Efectos de la regulación de la expresión de SPRY2 y miR-590-5p en la autofagia en condrocitos modelo de osteoartritis humana

Resumen

El estrés inflamatorio en un modelo de condrocitos C28/I2 inducido por IL-1β aumentó la miR-590-5p y redujo la expresión de SPRY2. La modulación de este eje alteró la expresión de Beclin-1, LC3-II y Bcl-2, sugiriendo una posible vía reguladora miR-590-5p/SPRY2 que podría influir en las respuestas asociadas a la autofagia y la supervivencia de los condrocitos en la osteoartritis.

Resumen

La osteoartritis (OA) es una enfermedad degenerativa articular prevalente caracterizada por la destrucción progresiva del cartílago y la pérdida de la homeostasis de los condrocitos. Aunque la autofagia desregulada contribuye a la patogénesis de la artrosis, los mecanismos moleculares que rigen las respuestas asociadas a la autofagia en los condrocitos siguen siendo incompletamente comprendidos. Este estudio investigó el papel del eje regulador miR-590-5p/SPRY2 en un microambiente inflamatorio de OA utilizando condrocitos humanos C28/I2 inducidos por IL-1β. Se estableció un modelo de OA in vitro tratando células C28/I2 con IL-1β. La expresión de miR-590-5p y SPRY2 se evaluó mediante PCR cuantitativa y Western bloting. Se emplearon enfoques de ganancia y pérdida de función para evaluar los efectos de SPRY2 y miR-590-5p sobre los marcadores asociados a la autofagia Beclin-1 y LC3-II, así como sobre la proteína relacionada con la supervivencia Bcl-2. Se utilizaron análisis bioinformáticos y experimentos de rescate para investigar la relación regulatoria entre miR-590-5p y SPRY2. El tratamiento con IL-1β aumentó significativamente la expresión de miR-590-5p mientras reducía los niveles de ARNm y proteínas SPRY2 (P < 0,05). La sobreexpresión de SPRY2 disminuyó notablemente la expresión de Beclin-1 y LC3-II, con reducciones de aproximadamente un 65% y 77%, respectivamente (P < 0,05). En cambio, la sobreexpresión de miR-590-5p aumentó la expresión de Beclin-1, LC3-II y Bcl-2, mientras que la inhibición de miR-590-5p revirtió estos efectos y restauró la expresión de SPRY2. Los análisis funcionales apoyaron a SPRY2 como un objetivo regulatorio posterior posible de miR-590-5p. Estos hallazgos identifican el eje miR-590-5p/SPRY2 como un regulador importante de la expresión de marcadores asociados a la autofagia y la supervivencia de los condrocitos en condiciones inflamatorias, y sugieren su posible relevancia como objetivo terapéutico en la artrosis.

Introducción

Como la forma de artritis más prevalente en todo el mundo, la osteoartritis (OA) es una de las principales causas de dolor, discapacidad de movilidad y discapacidad física, imponiendo una carga considerable para los sistemas sanitarios y la^sociedad. Patológicamente, la artrosis se caracteriza por una degeneración progresiva del cartílago articular, inflamación sinovial y remodelación patológica del hueso^{subcondral 1}. Las estimaciones epidemiológicas indican que aproximadamente 303 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la OA, y se espera que esta cifra aumente con el envejecimiento de la población y el aumento de las tasas de obesidad². En China, se estima que la prevalencia de la artrosis sintomática de la rodilla es del 8,1%, con una prevalencia desproporcionadamente mayor entre mujeres y poblaciones^{rurales 3}. A pesar de su alta prevalencia, las opciones de tratamiento actuales siguen estando limitadas en gran medida al manejo de los síntomas mediante antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) e intervención quirúrgica para la enfermedad^{avanzada 4}. La ausencia de fármacos modificadores de la osteoartritis (DMOADs) refleja una comprensión incompleta de los mecanismos moleculares que regulan la homeostasis y supervivencia de los^{condrocitos 5}.

La integridad estructural y funcional del cartílago articular depende de los condrocitos residentes, que mantienen el recambio de la matriz extracelular (MEC) mediante un equilibrio entre actividades anabólicas y^{catabólicas 6}. Durante la progresión de la OA, los condrocitos están expuestos a un estrés mecánico anormal y a mediadores proinflamatorios, en particular la interleucina-1β (IL-1 β) y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), que promueven un cambio de la síntesis matricial a la degradación de^{la matriz 6}. Laβ IL-1 contribuye a la destrucción del cartílago estimulando la producción de metaloproteinasas de matriz (MMPs) y aggrecanasas, mientras suprime la síntesis de colágeno tipo II y^{proteoglicanos 7}. Además, laβ IL-1 induce estrés oxidativo y disfunción mitocondrial, lo que conduce a la apoptosis de los condrocitos y la^{senescencia 8}. Por consiguiente, identificar vías de señalización intracelular que regulen la supervivencia de los condrocitos en condiciones inflamatorias sigue siendo una prioridad para la investigación en la OA.

La autofagia es una vía evolutiva de degradación lisosomal conservada que mantiene la homeostasis celular mediante la eliminación y reciclaje de orgánulos dañados y agregados^{proteicos 9}. La autofagia basal es esencial para la supervivencia celular y el equilibrio energético; sin embargo, la autofagia desregulada puede contribuir a la progresión de la^{enfermedad 9}. En la artrosis, la autofagia se considera generalmente una respuesta protectora que ayuda a los condrocitos a adaptarse al estrés celular y resistir la^{apoptosis 10}. Estudios previos han sugerido que la actividad autofágica disminuye durante la progresión de la artrosis, especialmente en enfermedades en estadio avanzado, lo que resulta en un control de calidad celular deteriorado y un aumento de la pérdida de^condrocitos. Varias proteínas se utilizan comúnmente como indicadores de la actividad asociada a la autofagia. Beclin-1 participa en la iniciación del autofagosoma, mientras que la conversión de la cadena ligera 3 de la proteína 1 asociada a microtúbulos (LC3-I a LC3-II) se utiliza ampliamente como marcador de la formación de^{autofagosomas 12}. En cambio, el linfoma de células B 2 (Bcl-2) inhibe la autofagia dependiente de Beclin-1 mientras ejerce efectos^{antiapoptóticos 13}. No obstante, la interpretación de los marcadores asociados a la autofagia requiere precaución porque las mediciones estáticas de LC3-II y Beclin-1 no pueden distinguir de forma independiente la formación aumentada de autofagosomas de la degradación lisosomal deteriorada. A pesar de estas limitaciones, la modulación de las vías relacionadas con la autofagia sigue siendo una estrategia terapéutica prometedora para la OA.

Los microARN (miARN) son ARN cortos y no codificantes que regulan la expresión génica post-transcripcionalmente uniéndose a secuencias complementarias dentro de las regiones 3′-no traducidas (3′-UTRs) de los ARN mensajeros objetivo, lo que resulta en la degradación del ARNm o represión^{traslacional 14}. La expresión aberrante de miARN se ha implicado en la patogénesis de la AO mediante efectos sobre inflamación, apoptosis y remodelación de la^{ECM 15}. Entre estas moléculas, el miR-590-5p ha llamado la atención debido a sus funciones reguladoras en el metabolismo óseo y otros procesos patológicos. Estudios previos han demostrado que miR-590-5p promueve la diferenciación osteogénica y suprime la adipogénesis en las células madre^{mesenquimales 16}. En modelos de cáncer, miR-590-5p presenta funciones dependientes del contexto como regulador oncogénico o supresor^{tumoral 17}. Además, los perfiles alterados de expresión de microARN, incluidos miembros de la familia miR-590, han estado implicados en la remodelación patológica de tejidos articulares durante la^{OA 18}. Sin embargo, la evidencia obtenida de modelos de células madre o cáncer no puede extrapolarse directamente a condrocitos articulares maduros. Por lo tanto, el papel de miR-590-5p en la regulación de las respuestas de los condrocitos dentro del microambiente inflamatorio de la OA sigue siendo incompletamente comprendido.

Para investigar los posibles mecanismos aguas abajo del miR-590-5p en la OA, se realizaron análisis de predicción de objetivos in silico , identificando a Sproverby2 (SPRY2) como un posible objetivo aguas abajo. SPRY2 pertenece a la familia de proteínas Sprouty, que regulan negativamente la señalización de tirosina quinasa receptora y suprimen la activación de la vía RAS/MAPK/^{ERK 19}. Dado que la señalización MAPK influye en la diferenciación de condrocitos, respuestas inflamatorias y autofagia, SPRY2 puede representar un nodo regulador importante en la fisiopatología de la^{AO 20}. Estudios previos indican que SPRY2 puede suprimir respuestas inflamatorias en modelos de artritis^{reumatoide 21}, participar en la regulación relacionada con la apoptosis en sistemas^{epiteliales 22}, y estar asociado con respuestas relacionadas con la autofagia en modelos de lesión^{isquémica 23}. Aunque estas observaciones sugieren que SPRY2 participa en la regulación tanto de la apoptosis como de la autofagia, su papel en los condrocitos articulares sigue siendo poco caracterizado. Por ello, se planteó la hipótesis de que miR-590-5p y SPRY2 forman un eje regulador que influye en la supervivencia de los condrocitos bajo estrés inflamatorio.

Basándose en estas observaciones, se propuso que miR-590-5p modula las respuestas asociadas a la autofagia en los condrocitos regulando la expresión de SPRY2. Aunque miR-590-5p y SPRY2 se han estudiado individualmente en otros contextos biológicos, no se ha establecido su relación funcional en los condrocitos OA. En el presente estudio, se utilizó un modelo de OA inducido por IL-1β en condrocitos humanos C28/I2 para examinar los patrones de expresión de miR-590-5p y SPRY2 y para evaluar sus efectos en la expresión de Beclin-1, LC3-II y Bcl-2. Al investigar el eje regulador miR-590-5p/SPRY2, este estudio proporciona información sobre los mecanismos epigenéticos subyacentes a la supervivencia de los condrocitos e identifica un posible objetivo terapéutico para la artrositis.

Protocolo

Este estudio se realizó exclusivamente utilizando la línea celular de condrocitos humanos C28/I2, disponible comercialmente. No participaron participantes humanos, muestras de tejido humano, materiales derivados de pacientes ni animales vivos en esta investigación. Por lo tanto, no se requería la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) ni la aprobación del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales. Las herramientas, productos químicos, kits y reactivos utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Construcción de modelos de cultivo celular y OA

La línea celular de condrocitos humanos C28/I2 (detalles proporcionados en la Tabla de Materiales) fue obtenida de un proveedor comercial. Para garantizar la reproducibilidad experimental, las células fueron autenticadas mediante perfilado de repeticiones cortas en tándem (STR) y probadas rutinariamente para confirmar la ausencia de contaminación por micoplasmas. Se utilizaron células entre los pasajes 3 y 8 para todos los experimentos. Las células se mantuvieron en DMEM suplementadas con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (todos los reactivos de cultivo se detallan en la Tabla de Materiales) a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO₂.

Para establecer el modelo in vitro de osteoartritis (OA), las células C28/I2 fueron estimuladas con IL-1β humano recombinante. Basándose en la literatura^{establecida 6,7}, experimentos preliminares de optimización dosis-respuesta diseñados para inducir un estado catabólico robusto sin citotoxicidad inmediata excesiva, las células fueron tratadas con 20 ng/mL de IL-1β durante 24 horas.

2. Agrupación experimental y transfección

Para esclarecer las vías mecanicistas, el estudio se dividió en tres módulos experimentales principales, cada uno con un mínimo de tres réplicas biológicas independientes:

1. Ganancia/pérdida de función SPRY2:
   Las células se asignaron a Control, modelo OA, OA + vector vacío (NC), OA + plásmido de sobreexpresión SPRY2 (OE-SPRY2), y pequeños grupos de ARN interferentes correspondientes (si-NC y tres constructos específicos si-SPRY2: si-695, si-800, si-896) para detectar la eficiencia de interferencia.
2. Modulación miR-590-5p:
   Las células se dividieron en grupos de control, modelo OA, OA + mimetismo NC, OA + miR-590-5p mimetético, OA + inhibidor NC y OA + miR-590-5p inhibidores.
3. Validación funcional de la relación regulatoria miR-590-5p/SPRY2:
   Para evaluar más a fondo la relación reguladora propuesta entre miR-590-5p y SPRY2, se sometieron células a condiciones miMómicas e inhibidoras de miR-590-5p para determinar si la modulación miR-590-5p alteraba la expresión de SPRY2 en el modelo de AAO.
   Para la transfección, las células C28/I2 se sembraron en placas de 6 pozos a 2 × 10^{5 células} por pozo. Al alcanzar una confluencia del 70%–80%, las transfecciones se realizaron utilizando un reactivo comercial de transfección a base de lípidos según el protocolo del fabricante y los procedimientos establecidos para la entrega de ARN pequeño en^{condrocitos 24}. En resumen, se diluyeron plásmidos (OE-SPRY2 y NC; 2 μg/pozo) y oligonucleótidos (miR-590-5p mimic/inhibidor y siRNAs; 50 nM) en un medio sérico reducido. Los complejos de ADN/ARN lipídico se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de añadirse gota a gota a las células en DMEM sin suero. A las 6 horas de la transfección, el medio fue reemplazado por DMEM completo con un 10% de FBS, y las células se cultivaron durante 48 horas adicionales antes de la extracción de ARN y proteínas.

3. detección qPCR

El ARN total y el miARN se aislaron utilizando un kit dedicado de extracción de miARN según el protocolo del fabricante. La pureza y concentración de ARN se evaluaron utilizando un espectrofotómetro UV-Vis, y se utilizaron muestras con proporciones A260/A280 de 1,8–2,0 para análisis posteriores. Se utilizaron reactivos comerciales de transcripción inversa para sintetizar ADNc. El procedimiento de ciclo de qPCR fue el siguiente: 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 10 s, 58 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; seguido de un análisis de curva de fusión para verificar la especificidad del cebador y la ausencia de dímeros cebadores. β-actina y U6 sirvieron como controles internos para el ARNm y el miARN, respectivamente. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método ^{2-ΔΔCt 25}. Todas las secuencias de cebadores, incluidas las de Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p y genes de referencia, están listadas en la Tabla 1.

Nombre de la guía	Cebador hacia adelante (5′-3′)	Imprimación inversa (5′-3′)
U6	ATTGGAACGATACAGAAGATT	GGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5p	GCGTAAGGCACGCGGTG	AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actina	TGGCACCCAGCACAATGAA	CTAAGTCATAGTCCCCCCTAGAAGCA
SPRY2	TAAGCCACTGAGCAAGGAAGAT	TGGAAGGTAACACCATAAAAAGG
Bcl-2	TGGGATTCCTGCGGATTGAC	TCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1	TCCCGTGGAATGGAATGAATGAGA	GTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTCTG
LC3-II	CATCCAACCAAAATCCCGGT	GAGCTGTAAGCGCCCCTTTTAA

Tabla 1: Secuencias de cebadores utilizadas para el análisis cuantitativo de PCR (qPCR). Secuencias de cebadores directos y inversos usados para la amplificación y cuantificación de transcritos objetivo y controles internos de referencia mediante qPCR.

Salvo que se especifique lo contrario, los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc S-N-K. Los símbolos indican: *P < 0,05 vs. Control; #P < 0,05 frente al modelo indicado o al grupo de control negativo; &P < 0,05 vs. OA+Inhibidor-NC.

4. Detección de manchas occidentales

Las células se extrajeron y lisaron utilizando un tampón RIPA suplementado con cócteles de proteasa y inhibidores de fosfatasa, siguiendo procedimientos establecidos de extracción proteica e inmunobloting. Tras la centrifugación a 14.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para eliminar restos celulares, se recogió el sobrenadante y se cuantificaron las concentraciones de proteínas utilizando un kit de análisis de proteínas BCA. Cantidades iguales de lisato proteico (30 μg) se desnaturalizaron, se resolvieron con SDS-PAGE durante 1,5 horas y se transfirieron a las membranas de PVDF a 300 mA durante 1,5 horas²⁶. Las membranas se bloquearon con leche seca desnatada al 5% en solución salina con Tris-buffer que contenía 0,1% Tween 20 (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguida de incubación a 4 °C durante 16 horas con anticuerpos primarios específicos (por ejemplo, anti-SPRY2, dilución 1:1000). Tras tres lavados en TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados a temperatura ambiente durante 2 horas. Las bandas proteicas se visualizaron mediante un sistema de detección ECL y se cuantificaron con el software ImageJ.

5. Análisis estadístico

Los datos se analizaron utilizando software de análisis estadístico. Todos los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas independientes (n ≥ 3), y los datos cuantitativos se presentan como la media ± desviación estándar (DS). Antes de las pruebas paramétricas, la normalidad de los datos se evaluaba mediante la prueba de Shapiro-Wilk y se evaluaba la homogeneidad de la varianza. La significación estadística entre múltiples grupos se evaluó mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Student-Newman-Keuls (S-N-K) para comparaciones múltiples. Se consideró estadísticamente significativo un P < 0,05.

Resultados

Establecimiento del modelo inflamatorio de condrocitos in vitro

Para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la patología de la osteoartritis, se estableció un modelo inflamatorio in vitro utilizando condrocitos humanos C28/I2 estimulados con IL-1β. La validez de este modelo se confirmó evaluando la expresión de la cadena alfa 1 tipo II de colágeno (Col-II), un componente principal de la matriz extracelular del cartílago hialino y un sello distintivo de los condrocitos sanos. El análisis cuantitativo reveló que la exposición a IL-1β condujo a una reducción estadísticamente significativa en la expresión de ARNm de Col-II en relación con el grupo de control. Esta alteración fenotípica indica un cambio inicial hacia un estado catabólico similar al microambiente osteoartrítico, proporcionando así un modelo fundamental para estudios mecanicistas posteriores (Figura 1).

Figura 1: Establecimiento del modelo in vitro de osteoartritis (OA) en condrocitos humanos C28/I2. Las células fueron tratadas con 20 ng/mL de IL-1β durante 24 horas. La expresión relativa de ARNm de Col-II se determinó mediante qPCR, con β-actina como control de normalización. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DS) de tres réplicas biológicas independientes (n = 3). El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional. *P < 0,05 comparado con el grupo de control. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Validación de la eficiencia de sobreexpresión de SPRY2 en células C28/I2

Antes de evaluar el papel funcional de Sproty2 (SPRY2) en este modelo, se verificó la eficiencia de transfección del vector de sobreexpresión SPRY2. Los condrocitos fueron transfectados con el plásmido de sobreexpresión (OE) o con un vector vacío de control negativo (NC). Tanto los análisis qPCR como los Western blot mostraron una regulación alcista robusta de SPRY2 en los niveles de ARNm y proteínas en el grupo OE en comparación con los grupos NC y control no tratados. Estos datos, presentados en la Figura 2, confirman que el sistema experimental mantuvo niveles elevados de SPRY2, lo que permitió investigar sus efectos biológicos específicos.

Figura 2: Validación de la sobreexpresión de SPRY2 en condrocitos C28/I2. Las células fueron transfectadas con un vector vacío (NC) o un plásmido de sobreexpresión SPRY2 (OE). Los niveles relativos de ARNm y proteínas de SPRY2 se evaluaron mediante qPCR y Western blot, respectivamente. La β-actina se utilizaba como control interno de carga. Los datos se expresan como la media ± DE (n = 3). *P < 0,05 comparado con el grupo NC. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La sobreexpresión de SPRY2 atenúa la autofagia y modula los marcadores de apoptosis en condiciones inflamatorias

Experimentos posteriores intentaron determinar si SPRY2 funciona como regulador de la autofagia y la apoptosis en el contexto inflamatorio. Tras el establecimiento del modelo de OA, el tratamiento con IL-1β por sí solo indujo un aumento notable de los marcadores de autofagia Beclin-1 y LC3-II, lo que sugiere una respuesta autofágica compensatoria al estrés inflamatorio. Simultáneamente, la expresión de Bcl-2 se elevó en el grupo modelo. Sin embargo, la introducción del vector de sobreexpresión SPRY2 alteró significativamente este perfil. Como se muestra en la Figura 3, el grupo Model+OE-SPRY2 mostró una reducción significativa tanto en los niveles de ARNm de Beclin-1 como de LC3-II en comparación con los grupos Model y Model+NC. Además, la sobreexpresión de SPRY2 atenuó la elevación de Bcl-2 inducida por inflamación. Estos hallazgos sugieren que SPRY2 regula negativamente la expresión de marcadores asociados a la autofagia en los condrocitos inflamatorios.

Figura 3: La sobreexpresión de SPRY2 atenúa la autofagia y modula los marcadores de apoptosis bajo condiciones inflamatorias inducidas por IL-1β. Los niveles relativos de expresión de ARNm de SPRY2, Bcl-2, Beclin-1 y LC3-II fueron cuantificados mediante qPCR en los grupos de control, modelo (tratado con IL-1β), Model+NC y Model+OE-SPRY2. β-actina actuaba como control interno. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc S-N-K. *P < 0,05 comparado con el grupo de control; #P < 0,05 comparado con el grupo Modelo+NC. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

miR-590-5p regula al alza los marcadores asociados a la autofagia y promueve la supervivencia de los condrocitos

A continuación, se investigó el impacto funcional de miR-590-5p en marcadores asociados a la autofagia y relacionados con la supervivencia. Como se muestra en la Figura 4, la transfección con un miM-590-5p mimetizado en el modelo de OA aumentó significativamente la expresión de Bcl-2, Beclin-1 y LC3-II, en contraste con los efectos inhibitorios observados tras la sobreexpresión de SPRY2. Por el contrario, la inhibición de miR-590-5p redujo notablemente la expresión de Bcl-2 y Beclin-1, mientras que la reducción de LC3-II no alcanzó la significación estadística. Estos resultados sugieren que el miR-590-5p aumenta la expresión de marcadores asociados a la autofagia y Bcl-2 relacionado con la supervivencia en los condrocitos, lo que justifica una investigación más profunda sobre sus posibles objetivos regulatorios posteriores.

Figura 4: miR-590-5p incrementa la expresión de marcadores asociados a la autofagia y la expresión de Bcl-2 relacionada con la supervivencia. Los niveles relativos de expresión de ARNm de Bcl-2, Beclin-1 y LC3-II se midieron mediante qPCR en el modelo de OA tras la transfección con un miM-590-5p imitador, inhibidor o sus respectivos controles negativos (NC). β-actina sirvió como control de normalización. Los datos se muestran como la media ± DE (n = 3). *P < 0,05 comparado con el grupo Modelo+Mimic-NC; #P < 0,05 comparado con el grupo Model+Inhibitor-NC (para Bcl-2 y Beclin-1). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

IL-1β modula el eje miR-590-5p/SPRY2 y la expresión del marcador asociado a la autofagia

Para esclarecer los mecanismos regulatorios aguas arriba que controlan SPRY2 y su relación con miR-590-5p, se examinaron sus perfiles de expresión en condiciones inflamatorias. Tras la observación morfológica del modelo celular C28/I2 inducido por IL-1β (Figura 5A), se verificaron las eficiencias de transfección para la manipulación genética SPRY2. Tanto los análisis qPCR como los análisis de Western blot confirmaron una regulación alcista robusta de SPRY2 en el grupo de sobreexpresión (OE) y un knockdown exitoso en los grupos de ARN interferente pequeño (siRNA) en comparación con sus respectivos controles (Figuras 5B y 5C). Por el contrario, los niveles de miR-590-5p se incrementaron significativamente tras el tratamiento con IL-1β.

Figura 5: Observación morfológica y validación de las eficiencias de transfección SPRY2. (A) Observación morfológica de células C28/I2 tras tratamiento con IL-1β (20×, micrografía de contraste de fase). (B) Niveles relativos de expresión de ARNm y proteínas de SPRY2 en grupos de control, NC y sobreexpresión (OE) de SPRY2. (C) Imágenes representativas de Western blot que confirman la sobreexpresión de SPRY2 (izquierda) y el knockdown de SPRY2 por siRNAs específicos (si-896, si-800, si-695) en comparación con los controles (derecha). β-actina servía como control interno de carga. Los datos se expresan como la media ± DS (n = 3). *P < 0,05 comparado con el grupo de control. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Para determinar si este patrón inverso de expresión reflejaba una posible relación reguladora, se utilizó TargetScan Human 7.1 para identificar un sitio de unión potencial de 8 millones para has-miR-590-5p dentro del 3′-UTR de SPRY2 humano (nucleótidos 236–243). El alineamiento de secuencias en la Figura 6 ilustra la complementariedad predicha entre región semilla y región. Posteriormente se realizaron experimentos de rescate para examinar funcionalmente si la modulación de miR-590-5p alteró la expresión de SPRY2 en el modelo de AA. Tras confirmar las eficiencias de transfección del miMömet e inhibidor de miR-590-5p (Figuras 7A, B), los ensayos de rescate mostraron que la inhibición de miR-590-5p revirtió la supresión asociada a la OA de la expresión de ARNm SPRY2 (Figura 7C). El miMömetismo de miR-590-5p no redujo aún más la expresión de SPRY2 más allá de la marcada supresión inducida por IL-1β, mientras que la inhibición de miR-590-5p aumentó significativamente la expresión de SPRY2 en relación con el control inhibidor negativo. Estos hallazgos apoyan una relación regulatoria inversa y supuesta entre miR-590-5p y SPRY2 en condrocitos inflamatorios.

Figura 6: Predicción in silico de la supuesta interacción regulatoria miR-590-5p/SPRY2. Se realizó un análisis bioinformático utilizando TargetScan Human 7.1^31,32 para identificar sitios de unión a posibles miARN. El esquema ilustra la alineación de secuencias predicha y la complementariedad de la región semilla entre has-miR-590-5p y el 3′-UTR del SPRY2 humano (nucleótidos 236–243). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Efectos de la modulación de miR-590-5p sobre la expresión de SPRY2 en condrocitos. Las eficiencias de transfección se confirmaron mediante qPCR para el miR-590-5p mimic (A) e inhibidor (B) en relación con sus respectivos controles. (C) Se midió la expresión relativa de ARNm SPRY2 entre los grupos experimentales indicados tras la modulación de miR-590-5p en el modelo OA. U6 y β-actina se utilizaron como controles internos para la cuantificación de miARN y ARNm, respectivamente. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3). *P < 0,05 comparado con el grupo de control; #P < 0,05 en comparación con el respectivo grupo Mimic-NC o Inhibidor-NC; &P < 0,05 en comparación con el grupo OA+Inhibidor-NC. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

En coherencia con los resultados de la Figura 4, los cambios en los marcadores asociados a la autofagia fueron paralelos a los efectos esperados por una reducción de la expresión de SPRY2, lo que sugiere que miR-590-5p podría mejorar su expresión al aliviar la inhibición mediada por SPRY2. En conjunto, estos hallazgos apoyan un eje de señalización potencial en el que IL-1β regula al alza la miR-590-5p, la miR-590-5p suprime la expresión de SPRY2 y la reducción de SPRY2 se asocia con un aumento de la expresión de marcadores de Beclin-1 y LC3-II.

DISPONIBILIDAD DE DATOS:

Los datos de este estudio se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

Archivo suplementario 1: Los conjuntos de datos utilizados para este estudio, incluyendo datos fuente de qPCR, imágenes fuente de Western blot y resultados de análisis estadístico.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Estudios previos han demostrado que los miARNs regulan la autofagia en múltiples etapas, incluyendo iniciación, elongación de vesículas y^{maduración 27}. La implicación de los miARN en la patogénesis de la AO ha sido cada vez más documentada, especialmente a través de efectos sobre la inflamación, la apoptosis, la remodelación de la matriz extracelular y las vías relacionadas con la autofagia. MiR-590-5p ha sido vinculado a la homeostasis celular y a procesos asociados al^cáncer 28,29,30. En contextos esqueléticos y relacionados con el cartílago, se ha reportado que miR-590-5p promueve la diferenciación condrogénica de células madre mesenquimales humanas 16, mientras que en modelos de condrocitos OA puede regular la proliferación, la apoptosis y las respuestas inflamatorias dirigiéndose a^{FGF 18,24}. Sin embargo, sigue sin estar claro si miR-590-5p afecta a las respuestas relacionadas con la autofagia en los condrocitos de la OA.

Por ello, RNAInter y TargetScan se utilizaron para explorar posibles mediadores posteriores, y ambos análisis sugirieron SPRY2 como un posible objetivo asociado al miR-590-5p. TargetScan Human 7.1^31,32 identificó un sitio de unión predicho de 8 mers en la región semilla en los nucleótidos 236–243 del SPRY2 3′-UTR (Figura 6). SPRY2 es un regulador negativo de la señalización receptora tirosina quinasa/MAPK y se expresa en múltiples^{tejidos 19}. Se ha reportado que la transferencia intraarticular de genes SPRY2 atenua la artritis inducida por adyuvante en^{ratas 21}. La sobreexpresión de SPRY2 puede inhibir el crecimiento, invasión, migración y citocinesis celular mediados por HGF/^SF, mientras que la pérdida de la función de Spry2 se ha asociado con la hiperactivación de MAPK-ERK y el aumento de la proliferación de células^{B 34}. SPRY2 también ha sido implicado en la regulación²² relacionada con la apoptosis, el control de migración asociado a^{miARN 35} y las respuestas relacionadas con la autofagia en modelos^{isquémicos 23}. En conjunto, estos estudios apoyan SPRY2 como un nodo regulador que vincula la señalización inflamatoria, las vías relacionadas con la supervivencia y las respuestas asociadas a la autofagia.

Dada la relación previamente no reportada entre miR-590-5p y SPRY2 en condrocitos de OA, la predicción bioinformática de su posible interacción llevó a una investigación experimental adicional. Los resultados actuales mostraron que SPRY2 estuvo significativamente regulado a la baja, mientras que miR-590-5p se subió en los condrocitos C28/I2 estimulados por IL-1β, lo que implica este eje en las respuestas inflamatorias de los condrocitos. Funcionalmente, la sobreexpresión de SPRY2 disminuyó la expresión de Beclin-1 y LC3-II, apoyando un efecto inhibidor sobre la expresión de marcadores asociados a la autofagia. Por el contrario, la inhibición de miR-590-5p redujo la expresión de Beclin-1 y Bcl-2 y restauró la expresión de SPRY2, lo cual es compatible con una relación regulatoria inversa posible. Dado que Bcl-2 puede inhibir la autofagia dependiente de Beclin-1 y también ejercer efectos antiapoptóticos13, la elevación concurrente de Bcl-2 con Beclin-1 y LC3-II debe interpretarse de manera específica para cada contexto. En este modelo inflamatorio de OA, la regulación alcista de Bcl-2 puede reflejar principalmente una respuesta antiapoptótica relacionada con la supervivencia, mientras que el aumento de la expresión de Beclin-1 y LC3-II puede reflejar alivio de la supresión asociada a SPRY2. Estos hallazgos sugieren un modelo en el que miR-590-5p coordina la señalización relacionada con la supervivencia de los condrocitos y la expresión de marcadores de autofagia suprimiendo SPRY2 bajo estrés inflamatorio.

Aunque este estudio aporta valiosas perspectivas mecanicistas sobre el eje miR-590-5p/SPRY2, deben reconocerse varias limitaciones. En primer lugar, todos los experimentos se realizaron en un sistema in vitro 2D utilizando la línea celular inmortalizada C28/I2. Este modelo simplificado no puede recapitular completamente el estrés biomecánico, las interacciones multicelulares y el microambiente inflamatorio del cartílago articular in vivo, limitando la aplicabilidad traslacional inmediata de los hallazgos. En segundo lugar, aunque las predicciones bioinformáticas y los ensayos de rescate apoyan una posible relación reguladora entre miR-590-5p y SPRY2, la ausencia de un ensayo reportero de doble luciferasa impide una confirmación definitiva de la unión física directa entre miR-590-5p y el SPRY2 3′-UTR. En tercer lugar, las mediciones estáticas de Beclin-1 y LC3-II no pueden distinguir el aumento de la formación de autofagosomas de una degradación autolisosomal deteriorada; por lo tanto, futuros estudios deberían evaluar el flujo autofágico utilizando enfoques como el tratamiento con Bafilomicina A1 o ensayos con reporteros fluorescentes en tándem. Los trabajos futuros también deberían incluir un panel más amplio de marcadores fenotípicos de la AA (por ejemplo, MMP13 y ADAMTS5), condrocitos humanos primarios, modelos 3D de explantación de cartílago y modelos in vivo de OA como la desestabilización del menisco medial para evaluar los efectos a largo plazo de la modulación de miR-590-5p y SPRY2.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-β-actin antibody	Proteintech	66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938	Control interno de carga para análisis de Western blot
Anti-SPRY2 antibody	Proteintech	11383-1-AP ; RRID: AB_2196324	Detección de la expresión de la proteína SPRY2
Kit de ensayo de proteína BCA	Thermo Fisher Scientific	23225	Determinación de la concentración total de proteínas
Línea celular de condrocitos humanos C28/I2	Punocel	CP-H107	Modelo de condrocitos in vitro para estudios de osteoartritis
DMEM completo	KeyGen Biotec	KGM12800S	Medio basal para cultivo celular de rutina
Kit de extracción de miRNA ultrapuro CWBIO	CWBIO	CW0627S	Aislamiento de ARN total y miRNA
Sistema de detección ECL	Thermo Fisher Scientific	32106	Visualización quimioluminiscente de bandas de proteínas
Suero bovino fetal (FBS)	Gibco	1891605	Suplemento de crecimiento para cultivo celular
GraphPad Prism versión 9.0	GraphPad Software	N/A	Análisis estadístico y generación de gráficos
HiScript II Q RT SuperMix	Vazyme	R223-01	Transcripción inversa de ARNm a ADNc
Software ImageJ	Institutos Nacionales de Salud	N/A	Cuantificación de la intensidad de las bandas de Western blot
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015	Transfección de plásmidos y oligonucleótidos
Mímico, inhibidor y NCs de miR-590-5p	RiboBio	Sintética personalizado	Modulación de la expresión de miR-590-5p
Kit de síntesis de ADNc de cadena sencilla de miRNA	Vazyme	MR101-02	Transcripción inversa de miRNA a ADNc
Medio Opti-MEM	Gibco	31985-062	Preparación de complejos de transfección
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122	Prevención de contaminación bacteriana en cultivo celular
Cócteles de inhibidores de proteasas y fosfatasas	MedChemExpress	HY-K0010	Protección de proteínas durante la extracción
Membranas de PVDF	Millipore Sigma	ISEQ00010	Membrana de transferencia de proteínas para inmunoblot
IL-1β humano recombinante	MedChemExpress	HY-P78459	Inducción de condiciones inflamatorias tipo OA
Buffer RIPA	Beyotime	P0013B	Lisi celular y extracción de proteínas
Construcciones si-SPRY2 y si-NC	GenePharma	Sintética personalizado	Silenciamiento de la expresión de SPRY2
Plásmido de sobreexpresión de SPRY2 (OE) y vector vacío (NC)	GeneChem	Construcción personalizada	Evaluación de los efectos de la sobreexpresión de SPRY2
Espectrófotometro UV-VIS (NanoDrop 2000)	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Medición de la concentración y pureza del ARN