La propentofilina alivia la hiperalgesia incisional mediante la regulación de la fosforilación de ERK1/2 en los astrocitos y la microglía espinales

Resumen

Este estudio investiga el efecto de la propentofilina administrada intratecalmente en la atenuación de la hiperalgesia postincisión y si este efecto está asociado con cambios en los marcadores gliales espinales y en la fosforilación de la proteína quinasa regulada por señal extracelular 1 y 2 en ratas.

Resumen

Se ha implicado a los astrocitos espinales, la microglía y la proteína quinasa regulada por señal extracelular 1 y 2 (ERK1/2) en el procesamiento del dolor. Este estudio investigó si la propentofilina (PPF) intratecal previa a la cirugía atenúa la hiperalgesia aguda por incisión en ratas y si este efecto se asocia con marcadores gliales espinales y con la fosforilación de ERK1/2. Sesenta y seis ratas macho Sprague–Dawley se asignaron aleatoriamente a grupos control, de dolor por incisión, de solución salina normal, de dimetilsulfóxido, de PPF y de U0126. Se evaluó la hiperalgesia mecánica y térmica en la línea base y a las 2, 4, 8, 24 y 72 h posteriores a la incisión. Los marcadores neuronales y gliales espinales, p-ERK1/2 y los mediadores inflamatorios se evaluaron mediante inmunotransferencia y análisis de inmunofluorescencia. Además, se utilizaron experimentos con astrocitos espinales primarios para examinar la liberación de mediadores inflamatorios dependiente de ERK1/2. La administración intratecal de PPF antes de la cirugía atenuó la hiperalgesia mecánica y térmica durante todo el período de observación de 72 h, mientras que el U0126 atenuó la hiperalgesia principalmente durante las primeras etapas posteriores a la incisión. A las 4 h posteriores a la incisión, ambos tratamientos se asociaron con una reducción en la expresión espinal de GFAP, Iba-1 y p-ERK1/2, así como con una disminución en la inmunorreactividad de TNF-α y COX-2. En astrocitos cultivados, la PPF redujo la liberación de mediadores inflamatorios inducida por LPS, mientras que la activación constitutiva de ERK1/2 atenuó este efecto. Estos hallazgos respaldan una asociación entre el efecto antihiperalgésico de la PPF y la modulación de las respuestas gliales espinales, relacionadas con ERK1/2 y las respuestas inflamatorias tras la incisión.

Introducción

El dolor incisional, un tipo común de dolor agudo tras procedimientos quirúrgicos, generalmente no persiste más de 7 días, pero presenta mecanismos patológicos complejos que difieren de los del dolor inflamatorio y neuropático^1,2. Si el dolor incisional no se controla adecuadamente durante su desarrollo, puede progresar posteriormente a un síndrome de dolor crónico, y su naturaleza puede cambiar de un dolor por lesión tisular aguda a un dolor neuropático o mixto³. En general, la administración de analgésicos, como opioides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos, es la forma más común de analgesia tras una incisión. Sin embargo, pueden presentarse muchos efectos secundarios con el uso continuo o a altas dosis de estos medicamentos, una circunstancia que resalta la necesidad de estrategias analgésicas más seguras y eficaces.

Evidencia confiable indica que la propentofilina (PPF) alivia la hiperalgesia en diversos procesos del dolor^4,5. Además, el efecto analgésico de la PPF puede lograrse en parte mediante la inhibición de la expresión espinal de las quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), como p38 y las quinasas N-terminales de c-Jun (JNKs)⁶. Aunque los efectos de la PPF sobre las vías p38 y JNK están establecidos, su posible modulación de la vía de la quinasa regulada por señal extracelular 1 y 2 (ERK1/2), otra subfamilia crítica de MAPKs implicada en la señalización del dolor, permanece inexplorada en el dolor incisional agudo. Esta brecha en el conocimiento es particularmente importante dado que la activación de ERK1/2 presenta patrones temporales y celulares distintos en comparación con p38 y JNK, lo que sugiere oportunidades terapéuticas potencialmente únicas.

Se pensaba inicialmente que las células gliales, incluidas los astrocitos, la microglía y los oligodendrocitos, constituían la estructura de conexión y soporte del tejido nervioso. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los astrocitos y la microglía desempeñan un papel importante en la regulación de la plasticidad sináptica y en la transmisión de la información sobre el dolor⁷. Como macrófagos residentes del cerebro y la médula espinal, la microglía puede activarse mediante varias señales de estímulo extracelular en las primeras etapas del proceso del dolor, y luego proliferar y liberar grandes cantidades de citoquinas inflamatorias, lo que aumenta la conducción de las señales del dolor desde la médula espinal hasta el cerebro^8,9. Al mismo tiempo, los astrocitos activados pueden aumentar la liberación del neurotransmisor excitador glutamato y enviar información directamente a las neuronas sensoriales al potenciar la comunicación intercelular¹⁰.

Los estudios han demostrado que la activación de los astrocitos ocurre en la etapa temprana (dentro de las primeras 24 h) del dolor inducido por incisión, mientras que la activación de la microglía aparece mucho más tarde^11,12. Además, un estudio indicó que la microglía activada tiene un efecto limitado sobre la hiperalgesia mecánica en el dolor inducido por incisión¹³. Estos hallazgos destacan las preguntas pendientes sobre los roles distintos de los astrocitos y la microglía en el dolor agudo. Se ha informado que la propentofilina, un agente modulador de la glía, alivia la hiperalgesia al regular la activación de astrocitos y microglía tras una lesión nerviosa crónica por compresión, una lesión nerviosa aguda y una lesión aguda del tejido^4,5. Sin embargo, hasta donde se conoce actualmente, ningún estudio ha examinado los efectos de la PPF sobre la activación de astrocitos o microglía en el dolor agudo inducido por incisión.

La quinasa regulada por señal extracelular 1 y 2, una subfamilia principal de MAPK activada en la vía descendente de la quinasa 1 y 2 activada por mitógenos (MEK1/2), ha estado ampliamente implicada en el procesamiento nociceptivo y la plasticidad neuronal^14,15. Estudios previos han demostrado que la ERK1/2 fosforilada (p-ERK1/2) puede inducirse en neuronas espinales mediante estimulación nociceptiva y también puede detectarse en astrocitos y microglía en estados de dolor inflamatorio o neuropático^16,17,18,19. Además, se ha informado que la inhibición farmacológica de la señalización MEK1/2–ERK1/2 atenúa la hiperalgesia mecánica y térmica en varios modelos de dolor^{20,21,22,23,24,25}.

Sin embargo, la distribución celular de la ERK1/2 espinal, particularmente en astrocitos y microglía, activada por una incisión aguda y su papel en el dolor inducido por incisión permanece insuficientemente definida. Estudios previos del grupo de investigación indican que el PPF alivia la hiperalgesia aguda por incisión en ratas al reducir la señalización espinal de JNK y p38, pero aún no está claro si el PPF también modula la señalización relacionada con ERK1/2 en las células gliales espinales durante el dolor inducido por incisión. Por lo tanto, el presente estudio debe considerarse como una extensión de los marcos existentes sobre glía y MAPK en la investigación del dolor, más que como un paradigma mecanicista completamente independiente. Su principal diferencia con respecto a trabajos anteriores radica en su enfoque específico en el dolor agudo por incisión, en el examen de ERK1/2 en lugar de p38/JNK como componente de MAPK de interés, y en la evaluación de la distribución celular espinal temprana de p-ERK1/2 en relación con el tratamiento con PPF.

Este estudio fue diseñado para investigar si la administración intratecal preoperatoria de PPF atenúa la hiperalgesia incisional en un modelo de incisión plantar en ratas y si este efecto está asociado con la fosforilación de ERK1/2 o con cambios en la expresión de marcadores neuronales y gliales espinales y mediadores inflamatorios, como el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Más específicamente, este estudio difiere de informes previos en su combinación de evaluación conductual con análisis temporal mediante inmunotransferencia; en su comparación farmacológica con el inhibidor MEK1/2 U0126; y en su localización cualitativa mediante inmunofluorescencia de p-ERK1/2 en neuronas espinales, astrocitos y microglía dentro de un modelo de dolor incisional agudo. Aunque su marco mecanicista se basa en literatura previa que vincula la modulación glial y la señalización MAPK con el dolor, el presente trabajo tiene como objetivo proporcionar evidencia adicional sobre la posible participación de respuestas gliales relacionadas con ERK1/2 espinal en la fase temprana de la hiperalgesia incisional.

En comparación con los analgésicos posoperatorios convencionales, los enfoques dirigidos a vías específicas permiten probar un componente de señalización definido, pero pueden ofrecer solo beneficios de duración limitada y pueden requerir administración invasiva; la inhibición de MEK1/2–ERK1/2 ha demostrado efectos antihiperalgésicos en varios modelos experimentales de dolor^{20,21,22,23,24,25}. El PPF difiere de un inhibidor de una sola vía porque modula las respuestas gliales y se ha relacionado con más de un proceso asociado a MAPK^4,5,6. La traducción práctica sigue siendo limitada por el diseño preclínico, la administración intratecal preoperatoria, el uso exclusivo de ratas macho y la ausencia de estudios de ajuste de dosis y de seguridad en modelos quirúrgicos más grandes.

Protocolo

Los experimentos realizados fueron aprobados por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Lanzhou, Provincia de Gansu, China (número de aprobación ética 2017-070). Todos los procedimientos siguieron las directrices de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor²⁶. Se utilizaron un total de 66 ratas Sprague–Dawley macho adultas, obtenidas de un centro acreditado de animales de laboratorio, con un peso de 200–250 g. Solo se incluyeron ratas macho en este estudio para reducir la variabilidad potencial relacionada con las influencias hormonales dependientes del sexo. Todos los protocolos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor²⁶, y se tomaron las medidas necesarias para minimizar el sufrimiento. Se proporciona información detallada sobre los reactivos, materiales de consumo, instrumentos y software utilizados en este estudio en la Tabla de Materiales.

Animales

Las ratas se mantuvieron en parejas antes de la operación y de forma individual después de la incisión, con alimento y agua ad libitum. La habitación se mantuvo en un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad, con temperatura controlada a 24 °C ± 2 °C.

Modelo de inyección intratecal y dolor incisional

Para la administración intratecal de soluciones, las ratas fueron anestesiadas con sevoflurano al 1,5 %–3 % (administrado a través de una mascarilla nasal) y colocadas en posición prona con la columna vertebral flexionada. Se afeitó el vello de la región lumbar y se desinfectó la piel sobre el espacio intervertebral L5–L6. Se insertó una microjeringa percutáneamente en el espacio intervertebral L5–L6. La entrada exitosa en el espacio subaracnoideo se indicó mediante un movimiento repentino de la cola o sacudida de la cola durante el avance de la aguja, y se confirmó además por la aparición de líquido cefalorraquídeo al aspirar suavemente. Si no se observaban estos signos, se ajustaba la posición de la aguja antes de la inyección. La inyección se realizó únicamente después de cumplir ambos criterios de confirmación, y se excluyeron los animales que presentaron signos neurológicos anormales tras la inyección. Luego se inyectó lentamente la solución correspondiente y se limpió nuevamente la piel tras la inyección. El procedimiento quirúrgico duró aproximadamente 3 min, y las ratas generalmente recuperaron la conciencia entre 5 y 10 min después.

El modelo de rata de dolor incisional se estableció como se describió previamente²⁷. Tras la anestesia, la superficie plantar de la pata trasera se desinfectó con povidona-yodo al 10 %. Se realizó una incisión longitudinal de 1 cm en la piel plantar, comenzando aproximadamente a 0,5 cm del talón y extendiéndose hacia los dedos. La incisión atravesó la piel y la fascia. El músculo plantar se elevó suavemente con pinzas oftálmicas y se incidió longitudinalmente, manteniendo la continuidad general del tejido. Luego, el músculo se reposicionó, se aplicó presión suave para lograr la hemostasia y la herida se cerró con dos puntos de sutura en cinta utilizando nylon 3-0. El sitio de la incisión se desinfectó nuevamente tras el cierre. Tras la cirugía, las ratas se alojaron individualmente y se les permitió recuperarse en un ambiente cálido y tranquilo, protegidas de la luz intensa y con acceso libre a alimento y agua. Los animales se monitorearon en el período postoperatorio, y aquellos que no cumplían con los criterios predefinidos se excluyeron de inmediato. La infección de la herida se determinó en función de enrojecimiento, hinchazón y aumento de la temperatura local alrededor de la herida, exudado purulento anormal de color amarillo-verdoso con mal olor, retraso en la cicatrización con persistencia de la abertura de la herida, necrosis y aumento de tamaño, así como signos sistémicos como temperatura corporal elevada, letargo y rechazo a la alimentación. Otros criterios de exclusión incluyeron la falta de recuperación de la anestesia en 30 minutos, sección muscular intraoperatoria o lesión neurovascular, automutilación postoperatoria, establecimiento fallido del modelo y déficits neurológicos, como parálisis de la extremidad trasera o incapacidad para soportar peso no relacionada con el dolor incisional. Las ratas con infección o dehiscencia de la herida se excluyeron del estudio.

Medición del comportamiento

El umbral mecánico de retirada de la pata (UMRP) y la latencia térmica de retirada de la pata (LRP) se midieron por un investigador cegado respecto a la asignación de los grupos. Las pruebas se realizaron en una habitación tranquila, a una hora constante del día, tras al menos 10 minutos de aclimatación; se mantuvieron constantes el recinto, el suelo de malla o de vidrio, la luz ambiental y la intensidad de la fuente de calor en todos los grupos. Para la prueba del UMRP, se aplicaron filamentos de von Frey calibrados (0,4 g, 0,6 g, 1,0 g, 1,4 g, 2,0 g, 4,0 g, 6,0 g, 8,0 g, 10,0 g y 15,0 g) perpendicularmente a la superficie plantar adyacente a la herida hasta que el filamento se doblaba aproximadamente 1–2 mm. Las estimulaciones consecutivas se separaron por 2 minutos, y el UMRP al 50 % se determinó mediante el método ascendente-descendente²⁸. Para la prueba de LRP, las ratas se colocaron en recintos transparentes individuales sobre un suelo de vidrio, y la fuente de calor radiante se alineó con la superficie plantar junto a la herida. Se estableció un límite de corte de 30 s para prevenir lesiones tisulares, las exposiciones consecutivas se separaron por 2 minutos, y se registró la media de tres mediciones²⁹. Se consideró una respuesta positiva de retirada el levantamiento, sacudida o lamido de la pata; las pruebas afectadas por aseo, locomoción o pérdida de alineación con la fuente de calor se repitieron tras una nueva aclimatación.

Análisis de inmunotransferencia

En los tiempos predeterminados, las ratas fueron sacrificadas mediante dislocación cervical, y la médula espinal lumbar L4–L6 se extrajo rápidamente en tampón de lisis para ensayo de inmunoprecipitación con radioinmunoensayo suplementado con inhibidor de proteasas en una proporción de 100:1. El tejido se homogeneizó, se mantuvo en hielo durante 20 min y se centrifugó a 15.000 × g durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante se mezcló con tampón de carga 4× en una proporción de 3:1, se calentó en agua hirviendo durante 5 min y se almacenó a −80 °C. Las muestras de proteína (30 µg por carril) se separaron en geles de dodecilsulfato de sodio–poliacrilamida al 10% y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno de 0,45 o 0,22 µm. Se verificó la transferencia exitosa confirmando la migración esperada del marcador de peso molecular previamente teñido y la ausencia de regiones de transferencia desiguales u obviamente interrumpidas. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% y albúmina de suero bovino al 3% durante 2 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) o GAPDH (1:2.000). Después de lavar con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 al 0,05% (pH 7,4), las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:5.000) durante 1 h a temperatura ambiente. Las señales se desarrollaron mediante quimioluminiscencia mejorada y se registraron en película utilizando el mismo rango de exposición dentro de cada blanco. Un investigador cegado respecto a la asignación de los grupos analizó la densidad de las bandas con software de análisis de imágenes. Las imágenes se convirtieron a escala de grises de 8 bits, se aplicó una región rectangular idéntica de interés a cada banda, se restó el fondo local de una región adyacente en blanco y se registró la densidad integrada. Se utilizó el mismo tamaño de región y procedimiento de fondo para todos los carriles en cada membrana. NeuN, GFAP, Iba-1 y t-ERK1/2 se normalizaron respecto a GAPDH; p-ERK1/2 se normalizó respecto a t-ERK1/2; y luego los valores se expresaron en relación con el grupo en blanco.

Inmunofluorescencia

En los momentos predeterminados, las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico al 3 % (1,5 mL/kg) y perfundidas a través del corazón con 300 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) preenfriada 0,01 mol/L (pH 7,4), seguido de 250 mL de paraformaldehído al 4 % preenfriado. La médula espinal L4–L6 se postfijó en paraformaldehído al 4 % durante 6 h, se crioprotegió durante la noche en sacarosa al 20–30 % en PBS a 4 °C y se cortó en secciones de 10 µm a −22 °C. Las secciones se lavaron en PBS 0,01 mol/L, se bloquearon con suero de cabra al 10 % durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) o COX-2 (1:50). Tras tres lavados con PBS, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con fluoróforo verde o rojo (1:400) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron tres veces más con PBS y se montaron con medio antidesvanecimiento y una cubreobjetos. En cada tanda de tinción se incluyeron secciones de control negativo procesadas sin el anticuerpo primario. Las imágenes fueron adquiridas por un investigador cegado mediante un microscopio de fluorescencia. Se obtuvieron imágenes generales de baja magnificación utilizando un objetivo de 10×, mientras que las imágenes de inmunorreactividad celular y de co-localización se adquirieron con objetivos de 20× o 40× según el panel de la figura correspondiente. Para comparaciones dentro de la misma figura y tanda de tinción, se fijaron la magnificación del objetivo, la intensidad de iluminación, el tiempo de exposición, la ganancia del detector, la configuración de la cámara y los parámetros de procesamiento de imágenes tras la optimización por debajo de la saturación. Los canales de fluorescencia separados se adquirieron secuencialmente para minimizar el solapamiento entre canales. Por animal se capturaron tres campos no superpuestos en el asta dorsal ipsilateral. La intensidad de fluorescencia se cuantificó mediante software de análisis de imágenes tras la conversión a 8 bits, la sustracción del fondo utilizando una región sin células y la aplicación de una región de interés y un umbral idénticos dentro de cada tanda de tinción; los valores de los campos se promediaron para obtener un valor por animal. Se excluyeron y volvieron a adquirir bajo las mismas condiciones sin saturación los campos con sobreexposición, plegado del tejido, desgarros, enfoque deficiente o fondo irregular. La tinción se aceptó cuando la arquitectura del tejido estaba intacta, la señal objetivo superaba el control sin anticuerpo primario y no había pliegues, desgarros o regiones saturadas que afectaran al análisis.

In vitro experimentos con astrocitos espinales primarios

Los astrocitos espinales primarios de rata se cultivaron bajo condiciones estériles estándar en medio de cultivo completo a 37 °C en una incubadora humedecida con 5 % de CO₂. Las células se utilizaron cuando alcanzaron aproximadamente un 70 %–80 % de confluencia y se asignaron a los grupos control, estimulados con LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 y rescate de ERK1/2. El PPF y el U0126 se añadieron a 10 µM. La estimulación con LPS, el tratamiento con fármacos y las condiciones de recolección se mantuvieron idénticas en los pocillos paralelos dentro de cada experimento. Para el análisis de selectividad de vías, se recogieron lisados celulares para la inmunotransferencia de p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, p38 total, p-JNK y JNK total, junto con el control de carga correspondiente. Los sobrenadantes del cultivo de los pocillos paralelos se recogieron, se clarificaron mediante centrifugación y se analizaron para TNF-α, PGE2 e IL-6 mediante ensayo inmunoenzimático tipo ELISA según las instrucciones del fabricante. La densitometría de inmunotransferencia siguió los mismos principios de análisis de imagen descritos anteriormente. Para los experimentos de rescate, la ERK1/2 endógena se suprimió mediante transfección con siRNA, y se introdujo un constructo de expresión de ERK1/2 constitutivamente activa (CA-ERK1/2) antes del tratamiento. La eficiencia del silenciamiento y sobreexpresión se confirmó mediante inmunotransferencia antes de interpretar los datos de citocinas. Las células expuestas al reactivo de transfección sin siRNA activo ni constructo sirvieron como controles del procedimiento cuando fue aplicable.

Diseño experimental

Subagrupamiento de animales experimentales

Las ratas se asignaron a seis grupos mediante un método de tabla de números aleatorios, y la asignación a los grupos se completó antes de las pruebas conductuales y la recolección de tejidos. Los seis grupos comprendieron un grupo en blanco (n = 6), un grupo de dolor incisional (IP) (n = 18), un grupo de suero salino normal (NS) (NS al 0,9 %, 10 µL; n = 9), un grupo de PPF (10 µg en 10 µL; n = 12), un grupo de dimetilsulfóxido (DMSO) (DMSO al 10 %, 10 µL; n = 9) y un grupo U0126 (10 µg en 10 µL; n = 12). Las ratas del grupo en blanco no recibieron ni incisión plantar ni inyección intratecal y sirvieron como controles no tratados. Las ratas del grupo IP sufrieron una incisión plantar sin pretratamiento mediante inyección intratecal. Las ratas de los grupos NS, PPF, DMSO y U0126 recibieron la administración intratecal de sus respectivos agentes 30 min antes de la incisión plantar. El grupo NS sirvió como control vehicular para PPF, mientras que el grupo DMSO sirvió como control vehicular para U0126.

Dosis de propentofilina y U0126

La propentofilina es un modulador glial, y se seleccionó una dosis de 10 µg porque había aliviado la hiperalgesia aguda en estudios previos del grupo de investigación. U0126 es un inhibidor no competitivo con respecto al trifosfato de adenosina de MEK1/2 utilizado para bloquear la fosforilación de ERK1/2. Se han reportado dosis intratecales efectivas de 1–10 µg en diversos modelos de dolor^30,31,32; en el presente estudio se utilizó la dosis de 10 µg. U0126 se disolvió en dimetilsulfóxido al 10%, mientras que PPF se disolvió en solución salina normal al 0,9%. Las concentraciones finales fueron de 1 µg/µL. Los fármacos y los vehículos se prepararon antes de la cirugía, se mantuvieron a 4 °C y se utilizaron dentro de las 12 horas.

Efecto de la administración intratecal preoperatoria de propentofilina o U0126 sobre la hiperalgesia

Se seleccionaron aleatoriamente seis ratas de cada grupo para la medición del comportamiento 24 h antes de la operación, y los valores resultantes de PWMT y PWTL se designaron como valores basales. Las inyecciones intratecales se administraron 30 min antes de la operación. Para evaluar los efectos de la administración intratecal preoperatoria de PPF y U0126 sobre la hiperalgesia mecánica y térmica, se determinaron el PWMT y el PWTL a las 2 h, 4 h, 8 h, 24 h y 72 h posteriores a la incisión.

Diseño experimental para evaluar los efectos del propentofilina o la U0126 administradas intratecalmente antes de la cirugía sobre la expresión de marcadores neuronales y gliales en la médula espinal tras una incisión

Para determinar el punto temporal adecuado tras la incisión para la evaluación del efecto del tratamiento, primero se realizó un análisis preliminar de curso temporal en el grupo IP. Concretamente, las ratas del grupo IP fueron sacrificadas a las 2 h, 4 h, 24 h y 72 h posteriores a la incisión, y los niveles de expresión de los marcadores celulares NeuN, GFAP e Iba-1 en la médula espinal se midieron mediante inmunotransferencia (n = 3 por punto temporal). Según este análisis preliminar, las primeras 4 h tras la incisión se seleccionaron como una ventana temprana de observación postoperatoria porque la expresión de NeuN alcanzó su nivel máximo en el punto temporal de 4 h, y porque se consideró que los cambios moleculares tempranos eran los más relevantes para el desarrollo inicial de la hiperalgesia por incisión. Sin embargo, el punto temporal de 4 h no pretendía representar todos los cambios moleculares temporales posteriores a la incisión.

En este punto temporal seleccionado, las ratas que habían recibido una inyección intratecal fueron sacrificadas para realizar un análisis por inmunotransferencia de diferentes marcadores celulares (n = 3 por grupo) y una evaluación por inmunofluorescencia de la morfología de distintos tipos celulares (n = 3 por grupo). En el grupo control, las ratas fueron sacrificadas aleatoriamente para determinar los niveles básicos de expresión de diferentes marcadores celulares (NeuN, GFAP e Iba-1) en la médula espinal mediante inmunotransferencia (n = 3) y la morfología de diferentes células (neuronas, astrocitos y microglía) mediante inmunofluorescencia (n = 3). Por lo tanto, el grupo control sirvió como referencia basal sin incisión ni tratamiento.

Efectos del tratamiento sobre la p-ERK1/2 espinal y los mediadores inflamatorios

Para determinar el punto temporal postincisión adecuado para evaluar los efectos del tratamiento sobre la expresión de p-ERK1/2 y los niveles de citocinas inflamatorias, primero se realizó un análisis preliminar de curso temporal en el grupo IP. Específicamente, las ratas del grupo IP fueron sacrificadas a las 2 h, 4 h, 24 h y 72 h tras la incisión, y la expresión de p-ERK1/2 en la médula espinal se midió mediante inmunotransferencia (n = 3 por punto temporal). Con base en este experimento de curso temporal, junto con el momento en que la expresión de NeuN fue máxima tras la incisión, se seleccionó el tiempo de 4 h después de la incisión como punto fijo para la evaluación posterior de los efectos de la administración intratecal preoperatoria de PPF o U0126 sobre la expresión de p-ERK1/2 y las citocinas inflamatorias en la médula espinal. Este punto temporal se eligió como una ventana temprana de observación mecanicista, y no como una representación integral de todos los cambios temporales posteriores a la incisión.

En este punto temporal seleccionado, las ratas que habían recibido una inyección intratecal fueron sacrificadas para el análisis por inmunotransferencia de la expresión de p-ERK1/2 (n = 3 por grupo) y para la evaluación por inmunofluorescencia de citocinas inflamatorias (n = 3 por grupo). En el grupo control, las ratas fueron sacrificadas aleatoriamente para determinar los niveles básicos de expresión de p-ERK1/2 en la médula espinal mediante inmunotransferencia (n = 3) y de citocinas inflamatorias (TNF-α y COX-2) mediante inmunofluorescencia (n = 3). Por lo tanto, el grupo control sirvió como referencia sin incisión ni tratamiento.

Localización celular de la p-ERK1/2 espinal en neuronas, astrocitos y microglía

Para evaluar más a fondo la distribución celular de la p-ERK1/2 espinal tras la incisión, se realizó una tinción de inmunofluorescencia en los grupos Control e IP a las 4 h posteriores a la incisión (n = 3).

Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± desviación estándar. El tamaño de la muestra se determinó con referencia a estudios previos del grupo de investigación y experimentos preliminares. Los datos conductuales se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías con medidas repetidas, utilizando el grupo como factor entre sujetos y el tiempo como factor dentro de los sujetos. Los datos de inmunotransferencia en función del tiempo se evaluaron mediante ANOVA de una vía seguido de comparaciones por pares ajustadas según Bonferroni. Los datos de inmunotransferencia e inmunofluorescencia en tiempos fijos se evaluaron mediante ANOVA de una vía con comparaciones planificadas ajustadas según Bonferroni; las comparaciones entre dos grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. La normalidad y la homogeneidad de la varianza se evaluaron con las pruebas de Shapiro–Wilk y de Levene, respectivamente. Se consideró significativo un valor p bilateral < 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron con el software de análisis estadístico que se enumera en la Tabla de Materiales. Para los experimentos in vitro con astrocitos, los experimentos independientes de cultivo se trataron como la unidad de análisis; la densitometría de inmunotransferencia y las concentraciones de citocinas se compararon utilizando ANOVA de una vía seguido de comparaciones planificadas ajustadas según Bonferroni o la prueba t de Student para comparaciones prespecificadas entre dos grupos, según correspondiera.

DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

Resultados

Los efectos de la incisión y de la administración intratecal preoperatoria de propentofilina o U0126 sobre la hiperalgesia tras la incisión

Hiperalgia mecánica

No hubo diferencias significativas en los PWMT entre los seis grupos a las 24 h antes de la operación (p > 0,05; Figura 1A,B). En el grupo IP, el PWMT disminuyó tras la incisión y permaneció significativamente más bajo que el valor basal desde las 2 h hasta las 72 h posteriores a la incisión (p < 0,05 frente al valor basal; Figura 1A). En los grupos NS y DMSO, no hubo diferencias significativas en los PWMT entre los diferentes momentos tras la incisión (p > 0,05 frente al grupo IP; Figura 1B). En el grupo PPF, el PWMT fue significativamente mayor que en el grupo IP desde las 2 h hasta las 72 h posteriores a la incisión (p < 0,05 frente al grupo IP; Figura 1A), y a las 72 h tras la incisión, ya no mostró una diferencia significativa frente al valor basal (p > 0,05 frente al valor basal; Figura 1A). En el grupo U0126, los PWMT fueron significativamente mayores que en el grupo IP durante las primeras 24 h tras la incisión (p < 0,05 frente al grupo IP; Figura 1A), pero este efecto no se mantuvo a las 72 h tras la incisión, momento en el que el PWMT permaneció significativamente más bajo que el valor basal y ya no mostró una diferencia significativa frente al del grupo IP (p < 0,05 frente al valor basal; p > 0,05 frente al grupo IP; Figura 1A).

Hiperalgia térmica

No hubo diferencias significativas en los LMTD entre los seis grupos a las 24 h antes de la operación (p > 0,05; Figura 1C,D). En el grupo IP, el LMTD disminuyó de 24,85 s ± 1,06 s antes de la operación a 4,38 s ± 1,02 s a las 4 h después de la incisión y luego aumentó parcialmente hasta 18,37 s ± 1,38 s a las 72 h después de la incisión, pero permaneció significativamente más bajo que el valor basal durante todo el período de observación (p < 0,05 frente a basal; Figura 1C). En los grupos NS y DMSO, no hubo diferencias significativas en los LMTD entre los diferentes momentos después de la incisión (p > 0,05 frente a el grupo IP; Figura 1D). En el grupo PPF, el LMTD fue significativamente mayor que en el grupo IP durante todo el período de observación de 72 h (p < 0,05 frente al grupo IP; Figura 1C), y a las 72 h después de la incisión, había regresado a un nivel que no era significativamente diferente del valor basal (p > 0,05 frente al basal; Figura 1C). En el grupo U0126, el LMTD fue significativamente mayor que en el grupo IP durante las primeras 24 h después de la incisión (p < 0,05 frente al grupo IP; Figura 1C); este efecto no se mantuvo a las 72 h después de la incisión, momento en el cual el LMTD permaneció significativamente más bajo que el valor basal y ya no fue significativamente diferente al del grupo IP (p < 0,05 frente al basal; p > 0,05 frente al grupo IP; Figura 1C).

Análisis por inmunotransferencia de los cambios temporales en la expresión de marcadores celulares espinales y en la fosforilación de la quinasa regulada por señales extracelulares 1 y 2 tras una incisión

Se identificaron varias bandas en pesos moleculares exactos con un anticuerpo específico en las membranas de PVDF, incluyendo NeuN (48 y 50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD) y GAPDH (36 kD). La banda de GAPDH se utilizó como control para NeuN, GFAP, Iba-1 y t-ERK1/2, y la banda de t-ERK1/2 se utilizó como control para p-ERK1/2.

Los datos de inmunotransferencia de las médulas espinales en el grupo IP mostraron aumentos de diversos grados tras la incisión (Figura 2A). La expresión de la proteína nuclear específica de neuronas alcanzó su valor máximo a las 4 h posteriores a la incisión (p < 0,001 frente al valor basal; Figura 2A) y permaneció significativamente elevada a las 72 h tras la incisión (p < 0,001 frente al valor basal; Figura 2A). Los niveles de la proteína ácida fibrilar glial aumentaron gradualmente durante el período de observación de 72 h (p < 0,001 frente al valor basal; Figura 2A), con el nivel más alto observado a las 72 h entre los puntos temporales medidos. De manera similar, Iba-1 también alcanzó un nivel significativamente aumentado a las 4 h tras la incisión (p < 0,001 frente al valor basal; Figura 2A) y fluctuó dentro de un rango pequeño. Cabe destacar que los datos de inmunotransferencia de las médulas espinales en el grupo IP mostraron que la activación de ERK1/2 solo aumentó durante las primeras 24 h tras la incisión (p < 0,05 frente al valor basal; Figura 2B), pero disminuyó a las 72 h tras la incisión (p < 0,05 frente al valor basal; Figura 2B), mientras que la expresión de t-ERK/2 no mostró cambios significativos en ninguno de los puntos temporales.

Análisis por inmunotransferencia de los efectos de la administración intratecal preoperatoria de propentofilina o U0126 sobre la expresión de marcadores celulares y de la quinasa regulada por señales extracelulares fosforilada 1 y 2 en la médula espinal

Los datos de inmunotransferencia mostraron que la expresión de NeuN alcanzó su nivel más alto a las 4 h después de la incisión, momento en el que la medición conductual estaba en su umbral más bajo. Por lo tanto, se evaluaron los efectos sobre la expresión del marcador celular y la fosforilación de ERK1/2 de PPF y U0126 administrados intratecalmente 30 min antes de la operación, a las 4 h posteriores a la incisión.

Los datos de inmunotransferencia mostraron que, en comparación con el grupo control, la expresión espinal de todos los marcadores celulares aumentó significativamente en el grupo IP a las 4 h posteriores a la incisión (p < 0,05 frente al valor basal; Figura 3). En comparación con el grupo IP, la administración intratecal preoperatoria de PPF redujo la expresión espinal de NeuN (p < 0,05 frente al grupo IP; Figura 3A), GFAP (p < 0,05 frente al grupo IP; Figura 3B) e Iba-1 (p < 0,01 frente al grupo IP; Figura 3C). En comparación con el grupo IP, la administración intratecal preoperatoria de U0126 también redujo la expresión espinal de NeuN (p < 0,01 frente al grupo IP; Figura 3D), GFAP (p < 0,05 frente al grupo IP; Figura 3E) e Iba-1 (p < 0,01 frente al grupo IP; Figura 3F). Sin embargo, cuando se comparó con el grupo control, la expresión de NeuN en el grupo PPF permaneció significativamente más alta que el valor basal (p < 0,01 frente al valor basal; Figura 3A), mientras que la expresión de NeuN en el grupo U0126 fue significativamente menor que en el grupo control (p < 0,01 frente al valor basal; Figura 3D). Para GFAP e Iba-1, el texto ahora enfatiza la comparación con el grupo IP, como se muestra en Figura 3. La administración intratecal preoperatoria de NS y DMSO no tuvo ningún efecto significativo sobre la expresión de ninguno de los marcadores celulares.

Los datos de inmunotransferencia mostraron que la expresión de t-ERK1/2 en la médula espinal no difirió significativamente entre los grupos Control, IP, NS y PPF a las 4 h posteriores a la incisión (Figura 4A). En contraste, en comparación con el grupo control, la expresión de p-ERK1/2 aumentó significativamente en los grupos IP y NS a las 4 h posteriores a la incisión (p < 0,001 frente al grupo control; Figura 4B). En comparación con el grupo IP, la administración intratecal preoperatoria de PPF redujo significativamente la expresión de p-ERK1/2 a las 4 h posteriores a la incisión (p < 0,001 frente al grupo IP; Figura 4B). Comparado con el grupo NS, la expresión de p-ERK1/2 en el grupo PPF también fue significativamente menor (p < 0,01 frente al grupo NS; Figura 4B). Sin embargo, en comparación con el grupo control, la expresión de p-ERK1/2 en el grupo PPF permaneció significativamente elevada a las 4 h posteriores a la incisión. De manera similar, la expresión de t-ERK1/2 en la médula espinal no difirió significativamente entre los grupos Control, IP, DMSO y U0126 a las 4 h posteriores a la incisión (Figura 4C). En comparación con el grupo control, la expresión de p-ERK1/2 aumentó significativamente en los grupos IP y DMSO a las 4 h posteriores a la incisión (p < 0,001 frente al grupo control; Figura 4D). En comparación con el grupo IP, la administración intratecal preoperatoria de U0126 redujo significativamente la expresión de p-ERK1/2 (p < 0,001 frente al grupo IP; Figura 4D). Comparado con el grupo DMSO, la expresión de p-ERK1/2 en el grupo U0126 también fue significativamente menor (p < 0,001 frente al grupo DMSO; Figura 4D). Notablemente, en comparación con el grupo control, la expresión de p-ERK1/2 en el grupo U0126 no mostró diferencias significativas respecto al grupo control a las 4 h posteriores a la incisión. El pretratamiento con NS o DMSO no tuvo un efecto significativo sobre la expresión de p-ERK1/2 en comparación con el grupo IP.

Observaciones de inmunofluorescencia de marcadores celulares espinales y mediadores inflamatorios

Los resultados de inmunofluorescencia mostraron cualitativamente una inmunorreactividad más intensa de NeuN en el asta dorsal ipsilateral a las 4 h después de la incisión en comparación con el lado contralateral (Figura 5). En el grupo control, imágenes representativas mostraron la inmunorreactividad basal de NeuN, GFAP e Iba-1 en el asta dorsal ipsilateral de la médula espinal (Figura 6A–C). En el grupo IP, la inmunorreactividad de NeuN fue cualitativamente más intensa que en el grupo control (Figura 6D vs Figura 6A), la inmunorreactividad de GFAP también fue mayor (Figura 6E vs Figura 6B) y la inmunorreactividad de Iba-1 aumentó asimismo (Figura 6F vs Figura 6C). Concurrentemente, en el grupo IP las astrocitos y microglías aparecieron hipertrofiados, con cuerpos celulares más grandes y prolongaciones más gruesas y altamente ramificadas (Figura 6E,F).

En el grupo PPF, las imágenes representativas sugirieron una inmunorreactividad más débil de NeuN en comparación con el grupo IP (Figura 6G vs Figura 6D), una inmunorreactividad más débil de GFAP (Figura 6H vs Figura 6E) y una inmunorreactividad más débil de Iba-1 (Figura 6I vs Figura 6F). En el grupo U0126, las imágenes representativas también indicaron una inmunorreactividad más débil de NeuN en comparación con el grupo IP (Figura 6J vs Figura 6D), una inmunorreactividad más débil de GFAP (Figura 6K vs Figura 6E) y una inmunorreactividad más débil de Iba-1 (Figura 6L vs Figura 6F). En ambos grupos, PPF y U0126, los astrocitos y la microglía aparecieron menos hipertrofiados, con cuerpos celulares más pequeños y procesos menos numerosos y más delgados (Figura 6H,I,K,L). El análisis correspondiente de intensidad de fluorescencia de NeuN, GFAP e Iba-1 fue coherente con las observaciones representativas de inmunofluorescencia (Figura 6M–O, respectivamente).

A las 4 h después de la incisión, la inmunorreactividad y la intensidad de fluorescencia relativa de TNF-α y COX-2 aumentaron en el asta dorsal ipsilateral del grupo IP en comparación con el grupo control. Ambas medidas fueron menores tras el tratamiento intratecal preoperatorio con PPF o U0126 (Figura 7A–C).

Localización celular de p-ERK1/2 espinal mediante inmunofluorescencia

Los resultados de inmunofluorescencia mostraron que, en el grupo control, la inmunorreactividad de p-ERK1/2 era débil en la médula espinal y se observaba únicamente en neuronas positivas para NeuN (Figura 8A–C). En contraste, a las 4 h después de la incisión, la inmunorreactividad de p-ERK1/2 aumentó notablemente en el asta dorsal ipsilateral de la médula espinal y se localizó no solo en neuronas, sino también en astrocitos positivos para GFAP y en microglía positiva para Iba-1 (Figura 8D–I). Este hallazgo indica que la incisión indujo una distribución celular más amplia de p-ERK1/2, que pasó de estar presente únicamente en neuronas bajo condiciones basales a encontrarse en neuronas, astrocitos y microglía tras la lesión.

Validación in vitro del mecanismo dependiente de ERK1/2 en astrocitos espinales

Para evaluar más a fondo si el PPF podría suprimir la liberación de mediadores inflamatorios a través de la señalización relacionada con ERK1/2 a nivel celular, se estimularon astrocitos espinales primarios de rata con LPS y se trataron con PPF o U0126 (10 µM). El análisis por inmunotransferencia mostró que el PPF redujo la expresión de p-ERK1/2 inducida por LPS, mientras que la fosforilación de p-p38 y p-JNK no cambió notablemente (Figura 9A), lo que respalda una selectividad relativa de la vía ERK1/2 bajo estas condiciones. Paralelamente, el PPF redujo los niveles de TNF-α, PGE2 (un producto downstream de la actividad de COX-2) e IL-6 en el sobrenadante de cultivo en comparación con el grupo Estimulado; U0126 produjo efectos inhibitorios similares (Figura 9B).

Para comprobar si la activación persistente de ERK1/2 podría debilitar el efecto antiinflamatorio de PPF, se realizaron experimentos de rescate. Se silenció ERK1/2 endógeno mediante ARNip, y posteriormente se introdujo un constructo de ERK1/2 constitutivamente activo (CA-ERK1/2) (Figura 9C). En astrocitos que expresaban CA-ERK1/2, PPF ya no redujo los niveles de TNF-α, PGE2 ni IL-6 en la misma medida (Figura 9D), lo que indica que la supresión de la fosforilación de ERK1/2 contribuye al efecto antiinflamatorio de PPF en este sistema de astrocitos in vitro.

En conjunto, estos hallazgos in vitro proporcionan apoyo mecanicista a nivel celular de que el PPF atenúa la liberación de mediadores inflamatorios mediante un mecanismo dependiente de ERK1/2 en astrocitos espinales, complementando los datos observacionales in vivo.

Figura 1: Efectos del PPF o U0126 intratecal preoperatorio sobre la hiperalgesia mecánica y térmica inducida por incisión. (A) Umbral mecánico de retirada del peso (PWMT) en los grupos blanco, IP, PPF y U0126. (B) Umbral mecánico de retirada del peso (PWMT) en los grupos IP y control con vehículo. (C) Latencia térmica de retirada del peso (PWTL) en los grupos blanco, IP, PPF y U0126. (D) Latencia térmica de retirada del peso (PWTL) en los grupos IP y control con vehículo. Los datos corresponden a la media ± DE (n = 6 ratas por grupo) y se analizaron mediante un ANOVA de medidas repetidas de dos vías. ***p < 0,001 frente al valor basal; #p < 0,05, ##p < 0,01 y ###p < 0,001 frente al grupo IP. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Curso temporal de la expresión de marcadores celulares espinales y la fosforilación de ERK1/2 tras la incisión. (A) Cuantificación y blottes Western representativos de NeuN, GFAP e Iba-1 en el grupo IP desde la línea base hasta 72 h después de la incisión. (B) Cuantificación y blottes Western representativos de t-ERK1/2 y p-ERK1/2 durante el mismo período. Los valores se normalizaron respecto al grupo control (100%) y se muestran como media ± DE (n = 3 ratas por punto temporal). Las diferencias generales se analizaron mediante ANOVA unidireccional con las comparaciones por pares indicadas. *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 frente a la línea base. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Efectos del PPF o U0126 intratecal preoperatorio sobre los marcadores neuronales y gliales espinales a las 4 h posteriores a la incisión. (A–C) NeuN, GFAP e Iba-1 en los grupos control, IP, suero fisiológico y PPF. (D–F) NeuN, GFAP e Iba-1 en los grupos control, IP, dimetilsulfóxido y U0126. A la derecha se muestran inmunotransferencias representativas. Los valores se normalizaron respecto al grupo control (100%) y se expresan como media ± DE (n = 3 ratas por grupo). *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 frente al grupo control; #p < 0,05 y ##p < 0,01 frente al grupo IP; Δp < 0,05, ΔΔp < 0,01 y ΔΔΔp < 0,001 frente al grupo correspondiente tratado con vehículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Efectos del PPF o U0126 intratecal preoperatorio sobre la fosforilación de ERK1/2 espinal a las 4 h después de la incisión. (A,B) t-ERK1/2 y p-ERK1/2 en los grupos blanco, IP, suero fisiológico y PPF. (C,D) t-ERK1/2 y p-ERK1/2 en los grupos blanco, IP, dimetilsulfóxido y U0126. A la derecha se muestran inmunotransferencias representativas. Los valores se normalizaron respecto al grupo blanco (100%) y se expresan como media ± DE (n = 3 ratas por grupo). **p < 0,01 y ***p < 0,001 frente al grupo blanco; ###p < 0,001 frente al grupo IP; ΔΔp < 0,01 y ΔΔΔp < 0,001 frente al grupo correspondiente control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Inmunorreactividad espinal ipsilateral y contralateral a NeuN tras la incisión. Una sección transversal representativa de la médula espinal lumbar del grupo IP a las 4 h después de la incisión muestra la tinción de NeuN en los cuernos dorsales contralateral e ipsilateral. La imagen es representativa de n = 3 ratas y se proporciona para comparación anatómica cualitativa. Barra de escala = 500 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Efectos del PPF y la U0126 en la inmunorreactividad neuronal y glial espinal a las 4 h después de la incisión. (A–C) NeuN, GFAP e Iba-1 en el grupo control. (D–F) Tinciones correspondientes en el grupo IP. (G–I) Tinciones correspondientes tras el tratamiento con PPF. (J–L) Tinciones correspondientes tras el tratamiento con U0126. (M–O) Intensidades relativas de fluorescencia de NeuN, GFAP e Iba-1, respectivamente. Las barras muestran la media ± DE (n = 3 ratas por grupo); *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 para las comparaciones indicadas. Barras de escala = 200 µm. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Inmunorreactividad de TNF-α y COX-2 espinales tras la incisión y el tratamiento. (A) Imágenes representativas de TNF-α y COX-2 de los grupos control, IP, PPF y U0126 a las 4 h posteriores a la incisión. (B) Intensidad relativa de fluorescencia de TNF-α. (C) Intensidad relativa de fluorescencia de COX-2. Las barras muestran la media ± DE (n = 3 ratas por grupo); ***p < 0,001 para las comparaciones indicadas. Barras de escala = 200 µm. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: Localización celular de p-ERK1/2 espinal a las 4 h tras la incisión. (A–C) Inmunomarcación doble de p-ERK1/2 con NeuN, GFAP e Iba-1, respectivamente, en el grupo control. (D–F) Inmunomarcación doble correspondiente en el grupo IP; las flechas identifican células representativas con co-localización. El color rojo indica p-ERK1/2, el verde indica el marcador celular y el amarillo indica co-localización. (G–I) Intensidades de fluorescencia relativas asociadas con regiones positivas para NeuN, GFAP e Iba-1, respectivamente. Las barras muestran la media ± DE (n = 3 ratas por grupo); **p < 0,01 y ***p < 0,001 para las comparaciones indicadas. Barras de escala = 100 µm. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 9: Efectos antiinflamatorios dependientes de ERK1/2 de PPF en astrocitos espinales primarios de rata. (A) Inmunotransferencias representativas que muestran que PPF redujo la p-ERK1/2 inducida por LPS sin un efecto evidente sobre p-p38 o p-JNK. (B) Concentraciones de TNF-α, PGE2 e IL-6 en sobrenadantes de cultivo tras tratamiento con LPS, PPF o U0126. (C) Inmunotransferencias que confirman la reducción de ERK1/2 mediada por ARNip y la expresión de ERK1/2 constitutivamente activa (CA-ERK1/2). (D) Concentraciones de TNF-α, PGE2 e IL-6 tras la expresión de CA-ERK1/2 con o sin PPF. Las barras muestran la media ± DE de experimentos in vitro independientes; ***p < 0,001 para las comparaciones indicadas; ns, no significativo. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: Datos que respaldan los hallazgos de este estudio.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La mayoría de los pacientes sufren dolor agudo después de la cirugía, no solo físicamente sino incluso en ocasiones mentalmente³³, aunque aún se desconocen muchos aspectos sobre los mecanismos detallados del dolor postoperatorio agudo. Junto con los potentes efectos de los medicamentos analgésicos vienen sus efectos secundarios inevitables, lo que hace de vital importancia la exploración de analgésicos más seguros y eficaces. Este estudio se basó en un modelo de rata con incisión previamente validado para simular el dolor postoperatorio agudo, que era fácil y factible de preparar²⁷. El presente estudio evaluó los cambios en los marcadores neuronales y gliales espinales, la fosforilación de ERK1/2 y los mediadores inflamatorios tras la incisión, y examinó si el efecto antihiperalgésico de la administración intratecal preoperatoria de PPF se asociaba con cambios paralelos en la fosforilación espinal de ERK1/2 y en la expresión de citoquinas inflamatorias.

Tras la incisión, las ratas del grupo IP desarrollaron una hiperalgesia mecánica y térmica intensa, mientras que el pretratamiento con vehículo no tuvo ningún efecto detectable sobre los resultados conductuales ni moleculares. Estos hallazgos respaldan la estabilidad del modelo e indican que los efectos observados en los grupos PPF y U0126 probablemente no se debieron al procedimiento de inyección ni al vehículo en sí. Además, aunque la expresión de NeuN aumentó tras la incisión, este cambio debe interpretarse con cautela como una variación en la expresión del marcador neuronal, más que como evidencia directa de activación neuronal. En conjunto, estas observaciones proporcionan la base para examinar las respuestas relacionadas con la glía y con ERK1/2 en las fases iniciales del dolor postincisional.

Se ha demostrado que las células gliales desempeñan un papel importante en la formación sináptica, la transmisión e integración de la información sináptica y la regulación de la plasticidad sináptica. Las funciones inmunológicas y proinflamatorias de las células gliales en el procesamiento del dolor, y especialmente de los astrocitos y microglía espinales activados, pueden potenciar la sensibilización central implicada en la mediación de la hiperalgesia y los cambios conductuales posoperatorios^7,34. Los cambios neurológicos maladaptativos en la médula espinal pueden provocar una mayor respuesta a estímulos nocivos o no nocivos. Hay evidencia considerable de que la activación de los astrocitos y la microglía espinales está implicada en el desarrollo y mantenimiento de la hiperalgesia en modelos de lesión del nervio espinal³⁵, dolor inducido por activador tisular del plasminógeno¹⁶, dolor incisional^11,12 y dolor por cáncer óseo^19,31. Por lo tanto, la activación glial espinal parece ser una característica común de múltiples estados de dolor, y una mayor exploración de su papel en el dolor incisional podría ampliar el entendimiento actual de los mecanismos del dolor posoperatorio.

Los hallazgos actuales respaldan la idea de que los astrocitos y la microglía espinales participan en la respuesta neuroinflamatoria temprana tras una incisión¹². En lugar de mostrar patrones temporales idénticos, GFAP, Iba-1 y p-ERK1/2 presentaron cursos temporales parcialmente distintos, lo que sugiere que diferentes procesos relacionados con las células gliales podrían contribuir a distintas fases del desarrollo del dolor posoperatorio^31,35. Los hallazgos de inmunofluorescencia respaldaron aún más esta interpretación al mostrar cambios morfológicos hipertrofiantes en astrocitos y microglía tras la incisión. Junto con los aumentos en la inmunorreactividad de TNF-α y COX-2, estas observaciones son coherentes con la idea de que la señalización inflamatoria asociada a las células gliales contribuye a la hiperalgesia aguda por incisión^7,36.

La propentofilina, un derivado de la metilxantina, fue estudiada inicialmente como un fármaco activo sobre el flujo sanguíneo cerebral debido a su actividad antiplaquetaria y su apoyo al mantenimiento de la memoria a largo plazo³⁷. Sin embargo, el efecto regulador de la PPF sobre las células gliales la convierte también en un fármaco analgésico potencialmente valioso. Estudios indican que la PPF puede impedir la activación de la microglía al inhibir la descomposición del adenosín monofosfato cíclico intracelular y reducir la recaptación del adenosín extracelular^4,5. En un estudio in vitro, la PPF inhibió la proliferación de los astrocitos al dificultar la vía del blanco mamífero de la rapamicina inducida por el TNF-α⁶. Por tanto, es el efecto regulador de la PPF sobre las células gliales lo que posibilita su participación en la modulación de los procesos del dolor.

El efecto antihiperalgésico sostenido del PPF en el presente estudio, junto con la reducción en la expresión de GFAP y Iba-1, respalda la interpretación de que la modulación glial es un componente importante de la acción analgésica del PPF en este modelo. Estudios previos también han sugerido que el PPF podría suprimir la señalización inflamatoria relacionada con la glía en estados de dolor^5,31. Además, la reducción paralela en TNF-α y COX-2 sugiere que el PPF podría atenuar el dolor postoperatorio en parte al disminuir las respuestas inflamatorias asociadas a la glía. Sin embargo, dado que los datos actuales son asociativos y no mecanicistas, estos hallazgos deben interpretarse como un respaldo a la participación de la glía, más que como una prueba de una vía causal directa.

Se ha demostrado que la participación de ERK1/2, un par de importantes quinasas reguladas por señales intracelulares, en el desarrollo y mantenimiento de diferentes procesos del dolor (mediando la excitabilidad neuronal y la plasticidad sináptica en el cerebro y la médula espinal)²¹. Por ejemplo, un estudio mostró que la inyección de capsaicina o formalina indujo un aumento breve y rápido de p-ERK1/2 en la médula espinal, pero la activación espinal de ERK1/2 persistió mucho más tiempo tras la inyección de adyuvante completo de Freund o veneno de abeja (tras una breve latencia)^38,39. Por el contrario, en otro estudio, la activación espinal de ERK1/2 inducida por lesión nerviosa alcanzó su punto máximo extremadamente temprano y persistió durante cierto tiempo, con el desarrollo de hiperalgesia tras el pico de p-ERK1/2³⁵. Por lo tanto, la fosforilación de ERK1/2 puede ocurrir en diferentes etapas de diversos procesos del dolor, y el aumento de p-ERK1/2 en la médula espinal podría ser importante tanto para la inducción inmediata como para la respuesta génica a largo plazo.

En el presente estudio, la fosforilación inducida por la incisión de ERK1/2 aumentó significativamente durante las primeras 24 h tras la incisión en comparación con el grupo control, y la expresión de p-ERK1/2 alcanzó su punto máximo a las 4 h después de la incisión (como se describió previamente)²⁴, coincidiendo con el momento en que la expresión de NeuN fue más alta. Concurrentemente, según revelaron los resultados de inmunofluorescencia, la fosforilación inducida por la incisión de ERK1/2 se distribuyó simultáneamente en neuronas, astrocitos y microglía en el asta dorsal medular ipsilateral, lo que respalda la idea de que la señalización relacionada con ERK1/2 es particularmente relevante para la fase temprana de la hiperalgesia posincisión. Además, la administración intratecal preoperatoria de U0126 redujo la expresión de los marcadores gliales medulares, NeuN y p-ERK1/2 a las 4 h tras la incisión, y alivió tanto la hiperalgesia mecánica como térmica durante el período temprano posincisión, lo que sugiere que el p-ERK1/2 medular podría estar implicado en la etapa inicial de la hiperalgesia aguda tras la incisión. Sin embargo, dado que GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 y los resultados conductuales mostraron perfiles temporales diferentes, la presente interpretación mecanicista debería limitarse a la etapa temprana posincisión representada por el momento de las 4 h, y no generalizarse a todo el período posoperatorio.

Además, en el presente estudio, la administración intratecal preoperatoria de PPF también redujo la fosforilación de ERK1/2 a las 4 h posteriores a la incisión, lo que sugiere que los cambios observados en la expresión espinal de NeuN, GFAP e Iba-1 podrían estar asociados, al menos en parte, con la señalización relacionada con ERK1/2. La administración intratecal preoperatoria de U0126 también disminuyó la inmunorreactividad de TNF-α y COX-2, lo que respalda una posible asociación entre la fosforilación de ERK1/2 y la expresión de mediadores inflamatorios tras la incisión. Los experimentos adicionales in vitro con astrocitos mostrados en la Figura 9 proporcionaron evidencia a nivel celular de un componente antiinflamatorio dependiente de ERK1/2, ya que la activación persistente de ERK1/2 debilitó la capacidad del PPF para reducir la liberación de TNF-α, PGE2 e IL-6. Sin embargo, dado que estos experimentos de rescate se realizaron en astrocitos cultivados y no en la médula espinal intacta, y porque no se llevaron a cabo manipulaciones de rescate in vivo ni selectivas por tipo celular, las conclusiones in vivo aún deben interpretarse como apoyo, y no como prueba definitiva, de un mecanismo causal dependiente de ERK1/2.

Para analizar más a fondo las posibles relaciones entre la activación de las células gliales, la expresión de p-ERK1/2 y la liberación de citoquinas inflamatorias, se consideraron los patrones de localización espacial observados mediante inmunofluorescencia. Tras la incisión, p-ERK1/2 se expresó conjuntamente con astrocitos positivos para GFAP y microglía positiva para Iba-1 en el asta dorsal espinal a las 4 h posteriores a la incisión. Combinados con los hallazgos de inmunotransferencia e inmunofluorescencia que muestran que tanto el PPF como el U0126 se asociaron con una reducción en la expresión de p-ERK1/2, TNF-α y COX-2, estos datos sugieren que la fosforilación de ERK1/2 en las células gliales espinales podría estar implicada en la respuesta inflamatoria tras la incisión. Los datos in vitro obtenidos en astrocitos primarios respaldan aún más un vínculo celular directo entre el tratamiento con PPF, la supresión de ERK1/2 y la liberación de mediadores inflamatorios. Sin embargo, la evidencia in vivo demuestra asociaciones y cambios paralelos relacionados con el tratamiento, mientras que los experimentos celulares complementan, pero no sustituyen, la validación causal específica por tipo celular in vivo. Dado que el análisis de inmunofluorescencia se basó en un número limitado de animales y campos, estas observaciones deben interpretarse con cautela y en conjunto con los hallazgos de inmunotransferencia y in vitro.

Varios pasos del procedimiento tienen un efecto desproporcionado en la reproducibilidad. La inyección intratecal requiere tanto una respuesta característica de la cola como la confirmación del líquido cefalorraquídeo; la resistencia durante la inyección, la ausencia de confirmación o un nuevo déficit neurológico deben llevar al descarte en lugar de una reinyección en el mismo sitio. Las pruebas conductuales son sensibles a la aclimatación, las condiciones del recinto, la colocación del estímulo y las expectativas del investigador, por lo que el enmascaramiento, los intervalos fijos y unas condiciones ambientales constantes son esenciales. El momento de la recolección de tejidos, la transferencia uniforme de proteínas, la incubación con anticuerpos y la configuración idéntica del microscopio dentro de cada lote de tinción son igualmente importantes. Los problemas comunes incluyen umbrales variables de retirada debido a una aclimatación inadecuada, bandas débiles o irregulares en el inmunotransferido por transferencia incompleta o sobreexposición, y un fondo de fluorescencia elevado debido a lavados insuficientes, concentración excesiva de anticuerpos o ajustes de adquisición saturados.

El protocolo puede modificarse según la pregunta científica. Puede utilizarse un curso temporal más amplio cuando interese estudiar respuestas gliales tardías, y pueden añadirse estudios de dosis o vías alternativas de administración cuando se priorice la viabilidad traslacional. En comparación con modelos de dolor inflamatorio o neuropático, el modelo de incisión plantar es relativamente rápido y práctico, y reproduce una lesión postoperatoria definida²⁷. Combinar pruebas conductuales, inmunotransferencia (Western blot) e inmunofluorescencia asociada a células proporciona información funcional, molecular y espacial complementaria; sin embargo, requiere más recursos que un ensayo con un único punto final y por sí solo no establece causalidad específica a nivel celular. La comparación farmacológica con U0126 refuerza la interpretación de la vía implicada, pero sigue siendo menos específica que la manipulación genética o selectiva por tipo celular^{20,21,22,23,24,25}.

Las aplicaciones futuras incluyen la evaluación de ambos sexos, lesiones quirúrgicas más extensas, vías de administración clínicamente viables, puntos temporales adicionales posteriores a la cirugía e intervenciones dirigidas a poblaciones gliales específicas. El flujo de trabajo es práctico para cribar tratamientos analgésicos o moduladores de la glía porque el modelo de incisión es breve, los parámetros conductuales son repetibles y los ensayos moleculares utilizan métodos de laboratorio estándar. Sin embargo, la reproducibilidad depende de criterios de exclusión preespecificados, la evaluación ciega de los resultados, la adquisición constante de imágenes y la presentación completa de los datos brutos y de los parámetros de análisis.

Limitaciones

Este estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, el modelo de incisión plantar en la pata representa una lesión quirúrgica relativamente menor y puede no reflejar completamente procedimientos quirúrgicos más extensos, como la toracotomía o la laparotomía. Por lo tanto, se requiere precaución al extrapolar los hallazgos actuales a otras formas de dolor posoperatorio. Además, solo se incluyeron ratas Sprague–Dawley macho, lo que limita la generalización de estos hallazgos a ambos sexos. Dadas las diferencias conocidas según el sexo en las respuestas al dolor, los efectos analgésicos y los patrones de activación glial, se justifican estudios adicionales que incluyan animales hembra.

Las principales observaciones moleculares e histológicas se centraron en el punto temporal de 4 h posteriores a la incisión. Dado que diferentes puntos finales, incluidos GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 y resultados conductuales, mostraron perfiles temporales distintos tras la incisión, la interpretación mecanicista de los hallazgos presentes debe limitarse principalmente a la etapa temprana posteriores a la incisión. Además, los experimentos moleculares aquí realizados se llevaron a cabo con un tamaño de muestra relativamente limitado, lo que podría reducir la solidez estadística de estas observaciones.

La cinasa regulada por señal extracelular 1 y 2 se evaluaron conjuntamente como p-ERK1/2; sus contribuciones individuales no se examinaron por separado. Por lo tanto, los roles respectivos de ERK1 y ERK2 en el procesamiento del dolor inducido por incisión no pudieron determinarse en el presente estudio. Además, la cuantificación de la intensidad de fluorescencia se basó en un número limitado de animales y campos y no incluyó recuentos estereológicos de células ni coeficientes formales de co-localización. Por consiguiente, estas observaciones deben interpretarse con cautela, junto con los hallazgos de la transferencia Western.

Finalmente, aunque los experimentos de rescate de astrocitos in vitro proporcionaron apoyo mecanicista para la regulación dependiente de ERK1/2 de los mediadores inflamatorios, los eventos reguladores upstream tras la incisión y los eventos downstream en tejido espinal intacto no se investigaron a fondo. El sistema de cultivo in vitro tampoco puede reproducir completamente las interacciones entre neuronas, astrocitos, microglía y células inmunitarias infiltrantes en el asta dorsal espinal. Por consiguiente, el presente estudio respalda un mecanismo relacionado con ERK1/2, pero no establece una causalidad celular específica completa in vivo.

Conclusión

El presente estudio demuestra que el aumento inducido por la incisión en la expresión espinal de NeuN, GFAP e Iba-1 se atenuó mediante la administración intratecal preoperatoria de PPF. Este efecto se acompañó de la reducción de la hiperalgesia mecánica y térmica aguda, así como de disminuciones en la fosforilación de ERK1/2 y en la expresión de TNF-α y COX-2 tras la incisión. Sin embargo, estos hallazgos respaldan (más que proporcionar una prueba mecanicista definitiva) una asociación entre el efecto antihiperalgésico del PPF y la reducción de la fosforilación de ERK1/2 en las células gliales espinales (en asociación con una menor expresión de mediadores inflamatorios). El efecto antihiperalgésico del PPF persistió durante todo el período de observación tras la incisión, mientras que el efecto del inhibidor de MEK1/2 U0126 se limitó principalmente al período temprano post-incisión. Estos hallazgos sugieren que la señalización de ERK1/2 podría ser particularmente relevante durante las fases iniciales del desarrollo del dolor posincisional. El efecto más prolongado del PPF indica que su mecanismo de acción podría implicar vías adicionales más allá de la simple inhibición de ERK1/2. Por lo tanto, el PPF podría representar una intervención terapéutica potencial, más que un objetivo biológico, para mejorar el manejo del dolor postoperatorio agudo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Buffer PBS 0,01 M	Solarbio	P1020
Buffer Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)	Solarbio	T1020
Buffer Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)	Solarbio	T1010
SDS al 10 % (dodecilsulfato de sodio)	Solarbio	S1010
Solución stock TBST 10×	Solarbio	T1081
Acrilamida al 30 %	Solarbio	A1010
Buffer de carga de proteínas 4×	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
Persulfato de amonio	Solarbio	A1030
Máquina automática de hielo en escamas	Changshu Xueke	IMS-40
Albúmina sérica bovina (BSA)	Solarbio	A8020
Criostato CM150	Leica	CM150
Medidor digital de pH	—	PHS-3C
DMSO (dimetilsulfóxido)	Solarbio	D8371
Balanza analítica electrónica	Cany	—
Reactivo de quimioluminiscencia mejorado (ECL)	Solarbio	PE0010
Película	Kodak	—
Microscopio de fluorescencia DP71	Olympus	DP71
Medio de inclusión para secciones congeladas	Sakura	4583
Aparato de electroforesis en gel	BIO-RAD	—
Glicerol	Solarbio	IG0910
Glicina	Solarbio	G8200
Anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 594 de cabra anti-ratón	Proteintech	SA00013-3
Anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra anti-ratón	ZSGB-BIO	ZB2305
Anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 de cabra anti-conejo	Proteintech	SA00013-2
Anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra anti-conejo	ZSGB-BIO	ZB2301
Suero de cabra	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	GraphPad Software	5
Centrífuga refrigerada de alta velocidad 3K15	Sigma	3K15
Agitador orbital horizontal TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	National Institutes of Health	1.51j8
Metanol	Tianjin Guangfu	—
Anticuerpo primario anti-GAPDH de ratón anti-rata	Proteintech	60004-1-Ig
Anticuerpo primario anti-p-ERK1/2 de ratón anti-rata	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
Paraformaldehído	Biosharp	BL539A
Láminas de microscopio de grado patológico	Shitai	—
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)	Beyotime	ST506
Prueba plantar 37370	UGO BASILE	37370
Membrana de fluoruro de polivinilideno	Solarbio	—
Propentofilina (PPF)	Taosu	T19812
Anticuerpo primario anti-COX-2 de conejo anti-rata	Abcam	Ab179800
Anticuerpo primario anti-GFAP de conejo anti-rata	Proteintech	16825-1-AP
Anticuerpo primario anti-Iba-1 de conejo anti-rata	Proteintech	10904-1-AP
Anticuerpo primario anti-NeuN de conejo anti-rata	Abcam	Ab279297
Anticuerpo primario anti-t-ERK1/2 de conejo anti-rata	Proteintech	11257-1-AP
Anticuerpo primario anti-TNF-α de conejo anti-rata	Proteintech	29652-1-AP
Buffer de lisis RIPA	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
Leche en polvo descremada	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
Tetrametiletilendiamina (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Tritón X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
Congelador de temperatura ultra baja	Haier	—
Congelador de temperatura ultra baja	Sanyo	—
Sistema de purificación de agua ultrapura	Heal Force	—
Hebras de von Frey	North Coast Medical	—