La emulsión lipídica a base de aceite de oliva mejora la miocarditis inducida por inhibidor de puntos de control inmunitarios mediante la inhibición de la vía NF-κB/NLRP3/IL-1β

Resumen

Las emulsiones lipídicas a base de aceite de oliva mitigan la miocarditis inducida por inhibidores de puntos de control inmunitarios al dirigirse a la vía NF-κB/NLRP3/IL-1β, demostrando su potencial para suprimir cascadas inflamatorias. Estos hallazgos ponen de relieve su potencial como terapia complementaria para lesiones cardíacas relacionadas con el sistema inmunológico.

Resumen

El presente estudio tuvo como objetivo investigar la eficacia terapéutica y el mecanismo subyacente de las emulsiones lipídicas a base de aceite de oliva (OOLE) para mitigar la miocarditis inducida por inhibidores de puntos de control inmunitarios (ICI) desencadenada por ipilimumab (IPI) y nivolumab (NIVO). Se estableció un modelo in vitro de cardiomiocitos inflamatorios mediante el co-cultivo de células HL-1 con células T CD4⁺/CD8⁺ aisladas de ratones tratados con ICI. Las células fueron tratadas con OOLE al 10%, seguidas de citometría de flujo para apoptosis, ELISA para perfilado de citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-6) y Western blot/qPCR para análisis de vías (NF-κB, NLRP3, IL-1β). In vivo, la miocarditis fue inducida en ratones mediante administración de IPI/NIVO (IPI/NIVO por vía de nacimiento). La función cardíaca se evaluó mediante ecocardiografía y se evaluaron marcadores inflamatorios en el tejido sérico y miocárdico. Los resultados mostraron que OOLE redujo significativamente la apoptosis inducida por células T y suprimió la producción de citocinas inflamatorias en células HL-1, mientras que la expresión de NF-κB, NLRP3 e IL-1β se reguló a la baja. In vivo, OOLE mejoró los parámetros funcionales del ventrículo izquierdo y atenuó la inflamación sistémica. Los análisis moleculares confirmaron que estos efectos protectores estaban mediados por la inhibición del eje de señalización NF-κB/NLRP3/IL-1β. En conclusión, OOLE mitiga la miocarditis aguda inducida por ICI al dirigirse a la vía NF-κB/NLRP3/IL-1β, demostrando su potencial para suprimir cascadas inflamatorias tempranas y proporcionar una cardioprotección rápida. Estos hallazgos ponen de relieve su potencial como terapia complementaria para lesiones cardíacas relacionadas con el sistema inmunológico.

Introducción

Los inhibidores de puntos de control inmunitarios (ICI), como los que apuntan a la muerte celular programada 1 (PD-1) y la proteína citotóxica asociada a linfocitos T 4 (CTLA-4), han revolucionado el panorama del tratamiento para diversas malignidades. Sin embargo, la aplicación clínica generalizada de las ICI suele verse complicada por los eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario (IRAE). Entre ellas, la miocarditis inducida por ICI es una complicación rara pero potencialmente fatal, caracterizada por un curso clínico rápido y altas tasas de mortalidad que oscilan entre el 25% y el 50%^1,2. A pesar de su gravedad, las opciones terapéuticas actuales para la miocarditis inducida por ICI siguen estando en gran medida limitadas a corticosteroides de alta dosis e inmunosupresores^{inespecíficos 3,4}. Estas intervenciones tradicionales suelen dar respuestas subóptimas y pueden comprometer la eficacia antitumoral de las^{ICI 1}, creando una brecha crítica de conocimiento en la búsqueda de estrategias cardioprotectoras más seguras y dirigidas que puedan mitigar la inflamación cardíaca sin inmunosupresión sistémica.

El inflammasa de la proteína receptor tipo NOD 3 (NLRP3), activada a través de la vía de señalización NF-κB, ha emergido como un motor central de la tormenta de citocinas observada en la miocarditis ^5,6 inducida por ICI. La producción excesiva de citocinas proinflamatorias, especialmente IL-1β e IL-6, conduce a una lesión cardiomiocídica profunda e insuficiencia^{cardíaca 7}. Aunque se han explorado varias intervenciones basadas en lípidos en enfermedades cardiovasculares, el potencial de las emulsiones lipídicas a base de aceite de oliva (OOLE) en este contexto específico sigue sin explorar. OOLE es rico en ácido oleico, un ácido graso monoinsaturado conocido por su capacidad única para modular la fluidez de la membrana y suprimir cascadas^{inflamatorias 8,9}. Sin embargo, no se ha establecido si la OOLE puede mejorar específicamente el estado hiperinflamatorio característico de la miocarditis inducida por ICI.

En este estudio, pretendemos abordar esta carencia investigando el potencial terapéutico de la OOLE. Planteamos la hipótesis de que OOLE ejerce un potente efecto cardioprotector al inhibir el eje de señalización NF-κB/NLRP3/IL-1β, suprimiendo así el aumento inflamatorio y preservando la función cardíaca. Combinando un modelo de cocultivo in vitro de cardiomiocitos HL-1 y células T con un modelo murino in vivo . de miocarditis inducida por ICI, demostramos que la intervención OOLE proporciona una recuperación funcional rápida y mitiga la lesión miocárdica. Este estudio proporciona la primera evidencia de OOLE como un enfoque farmacológico nutricional novedoso y dirigido para el manejo de la cardiotoxicidad relacionada con la ICI.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de Guangzhou Miles Biotechnology Co., Ltd., con el número de aprobación IACUC-MIS2023076. La empresa mencionada es un centro de experimentación animal; Nuestros experimentos con animales se realizan aquí y, por tanto, están sujetos a revisión por parte del Comité de Ética del Centro.

Animales y diseño experimental
Se compraron comercialmente treinta ratones BALB/c (macho, 8 semanas, que pesan 22 ± 2 g). Criterios de inducción y validación del modelo: Se estableció un modelo de miocarditis inducida por inhibidor de puntos de control inmunitarios (ICI) mediante inyección intravenosa de ipilimumab (5 mg/kg) y nivolumab (10 mg/kg) durante 2 semanas consecutivas. La dosificación se realizó cada 3 días, durante una duración total de modelado de 2 semanas. Se ha demostrado previamente que este protocolo induce una lesión cardíaca inmunomediada^{significativa 10}. A las 24 horas de la inyección final, se recogieron muestras de sangre a través del plexo retroorbitario y centrifugadas a 300 x g durante 15 minutos a 4 °C para aislar el suero; posteriormente, los niveles séricos de cTnT se cuantificaron utilizando un kit ELISA específico, que incluía pasos secuenciales de carga de muestras, incubación de anticuerpos conjugados con HRP, lavado automatizado y reacción del cromógeno TMB, con la densidad óptica medida en 450 nm para calcular concentraciones basándose en una curva logística de cuatro parámetros, y una concentración de cTnT de ≥10 ng/mL se consideró un establecimiento exitoso del modelo.

Seis ratones modelo con el peso corporal y concentración de cTnT más próximos se dividieron aleatoriamente en dos grupos: un grupo control y un grupo de tratamiento (n=3 en ambos, replicación biológica). El grupo control recibió inyecciones intravenosas diarias de solución fisiológica normal a una dosis de 5 mL/kg. El grupo de tratamiento recibió inyecciones intravenosas diarias de emulsión lipídica al 5% de aceite de oliva (OOLE) a una dosis de 5 mL/kg a través de la vena caudal durante 6 días (esto representa la dosis que empleamos para el tratamiento clínico dentro de nuestra institución; se extrapoló para su uso en ratones basándose en las proporciones de área superficial corporal). Las siguientes pruebas se realizaron en una ventana de observación de 6 días: la función cardíaca se evaluó al inicio (día 0) y después del tratamiento (día 6) utilizando un sistema de imagen fotoacústica por ultrasonidos. La sangre se recogió a través de la vena retroorbitaria en el día 6, y las citocinas séricas fueron cuantificadas por ELISA. Tras la eutanasia de los animales con una sobredosis de anestesia, el tejido cardíaco fue congelado rápidamente para análisis de proteínas.

Aislamiento de células T
Los ratones del grupo de control fueron eutanasiados con una sobredosis de anestesia. Los bazos fueron extirpados asépticamente tras una esterilización superficial de 5 minutos con etanol al 75%, y se retiraron todos los tejidos conectivos. Los bazos se disociaron mecánicamente usando un colador de células de 70 μm con PBS suplementado con 2% de FBS para crear una suspensión de célula única. Esta suspensión se centrifugó a 300 x g ., 4 °C durante 5 minutos, y los eritrocitos se lisaron con 1 mL de tampón lisado ACK durante 2 minutos a temperatura ambiente. El proceso de lisis terminaba lavándolo con PBS. Las células T se enriquecieron negativamente para evitar la activación utilizando un kit de aislamiento de células T de ratón. Por cada 10 millones de células, se añadieron 50 μL de cóctel de selección e incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. A esto le siguió la adición de 75 μL de perlas magnéticas de estreptavidina por cada 10 millones de celdas, con una incubación de 5 minutos. Las células unidas a las perlas se conservaron usando un imán durante 3 minutos, y las células T enriquecidas (con más del 94% de pureza) se recogieron del sobrenadante. Para clasificar los subconjuntos CD4⁺ y CD8⁺, las células enriquecidas se tiñeron con anticuerpos anti-CD3ε-PE, anti-CD4-APC y anti-CD8-FITC durante 15 minutos en la oscuridad, y luego se lavaron 3 veces con PBS preenfriado. La clasificación se realizó en un citómetro de flujo utilizando la siguiente estrategia de compuerción: linfocitos (FSC/SSC), luego subconjuntos CD3⁺, después CD4⁺ o CD8⁺. Las células se clasificaron en modo pureza en tubos de recogida prellenados con 200 μL de PBS, dando lugar a subconjuntos objetivo con mayor del 98% de pureza.

Construcción y tratamiento del modelo celular de miocarditis
Las células HL-1 se cultivaron en medio DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (PS) bajo condiciones estándar (37 °C, 5% CO₂). Las células se dividieron en tres grupos: grupo de control (no tratado), grupo modelo (células HL-1 tratadas con células T CD4+/CD8+ durante 24 horas) y grupo OOLE (grupo modelo co-tratado con OOLE al 10% durante 24 horas).

ELISA para la detección sérica de proteínas relacionadas con lesiones miocárdicas
Incubar 50 μL de la muestra de suero en los pozos de microplacas ricos en anticuerpos pre-recubiertos del kit durante 30 minutos, luego lavar tres veces con PBST para eliminar los componentes no unidos. Añade la solución preparada de avidina marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) para una segunda incubación. Lave tres veces más con PBST, añada 100 μL de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) para iniciar la reacción colorimétrica y termina la reacción con 100 μL de solución de parada en un plazo de 30–45 minutos tras la iniciación. Mide la absorbancia (OD) a 450 nm usando un lector de microplacas y cuantifica la concentración del analito objetivo usando una curva estándar trazada con estándares de referencia conocidos.

Western blot
Los tejidos cardíacos se pulverizaron usando un homogeneizador de tejidos con nitrógeno líquido. Posteriormente, tanto las muestras de tejido como celulares se lisaron en 200 μL de tampón RIPA sobre hielo durante 30 minutos. Los lisados se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C para recoger los supernacionantes proteicos. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante un kit de análisis de proteínas BCA. Tras ajustar la concentración de proteína a 5 μg/μL, las muestras se mezclaron con tampón de carga de 5× y se desnaturalizaron calentando a 95 °C durante 10 minutos. Las proteínas se separaron en geles SDS-PAGE al 10% (administradas a 100 V durante 90 minutos) y posteriormente se transfirieron a las membranas PVDF mediante electroblotting semiseco a 15 V durante 30 minutos. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y luego se sondaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios (incluyendo IL-1β, NLRP3, MyD88, NF-κB p65 y Tubulina; dilución 1:1.000)². Tras lavar las membranas tres veces durante 10 minutos cada una con suero salino con Tris-buffer que contenía 0,1% de Tween 20 (TBST), se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1:10.000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se visualizaron aplicando un sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL), y las señales se capturaron mediante un sistema de imagen por quimiluminiscencia. Finalmente, los niveles relativos de expresión se analizaron cuantitativamente normalizando los valores densitométricos de las bandas proteicas objetivo al control interno de Tubulina mediante el software ImageJ.

Ensayo de apoptosis celular mediante citometría de flujo
Las células HL-1 fueron lavadas 2 veces con solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS). Para la disociación celular, se añadió 1 mL de tripsina e incubó durante 1 minuto, seguido inmediatamente por la neutralización con 2 mL de medio de cultivo completo. La suspensión de la celda se centrifugaba entonces a 250 x g durante 5 minutos a 4 °C, y el sobrenadante se descartaba. La pelota de células recogida se lavó dos veces con PBS bien frío y se resuspendió en un tampón de unión 1x para lograr una densidad celular de 1x^{10 6} células/mL. Una aliteracia de 100 μL de esta suspensión celular se transfirió a un tubo de citometría de flujo, seguida de la adición de 5 μL de FITC-Anexina V y 5 μL de yoduro propidio (PI). Tras un suave vórtice, la mezcla se incubaba durante 15 minutos a temperatura ambiente (25 °C) en la oscuridad. Finalmente, se añadieron 400 μL de buffer de unión 1x a cada tubo, y posteriormente se analizó la apoptosis celular utilizando un citómetro de flujo. Para la estrategia de gating, los eventos se activaron primero en dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) para excluir residuos subcelulares y aislar la población intacta de células HL-1. Dentro de esta compuerta primaria, las células apoptóticas se cuantificaron mediante análisis de cuadrantes, con las células apoptóticas tempranas definidas como FITC-Anexina V⁺/PI⁻ y las células apoptóticas tardías definidas como FITC-Annexin V⁺/PI⁺.

Análisis estadístico
Cada experimento se realizó en triplicado y el análisis estadístico se realizó mediante software estadístico. Las diferencias entre dos grupos se analizaron utilizando la prueba t de muestras independientes; las diferencias entre tres o más grupos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional seguida de la prueba post-hoc de Bonferroni. Los datos se expresan como media ± error estándar (SEM). P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

La combinación de ipilimumab y Novolumab induce miocarditis inducida por ICI en un modelo animal
Para establecer un modelo de miocarditis inducida por ICI, se administraron inyecciones intravenosas de ipilimumab (5 mg/kg) y nivolumab (10 mg/kg) a ratones BALB/c a través de la vena caudal. Posteriormente, se midieron los niveles séricos de troponina T cardíaca (cTnT) mediante un ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA). Se definió un nivel de cTnT ≥ 10 ng/mL co...

Discusión

En este estudio, demostramos por primera vez que las emulsiones lipídicas a base de aceite de oliva (OOLE) atenúan eficazmente la miocarditis inducida por inhibidores de puntos de control inmunitarios (ICI) al suprimir la vía de señalización IL-1β/NLRP3/NF-κB. Nuestros resultados proporcionan evidencia tanto mecanicista como funcional de que OOLE no solo mejora la función cardíaca, sino que también alivia la inflamación miocárdica tanto in vivo como in vitro. modelos de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Membranas PVDF de 0,22	Millipore	ISEQ00010
4% de paraformaldehído	Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd.	BL539A
Ratones BALB/c	Guangdong Zhiyuan Biomedicine Technology Co., Ltd.
Kit de ensayo BCA	Dingguo Biotech	BCA02
Microscopía de campo claro	MSHOT	ML31
Kit cTnT elisa	lunchangshuobiotech	ED-28107
Aparato de electroforesis	WIX	miniPro4
Sistema de Análisis de Imágenes Quimioluminiscencia Totalmente Automatizado	FUJIFILM	LAS-3000
kit de hematoxilina-eosina & nbsp;	Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd.	BL2236A
IFN-γ Kits ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-10284
IL-1 y beta; anticuerpo	Afinidad	BF8021
IL-1 y beta; Kits ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-10351
Kits IL-6 ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-10377
Software ImageJ 1.54	NIH
Ipilimumab	MCE	CAS: 477202-00-9
Anticuerpo MyD88	Afinidad	AF5195
NF-κ Anticuerpo B p65	Afinidad	BF8005
nivolumab	MCE	CAS: 946414-94-4
Anticuerpo NLRP3	Afinidad	BF8029
Emulsión lipídica a base de aceite de oliva	el Departamento de Nutrición del Hospital Oncológico Fuda de Guangzhou
Aparato de película rotatoria semi-seca rápida	Bio-Rad	788BR04132
Sistema cuantitativo qPCR de fluorescencia en tiempo real	YARUI	MA-6000
Búfer de lisis RIPA	Beyotime	P0013B
Microtomo rotatorio	Leica	RM2235
Geles SDS-PAGE	Beyotime	P0052A, P0053A
El Kit de Detección de Apoptosis Annexin V-FITC/PI	Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.	MA0220-1
el kit de aislamiento de células T EasySep Mouse CD4+	Stemcell	19765
La línea celular de cardiomiocitos de rata HL-1	Guangzhou All-perfect Biotechnology Co., Ltd.	TCM-C783
TNF-& alfa; Kits ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-11776
Sistema de Imagen Fotoacústica por Ultrasonidos	Fujifilm VisualSonics	VEvo3100
Sistema de pruebas urodinámicas	Techman	BL-420