Algunos fabricantes recomiendan el uso de ditiotreitol (DTT, 0,1 M) para limitar la oxidación de la reacción y mejorar la eficiencia. Este paso se recomienda cuando sea compatible con el kit. Si se utilizan dNTP modificados, sustituya el nucleótido no modificado equivalente por la misma cantidad de nucleótido modificado. Evalúe el rendimiento de una reacción a media escala, ya que no se observó una mejora sustancial en el rendimiento con una reacción completa. Cuando se sintetice más de un ARNm, se recomienda preparar una mezcla maestra para reducir errores y variabilidad en la pipetación.
3. Pipetee y mezcle brevemente, luego incube a 37 °C durante 5 h con tapa calefaccionada para evitar la condensación. Prolongue la incubación durante la noche si es necesario, ya que esto tiene un efecto mínimo sobre el rendimiento o la integridad del ARNm.
4. Añada 1 µL de DNasa I y pipetee completamente. Incube a 37 °C durante 30 min.
5. Purificación del ARN transcrito in vitro (IVT)
   1. Limpie la reacción IVT utilizando un kit de purificación de ARN basado en columnas, siguiendo las instrucciones del fabricante (diferentes kits pueden dar lugar a distintos niveles de recuperación y tener capacidades de unión variables). Para la elución, añada 60 µL de agua libre de nucleasas e incube a temperatura ambiente durante 5 min antes de centrifugar.
   2. Alternativamente, utilice la precipitación con cloruro de litio como un método más económico y flexible.
      1. Añada un volumen igual de cloruro de litio 7,5 M a la reacción, mezcle e incube a -20 °C durante la noche.
      2. Centrifugue a 18.300 × g durante 20 min a 4 °C, luego retire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet de ARN.
      3. Lave con 950 µL de etanol al 70 % y centrifugue a 18.300 × g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante, deje secar el pellet aproximadamente 5 min a temperatura ambiente y resuspenda en agua libre de nucleasas (60 µL es estándar; reduzca el volumen según el tamaño del pellet para aumentar la concentración).
         ADVERTENCIA: El cloruro de litio puede causar irritación en la piel o los ojos si no se utiliza el EPP adecuado. Use guantes y protección ocular al manipularlo. Además, el etanol es un líquido altamente inflamable y puede causar irritación ocular. Manténgalo alejado de llamas desnudas y use el EPP adecuado, incluida la protección ocular.
6. Cuantifique el ARNm utilizando un espectrofotómetro. Asegúrese de que la relación A260/A280 del ARNm sea ~2,0 y confirme que la relación A260/A230 se encuentre entre 1,8 y 2,2.
7. Para confirmar una transcripción IVT exitosa, prepare un gel de agarosa al 1 % en tampón TAE (no desnaturalizante) que contenga bromuro de etidio. Mezcle 500 ng de ARNm con agua y colorante de carga, y siga las instrucciones del fabricante para la preparación de la escalera de ARN y las condiciones de desnaturalización. Cargue el gel de agarosa y corra a 80 V durante 40 min en tampón TAE. Visualice con un sistema de imagen para geles.
8. Para una confirmación adicional del tamaño correcto del ARNm, analice las muestras en un Bioanalyzer.
9. Para evitar ciclos de congelación-descongelación, alícuote el ARNm en volúmenes adecuados para el experimento. Por ejemplo, utilice 1,2 pmol de ARNm por pocillo en una placa de 96 pocillos. Por lo tanto, alícuote el volumen apropiado para 1,2 pmol × n réplicas y almacénelo a -80 °C.

3. Transfección inversa en HEK293

NOTA: Para obtener mediciones temporales, se requiere una línea celular que exprese constitutivamente el fragmento complementario de luciferasa. Esto puede lograrse generando una línea celular estable mediante la transfección de un plásmido que exprese el fragmento de luciferasa requerido y la posterior selección clonal. Esto permite al usuario medir dinámicas traduccionales de ARNm resueltas temporalmente en cualquier contexto celular deseado. Alternativamente, pueden adquirirse líneas celulares que expresen el fragmento de luciferasa requerido. Estos experimentos se realizaron utilizando células HEK293 que expresan constitutivamente el heterodímero complementario.

1. Antes de comenzar, descongele el ARNm sobre hielo para evitar su degradación.
2. Prepare los complejos de transfección. Para una placa de 96 pocillos, se requieren 1,2 pmol de ARNm por pocillo. Si se realiza el ensayo en duplicado, prepare suficiente volumen para 2,5 réplicas para permitir errores de pipeteo. Por lo tanto, combine 3 pmol de ARNm con Medio Opti-MEM con suero reducido hasta un volumen final de 50 µL (20 µL/pocillo).
3. Agregue 0,5 µL de reactivo de transfección basado en lípidos catiónicos (0,2 µL/pocillo), mezcle aspirando y expulsando con la pipeta y luego incube a temperatura ambiente. Tras incubar durante 5 min, mezcle nuevamente aspirando y expulsando con la pipeta, y a continuación agregue 20 µL por pocillo a una microplaca de 96 pocillos blanca con fondo plano. Se recomienda colocar los pocillos de transfección en el centro de la placa, dejando los pocillos periféricos vacíos.
4. Prepare las células HEK293 retirando el medio y lavando con 2 mL de solución salina tamponada con fosfatos (PBS) sin Ca²⁺ y Mg²⁺. Retire el lavado y agregue 500 µL de tripsina-EDTA, luego incube a 37 °C durante 3 min.
5. Durante la disociación celular, llene los pocillos periféricos de la placa de 96 pocillos con PBS para reducir la evaporación del medio durante el cultivo celular. Si se requieren todos los pocillos, la placa puede inundarse con PBS entre los pocillos.
6. Agregue 4,5 mL de Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con L-glutamina 1× y suero bovino fetal (FBS) al 10 % para recolectar las células. Realice el recuento celular utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células.
7. Transfiera la cantidad necesaria de células (suficiente para sembrar 1 x 10⁵ células por pocillo) más 3 pocillos adicionales (para errores de pipeteo) a un tubo nuevo y centrifugue a 500 × g durante 2 min.
8. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en el volumen requerido de medio Leibovitz L-15 (sin fenol) suplementado con FBS al 10 % y sustrato para células vivas Endurazine (1:200) para asegurar una concentración final de 1 × 10⁶ células/mL. Mezcle con una pipeta serológica para garantizar una mezcla homogénea del Endurazine. Pipetee 100 µL (1 × 10⁵ células) de células resuspendidas por pocillo.
   NOTA: Si se realizan experimentos de curso temporal de 72 h, aumente el volumen a 200 µL para evitar la evaporación.
9. Inmediatamente después de la transfección, coloque las células en un lector de placas (luminómetro) ajustado a 37 °C. Registre lecturas a intervalos regulares con un tiempo de integración de 1 s. Debido a la eficiente complementación del sistema, la señal es detectable en cuestión de minutos. Por lo tanto, para obtener una lectura precisa de la línea base, este paso debe realizarse de inmediato. Estos intervalos dependen del experimento y del instrumento; sin embargo, en estos experimentos, se encontró que era óptimo medir cada 12 min en experimentos de 18 h, pero cada 48 min en experimentos de 72 h. La luminiscencia no requiere filtro para su medición; sin embargo, se observó una mejor relación señal-ruido al utilizar un filtro de 530–540 nm.
   NOTA: Se genera una señal de transferencia de resonancia de energía por bioluminiscencia (BRET) a partir de eGFP marcado con luciferasa dividida, por lo que un filtro de 530–540 nm captará tanto la señal luminiscente como la fluorescente. Para evitar la captura de BRET, utilice un filtro de 460–480 nm o, alternativamente, emplee una proteína no fluorescente como MYL3 como referencia.

4. Análisis de datos

1. Genere cambios en el plegamiento de las unidades de luminiscencia relativas (RLU), normalizando la señal de cada condición respecto a su primer punto de tiempo (t0, normalizado al promedio de los réplicas técnicos), ya que la señal al inicio del ensayo corresponde al nivel de fondo.
2. Reduzca la variabilidad entre réplicas biológicas normalizando respecto a una condición de control.
3. Seleccione el análisis estadístico para el ensayo, ya sea un único punto de tiempo o el área bajo la curva (AUC), según la pregunta que se esté investigando.
   1. Para un único punto de tiempo, utilice los puntos de tiempo en los que ocurre la expresión máxima (que depende del POI) junto con el tiempo final. Represente gráficamente la RLU calculada en el paso 4.1 en el punto de tiempo específico (por ejemplo, 240 min) y analícela mediante una prueba estadística adecuada.
   2. Mida la dinámica de la traducción y degradación proteica calculando el AUC ya sea para un intervalo de tiempo específico (es decir, t0 a 240 min) o para toda la duración del ensayo (es decir, t0 hasta el punto final). Normalice el valor de AUC de cada réplica biológica respecto al promedio del ARNm de referencia, obteniendo así una medida del cambio en el plegamiento del AUC que puede analizarse mediante pruebas estadísticas apropiadas.

Resultados

Existen varias formas en las que se puede optimizar la relación costo-eficacia de este protocolo. Por ejemplo, la reacción de transcripción in vitro (IVT) se miniaturizó a la mitad del volumen recomendado por el fabricante, y se encontró que el rendimiento resultante satisface la cantidad requerida para en célula experimentos. Cabe señalar que la longitud y complejidad de la secuencia afectan el rendimiento de la transcripción in vitro (IVT), por lo que una optimización exitosa del protocolo debería producir al menos 50 µg de ARNm por reacción de transcripción in vitro (IVT). Al igual que los kits para reacciones de IVT, los reactivos de encapuchado también suelen tener un costo elevado. Dado que solo se requiere un capuchón por molécula de ARNm, planteamos la hipótesis de que la reacción de IVT contiene un exceso de moléculas de capuchón en comparación con el número resultante de moléculas de ARNm. Por lo tanto, se investigó si el protocolo podría optimizarse aún más mediante la titulación de la cantidad de reactivo de encapuchado añadido a la reacción de IVT, cuyos resultados se muestran en Figura 2. Se añadió 100% (cap final de 10 mM), 50%, 25% o 0% (sin cap) del reactivo de capping a 10 µL Las reacciones de transcripción in vitro (IVT) y el ARNm de eGFP resultante se transfectaron en células HEK293 que expresaban constitutivamente el heterodímero complementario. Como control de normalización, también se transfectó MYL3 (capado al 100%), ya que este gen endógeno, que codifica una proteína estructural enriquecida en músculo, presenta dinámicas de traducción similares a las de eGFP, aunque con una señal más cercana a la de otros genes endógenos.³. Coherente con datos previos³, el ARNm de eGFP sin caperuza dio como resultado una falta de traducción análoga al control simulado (Figura 2A). El ARNm de eGFP sintetizado con el 25% o el 50% del reactivo de encapuchado recomendado mostró niveles de expresión comparables al 100%Figura 2A), lo que resulta en ninguna diferencia en los valores del área bajo la curva (AUC) durante el período de 18 hFigura 2B). Estos resultados indican que, bajo estas condiciones, el reactivo de capping está presente en exceso y que reducir su concentración no afecta la producción traduccional, lo cual es consistente con una incorporación suficiente del cap. Los hallazgos presentados en Figura 2 son específicos de la marca del reactivo de capping utilizado y deben optimizarse para diferentes reactivos.

Si bien los avances en la tecnología de cap y la incorporación de nucleótidos modificados han mejorado la expresión del ARNm, el desarrollo de algoritmos de diseño de ARNm ha mejorado aún más la expresión. Estos algoritmos se centran en optimizar la estabilidad del ARNm y el uso de codones mediante la mejora de la energía libre mínima (MFE) y del índice de adaptabilidad de codones (CAI), respectivamente. Para evaluar el efecto de la optimización sobre la expresión del ARNm, se utilizó LinearDesign⁹. Este algoritmo depende de la entrada de un valor lambda, que es un parámetro de escala empleado en fórmulas de optimización y que determina con qué intensidad el algoritmo favorece la MFE o el CAI. Se aplicaron los mismos ajustes de optimización (es decir, el mismo valor de lambda) a cuatro factores de transcripción: HAND2, GATA4, MEF2C y TBX5. Figura 3 explora los efectos de la optimización sobre las tasas de traducción. La optimización mejoró los valores tanto de MFE como de CAI para todos los factores de transcripción, siendo MEF2C el que mostró los mayores cambios en ambos parámetros (Figura 3A). A la terminación C de cada construcción se fusionó una etiqueta luminiscente dividida, precedida por un enlazador GS, y se sintetizó ARNm para los cuatro factores de transcripción en sus formas no optimizadas y optimizadas. Para asegurar que cada ARNm pudiera traducirse y producir una proteína con el peso molecular esperado, se empleó un sistema de traducción libre de células basado en lisado de reticulocitos de conejo³. Las proteínas resultantes se separaron mediante inmunotransferencia (western blot), utilizando la subunidad enzimática de la proteína luciferasa dividida y el sustrato adecuado para detectar la etiqueta luminiscente dividida. Los análisis por inmunotransferencia mostraron que la optimización produjo proteínas que coincidían con su peso molecular esperado (Figura 3B). Se transfirieron células HEK293 con las formas no optimizadas u optimizadas de cada factor de transcripción, y se realizaron grabaciones en células vivas durante 18 h. En todos los experimentos de 18 h, se tomaron mediciones de tres réplicas biológicas, y se utilizaron tres réplicas técnicas por muestra en cada experimento repetido. La optimización de HAND2 (Figura 3C) y GATA4 (Figura 3D) no tuvo efecto sobre la expresión (determinado mediante una prueba t de dos muestras independientes), con un aumento de 1,07 veces y una disminución de 1,25 veces, respectivamente, en comparación con sus contrapartes no optimizadas. Mientras tanto, la optimización de MEF2C (Figura 3E) y TBX5 (Figura 3F) provocó un aumento estadísticamente significativo en la expresión, con un incremento de 2,25 veces (P = 0,0486, n = 3, prueba t de dos muestras independientes) y de 1,72 veces (P = 0,0379, n = 3, prueba t de dos muestras independientes) en el área bajo la curva (AUC) respecto a sus versiones no optimizadas. De forma coherente, se observan diferencias no solo en la expresión final, sino también en la forma y velocidad de las curvas de expresión, lo que indica que el ensayo detecta cambios en la dinámica traduccional a lo largo del tiempo. Para determinar si este aumento en la expresión se mantiene durante un período más prolongado, se transfirieron células HEK293 con ARNm de MEF2C y se realizaron grabaciones durante 72 h (Figura 3G). Al igual que en los experimentos de 18 h, se tomaron mediciones de tres réplicas biológicas, y se utilizaron tres réplicas técnicas por muestra en cada experimento repetido. Similar a lo observado tras 18 h, la versión optimizada de MEF2C aumentó significativamente la expresión, con una mejora de 2,5 veces (P = 0,0061, n = 3, prueba t de dos muestras independientes) en el AUC en comparación con la versión no optimizada. Aunque existe un aumento considerable en la expresión tras la optimización, estos resultados demuestran que, en este caso, la optimización no evita la degradación durante 72 h, ya que ambas formas de MEF2C mostraron pendientes similares a partir de las 24 h. Esta degradación probablemente se deba a la degradación del ARNm lineal y/o a la división celular. En conjunto, estos resultados demuestran el potencial de los algoritmos de diseño de ARNm para mejorar la expresión del ARNm; sin embargo, destacan que la optimización debe realizarse de manera dependiente del POI (interés del investigador).

Figura 1: Flujo de trabajo para la síntesis de ARNm y el ensayo de etiqueta luminiscente dividida en células HEK293. Para realizar la transcripción in vitro (IVT) para el ensayo de etiqueta luminiscente dividida, asegúrese de que el plásmido contenga un promotor para ARN polimerasa (T7 o SP6), las regiones UTR 5’ y 3’, y las secuencias codificantes para la proteína de interés fusionada a una subunidad corta de luciferasa HB (HiBiT). El plásmido se linealiza con una enzima de restricción que corta en un solo sitio, proporcionando la plantilla para la PCR con poli T, que posteriormente se utiliza como plantilla para la IVT. El ARNm se sintetiza, se compleja con liposomas y se transfecta inversamente en células HEK293 que expresan constitutivamente la subunidad mayor de luciferasa (LB), las cuales pueden colocarse inmediatamente en un lector de placas donde se registran las mediciones en tiempo real. Tras la finalización del experimento, se realiza el análisis de datos para la normalización y el posterior análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Una reducción cuatro veces menor en la concentración del reactivo de capping produce una expresión comparable de eGFP con la concentración completa. (A) Ensayo cinético celular en células vivas de HEK293 transfectadas con ARNm de eGFP con concentraciones variables del reactivo de capping, MYL3 o control Mock; los datos se normalizaron respecto a t₀; cada punto representa la media de al menos tres réplicas biológicas por punto temporal. (B) El cambio en el número de veces de las curvas durante un curso temporal de 18 h de al menos tres réplicas biológicas se obtuvo normalizando respecto a la muestra de referencia MYL3 y se comparó mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (SEM), donde cada punto representa la media de una réplica biológica. ***P < 0.001. (eGFP – proteína verde fluorescente mejorada; AUC – área bajo la curva; RLU – unidades relativas de luminiscencia) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La optimización de la secuencia mejora la traducción del ARNm de manera dependiente del factor de interés (POI). (A) La optimización de la secuencia de ARNm mediante LinearDesign provocó una reducción y un aumento de los valores de energía libre mínima (MFE) e índice de adaptabilidad de codones (CAI), respectivamente, para cada factor de transcripción. (B) Se realizaron reacciones en lisado de reticulocitos de conejo (RRL) durante 120 minutos con ARNm que codifica para HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5 no optimizados u optimizados, o sin ARN. Las proteínas resultantes se procesaron para inmunotransferencia (western blot) y se detectaron mediante quimioluminiscencia mediante la incubación de la membrana con la subunidad enzimática del sistema de luciferasa dividida y el sustrato adecuado. Ensayo cinético celular en vivo en células HEK293 transfectadas con HAND2 no optimizado u optimizado (C), GATA4 (D), MEF2C (E) o TBX5 (F), junto con MYL3 y control sin transfección (Mock). Los datos se normalizaron a t₀, y los puntos representan la media de tres réplicas biológicas por punto temporal. El cambio en el área bajo la curva (AUC) durante un curso temporal de 18 h de tres réplicas biológicas se obtuvo normalizando respecto a la muestra de referencia MYL3 y se comparó mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (SEM), siendo cada punto la media de una réplica biológica. *P < 0,05. (G) Ensayo cinético celular en vivo en células HEK293 transfectadas con MEF2C no optimizado u optimizado, MYL3 y control Mock; los datos se normalizaron a t₀, y los puntos representan la media de tres réplicas biológicas por punto temporal. El cambio en el área bajo la curva (AUC) durante un curso temporal de 72 h de tres réplicas biológicas se obtuvo normalizando respecto a la muestra de referencia MYL3 y se comparó mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se muestran como media ± SEM siendo cada punto la media de una réplica biológica. **P < 0,01. (MFE – energía libre mínima; CAI – índice de adaptación de codones; RRL – lisado de reticulocitos de conejo; AUC – área bajo la curva; RLU – unidades de luminiscencia relativa) Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

El campo de la terapéutica con ARNm ha expandido rápidamente en los últimos años, destacando la importancia del diseño y la optimización de secuencias como una etapa crítica en la línea de desarrollo. Se han realizado importantes esfuerzos para crear herramientas computacionales que predigan las estructuras y composiciones de ARN más eficaces, centrándose especialmente en la optimización de secuencias^8,9. Aunque estas herramientas son potentes, la validación experimental de estos diseños sigue siendo una parte esencial del proceso. Sin embargo, esta validación ha dependido en gran medida de proteínas reporteras, incluyendo GFP⁷, NanoLuc⁸ y la proteína espiga del SARS-CoV-2⁹ , que ya son proteínas extremadamente estables y altamente traducibles. Para superar esta limitación, se incorporó un sistema de luciferasa dividida en una línea de trabajo para estudiar la dinámica de traducción de ARNm transcrito in vitro en células HEK293, permitiendo resolución temporal³, y se demostraron las limitaciones del uso de proteínas reporteras para detectar cambios en la traducción tras la ingeniería del ARNm. El presente artículo describe los pasos necesarios para realizar este ensayo, muestra que la reacción de IVT puede miniaturizarse y que la concentración del casquete 5’ puede reducirse sin consecuencias en la traducción, reduciendo así los costos. A partir de nuestras observaciones previas, destacamos que se requiere un enfoque dependiente de la proteína de interés (POI) para la optimización de la secuencia de ARNm con el fin de lograr una expresión aumentada.

Como se describe aquí, el ensayo con etiqueta luminiscente dividida es una metodología relativamente sencilla que permite la medición de la traducción de ARNm con un rendimiento medio, permitiendo a los usuarios investigar la expresión temporal de su proteína de interés (POI) en tiempo real. Sin embargo, existen varios pasos y consideraciones críticos necesarios para obtener resultados robustos. En primer lugar, todos los resultados posteriores dependen de la calidad del ARNm, que comienza con la transcripción in vitro (IVT) y la descontaminación del equipo utilizado para este fin. Tras la síntesis, el almacenamiento del ARNm es fundamental: debe mantenerse en hielo tras la elución y, tras confirmar el tamaño del ARNm, este se alícuota en volúmenes de trabajo para evitar ciclos de congelación-descongelación, manteniéndose almacenado a -80 °C. En segundo lugar, la placa de 96 pocillos utilizada es de suma importancia y debe ser consistente entre experimentos. Para este protocolo, asegúrese de utilizar una placa de 96 pocillos completamente blanca. Pueden usarse placas con fondo transparente y paredes blancas si es necesario monitorear la morfología celular; sin embargo, estas generan una señal mucho más baja, por lo que ambos tipos de placa no son intercambiables. Se observó que al medir la traducción de los mismos ARNm en una placa con fondo transparente y paredes blancas, la señal luminiscente resultante era 5 veces menor que la obtenida con una placa paralela completamente blanca. Esta consideración técnica puede tener un impacto significativo al evaluar genes con dinámicas traduccionales ineficientes. Además de introducir inconsistencias en los datos, la reducción de la señal puede impedir la detección de diferencias sutiles inducidas por perturbaciones en la secuencia o la estructura del ARNm. En tercer lugar, el uso del medio L-15 es fundamental en este ensayo, ya que permite la viabilidad celular en un entorno sin suplementación de CO₂²⁵, lo que brinda flexibilidad respecto al luminómetro utilizado. Además, el uso de medio L-15 sin fenol reduce la señal de fondo durante la medición de la luminiscencia. Por último, es esencial cultivar y medir la luminiscencia a 37 °C (o a las condiciones de cultivo del tipo celular de interés). Realizar este experimento a temperatura ambiente alterará considerablemente los resultados, ya que la velocidad de elongación en la traducción se reduce²⁶, lo que impide observar la cinética normal.

La versatilidad del diseño de ARNm transcrito in vitro puede transferirse al proceso de síntesis, lo que permite numerosas modificaciones. Como se observó, la concentración del casquete 5’ puede reducirse hasta 4 veces y aún así lograr una expresión comparable, permitiendo a los investigadores disminuir costos. Aunque la eficiencia de encapuchado no se midió directamente tras la IVT, una proporción creciente de ARNm sin casquete dentro del grupo de IVT daría lugar a una señal reducida, como se demostró con el ARNm sin casquete; esto no se observó. Además, considerando que eGFP es una proteína relativamente pequeña de solo 27 kDa, esta modulación de la concentración del casquete debería trasladarse fácilmente a genes más grandes, ya que habrá menos transcritos por encapuchar tras la IVT. Existen múltiples análogos del casquete que poseen diferentes modificaciones de metilación, lo que afecta la inmunogenicidad³ y la expresión proteica²⁷. Asimismo, el proceso de encapuchado puede realizarse de forma co-transcripcional (como se demostró aquí) o post-transcripcionalmente utilizando el virus Vaccinia, lo que resulta en una eficiencia de encapuchado del 100 %²⁸, aunque requiere pasos adicionales de purificación. Para la producción a escala de laboratorio de ARNm, comúnmente se utilizan columnas de purificación, ya que son rápidas y eficientes, pero costosas. Un enfoque más económico y versátil es la precipitación con cloruro de litio, que, aunque más lenta, permite al usuario concentrar el ARNm y no restringe el rendimiento a la capacidad de unión de la columna; por lo tanto, es adecuada para la ampliación del proceso. Al igual que las columnas de purificación, este enfoque no elimina completamente el ARN bicatenario ni los fragmentos de ARN truncados, que causan inmunogenicidad²⁹. De forma análoga al casquete 5’, la incorporación de la cola poli(A) puede lograrse mediante métodos alternativos a los descritos aquí. De manera similar a la introducción de la cola mediante PCR, el ADN plasmídico puede diseñarse para contener una cola poli(A); sin embargo, estas secuencias largas pueden sufrir recombinación, lo que resulta en secuencias poli(A) heterogéneas y acortadas. No obstante, la segmentación de la poli(A) —la inserción de espaciadores heteronucleotídicos— ha minimizado estos efectos^30,31. Alternativamente, la cola poli(A) puede generarse utilizando una poli(A) polimerasa independiente de plantilla, lo que permite obtener colas poli(A) más largas³², pero con el riesgo de heterogeneidad que podría afectar los requisitos regulatorios³³.

Aunque el ensayo con etiqueta luminiscente dividida descrito es extremadamente eficaz para medir la expresión proteica de ARNm exógeno, existen algunas limitaciones que deben considerarse según la pregunta de investigación. En primer lugar, es necesario generar una línea celular que exprese constitutivamente una de las mitades de la luciferasa dividida. Aunque esta puede adquirirse ya preparada, actualmente está limitada únicamente a células HEK293. Si la creación de una línea estable en el tipo celular de interés resulta difícil, existe un ensayo lítico que, según hemos observado, muestra resultados similares entre células HEK293, células madre embrionarias humanas y cardiomiocitos diferenciados³. Sin embargo, el punto temporal elegido para el ensayo lítico en este estudio previamente publicado³ se basó en los datos obtenidos con células HEK293 vivas. En segundo lugar, el ensayo proporciona resolución temporal en células vivas, pero no puede ofrecer resolución espacial en células vivas, lo cual podría interesar a ciertos investigadores. No obstante, existe un anticuerpo primario que funciona bien en inmunocitoquímica fluorescente contra el péptido corto de la etiqueta de luciferasa utilizado en estos experimentos, lo que permite interrogar espacialmente la proteína de interés traducida. Además, un microscopio capaz de obtener imágenes luminiscentes podría proporcionar datos con resolución a nivel individual de células. Un enfoque que ofrece información espacio-temporal es SunTag, que mide la traducción activa y la localización mediante imágenes en células vivas a través de interacciones entre scFv marcado con GFP que se une a epítopos peptídicos^14,34. Sin embargo, se requieren 24 repeticiones en tándem de estos epítopos, lo que podría distorsionar la traducción, y además el procedimiento tiene una capacidad relativamente baja de procesamiento. En tercer lugar, la etiqueta luminiscente dividida permite medir la abundancia de ARNm, pero no en células vivas. En nuestro trabajo anterior³, se realizó una qRT-PCR en ARN extraído utilizando cebadores específicos para el ARNm exógeno, lo que confirmó los niveles de ARNm respecto a la eficiencia de transfección entre constructos y su decaimiento entre diferentes tiempos. Otro enfoque ha empleado el blotting Northern para medir la estabilidad del ARNm³⁵. Sin embargo, ambos métodos son laboriosos y no permiten mediciones continuas. Actualmente, no existe ningún método que permita mediciones simultáneas de la traducción y abundancia de ARNm en células vivas, lo que representa una posible vía para avanzar en el desarrollo de ensayos en este campo.

El sistema de luciferasa dividida se aplicó inicialmente para estudiar la dinámica de proteínas, pero aquí es evidente que este ensayo tiene importantes implicaciones en otras áreas de investigación. Con la terapia basada en ARNm a la vanguardia de nuevos enfoques de terapia génica, este ensayo es ideal para permitir a los investigadores caracterizar la expresión de sus posibles terapéuticos y optimizarlos para una expresión mejorada. Como se mencionó anteriormente, la optimización de codones se ha convertido en una poderosa herramienta novedosa en el diseño de ARNm con el desarrollo de múltiples herramientas^8,9,36. Cuando se aplicó un enfoque uniforme de optimización de secuencias a cuatro factores de transcripción, mejoró tanto el MFE como el CAI para todos los genes, pero solo MEF2C y TBX5 mostraron un aumento en la expresión. Destacablemente, al permitir la detección de diferencias en la expresión derivadas únicamente de variaciones sinónimas en la secuencia codificante, este enfoque proporciona una plataforma única para investigar la eficiencia de traducción en células vivas con alta resolución temporal. Estos hallazgos indican que la optimización de secuencias debe considerar el contenido inicial de GC, el uso de codones y la estructura secundaria del ARN de manera dependiente del POI para lograr una expresión mejorada. Aunque pueden necesitarse más constructos para pruebas, el ensayo con etiqueta luminiscente dividida tiene potencial para análisis de alto rendimiento destinados a identificar al candidato óptimo para el POI. Además, como se ha demostrado previamente³, este ensayo puede medir los efectos de alterar cualquier componente de secuencia o estructura del ARNm, destacando aún más sus aplicaciones. Aparte de investigar modificaciones en el ARNm, el ensayo con etiqueta luminiscente dividida también podría utilizarse en la investigación de sistemas de entrega y formulación. Incluso con mejoras en las caperuzas 5’ y el uso de nucleótidos modificados, el ARNm exógeno requiere un sistema de empaquetamiento para prevenir su degradación y facilitar su captación celular³⁷. Aunque las nanopartículas lipídicas³⁸, las vesículas extracelulares³⁹ y los biomiméticos⁴⁰ están a la vanguardia en la entrega de ARNm, aún se requiere un mayor desarrollo. La encapsulación de ARNm marcado con etiqueta luminiscente dividida en cualquiera de estos vehículos permitiría caracterizar su eficiencia de entrega y permitiría a los investigadores probar vehículos modificados de manera media a alta escala. Fuera de la investigación enfocada en la traducción, el ensayo con etiqueta luminiscente dividida es fácilmente utilizable en biología fundamental. Ya sea evaluando los efectos de perturbaciones en secuencias y elementos estructurales sobre la traducción del ARNm, interfiriendo con la función del maquinaria traduccional o explorando el proteasoma, el sistema de etiquetado con luminiscencia dividida ofrece una opción atractiva.

En general, el sistema de etiquetado luminiscente dividido descrito aquí ofrece un ensayo flexible y robusto para monitorear temporalmente la expresión proteica dirigida por ARNm sintético como lectura de la dinámica traduccional. La implementación de un ensayo en células vivas supera muchas de las limitaciones previas en el campo de la traducción de ARNm y revela información crucial sobre la dinámica de la síntesis proteica y la degradación del POI. Dado que los transcritos poseen diferentes perfiles reguladores y de expresión, es fundamental caracterizar el POI terapéutico, lo que permitirá que los fármacos basados en ARNm sigan evolucionando y se traduzcan al entorno clínico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido acético	Sigma-Aldrich	A6283	Componente del tampón TAE
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9539	Electroforesis en gel
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939B	Bioanalizador utilizado para el control de calidad de ARNm
Luminómetro CLARIOstar Plus	BMG Labtech	430-501S-F	Lector de placas/luminómetro utilizado para medir la luminiscencia
CleanCap AG	Trilink Biotechnologies	N-7113	cap 5' utilizado para la transcripción in vitro
DMEM, glucosa alta, piruvato	Thermo Fisher Scientific	41966029	Medios utilizados para el cultivo de células HEK293-LgBiT
DNasa I	New England Biolabs	M0303	Degrada la plantilla de ADN tras la reacción de transcripción in vitro (IVT)
Solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Para lavado celular y adición a la placa para prevenir la evaporación
EDTA, pH 8,0, libre de RNasa	Thermo Fisher Scientific	AM9260	Componente del tampón TAE
Bromuro de etidio	Sigma-Aldrich	E1510	Tinción para electroforesis en gel
Suero bovino fetal (SBF)	Sigma-Aldrich	F7524	Suplemento añadido al DMEM
Kit de síntesis de ARN HiScribe T7 de alto rendimiento	New England Biolabs	E2040	kit de transcripción in vitro (IVT)
Medio Leibovitz L-15, sin rojo de fenol	Thermo Fisher Scientific	21083027	Medio utilizado para el cultivo de HEK293-LgBiT durante las mediciones de luminiscencia
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030-024	Suplemento añadido al DMEM
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778150	Reactivo de transfección basado en lípidos
Solución de precipitación de cloruro de litio	Thermo Fisher Scientific	AM9480	Enfoque alternativo para la purificación de ARNm tras la transcripción in vitro
Monarch Spin PCR & Kit de Purificación de ADN	New England Biolabs	T1130	Kit de purificación tras la linealización del plásmido
Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen NanoDrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Espectrofotómetro utilizado para cuantificar la concentración de ADN y ARNm
Nano-Glo Endurazine Sustrato para Células Vivas	Promega	N2570	Sustrato necesario para la luminiscencia añadido al medio L-15
Kit NucleoSpin de Purificación de RNA	Macherey-Nagel	12708612	Purifica el ARNm tras la reacción de transcripción in vitro (IVT)
Placa microtituladora de 96 pocillos Nunc MicroWell, tratada Nunclon Delta, con fondo plano	Thermo Fisher Scientific	136101	Placa utilizada para el siembra de HEK293-LgBiT y mediciones posteriores
Medio Opti-MEM con suero reducido	Thermo Fisher Scientific	31985062	Medio utilizado para la reacción de transfección
Kit de PCR de alta fidelidad Phusion	New England Biolabs	E0553	kit de PCR
RiboRuler High Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	11883993	Escalera de ARN para electroforesis en gel
RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	R2020	Spray descontaminante de RNasa
TRIZMA Base	Sigma-Aldrich	T6066	Componente del tampón TAE
Solución de tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174	Reactivo de disociación celular
Agua destilada libre de DNasa/RNasa UltraPure	Thermo Fisher Scientific	10977035	Utilizado para la preparación de la plantilla y para la transcripción in vitro (IVT)