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Artículo de método

Medición de la dinámica traduccional de mRNA en células vivas mediante etiquetado luminiscente dividido en células HEK293

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DOI:

10.3791/70840

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14 de agosto de 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un método flexible y compatible con alta capacidad para medir dinámicas de traducción de ARNm en células vivas en HEK293, utilizando etiquetado luminiscente dividido. Este ensayo versátil distingue efectos estructurales, apoya la optimización de la transcripción in vitro y agiliza el desarrollo de terapias basadas en ARNm.

Resumen

El rápido desarrollo de vacunas para combatir la COVID-19 ilustró el potencial de los fármacos basados en ARN mensajero (ARNm) para transformar el desarrollo de medicamentos. Al igual que el ARNm maduro, el ARNm transcrito in vitro posee los mismos elementos, incluyendo un extremo 5’ con caperuza (5’ cap), regiones no traducidas (UTR), una secuencia codificante y una cola poli(A). Trabajos previos que estudiaron los efectos de estos componentes en la traducción del ARNm han utilizado principalmente proteínas reporteras altamente modificadas que exhiben una traducción eficiente y una gran estabilidad proteica. Dado que los elementos estructurales de cada ARNm afectan diferencialmente su traducción, es fundamental identificar el diseño óptimo relacionado con la proteína terapéutica de interés (POI). Para permitir la caracterización de la traducción de la POI, se empleó un sistema de complementación de luciferasa dividida. Una etiqueta peptídica corta (HiBiT), que puede fusionarse a cualquiera de los extremos de la POI, se asocia con su heterodímero complementario (LgBiT) para reconstituir la actividad enzimática en presencia de un sustrato permeable a la célula. Hasta la fecha, la etiquetación luminiscente dividida se ha utilizado principalmente en estudios de alto rendimiento sobre el recambio proteico. Anteriormente, hemos demostrado cómo esta técnica de etiquetación puede emplearse para cuantificar de forma de alto rendimiento la traducción del ARNm en el tiempo in cellulo en células HEK293 que expresan constitutivamente el heterodímero complementario. Aquí, demostramos además la versatilidad del ensayo y detallamos cómo puede utilizarse para optimizar la transcripción in vitro y reducir costos. El sistema de ensayo puede distinguir de forma única alteraciones en los componentes estructurales, destacando al mismo tiempo los efectos de la optimización de la secuencia codificante mediante genes no modificados. Además, demostramos que una reducción de cuatro veces en la concentración del caperuz 5’ para la transcripción in vitro produce una traducción equivalente in cellulo. Estos hallazgos ilustran cómo la etiquetación luminiscente dividida puede integrarse fácilmente en el flujo de trabajo de terapéuticos de ARNm, permitiendo el monitoreo en tiempo real de la dinámica de expresión proteica inducida por ARNm in cellulo, ofreciendo así un método versátil para el avance de los tratamientos basados en ARNm.

Introducción

Los fármacos y aplicaciones de investigación basados en ARN mensajero (ARNm) se han expandido rápidamente en los últimos años, impulsados por el éxito de las vacunas de ARNm1,2 y por el creciente reconocimiento de la versatilidad del ARN como biomolécula programable. Un desafío central en este campo es la capacidad de evaluar cuantitativa y dinámicamente la eficiencia de la traducción del ARNm en diversos contextos. El método descrito aquí, que aprovecha un sistema de etiquetado luminiscente dividido, proporciona una plataforma flexible y escalable para estudiar la traducción de ARNm en células vivas in cellulo3. El objetivo general de este método es permitir a los investigadores medir cómo las características de la secuencia, las modificaciones químicas y los elementos estructurales influyen en la cinética de traducción y en la posterior degradación de la proteína, ofreciendo así una herramienta potente para optimizar los constructos de ARNm en aplicaciones terapéuticas y en la ciencia básica.

El ARNm transcrito in vitro refleja la arquitectura esencial de los transcritos maduros, incorporando un extremo 5′ con caperuza, regiones no traducidas (UTR), una secuencia codificante y una cola poli(A), además de incluir frecuentemente nucleótidos modificados para reducir la inmunogenicidad4,5. Trabajos extensos han demostrado que cada uno de estos elementos, ya sea individualmente o en combinación, puede modificarse para influir fuertemente en la eficiencia de la traducción y el rendimiento proteico6,7. Sin embargo, la mayoría de los estudios anteriores se han basado en proteínas reporteras altamente optimizadas, como la proteína verde fluorescente (GFP)7, NanoLuc8 o la proteína espiga del SARS-CoV-28,9, que están diseñadas para traducirse con alta eficiencia y producir proteínas muy estables, por lo que no reflejan los desafíos presentes en contextos terapéuticos. Dado que los ARNm terapéuticos codifican diversas proteínas de interés (POI), cada una sujeta a restricciones estructurales únicas y a regulación específica según el tipo celular, los principios de diseño que maximizan la traducción para un constructo determinado podrían no ser generalizables a otros, tal como se ha informado previamente3. Por lo tanto, identificar la configuración óptima para una POI terapéutica específica es fundamental y requiere métodos capaces de evaluar de forma sensible y sistemática cómo cada característica individual del transcrito contribuye a la producción proteica.

Los métodos centrados en el ribosoma, como el perfilado de polisomas, distinguen las fracciones de traducción mediante centrifugación en gradiente10, mientras que el perfilado de ribosomas (Ribo-seq) proporciona una resolución a nivel de nucleótidos de la ocupación ribosómica, los sitios de iniciación y las pausas11. Al igual que Ribo-seq, otros enfoques basados en secuenciación, como la secuenciación de alto rendimiento del ARN aislado mediante inmunoprecipitación con reticulación cruzada (HITS-CLIP) y la purificación por afinidad de ribosomas en traducción (TRAP), caracterizan aún más la traducción de ARNs asociados a proteínas de unión al ARN o a ribosomas12. Aunque potentes, estas técnicas requieren preparaciones complejas, equipos especializados y experiencia computacional, lo que las hace inadecuadas para el desarrollo de ARNm terapéuticos de alto rendimiento. La inmunoprecipitación de cadenas nacientes13 mide la eficiencia de traducción utilizando proteínas marcadas con la etiqueta FLAG que se inmunoprecipitan a partir de ribosomas y se cuantifican mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). Aunque adaptable a ARNm terapéuticos, este ensayo es laborioso, carece de resolución temporal y no es adecuado para aplicaciones de alto rendimiento. El sistema SunTag14 permite mediciones en células vivas de la producción de síntesis proteica y la regulación traduccional a partir de moléculas individuales de ARNm, y funciona mediante la interacción de un fragmento variable monocatenario (scFv) fusionado a GFP con repeticiones en tándem del epítopo peptídico. Este sistema permite mediciones dinámicas de la traducción y la localización con resolución a nivel de un solo ARNm, por lo que se ha aprovechado para desarrollar numerosos sistemas de seguimiento de cadenas nacientes15,16. Sin embargo, este enfoque tiene un bajo rendimiento y requiere el uso de microscopios de alta potencia.

Aunque la etiquetación de la proteína recién sintetizada es inevitable, se identificó el uso potencial de una etiqueta peptídica pequeña derivada de la luciferasa NanoLuc para informar sobre la traducción del ARNm en células vivas. La luciferasa Nano se diseñó para dividirse en una subunidad pequeña de 11 aminoácidos (HiBiT) y una subunidad más grande de 158 aminoácidos (LgBiT), que pueden dimerizarse rápidamente y, en presencia de sustrato, reconstituir una luciferasa funcional17,18. El sistema de etiquetado luminiscente dividido ofrece varias ventajas clave para estudios de la dinámica del ARNm. En primer lugar, el tamaño mínimo de la subunidad pequeña fusionada al POI permite que el constructo codificado se mantenga lo más cercano posible a la proteína de interés nativa. Dado que la longitud de la secuencia codificante puede afectar directamente las tasas de traducción19, minimizar la longitud de la etiqueta mejora nuestra predicción de la dinámica de traducción de ARNm sintéticos. Esencialmente, esta estrategia de etiquetado mínima permite detectar diferencias en la traducción impulsadas por variaciones sinónimas en la secuencia codificante, lo que permite investigar la eficiencia traduccional independientemente de la secuencia o estabilidad de la proteína3. Por esta razón, el uso de etiquetas más grandes, como proteínas fluorescentes o luciferasas completas, es subóptimo. En segundo lugar, el sistema de etiquetado luminiscente dividido empleado aquí permite una generación inmediata de señal. Su reacción de complementación rápida y eficiente in cellulo presenta una alta afinidad (KD = 700 pM) y se ha utilizado para medir la modulación del recambio proteico con lecturas tan frecuentes como cada 30 s18. Aunque el sistema original de etiquetado luminiscente dividido se comparó principalmente con otros sistemas de luciferasa dividida17,18, la ventaja clave en este contexto es que la generación de señal no está limitada por la maduración de la proteína. En contraste, las proteínas fluorescentes requieren la maduración del cromóforo, un proceso que puede tardar desde minutos hasta horas20, limitando así la resolución temporal. Finalmente, el sistema de etiquetado luminiscente dividido aquí empleado supera las limitaciones de los sistemas de proteínas fluorescentes divididas, que normalmente requieren la formación del cromóforo tras la complementación21, lo que introduce un retraso adicional y limita su idoneidad para capturar procesos rápidos y dinámicos. Estudios previos han demostrado la utilidad del etiquetado luminiscente dividido en ensayos de recambio proteico y estudios de degradación22,23,24. Extender esta tecnología consolidada a la cinética de traducción representa un avance metodológico significativo. Por ejemplo, aunque el perfilado de ribosomas puede revelar la densidad ribosómica a lo largo de los transcritos, no puede captar fácilmente cambios dinámicos en las tasas de iniciación o elongación de la traducción bajo diferentes condiciones. Como se ilustró previamente3, este sistema de etiquetado luminiscente dividido puede detectar diferencias al modificar la estructura del capuchón, la composición de la región no traducida 5′ (UTR), la optimización de codones, las modificaciones de nucleótidos y la longitud de la cola poli(A), todos los cuales son determinantes críticos de la eficiencia traduccional. Esta amplia aplicabilidad hace que el método sea excepcionalmente poderoso para desentrañar las contribuciones de características individuales del ARNm a la producción proteica total. Vale la pena señalar que, dependiendo del instrumento utilizado, esta tecnología puede capturar datos tanto a nivel de célula individual como de pocillo completo. Las plataformas de imagen capaces de adquirir imágenes basadas en luminiscencia pueden potenciar esta tecnología para estudiar la dinámica de traducción a nivel de célula individual. Aquí, nos centramos en una aplicación basada en lectoras de placas debido a su naturaleza de medio a alto rendimiento y su mínima necesidad de análisis de datos.

Los investigadores que consideren este método deben evaluar su idoneidad a la luz de sus objetivos experimentales específicos. El ensayo es particularmente valioso en contextos donde se requiere cribado de alto rendimiento de constructos de ARNm sintético, como en las líneas de diseño terapéutico basadas en ARNm. Es muy adecuado para análisis comparativos de características de secuencias de ARNm sintético, incluyendo regiones no traducidas, uso de codones o modificaciones de nucleótidos, en los que pueden detectarse diferencias sutiles en la eficiencia de traducción3. Debido a que el sistema es compatible con plataformas de traducción libres de células, ensayos en células vivas y un ensayo lítico específico por puntos temporales, ofrece flexibilidad a los investigadores que deseen adaptar su diseño experimental a estudios mecanicistas o a investigaciones aplicadas. Al mismo tiempo, es importante reconocer los límites de la técnica. Fundamentalmente, el ensayo de marcado con luminiscencia dividida no proporciona resolución de la ocupación de ribosomas, una capacidad que sigue siendo exclusiva de los enfoques de huella de ribosomas, ni mide directamente la estabilidad o degradación del ARN, lo cual podría necesitar evaluarse mediante métodos complementarios. Sin embargo, debido a las limitaciones de las técnicas existentes centradas en ribosomas, los investigadores dependen de ensayos basados en marcadores, como el sistema de luminiscencia dividida, para investigar la expresión proteica impulsada por ARNm con resolución temporal como proxy de la dinámica traduccional. Por lo tanto, aunque este sistema es una herramienta potente para monitorear la expresión proteica impulsada por ARNm sintético, su adecuación depende de si la pregunta de investigación se centra en la producción dinámica de proteínas más que en la posición fina de ribosomas o en la degradación del ARN.

En resumen, el sistema de etiquetado luminiscente dividido representa un método potente y versátil para estudiar la traducción del ARNm. Su objetivo general es proporcionar a los investigadores un sistema flexible, escalable, de alto rendimiento y capaz de detectar diferencias en la producción de proteínas derivadas de ARNm sintéticos con distintos elementos estructurales y de secuencia3. La justificación para su desarrollo radica en superar las limitaciones de las técnicas existentes, ofreciendo ventajas en sensibilidad, escalabilidad y resolución temporal. Ubicado dentro de la literatura más amplia sobre biología y terapéutica del ARN, este método constituye un valioso aporte al repertorio experimental, permitiendo avances tanto en conocimientos fundamentales como en aplicaciones traslacionales. Al considerar cuidadosamente las fortalezas y limitaciones del ensayo, los investigadores pueden determinar su idoneidad para sus aplicaciones específicas, maximizando así su impacto en el campo en rápida evolución de la ciencia del ARN.

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Protocolo

Se muestra una representación gráfica de todo el protocolo en la Figura 1.

1. Preparación de la plantilla para la transcripción in vitro (IVT)

NOTA: Para preparar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro (IVT), asegúrese de que el ADN plasmídico contenga un promotor para la ARN polimerasa (generalmente T7 o SP6), las UTR 5’ y 3’, y el marco de lectura abierto del POI (Figura 1).

  1. Linealice el ADN plasmídico utilizando una enzima de restricción con un sitio de corte único ubicado después de la UTR 3’ y prepare la reacción según las instrucciones del fabricante. Tras la incubación, purifique la reacción de digestión con enzima de restricción utilizando un kit de purificación de ADN basado en columnas giratorias. Cuantifique el ADN mediante un espectrofotómetro.
  2. Para confirmar la linealización, prepare un gel de agarosa TAE al 1 % que contenga el colorante de ADN bromuro de etidio a 0,1 µg/mL. Mezcle 150 ng de ADN digerido con agua y colorante de carga. Cargue el gel de agarosa con la muestra, el plásmido sin digerir y una escalera de ADN, y corra el gel de agarosa a 100 V durante 40 minutos en un tampón 1× Tris-ácido acético-EDTA (TAE). Visualice con un sistema de imagen para geles.
    ADVERTENCIA: La solución de bromuro de etidio es un potente mutágeno y requiere manipulación cuidadosa utilizando equipo de protección personal (EPP) adecuado.
  3. Si el ADN plasmídico no tiene una cola poli(A) inmediatamente después de la UTR 3’, introdúzcala mediante una PCR. Realice la PCR según las instrucciones del fabricante utilizando una polimerasa de alta fidelidad con cebadores diseñados adecuadamente. Asegúrese de que el amplicón incluya el promotor T7, el marco de lectura abierto y una cola poli(A).
    NOTA: Las tecnologías de caperuza pueden tener requisitos específicos de secuencia en el promotor T7; por lo tanto, estos requisitos pueden satisfacerse mediante un diseño adecuado del cebador directo. El cebador inverso se une al extremo de la UTR 3’ e introduce una cola poli(A) (longitud recomendada de al menos 80 T). Para construcciones con alto contenido de GC, se recomienda PCR con incremento de temperatura y/o 3 % de DMSO.
  4. Para confirmar una PCR exitosa, prepare un gel de agarosa TAE que contenga bromuro de etidio (véase el paso 1.2). Si la longitud del constructo es ≥1 kb o <1 kb, prepare un gel al 1 % o al 2 %, respectivamente. Mezcle 5 µL de la reacción de PCR con agua y colorante de carga. Cargue el gel de agarosa con la muestra y una escalera de ADN, y corra el gel a 100 V durante 40 minutos en tampón TAE. Visualice con un sistema de imagen para geles.
  5. Tras confirmar el tamaño por PCR, purifique la reacción de PCR utilizando un kit de purificación de ADN basado en columnas giratorias. Eluya en 15–20 µL de tampón de elución (a menudo proporcionado con el kit de purificación de ADN) o agua libre de nucleasas para concentrar la plantilla de ADN para su uso en la transcripción in vitro (IVT). Cuantifique el ADN mediante un espectrofotómetro.

2. Transcripción in vitro

  1. Antes de comenzar, rocíe y limpie la superficie de trabajo, los guantes y las pipetas con una solución descontaminante de RNasas. Para mejorar el rendimiento y la calidad, realice este procedimiento en un entorno de cabina estéril.
  2. Descongele y ensamble los componentes de un kit de transcripción in vitro (IVT) basado en T7 según las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Algunos fabricantes recomiendan el uso de ditiotreitol (DTT, 0,1 M) para limitar la oxidación de la reacción y mejorar la eficiencia. Este paso se recomienda cuando sea compatible con el kit. Si se utilizan dNTP modificados, sustituya el nucleótido no modificado equivalente por la misma cantidad de nucleótido modificado. Evalúe el rendimiento de una reacción a media escala, ya que no se observó una mejora sustancial en el rendimiento con una reacción completa. Cuando se sintetice más de un ARNm, se recomienda preparar una mezcla maestra para reducir errores y variabilidad en la pipetación.
  3. Pipetee y mezcle brevemente, luego incube a 37 °C durante 5 h con tapa calefaccionada para evitar la condensación. Prolongue la incubación durante la noche si es necesario, ya que esto tiene un efecto mínimo sobre el rendimiento o la integridad del ARNm.
  4. Añada 1 µL de DNasa I y pipetee completamente. Incube a 37 °C durante 30 min.
  5. Purificación del ARN transcrito in vitro (IVT)
    1. Limpie la reacción IVT utilizando un kit de purificación de ARN basado en columnas, siguiendo las instrucciones del fabricante (diferentes kits pueden dar lugar a distintos niveles de recuperación y tener capacidades de unión variables). Para la elución, añada 60 µL de agua libre de nucleasas e incube a temperatura ambiente durante 5 min antes de centrifugar.
    2. Alternativamente, utilice la precipitación con cloruro de litio como un método más económico y flexible.
      1. Añada un volumen igual de cloruro de litio 7,5 M a la reacción, mezcle e incube a -20 °C durante la noche.
      2. Centrifugue a 18.300 × g durante 20 min a 4 °C, luego retire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet de ARN.
      3. Lave con 950 µL de etanol al 70 % y centrifugue a 18.300 × g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante, deje secar el pellet aproximadamente 5 min a temperatura ambiente y resuspenda en agua libre de nucleasas (60 µL es estándar; reduzca el volumen según el tamaño del pellet para aumentar la concentración).
        ADVERTENCIA: El cloruro de litio puede causar irritación en la piel o los ojos si no se utiliza el EPP adecuado. Use guantes y protección ocular al manipularlo. Además, el etanol es un líquido altamente inflamable y puede causar irritación ocular. Manténgalo alejado de llamas desnudas y use el EPP adecuado, incluida la protección ocular.
  6. Cuantifique el ARNm utilizando un espectrofotómetro. Asegúrese de que la relación A260/A280 del ARNm sea ~2,0 y confirme que la relación A260/A230 se encuentre entre 1,8 y 2,2.
  7. Para confirmar una transcripción IVT exitosa, prepare un gel de agarosa al 1 % en tampón TAE (no desnaturalizante) que contenga bromuro de etidio. Mezcle 500 ng de ARNm con agua y colorante de carga, y siga las instrucciones del fabricante para la preparación de la escalera de ARN y las condiciones de desnaturalización. Cargue el gel de agarosa y corra a 80 V durante 40 min en tampón TAE. Visualice con un sistema de imagen para geles.
  8. Para una confirmación adicional del tamaño correcto del ARNm, analice las muestras en un Bioanalyzer.
  9. Para evitar ciclos de congelación-descongelación, alícuote el ARNm en volúmenes adecuados para el experimento. Por ejemplo, utilice 1,2 pmol de ARNm por pocillo en una placa de 96 pocillos. Por lo tanto, alícuote el volumen apropiado para 1,2 pmol × n réplicas y almacénelo a -80 °C.

3. Transfección inversa en HEK293

NOTA: Para obtener mediciones temporales, se requiere una línea celular que exprese constitutivamente el fragmento complementario de luciferasa. Esto puede lograrse generando una línea celular estable mediante la transfección de un plásmido que exprese el fragmento de luciferasa requerido y la posterior selección clonal. Esto permite al usuario medir dinámicas traduccionales de ARNm resueltas temporalmente en cualquier contexto celular deseado. Alternativamente, pueden adquirirse líneas celulares que expresen el fragmento de luciferasa requerido. Estos experimentos se realizaron utilizando células HEK293 que expresan constitutivamente el heterodímero complementario.

  1. Antes de comenzar, descongele el ARNm sobre hielo para evitar su degradación.
  2. Prepare los complejos de transfección. Para una placa de 96 pocillos, se requieren 1,2 pmol de ARNm por pocillo. Si se realiza el ensayo en duplicado, prepare suficiente volumen para 2,5 réplicas para permitir errores de pipeteo. Por lo tanto, combine 3 pmol de ARNm con Medio Opti-MEM con suero reducido hasta un volumen final de 50 µL (20 µL/pocillo).
  3. Agregue 0,5 µL de reactivo de transfección basado en lípidos catiónicos (0,2 µL/pocillo), mezcle aspirando y expulsando con la pipeta y luego incube a temperatura ambiente. Tras incubar durante 5 min, mezcle nuevamente aspirando y expulsando con la pipeta, y a continuación agregue 20 µL por pocillo a una microplaca de 96 pocillos blanca con fondo plano. Se recomienda colocar los pocillos de transfección en el centro de la placa, dejando los pocillos periféricos vacíos.
  4. Prepare las células HEK293 retirando el medio y lavando con 2 mL de solución salina tamponada con fosfatos (PBS) sin Ca2+ y Mg2+. Retire el lavado y agregue 500 µL de tripsina-EDTA, luego incube a 37 °C durante 3 min.
  5. Durante la disociación celular, llene los pocillos periféricos de la placa de 96 pocillos con PBS para reducir la evaporación del medio durante el cultivo celular. Si se requieren todos los pocillos, la placa puede inundarse con PBS entre los pocillos.
  6. Agregue 4,5 mL de Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con L-glutamina 1× y suero bovino fetal (FBS) al 10 % para recolectar las células. Realice el recuento celular utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células.
  7. Transfiera la cantidad necesaria de células (suficiente para sembrar 1 x 105 células por pocillo) más 3 pocillos adicionales (para errores de pipeteo) a un tubo nuevo y centrifugue a 500 × g durante 2 min.
  8. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en el volumen requerido de medio Leibovitz L-15 (sin fenol) suplementado con FBS al 10 % y sustrato para células vivas Endurazine (1:200) para asegurar una concentración final de 1 × 106 células/mL. Mezcle con una pipeta serológica para garantizar una mezcla homogénea del Endurazine. Pipetee 100 µL (1 × 105 células) de células resuspendidas por pocillo.
    NOTA: Si se realizan experimentos de curso temporal de 72 h, aumente el volumen a 200 µL para evitar la evaporación.
  9. Inmediatamente después de la transfección, coloque las células en un lector de placas (luminómetro) ajustado a 37 °C. Registre lecturas a intervalos regulares con un tiempo de integración de 1 s. Debido a la eficiente complementación del sistema, la señal es detectable en cuestión de minutos. Por lo tanto, para obtener una lectura precisa de la línea base, este paso debe realizarse de inmediato. Estos intervalos dependen del experimento y del instrumento; sin embargo, en estos experimentos, se encontró que era óptimo medir cada 12 min en experimentos de 18 h, pero cada 48 min en experimentos de 72 h. La luminiscencia no requiere filtro para su medición; sin embargo, se observó una mejor relación señal-ruido al utilizar un filtro de 530–540 nm.
    NOTA: Se genera una señal de transferencia de resonancia de energía por bioluminiscencia (BRET) a partir de eGFP marcado con luciferasa dividida, por lo que un filtro de 530–540 nm captará tanto la señal luminiscente como la fluorescente. Para evitar la captura de BRET, utilice un filtro de 460–480 nm o, alternativamente, emplee una proteína no fluorescente como MYL3 como referencia.

4. Análisis de datos

  1. Genere cambios en el plegamiento de las unidades de luminiscencia relativas (RLU), normalizando la señal de cada condición respecto a su primer punto de tiempo (t0, normalizado al promedio de los réplicas técnicos), ya que la señal al inicio del ensayo corresponde al nivel de fondo.
  2. Reduzca la variabilidad entre réplicas biológicas normalizando respecto a una condición de control.
  3. Seleccione el análisis estadístico para el ensayo, ya sea un único punto de tiempo o el área bajo la curva (AUC), según la pregunta que se esté investigando.
    1. Para un único punto de tiempo, utilice los puntos de tiempo en los que ocurre la expresión máxima (que depende del POI) junto con el tiempo final. Represente gráficamente la RLU calculada en el paso 4.1 en el punto de tiempo específico (por ejemplo, 240 min) y analícela mediante una prueba estadística adecuada.
    2. Mida la dinámica de la traducción y degradación proteica calculando el AUC ya sea para un intervalo de tiempo específico (es decir, t0 a 240 min) o para toda la duración del ensayo (es decir, t0 hasta el punto final). Normalice el valor de AUC de cada réplica biológica respecto al promedio del ARNm de referencia, obteniendo así una medida del cambio en el plegamiento del AUC que puede analizarse mediante pruebas estadísticas apropiadas.

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Resultados

Existen varias formas en las que puede optimizarse la relación costo-eficacia de este protocolo. Por ejemplo, la reacción de transcripción in vitro (IVT) se miniaturizó hasta la mitad del volumen recomendado por el fabricante, y se encontró que el rendimiento resultante satisface la cantidad requerida para en célula experimentos. Cabe señalar que la longitud y complejidad de la secuencia afectan el rendimiento de la transcripción in vitro (IVT), por lo que una optimización exitosa del protocolo debería producir ...

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Discusión

El campo de la terapéutica con ARNm ha expandido rápidamente en los últimos años, destacando la importancia del diseño y la optimización de secuencias como una etapa crítica en la línea de desarrollo. Se han realizado importantes esfuerzos para crear herramientas computacionales que predigan las estructuras y composiciones de ARN más eficaces, centrándose especialmente en la optimización de secuencias8,9. Aunque estas herramientas son potentes, la validación expe...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Laura Itzhaki por la línea celular HEK293 LgBiT. Este trabajo fue financiado por la subvención de proyecto y el premio de traslación del British Heart Foundation (G114642 y G919651 para CHW) y por una subvención para la investigación en ciencias de la vida de GenScript (CAPB).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acéticoSigma-AldrichA6283Componente del tampón TAE
AgarosaSigma-AldrichA9539Electroforesis en gel
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BBioanalizador utilizado para el control de calidad de ARNm
Luminómetro CLARIOstar PlusBMG Labtech430-501S-FLector de placas/luminómetro utilizado para medir la luminiscencia
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113cap 5' utilizado para la transcripción in vitro
DMEM, glucosa alta, piruvatoThermo Fisher Scientific41966029Medios utilizados para el cultivo de células HEK293-LgBiT
DNasa INew England BiolabsM0303Degrada la plantilla de ADN tras la reacción de transcripción in vitro (IVT)
Solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537Para lavado celular y adición a la placa para prevenir la evaporación
EDTA, pH 8,0, libre de RNasaThermo Fisher ScientificAM9260Componente del tampón TAE
Bromuro de etidioSigma-AldrichE1510Tinción para electroforesis en gel
Suero bovino fetal (SBF)Sigma-AldrichF7524Suplemento añadido al DMEM
Kit de síntesis de ARN HiScribe T7 de alto rendimientoNew England BiolabsE2040kit de transcripción in vitro (IVT)
Medio Leibovitz L-15, sin rojo de fenolThermo Fisher Scientific21083027Medio utilizado para el cultivo de HEK293-LgBiT durante las mediciones de luminiscencia
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-024Suplemento añadido al DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Reactivo de transfección basado en lípidos
Solución de precipitación de cloruro de litioThermo Fisher ScientificAM9480Enfoque alternativo para la purificación de ARNm tras la transcripción in vitro
Monarch Spin PCR & Kit de Purificación de ADNNew England BiolabsT1130Kit de purificación tras la linealización del plásmido
Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WEspectrofotómetro utilizado para cuantificar la concentración de ADN y ARNm
Nano-Glo Endurazine Sustrato para Células VivasPromegaN2570Sustrato necesario para la luminiscencia añadido al medio L-15 
Kit NucleoSpin de Purificación de RNAMacherey-Nagel12708612Purifica el ARNm tras la reacción de transcripción in vitro (IVT)
Placa microtituladora de 96 pocillos Nunc MicroWell, tratada Nunclon Delta, con fondo planoThermo Fisher Scientific136101Placa utilizada para el siembra de HEK293-LgBiT y mediciones posteriores
Medio Opti-MEM con suero reducidoThermo Fisher Scientific31985062Medio utilizado para la reacción de transfección
Kit de PCR de alta fidelidad PhusionNew England BiolabsE0553kit de PCR
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993Escalera de ARN para electroforesis en gel
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020Spray descontaminante de RNasa
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066Componente del tampón TAE
Solución de tripsina-EDTASigma-AldrichT4174Reactivo de disociación celular
Agua destilada libre de DNasa/RNasa UltraPureThermo Fisher Scientific10977035Utilizado para la preparación de la plantilla y para la transcripción in vitro (IVT)

Referencias

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