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Artículo de investigación

Efectos de la regulación de la expresión de SPRY2 y miR-590-5p en la autofagia en condrocitos modelo de osteoartritis humana

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DOI:

10.3791/70883

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31 de julio de 2026

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1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El estrés inflamatorio en un modelo de condrocitos C28/I2 inducido por IL-1β aumentó la miR-590-5p y redujo la expresión de SPRY2. La modulación de este eje alteró la expresión de Beclin-1, LC3-II y Bcl-2, sugiriendo una posible vía reguladora miR-590-5p/SPRY2 que podría influir en las respuestas asociadas a la autofagia y la supervivencia de los condrocitos en la osteoartritis.

Resumen

La osteoartritis (OA) es una enfermedad degenerativa articular prevalente caracterizada por la destrucción progresiva del cartílago y la pérdida de la homeostasis de los condrocitos. Aunque la autofagia desregulada contribuye a la patogénesis de la artrosis, los mecanismos moleculares que rigen las respuestas asociadas a la autofagia en los condrocitos siguen siendo incompletamente comprendidos. Este estudio investigó el papel del eje regulador miR-590-5p/SPRY2 en un microambiente inflamatorio de OA utilizando condrocitos humanos C28/I2 inducidos por IL-1β. Se estableció un modelo de OA in vitro tratando células C28/I2 con IL-1β. La expresión de miR-590-5p y SPRY2 se evaluó mediante PCR cuantitativa y Western bloting. Se emplearon enfoques de ganancia y pérdida de función para evaluar los efectos de SPRY2 y miR-590-5p sobre los marcadores asociados a la autofagia Beclin-1 y LC3-II, así como sobre la proteína relacionada con la supervivencia Bcl-2. Se utilizaron análisis bioinformáticos y experimentos de rescate para investigar la relación regulatoria entre miR-590-5p y SPRY2. El tratamiento con IL-1β aumentó significativamente la expresión de miR-590-5p mientras reducía los niveles de ARNm y proteínas SPRY2 (P < 0,05). La sobreexpresión de SPRY2 disminuyó notablemente la expresión de Beclin-1 y LC3-II, con reducciones de aproximadamente un 65% y 77%, respectivamente (P < 0,05). En cambio, la sobreexpresión de miR-590-5p aumentó la expresión de Beclin-1, LC3-II y Bcl-2, mientras que la inhibición de miR-590-5p revirtió estos efectos y restauró la expresión de SPRY2. Los análisis funcionales apoyaron a SPRY2 como un objetivo regulatorio posterior posible de miR-590-5p. Estos hallazgos identifican el eje miR-590-5p/SPRY2 como un regulador importante de la expresión de marcadores asociados a la autofagia y la supervivencia de los condrocitos en condiciones inflamatorias, y sugieren su posible relevancia como objetivo terapéutico en la artrosis.

Introducción

Como la forma de artritis más prevalente en todo el mundo, la osteoartritis (OA) es una de las principales causas de dolor, discapacidad de movilidad y discapacidad física, imponiendo una carga considerable para los sistemas sanitarios y lasociedad. Patológicamente, la artrosis se caracteriza por una degeneración progresiva del cartílago articular, inflamación sinovial y remodelación patológica del huesosubcondral 1. Las estimaciones epidemiológicas indican que aproximadamente 303 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la OA, y se espera que esta cifra aumente con el envejecimiento de la población y el aumento de las tasas de obesidad2. En China, se estima que la prevalencia de la artrosis sintomática de la rodilla es del 8,1%, con una prevalencia desproporcionadamente mayor entre mujeres y poblacionesrurales 3. A pesar de su alta prevalencia, las opciones de tratamiento actuales siguen estando limitadas en gran medida al manejo de los síntomas mediante antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) e intervención quirúrgica para la enfermedadavanzada 4. La ausencia de fármacos modificadores de la osteoartritis (DMOADs) refleja una comprensión incompleta de los mecanismos moleculares que regulan la homeostasis y supervivencia de loscondrocitos 5.

La integridad estructural y funcional del cartílago articular depende de los condrocitos residentes, que mantienen el recambio de la matriz extracelular (MEC) mediante un equilibrio entre actividades anabólicas ycatabólicas 6. Durante la progresión de la OA, los condrocitos están expuestos a un estrés mecánico anormal y a mediadores proinflamatorios, en particular la interleucina-1β (IL-1 β) y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), que promueven un cambio de la síntesis matricial a la degradación dela matriz 6. Laβ IL-1 contribuye a la destrucción del cartílago estimulando la producción de metaloproteinasas de matriz (MMPs) y aggrecanasas, mientras suprime la síntesis de colágeno tipo II yproteoglicanos 7. Además, laβ IL-1 induce estrés oxidativo y disfunción mitocondrial, lo que conduce a la apoptosis de los condrocitos y lasenescencia 8. Por consiguiente, identificar vías de señalización intracelular que regulen la supervivencia de los condrocitos en condiciones inflamatorias sigue siendo una prioridad para la investigación en la OA.

La autofagia es una vía evolutiva de degradación lisosomal conservada que mantiene la homeostasis celular mediante la eliminación y reciclaje de orgánulos dañados y agregadosproteicos 9. La autofagia basal es esencial para la supervivencia celular y el equilibrio energético; sin embargo, la autofagia desregulada puede contribuir a la progresión de laenfermedad 9. En la artrosis, la autofagia se considera generalmente una respuesta protectora que ayuda a los condrocitos a adaptarse al estrés celular y resistir laapoptosis 10. Estudios previos han sugerido que la actividad autofágica disminuye durante la progresión de la artrosis, especialmente en enfermedades en estadio avanzado, lo que resulta en un control de calidad celular deteriorado y un aumento de la pérdida decondrocitos. Varias proteínas se utilizan comúnmente como indicadores de la actividad asociada a la autofagia. Beclin-1 participa en la iniciación del autofagosoma, mientras que la conversión de la cadena ligera 3 de la proteína 1 asociada a microtúbulos (LC3-I a LC3-II) se utiliza ampliamente como marcador de la formación deautofagosomas 12. En cambio, el linfoma de células B 2 (Bcl-2) inhibe la autofagia dependiente de Beclin-1 mientras ejerce efectosantiapoptóticos 13. No obstante, la interpretación de los marcadores asociados a la autofagia requiere precaución porque las mediciones estáticas de LC3-II y Beclin-1 no pueden distinguir de forma independiente la formación aumentada de autofagosomas de la degradación lisosomal deteriorada. A pesar de estas limitaciones, la modulación de las vías relacionadas con la autofagia sigue siendo una estrategia terapéutica prometedora para la OA.

Los microARN (miARN) son ARN cortos y no codificantes que regulan la expresión génica post-transcripcionalmente uniéndose a secuencias complementarias dentro de las regiones 3′-no traducidas (3′-UTRs) de los ARN mensajeros objetivo, lo que resulta en la degradación del ARNm o represióntraslacional 14. La expresión aberrante de miARN se ha implicado en la patogénesis de la AO mediante efectos sobre inflamación, apoptosis y remodelación de laECM 15. Entre estas moléculas, el miR-590-5p ha llamado la atención debido a sus funciones reguladoras en el metabolismo óseo y otros procesos patológicos. Estudios previos han demostrado que miR-590-5p promueve la diferenciación osteogénica y suprime la adipogénesis en las células madremesenquimales 16. En modelos de cáncer, miR-590-5p presenta funciones dependientes del contexto como regulador oncogénico o supresortumoral 17. Además, los perfiles alterados de expresión de microARN, incluidos miembros de la familia miR-590, han estado implicados en la remodelación patológica de tejidos articulares durante laOA 18. Sin embargo, la evidencia obtenida de modelos de células madre o cáncer no puede extrapolarse directamente a condrocitos articulares maduros. Por lo tanto, el papel de miR-590-5p en la regulación de las respuestas de los condrocitos dentro del microambiente inflamatorio de la OA sigue siendo incompletamente comprendido.

Para investigar los posibles mecanismos aguas abajo del miR-590-5p en la OA, se realizaron análisis de predicción de objetivos in silico , identificando a Sproverby2 (SPRY2) como un posible objetivo aguas abajo. SPRY2 pertenece a la familia de proteínas Sprouty, que regulan negativamente la señalización de tirosina quinasa receptora y suprimen la activación de la vía RAS/MAPK/ERK 19. Dado que la señalización MAPK influye en la diferenciación de condrocitos, respuestas inflamatorias y autofagia, SPRY2 puede representar un nodo regulador importante en la fisiopatología de laAO 20. Estudios previos indican que SPRY2 puede suprimir respuestas inflamatorias en modelos de artritisreumatoide 21, participar en la regulación relacionada con la apoptosis en sistemasepiteliales 22, y estar asociado con respuestas relacionadas con la autofagia en modelos de lesiónisquémica 23. Aunque estas observaciones sugieren que SPRY2 participa en la regulación tanto de la apoptosis como de la autofagia, su papel en los condrocitos articulares sigue siendo poco caracterizado. Por ello, se planteó la hipótesis de que miR-590-5p y SPRY2 forman un eje regulador que influye en la supervivencia de los condrocitos bajo estrés inflamatorio.

Basándose en estas observaciones, se propuso que miR-590-5p modula las respuestas asociadas a la autofagia en los condrocitos regulando la expresión de SPRY2. Aunque miR-590-5p y SPRY2 se han estudiado individualmente en otros contextos biológicos, no se ha establecido su relación funcional en los condrocitos OA. En el presente estudio, se utilizó un modelo de OA inducido por IL-1β en condrocitos humanos C28/I2 para examinar los patrones de expresión de miR-590-5p y SPRY2 y para evaluar sus efectos en la expresión de Beclin-1, LC3-II y Bcl-2. Al investigar el eje regulador miR-590-5p/SPRY2, este estudio proporciona información sobre los mecanismos epigenéticos subyacentes a la supervivencia de los condrocitos e identifica un posible objetivo terapéutico para la artrositis.

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Protocolo

Este estudio se realizó exclusivamente utilizando la línea celular de condrocitos humanos C28/I2, disponible comercialmente. No participaron participantes humanos, muestras de tejido humano, materiales derivados de pacientes ni animales vivos en esta investigación. Por lo tanto, no se requería la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) ni la aprobación del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales. Las herramientas, productos químicos, kits y reactivos utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Construcción de modelos de cultivo celular y OA

La línea celular de condrocitos humanos C28/I2 (detalles proporcionados en la Tabla de Materiales) fue obtenida de un proveedor comercial. Para garantizar la reproducibilidad experimental, las células fueron autenticadas mediante perfilado de repeticiones cortas en tándem (STR) y probadas rutinariamente para confirmar la ausencia de contaminación por micoplasmas. Se utilizaron células entre los pasajes 3 y 8 para todos los experimentos. Las células se mantuvieron en DMEM suplementadas con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (todos los reactivos de cultivo se detallan en la Tabla de Materiales) a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2.

Para establecer el modelo in vitro de osteoartritis (OA), las células C28/I2 fueron estimuladas con IL-1β humano recombinante. Basándose en la literaturaestablecida 6,7, experimentos preliminares de optimización dosis-respuesta diseñados para inducir un estado catabólico robusto sin citotoxicidad inmediata excesiva, las células fueron tratadas con 20 ng/mL de IL-1β durante 24 horas.

2. Agrupación experimental y transfección

Para esclarecer las vías mecanicistas, el estudio se dividió en tres módulos experimentales principales, cada uno con un mínimo de tres réplicas biológicas independientes:

  1. Ganancia/pérdida de función SPRY2:
    Las células se asignaron a Control, modelo OA, OA + vector vacío (NC), OA + plásmido de sobreexpresión SPRY2 (OE-SPRY2), y pequeños grupos de ARN interferentes correspondientes (si-NC y tres constructos específicos si-SPRY2: si-695, si-800, si-896) para detectar la eficiencia de interferencia.
  2. Modulación miR-590-5p:
    Las células se dividieron en grupos de control, modelo OA, OA + mimetismo NC, OA + miR-590-5p mimetético, OA + inhibidor NC y OA + miR-590-5p inhibidores.
  3. Validación funcional de la relación regulatoria miR-590-5p/SPRY2:
    Para evaluar más a fondo la relación reguladora propuesta entre miR-590-5p y SPRY2, se sometieron células a condiciones miMómicas e inhibidoras de miR-590-5p para determinar si la modulación miR-590-5p alteraba la expresión de SPRY2 en el modelo de AAO.
    Para la transfección, las células C28/I2 se sembraron en placas de 6 pozos a 2 × 105 células por pozo. Al alcanzar una confluencia del 70%–80%, las transfecciones se realizaron utilizando un reactivo comercial de transfección a base de lípidos según el protocolo del fabricante y los procedimientos establecidos para la entrega de ARN pequeño encondrocitos 24. En resumen, se diluyeron plásmidos (OE-SPRY2 y NC; 2 μg/pozo) y oligonucleótidos (miR-590-5p mimic/inhibidor y siRNAs; 50 nM) en un medio sérico reducido. Los complejos de ADN/ARN lipídico se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de añadirse gota a gota a las células en DMEM sin suero. A las 6 horas de la transfección, el medio fue reemplazado por DMEM completo con un 10% de FBS, y las células se cultivaron durante 48 horas adicionales antes de la extracción de ARN y proteínas.

3. detección qPCR

El ARN total y el miARN se aislaron utilizando un kit dedicado de extracción de miARN según el protocolo del fabricante. La pureza y concentración de ARN se evaluaron utilizando un espectrofotómetro UV-Vis, y se utilizaron muestras con proporciones A260/A280 de 1,8–2,0 para análisis posteriores. Se utilizaron reactivos comerciales de transcripción inversa para sintetizar ADNc. El procedimiento de ciclo de qPCR fue el siguiente: 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 10 s, 58 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; seguido de un análisis de curva de fusión para verificar la especificidad del cebador y la ausencia de dímeros cebadores. β-actina y U6 sirvieron como controles internos para el ARNm y el miARN, respectivamente. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2-ΔΔCt 25. Todas las secuencias de cebadores, incluidas las de Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p y genes de referencia, están listadas en la Tabla 1.

Nombre de la guía Cebador hacia adelante (5′-3′)Imprimación inversa (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGCGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actinaTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCCCCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACACCATAAAAAGG
Bcl-2TGGGATTCCTGCGGATTGACTCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1TCCCGTGGAATGGAATGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTCTG
LC3-IICATCCAACCAAAATCCCGGTGAGCTGTAAGCGCCCCTTTTAA

Tabla 1: Secuencias de cebadores utilizadas para el análisis cuantitativo de PCR (qPCR). Secuencias de cebadores directos y inversos usados para la amplificación y cuantificación de transcritos objetivo y controles internos de referencia mediante qPCR.

Salvo que se especifique lo contrario, los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc S-N-K. Los símbolos indican: *P < 0,05 vs. Control; #P < 0,05 frente al modelo indicado o al grupo de control negativo; &P < 0,05 vs. OA+Inhibidor-NC.

4. Detección de manchas occidentales

Las células se extrajeron y lisaron utilizando un tampón RIPA suplementado con cócteles de proteasa y inhibidores de fosfatasa, siguiendo procedimientos establecidos de extracción proteica e inmunobloting. Tras la centrifugación a 14.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para eliminar restos celulares, se recogió el sobrenadante y se cuantificaron las concentraciones de proteínas utilizando un kit de análisis de proteínas BCA. Cantidades iguales de lisato proteico (30 μg) se desnaturalizaron, se resolvieron con SDS-PAGE durante 1,5 horas y se transfirieron a las membranas de PVDF a 300 mA durante 1,5 horas26. Las membranas se bloquearon con leche seca desnatada al 5% en solución salina con Tris-buffer que contenía 0,1% Tween 20 (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguida de incubación a 4 °C durante 16 horas con anticuerpos primarios específicos (por ejemplo, anti-SPRY2, dilución 1:1000). Tras tres lavados en TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados a temperatura ambiente durante 2 horas. Las bandas proteicas se visualizaron mediante un sistema de detección ECL y se cuantificaron con el software ImageJ.

5. Análisis estadístico

Los datos se analizaron utilizando software de análisis estadístico. Todos los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas independientes (n ≥ 3), y los datos cuantitativos se presentan como la media ± desviación estándar (DS). Antes de las pruebas paramétricas, la normalidad de los datos se evaluaba mediante la prueba de Shapiro-Wilk y se evaluaba la homogeneidad de la varianza. La significación estadística entre múltiples grupos se evaluó mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Student-Newman-Keuls (S-N-K) para comparaciones múltiples. Se consideró estadísticamente significativo un P < 0,05.

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Resultados

Establecimiento del modelo inflamatorio de condrocitos in vitro

Para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la patología de la osteoartritis, se estableció un modelo inflamatorio in vitro utilizando condrocitos humanos C28/I2 estimulados con IL-1β. La validez de este modelo se confirmó evaluando la expresión de la cadena alfa 1 tipo II de colágeno (Col-II), un componente principal de la matriz extracelular del cartílago h...

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Discusión

Estudios previos han demostrado que los miARNs regulan la autofagia en múltiples etapas, incluyendo iniciación, elongación de vesículas ymaduración 27. La implicación de los miARN en la patogénesis de la AO ha sido cada vez más documentada, especialmente a través de efectos sobre la inflamación, la apoptosis, la remodelación de la matriz extracelular y las vías relacionadas con la autofagia. MiR-590-5p ha sido vinculado a la homeostasis celular y a procesos asocia...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Departamento de Geriatría del Hospital Ruikang, Universidad de Medicina China de Guangxi, por proporcionar instalaciones experimentales y apoyo técnico para este estudio. Los autores también agradecen al personal del laboratorio y a sus colegas su ayuda en la recopilación y análisis de datos. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Investigación en Ciencias Naturales de la Universidad de Medicina China de Guangxi (Subvención nº 2022MS039; LncRNA-GAS5 media la expresión de SPRY2 para inhibir la autofagia en condrocitos OA de rodilla de ratón: estudio del mecanismo y efecto de intervención temprana de la receta Huayu Qushi) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Fundación Regional) (Subvención nº 82160912; Discusión sobre el mecanismo sobre la ubiquitinación de Skp2, la degradación de FoxO1, la inhibición de la autofagia de condrocitos OA de rodilla y el efecto de intervención temprana de Huayu Qushi.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anti-β-actin antibodyProteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Control interno de carga para análisis de Western blot
Anti-SPRY2 antibodyProteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324Detección de la expresión de la proteína SPRY2
Kit de ensayo de proteína BCAThermo Fisher Scientific23225Determinación de la concentración total de proteínas
Línea celular de condrocitos humanos C28/I2PunocelCP-H107Modelo de condrocitos in vitro para estudios de osteoartritis
DMEM completoKeyGen BiotecKGM12800SMedio basal para cultivo celular de rutina
Kit de extracción de miRNA ultrapuro CWBIOCWBIOCW0627SAislamiento de ARN total y miRNA
Sistema de detección ECLThermo Fisher Scientific32106Visualización quimioluminiscente de bandas de proteínas
Suero bovino fetal (FBS)Gibco1891605Suplemento de crecimiento para cultivo celular
GraphPad Prism versión 9.0GraphPad SoftwareN/AAnálisis estadístico y generación de gráficos
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01Transcripción inversa de ARNm a ADNc
Software ImageJInstitutos Nacionales de SaludN/ACuantificación de la intensidad de las bandas de Western blot
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015Transfección de plásmidos y oligonucleótidos
Mímico, inhibidor y NCs de miR-590-5pRiboBioSintética personalizadoModulación de la expresión de miR-590-5p
Kit de síntesis de ADNc de cadena sencilla de miRNAVazymeMR101-02Transcripción inversa de miRNA a ADNc
Medio Opti-MEMGibco31985-062Preparación de complejos de transfección
Penicilina-estreptomicinaGibco15140122Prevención de contaminación bacteriana en cultivo celular
Cócteles de inhibidores de proteasas y fosfatasasMedChemExpressHY-K0010Protección de proteínas durante la extracción
Membranas de PVDFMillipore SigmaISEQ00010Membrana de transferencia de proteínas para inmunoblot
IL-1β humano recombinanteMedChemExpressHY-P78459Inducción de condiciones inflamatorias tipo OA
Buffer RIPABeyotimeP0013BLisi celular y extracción de proteínas
Construcciones si-SPRY2 y si-NCGenePharmaSintética personalizadoSilenciamiento de la expresión de SPRY2
Plásmido de sobreexpresión de SPRY2 (OE) y vector vacío (NC)GeneChemConstrucción personalizadaEvaluación de los efectos de la sobreexpresión de SPRY2
Espectrófotometro UV-VIS (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000Medición de la concentración y pureza del ARN

Referencias

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MedicinaNúmero 233Número 233Valor vacíoNúmerocélulas C28/I2modelo humano de osteoartritis (OA)miRNA-590-5pBeclin-1LC3IIBcl-2
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