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Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital General de Hebei (Aprobación: 2025-LW-0265). Debido a la naturaleza retrospectiva del estudio, se obtuvo la aprobación ética tras el periodo de recogida de datos, lo cual fue permitido por el comité de estudios no intervencionistas utilizando datos clínicos anonimizados. Se eliminó el requisito de consentimiento informado por escrito.
Selección de participantes
Entre julio de 2022 y mayo de 2024, se reclutaron participantes potenciales del Departamento de Nefrología del Hospital General de Hebei. Todos los pacientes fueron evaluados según criterios predefinidos de inclusión y exclusión.
Los criterios de inclusión fueron los siguientes: diagnóstico de nefropatía diabética (DN) enestadio III de Mogensen, definida como albuminuria persistente con una proporción albúmina urinaria-creatinina (UAlb/UCR) de 30–300 mg/g en al menos dos de tres muestras puntuales recogidas durante 3–6 meses, sin hematuria ni rápido deterioro de la función renal sugestiva de enfermedad renal no diabética; tasa estimada de filtración glomerular (eGFR) ≥45 mL/min/1,73m2 calculada usando la ecuación CKD-EPI; diagnóstico inicial de DN sin necesidad previa de vitamina D, probucol o terapia inmunosupresora para DN; edad <75 años; y condición clínicamente estable sin complicaciones agudas diabéticas como cetoacidosis diabética o estado hiperglucémico hiperglucémico, ni infecciones graves activas dentro de las 4 semanas previas a la inscripción. No se requería biopsia renal para la inscripción; Sin embargo, se excluyeron pacientes con sospecha de enfermedad renal no diabética, incluyendo sedimento urinario activo, glomerulonefritis de rápida progresión o enfermedad autoinmune sistémica.
Los criterios de exclusión incluían enfermedades sistémicas graves como malignidades, enfermedades cardiovasculares graves o enfermedades autoinmunes; alergia conocida a la vitamina D, probucol, valsartán, atorvastatina o insulina; embarazo o lactancia; y el uso reciente de medicamentos en un plazo de 4 semanas que podrían interferir con los resultados del estudio, incluidos inmunosupresores o corticosteroides.
Asignación por grupos
El médico de cribado permaneció ciego respecto a la asignación final del grupo hasta la confirmación de elegibilidad.
Se registraron características demográficas y clínicas basales, incluyendo edad, sexo, duración de la diabetes y DN, y antecedentes de hipertensión o hiperlipidemia.
Este estudio utilizó un diseño controlado retrospectivo y no aleatorizado. Para minimizar el sesgo de selección y abordar posibles factores de confusión, incluidos los cambios temporales y la variabilidad relacionada con el médico, la asignación de grupos se basó en el orden cronológico de admisión en lugar de la preferencia del médico o del paciente.
Los pacientes ingresados entre julio de 2022 y diciembre de 2023 recibieron terapia triple estándar que consistía en valsartán, atorvastatina y probucol y fueron asignados al grupo control (n = 56). Los pacientes ingresados entre enero de 2024 y mayo de 2024 que recibieron cuádruple terapia (valsartán, atorvastatina, probucol y vitamina D) fueron asignados al grupo de observación (n = 94).
El mayor número de pacientes en el grupo de observación reflejó un aumento en la aplicación clínica de la terapia adjunta con vitamina D en el centro de estudio a partir de principios de 2024, tras la evidencia emergente. Las características demográficas y clínicas basales fueron comparables entre grupos (Tabla 1; P>0,05), y no se produjeron cambios significativos en los criterios diagnósticos, métodos de laboratorio ni composición del equipo médico durante el periodo del estudio.
Administración del régimen de tratamiento
Todos los participantes recibieron un régimen estandarizado diario de infusión subcutánea de insulina para el control glucémico durante el periodo de 8 meses del estudio. La dosis de insulina se ajustó individualmente según el monitoreo diario de glucosa en sangre capilar. Los pacientes del grupo control recibieron valsartán (80 mg una vez al día con el estómago vacío), atorvastatina (20 mg una vez al día) y probucol (250 mg dos veces al día) durante 8 meses. Los pacientes del grupo de observación recibieron el mismo régimen de valsartán, atorvastatina y probucol con dosis y esquemas idénticos, junto con suplementación diaria oral de vitamina D.
La dosis de vitamina D se determinó según los niveles séricos basales de 25-hidroxivitamina D [25(OH)D] medidos en el momento de la inscripción mediante inmunoensayo electroquimioluminiscencia (ECLIA). La suficiencia de vitamina D se definió como 25(OH)D ≥30 ng/mL, insuficiencia como 20 ng/mL ≤25(OH)D <30 ng/mL, y deficiencia como 25(OH)D <20 ng/mL. Los pacientes que recibieron suplementación para prevenir la deficiencia recibieron entre 600 y 800 UI/día, mientras que los pacientes con insuficiencia o deficiencia establecida de vitamina D recibieron 2000 UI/día.
Criterios de monitorización y parada de seguridad
Para garantizar la seguridad de los participantes durante el periodo de tratamiento de 8 meses, se midieron los niveles séricos de calcio, fósforo y hormona paratiroidea (PTH) al inicio y cada 4 semanas para monitorizar la hipercalcemia inducida por vitamina D y el desequilibrio calcio-fósforo. Se realizó un electrocardiograma (ECG) de 12 derivaciones al inicio y tras 8 meses para evaluar la prolongación del intervalo QTc asociada al probucol. En pacientes con QTc basal ≥450 ms en hombres o ≥460 ms en mujeres, el ECG se repitió en el primer mes.
Los parámetros de la función renal, incluyendo la creatinina sérica y la eGFR, junto con los electrolitos séricos, se monitorizaron quincenalmente durante el primer mes y mensualmente después. Se instruyó a los participantes para que informaran de nuevos síntomas de inmediato. Los criterios para la suspensión del tratamiento incluyeron calcio sérico corregido >10,5 mg/dL (2,62 mmol/L) confirmado mediante pruebas repetidas en 48 horas; Intervalo QTc >500 ms o aumento >60 ms respecto al inicio en dos ECGs consecutivos; duplicación de la creatinina sérica desde el inicio o desarrollo de lesión renal aguda según los criterios de Enfermedad Renal: Mejorando los Resultados Globales (KDIGO); y cualquier evento adverso de grado ≥3 según los Criterios Comunes de Terminología para Eventos Adversos (CTCAE) considerado posible, probable o definitivamente relacionado con la vitamina D o el probucol. Los eventos adversos graves se notificaron al comité de ética del hospital en un plazo de 24 horas.
Recogida y procesamiento de muestras biológicas
Se recogieron muestras de sangre y orina antes de iniciar el tratamiento y tras completar el periodo de tratamiento de 8 meses. Todas las muestras se recogieron por la mañana tras un ayuno nocturno de 8–12 horas. Se recogieron aproximadamente 20 mL de sangre venosa mediante técnicas estándar de flebotomía en tubos separadores de suero y EDTA. Las muestras de sangre se dejaron coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos y centrifugaron a 1000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Los suteóricos sueros transparentes se aspiraron cuidadosamente sin alterar el coágulo ni el abrigo buffy, se alicitaron en crioviales para diferentes ensayos, se etiquetaron con identificación del participante, fecha y tipo de muestra, y se almacenaron a −80 °C hasta el análisis. Las muestras de suero podían almacenarse a −80 °C durante hasta 12 meses.
Para la excreción de proteínas urinarias de 24 horas (UPE de 24 horas), los participantes descartaron la primera muestra de orina de la mañana a las 7:00 AM del día 1 y posteriormente recogieron toda la orina, incluida la primera muestra de orina a las 7:00 AM del día 2, en un recipiente de recogida proporcionado. Se instruyó a los participantes para que refrigeraran el contenedor de recogida durante el periodo de recogida. Se registró el volumen total de orina, se mezcló a fondo y se alicitó para análisis de laboratorio. Las muestras se almacenaron a 4 °C cuando se analizaron en un plazo de 24 horas o a −20 °C para su análisis posterior.
Para la proporción albúmina a creatinina urinaria (UAlb/UCR), se recogieron muestras de orina a mitad de la mañana en recipientes estériles y se procesaron de forma similar. Los mismos procedimientos se repitieron tras completar el periodo de tratamiento de 8 meses.
Análisis de parámetros bioquímicos y clínicos
Las muestras de suero congeladas se descongelaron en hielo o a 4 °C antes del análisis de creatinina sérica (SCr). La SCR se midió mediante un ensayo colorimétrico enzimático en un analizador bioquímico automático, según las instrucciones del fabricante. La calibración diaria se realizaba utilizando calibradores multinivel, y en cada lote se incluían dos niveles de materiales comerciales de control de calidad. Se analizaron muestras en duplicado y se repitieron ensayos con un coeficiente de variación del >5%. El límite inferior de detección para SCr era de 2,0 μmol/L.
La concentración de proteínas en alícuotas de orina de 24 horas se midió utilizando el método de pirogalol-rojo-molibdato. Se analizaron muestras en duplicado y se incluyeron materiales de control de calidad en cada ejecución. Las muestras por encima del rango de calibración (>3,0 g/L) se diluyeron con solución fisiológica normal y se volvieron a evaluar. El UPE de 24 horas se calculó utilizando la concentración de proteínas urinarias y el volumen total de orina.
Se midieron las concentraciones urinarias de albúmina y creatinina en muestras de orina de la primera mañana utilizando el analizador bioquímico, y posteriormente se calculó la relación UAlb/UCR.
La glucosa plasmática en ayunas (FPG) y la glucosa postprandial a 2 horas (2h-PPG) se midieron utilizando un medidor de glucosa validado y muestras de sangre por pinchazo capilar, según las instrucciones del fabricante.
La hemoglobina glicada (HbA1c) se analizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento con un sistema dedicado de análisis de HbA1c. Se indicó a los participantes que evitaran medicamentos que reducen los lípidos durante 7 días y comidas o alcohol con alto contenido en grasas durante 24 horas antes de la extracción de sangre tras el tratamiento. El colesterol total sérico (TC), los triglicéridos (TG), el colesterol lipoproteico de alta densidad (HDL-C) y el colesterol lipoproteico de baja densidad (LDL-C) se midieron mediante ensayos enzimáticos. Se analizaron diariamente materiales de control de calidad de dos niveles. Los parámetros lipídicos se midieron inicialmente en singlicado y muestras con un coeficiente de variación del >10% se reevaluaron en duplicado. Los límites de detección eran 0,1 mmol/L para TC, 0,05 mmol/L para TG, 0,08 mmol/L para HDL-C y 0,10 mmol/L para LDL-C. Los valores de LDL-C se determinaron mediante ensayo directo o mediante la ecuación de Friedewald cuando los niveles de triglicéridos eran <400 mg/dL.
Función inmunitaria y análisis de marcadores inflamatorios
Las concentraciones séricas de inmunoglobulina G (IgG) se midieron utilizando un kit comercial de IgG ELISA en humanos. El rango de detección del ensayo fue de 1,37–1000 ng/mL, la sensibilidad de 0,52 ng/mL, el coeficiente de variación intraensayo fue del <6% y el coeficiente de variación entre ensayos fue del <9%. Todas las muestras se analizaron en duplicado, y se incluyeron materiales de control de alta y baja calidad suministrados con el kit en cada placa. Las placas con valores de control de calidad fuera de 2 desviaciones estándar respecto a los valores objetivo fueron rechazadas y repetidas. Las muestras por encima del límite superior estándar se diluyeron 1:2 y se reevaluaron.
Todos los reactivos y muestras de suero se equilibraron a temperatura ambiente antes del análisis. Las muestras de suero se diluyeron según las instrucciones del kit, normalmente a 1:100.000 de dilución. Se añadieron estándares, muestras diluidas y blanks (100 μL) a pozos apropiados de microplacas prerecubiertas e incubados a 37 °C durante 90 minutos. Los pozos se lavaron tres veces antes de la incubación con anticuerpo de detección biotinilado durante 60 minutos a 37 °C. Tras lavados adicionales, se añadió y incubó peroxidasa de rábano picante durante 30 minutos en la oscuridad. Después del lavado, se añadió la solución de sustrato y la mezcla se incubó en la oscuridad durante 15 minutos antes de añadir la solución de parada. La densidad óptica se midió en 450 nm con longitudes de onda de referencia de 570 nm o 630 nm. Se generaron curvas estándar para calcular las concentraciones de IgG.
Los subconjuntos de linfocitos se analizaron mediante citometría de flujo en un BD FACSCanto II equipado con láseres de 488 nm y 640 nm. El voltaje de dispersión directa se ajustó a 300 V, la dispersión lateral a 350 V, y los voltajes de tubos fotomultiplicadores para los canales FITC, APC y PE a 400 V, 550 V y 480 V, respectivamente. Se excluyeron los dobletes usando la puerta FSC-A frente a FSC-H.
La tinción de viabilidad se realizó utilizando 7-aminoactinomicina D (7-AAD), y solo se analizaron eventos 7-AAD-negativos. Las muestras de sangre total se distribuyeron en tubos de control isotipo y sin tintura. Se añadieron anticuerpos anti-humanos CD3-FITC, CD4-APC y CD8-PE a los tubos de ensayo, mientras que anticuerpos isotipo-control emparejados se añadieron a los tubos control. Las muestras se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los controles de compensación se prepararon con BD CompBeads y la compensación automática se realizó en el software FACSDiva. Los glóbulos rojos se lisaron con tampón de lisis de glóbulos rojos, luego se lavaron y resuspendieron en tampón de tinción que contenía 7-AAD.
Se utilizaban la configuración diaria del citómetro y las perlas de seguimiento para el control de calidad. La jerarquía de gating incluyó exclusión de dobles, selección de linfocitos, gating de viabilidad, gating CD3+ e identificación de subconjuntos CD4/CD8. Se adquirieron al menos 50.000 eventos linfocitos vivos por muestra, con un total de eventos adquiridos que osciló entre 100.000 y 150.000. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo, y se calcularon los porcentajes de celdas CD3+, CD4+ y CD8+, junto con las relaciones CD4+/CD8+.
Se midieron las concentraciones séricas de hs-CRP, IL-6, TNF-α y MCP-1 utilizando kits ELISA comerciales obtenidos. Los rangos y sensibilidades de detección fueron los siguientes: hs-CRP (0,07–12,5 ng/mL; sensibilidad 0,022 ng/mL), IL-6 (0,7–300 pg/mL; sensibilidad 0,35 pg/mL), TNF-α (1,6–100 pg/mL; sensibilidad 0,8 pg/mL) y MCP-1 (5–1000 pg/mL; sensibilidad 2,5 pg/mL). Todos los ensayos se realizaban en duplicado. En cada placa se incluían materiales de control de baja y alta calidad. Los coeficientes de variación intraensayo fueron del <8% y los coeficientes de variación entre ensayos del <10%. Los valores por debajo de los límites de detección se registraron como la mitad del límite inferior de cuantificación, mientras que los valores por encima del estándar más alto se diluyeron y reevaluaron. Las muestras solo sufrieron un ciclo de congelación-descongelación antes del análisis. Los procedimientos ELISA de citocinas siguieron protocolos idénticos a los descritos para ELISA de IgG, según las instrucciones del fabricante respecto a factores de dilución, condiciones de incubación y temperaturas.
Evaluación de resultados clínicos y gestión de datos
Al final del periodo de tratamiento de 8 meses, los médicos tratantes, ciegos ante la asignación de grupos, evaluaron el estado clínico de los participantes. Los pacientes fueron clasificados como dados de alta cuando se cumplieron todos los criterios predefinidos de mejoría clínica para la nefropatía diabética durante al menos dos semanas consecutivas: reducción del ≥ del 30% en la UPE de 24 horas en comparación con la fase inicial, estabilización o mejoría en la eGFR definida como disminución <5 mL/min/1,73m2 respecto al inicio y ausencia de complicaciones agudas diabéticas u otras condiciones que requirieran atención hospitalaria continuada. Los participantes que no cumplieron todos los criterios fueron clasificados como no dados de alta. Posteriormente se calcularon tasas de respuesta clínica para cada grupo.
Todos los datos demográficos, de laboratorio y clínicos recogidos se introdujeron en una base de datos electrónica utilizando doble introducción de datos por dos investigadores independientes. Se realizaron comprobaciones de rango y de consistencia para garantizar la precisión de los datos. Los criterios finales principales incluyeron cambios desde el inicio hasta los 8 meses en los parámetros de función renal, incluyendo UPE de 24 horas y UAlb/UCR, y parámetros de función inmunitaria, incluyendo el porcentaje de células T CD3+ y la proporción CD4+/CD8+. Los criterios secundarios incluyeron cambios desde la línea inicial hasta 8 meses en parámetros glucémicos (FPG, 2h-PPG, HbA1c), perfil lipídico (TC, TG, LDL-C, HDL-C), marcadores inflamatorios (hs-CRP, IL-6, TNF-α, MCP-1) y tasa de respuesta clínica. Todas las medidas de resultado se evaluaron al inicio, dentro de las 48 horas previas al inicio del tratamiento y después del tratamiento, dentro de la semana siguiente a la finalización del periodo de tratamiento de 8 meses.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS. Las variables continuas con distribución normal se expresaban como media ± desviación estándar, mientras que las variables categóricas se expresaban como frecuencia y porcentaje. Se utilizaron pruebas t con muestras independientes para comparaciones entre grupos, y pruebas de chi-cuadrado para variables categóricas. La significación estadística se definió como P<0,05. Dada la naturaleza exploratoria del estudio y el gran número de resultados evaluados, los resultados secundarios no se ajustaron por multiplicidad. Por lo tanto, los valores P se consideraron descriptivos en lugar de confirmatorios. Debido al diseño retrospectivo no aleatorizado del estudio, todas las comparaciones entre los grupos control y observación no se ajustaron para posibles factores de confusión, y la confusión residual pudo haber permanecido. Los 150 pacientes inscritos (56 en el grupo control y 94 en el grupo de observación) completaron el tratamiento completo de 8 meses y el periodo de seguimiento. No se perdió ningún paciente en el seguimiento, ni fue retirado ni excluido tras el registro. No se identificaron datos faltantes sobre características basales ni medidas de resultado, incluyendo función renal, perfiles de glucosa y lípidos, marcadores inmunitarios y factores inflamatorios. Por lo tanto, no se requirieron procedimientos de imputación.