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Artículo de investigación

La propentofilina alivia la hiperalgesia incisional mediante la regulación de la fosforilación de ERK1/2 en los astrocitos y la microglía espinales

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DOI:

10.3791/70927

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14 de agosto de 2026

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1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

En este artículo

Resumen

Este estudio investiga el efecto de la propentofilina administrada intratecalmente en la atenuación de la hiperalgesia postincisión y si este efecto está asociado con cambios en los marcadores gliales espinales y en la fosforilación de la proteína quinasa regulada por señal extracelular 1 y 2 en ratas.

Resumen

Se ha implicado a los astrocitos espinales, la microglía y la proteína quinasa regulada por señal extracelular 1 y 2 (ERK1/2) en el procesamiento del dolor. Este estudio investigó si la propentofilina (PPF) intratecal previa a la cirugía atenúa la hiperalgesia aguda por incisión en ratas y si este efecto se asocia con marcadores gliales espinales y con la fosforilación de ERK1/2. Sesenta y seis ratas macho Sprague–Dawley se asignaron aleatoriamente a grupos control, de dolor por incisión, de solución salina normal, de dimetilsulfóxido, de PPF y de U0126. Se evaluó la hiperalgesia mecánica y térmica en la línea base y a las 2, 4, 8, 24 y 72 h posteriores a la incisión. Los marcadores neuronales y gliales espinales, p-ERK1/2 y los mediadores inflamatorios se evaluaron mediante inmunotransferencia y análisis de inmunofluorescencia. Además, se utilizaron experimentos con astrocitos espinales primarios para examinar la liberación de mediadores inflamatorios dependiente de ERK1/2. La administración intratecal de PPF antes de la cirugía atenuó la hiperalgesia mecánica y térmica durante todo el período de observación de 72 h, mientras que el U0126 atenuó la hiperalgesia principalmente durante las primeras etapas posteriores a la incisión. A las 4 h posteriores a la incisión, ambos tratamientos se asociaron con una reducción en la expresión espinal de GFAP, Iba-1 y p-ERK1/2, así como con una disminución en la inmunorreactividad de TNF-α y COX-2. En astrocitos cultivados, la PPF redujo la liberación de mediadores inflamatorios inducida por LPS, mientras que la activación constitutiva de ERK1/2 atenuó este efecto. Estos hallazgos respaldan una asociación entre el efecto antihiperalgésico de la PPF y la modulación de las respuestas gliales espinales, relacionadas con ERK1/2 y las respuestas inflamatorias tras la incisión.

Introducción

El dolor incisional, un tipo común de dolor agudo tras procedimientos quirúrgicos, generalmente no persiste más de 7 días, pero presenta mecanismos patológicos complejos que difieren de los del dolor inflamatorio y neuropático1,2. Si el dolor incisional no se controla adecuadamente durante su desarrollo, puede progresar posteriormente a un síndrome de dolor crónico, y su naturaleza puede cambiar de un dolor por lesión tisular aguda a un dolor neuropático o mixto3. En general, la administración de analgésicos, como opioides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos, es la forma más común de analgesia tras una incisión. Sin embargo, pueden presentarse muchos efectos secundarios con el uso continuo o a altas dosis de estos medicamentos, una circunstancia que resalta la necesidad de estrategias analgésicas más seguras y eficaces.

Evidencia confiable indica que la propentofilina (PPF) alivia la hiperalgesia en diversos procesos del dolor4,5. Además, el efecto analgésico de la PPF puede lograrse en parte mediante la inhibición de la expresión espinal de las quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), como p38 y las quinasas N-terminales de c-Jun (JNKs)6. Aunque los efectos de la PPF sobre las vías p38 y JNK están establecidos, su posible modulación de la vía de la quinasa regulada por señal extracelular 1 y 2 (ERK1/2), otra subfamilia crítica de MAPKs implicada en la señalización del dolor, permanece inexplorada en el dolor incisional agudo. Esta brecha en el conocimiento es particularmente importante dado que la activación de ERK1/2 presenta patrones temporales y celulares distintos en comparación con p38 y JNK, lo que sugiere oportunidades terapéuticas potencialmente únicas.

Se pensaba inicialmente que las células gliales, incluidas los astrocitos, la microglía y los oligodendrocitos, constituían la estructura de conexión y soporte del tejido nervioso. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los astrocitos y la microglía desempeñan un papel importante en la regulación de la plasticidad sináptica y en la transmisión de la información sobre el dolor7. Como macrófagos residentes del cerebro y la médula espinal, la microglía puede activarse mediante varias señales de estímulo extracelular en las primeras etapas del proceso del dolor, y luego proliferar y liberar grandes cantidades de citoquinas inflamatorias, lo que aumenta la conducción de las señales del dolor desde la médula espinal hasta el cerebro8,9. Al mismo tiempo, los astrocitos activados pueden aumentar la liberación del neurotransmisor excitador glutamato y enviar información directamente a las neuronas sensoriales al potenciar la comunicación intercelular10.

Los estudios han demostrado que la activación de los astrocitos ocurre en la etapa temprana (dentro de las primeras 24 h) del dolor inducido por incisión, mientras que la activación de la microglía aparece mucho más tarde11,12. Además, un estudio indicó que la microglía activada tiene un efecto limitado sobre la hiperalgesia mecánica en el dolor inducido por incisión13. Estos hallazgos destacan las preguntas pendientes sobre los roles distintos de los astrocitos y la microglía en el dolor agudo. Se ha informado que la propentofilina, un agente modulador de la glía, alivia la hiperalgesia al regular la activación de astrocitos y microglía tras una lesión nerviosa crónica por compresión, una lesión nerviosa aguda y una lesión aguda del tejido4,5. Sin embargo, hasta donde se conoce actualmente, ningún estudio ha examinado los efectos de la PPF sobre la activación de astrocitos o microglía en el dolor agudo inducido por incisión.

La quinasa regulada por señal extracelular 1 y 2, una subfamilia principal de MAPK activada en la vía descendente de la quinasa 1 y 2 activada por mitógenos (MEK1/2), ha estado ampliamente implicada en el procesamiento nociceptivo y la plasticidad neuronal14,15. Estudios previos han demostrado que la ERK1/2 fosforilada (p-ERK1/2) puede inducirse en neuronas espinales mediante estimulación nociceptiva y también puede detectarse en astrocitos y microglía en estados de dolor inflamatorio o neuropático16,17,18,19. Además, se ha informado que la inhibición farmacológica de la señalización MEK1/2–ERK1/2 atenúa la hiperalgesia mecánica y térmica en varios modelos de dolor20,21,22,23,24,25.

Sin embargo, la distribución celular de la ERK1/2 espinal, particularmente en astrocitos y microglía, activada por una incisión aguda y su papel en el dolor inducido por incisión permanece insuficientemente definida. Estudios previos del grupo de investigación indican que el PPF alivia la hiperalgesia aguda por incisión en ratas al reducir la señalización espinal de JNK y p38, pero aún no está claro si el PPF también modula la señalización relacionada con ERK1/2 en las células gliales espinales durante el dolor inducido por incisión. Por lo tanto, el presente estudio debe considerarse como una extensión de los marcos existentes sobre glía y MAPK en la investigación del dolor, más que como un paradigma mecanicista completamente independiente. Su principal diferencia con respecto a trabajos anteriores radica en su enfoque específico en el dolor agudo por incisión, en el examen de ERK1/2 en lugar de p38/JNK como componente de MAPK de interés, y en la evaluación de la distribución celular espinal temprana de p-ERK1/2 en relación con el tratamiento con PPF.

Este estudio fue diseñado para investigar si la administración intratecal preoperatoria de PPF atenúa la hiperalgesia incisional en un modelo de incisión plantar en ratas y si este efecto está asociado con la fosforilación de ERK1/2 o con cambios en la expresión de marcadores neuronales y gliales espinales y mediadores inflamatorios, como el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Más específicamente, este estudio difiere de informes previos en su combinación de evaluación conductual con análisis temporal mediante inmunotransferencia; en su comparación farmacológica con el inhibidor MEK1/2 U0126; y en su localización cualitativa mediante inmunofluorescencia de p-ERK1/2 en neuronas espinales, astrocitos y microglía dentro de un modelo de dolor incisional agudo. Aunque su marco mecanicista se basa en literatura previa que vincula la modulación glial y la señalización MAPK con el dolor, el presente trabajo tiene como objetivo proporcionar evidencia adicional sobre la posible participación de respuestas gliales relacionadas con ERK1/2 espinal en la fase temprana de la hiperalgesia incisional.

En comparación con los analgésicos posoperatorios convencionales, los enfoques dirigidos a vías específicas permiten probar un componente de señalización definido, pero pueden ofrecer solo beneficios de duración limitada y pueden requerir administración invasiva; la inhibición de MEK1/2–ERK1/2 ha demostrado efectos antihiperalgésicos en varios modelos experimentales de dolor20,21,22,23,24,25. El PPF difiere de un inhibidor de una sola vía porque modula las respuestas gliales y se ha relacionado con más de un proceso asociado a MAPK4,5,6. La traducción práctica sigue siendo limitada por el diseño preclínico, la administración intratecal preoperatoria, el uso exclusivo de ratas macho y la ausencia de estudios de ajuste de dosis y de seguridad en modelos quirúrgicos más grandes.

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Protocolo

Los experimentos realizados fueron aprobados por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Lanzhou, Provincia de Gansu, China (número de aprobación ética 2017-070). Todos los procedimientos siguieron las directrices de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor26. Se utilizaron un total de 66 ratas Sprague–Dawley macho adultas, obtenidas de un centro acreditado de animales de laboratorio, con un peso de 200–250 g. Solo se incluyeron ratas macho en este estudio para reducir la variabilidad potencial relacionada con las influencias hormonales dependientes del sexo. Todos los protocolos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor26, y se tomaron las medidas necesarias para minimizar el sufrimiento. Se proporciona información detallada sobre los reactivos, materiales de consumo, instrumentos y software utilizados en este estudio en la Tabla de Materiales.

Animales

Las ratas se mantuvieron en parejas antes de la operación y de forma individual después de la incisión, con alimento y agua ad libitum. La habitación se mantuvo en un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad, con temperatura controlada a 24 °C ± 2 °C.

Modelo de inyección intratecal y dolor incisional

Para la administración intratecal de soluciones, las ratas fueron anestesiadas con sevoflurano al 1,5 %–3 % (administrado a través de una mascarilla nasal) y colocadas en posición prona con la columna vertebral flexionada. Se afeitó el vello de la región lumbar y se desinfectó la piel sobre el espacio intervertebral L5–L6. Se insertó una microjeringa percutáneamente en el espacio intervertebral L5–L6. La entrada exitosa en el espacio subaracnoideo se indicó mediante un movimiento repentino de la cola o sacudida de la cola durante el avance de la aguja, y se confirmó además por la aparición de líquido cefalorraquídeo al aspirar suavemente. Si no se observaban estos signos, se ajustaba la posición de la aguja antes de la inyección. La inyección se realizó únicamente después de cumplir ambos criterios de confirmación, y se excluyeron los animales que presentaron signos neurológicos anormales tras la inyección. Luego se inyectó lentamente la solución correspondiente y se limpió nuevamente la piel tras la inyección. El procedimiento quirúrgico duró aproximadamente 3 min, y las ratas generalmente recuperaron la conciencia entre 5 y 10 min después.

El modelo de rata de dolor incisional se estableció como se describió previamente27. Tras la anestesia, la superficie plantar de la pata trasera se desinfectó con povidona-yodo al 10 %. Se realizó una incisión longitudinal de 1 cm en la piel plantar, comenzando aproximadamente a 0,5 cm del talón y extendiéndose hacia los dedos. La incisión atravesó la piel y la fascia. El músculo plantar se elevó suavemente con pinzas oftálmicas y se incidió longitudinalmente, manteniendo la continuidad general del tejido. Luego, el músculo se reposicionó, se aplicó presión suave para lograr la hemostasia y la herida se cerró con dos puntos de sutura en cinta utilizando nylon 3-0. El sitio de la incisión se desinfectó nuevamente tras el cierre. Tras la cirugía, las ratas se alojaron individualmente y se les permitió recuperarse en un ambiente cálido y tranquilo, protegidas de la luz intensa y con acceso libre a alimento y agua. Los animales se monitorearon en el período postoperatorio, y aquellos que no cumplían con los criterios predefinidos se excluyeron de inmediato. La infección de la herida se determinó en función de enrojecimiento, hinchazón y aumento de la temperatura local alrededor de la herida, exudado purulento anormal de color amarillo-verdoso con mal olor, retraso en la cicatrización con persistencia de la abertura de la herida, necrosis y aumento de tamaño, así como signos sistémicos como temperatura corporal elevada, letargo y rechazo a la alimentación. Otros criterios de exclusión incluyeron la falta de recuperación de la anestesia en 30 minutos, sección muscular intraoperatoria o lesión neurovascular, automutilación postoperatoria, establecimiento fallido del modelo y déficits neurológicos, como parálisis de la extremidad trasera o incapacidad para soportar peso no relacionada con el dolor incisional. Las ratas con infección o dehiscencia de la herida se excluyeron del estudio.

Medición del comportamiento

El umbral mecánico de retirada de la pata (UMRP) y la latencia térmica de retirada de la pata (LRP) se midieron por un investigador cegado respecto a la asignación de los grupos. Las pruebas se realizaron en una habitación tranquila, a una hora constante del día, tras al menos 10 minutos de aclimatación; se mantuvieron constantes el recinto, el suelo de malla o de vidrio, la luz ambiental y la intensidad de la fuente de calor en todos los grupos. Para la prueba del UMRP, se aplicaron filamentos de von Frey calibrados (0,4 g, 0,6 g, 1,0 g, 1,4 g, 2,0 g, 4,0 g, 6,0 g, 8,0 g, 10,0 g y 15,0 g) perpendicularmente a la superficie plantar adyacente a la herida hasta que el filamento se doblaba aproximadamente 1–2 mm. Las estimulaciones consecutivas se separaron por 2 minutos, y el UMRP al 50 % se determinó mediante el método ascendente-descendente28. Para la prueba de LRP, las ratas se colocaron en recintos transparentes individuales sobre un suelo de vidrio, y la fuente de calor radiante se alineó con la superficie plantar junto a la herida. Se estableció un límite de corte de 30 s para prevenir lesiones tisulares, las exposiciones consecutivas se separaron por 2 minutos, y se registró la media de tres mediciones29. Se consideró una respuesta positiva de retirada el levantamiento, sacudida o lamido de la pata; las pruebas afectadas por aseo, locomoción o pérdida de alineación con la fuente de calor se repitieron tras una nueva aclimatación.

Análisis de inmunotransferencia

En los tiempos predeterminados, las ratas fueron sacrificadas mediante dislocación cervical, y la médula espinal lumbar L4–L6 se extrajo rápidamente en tampón de lisis para ensayo de inmunoprecipitación con radioinmunoensayo suplementado con inhibidor de proteasas en una proporción de 100:1. El tejido se homogeneizó, se mantuvo en hielo durante 20 min y se centrifugó a 15.000 × g durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante se mezcló con tampón de carga 4× en una proporción de 3:1, se calentó en agua hirviendo durante 5 min y se almacenó a −80 °C. Las muestras de proteína (30 µg por carril) se separaron en geles de dodecilsulfato de sodio–poliacrilamida al 10% y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno de 0,45 o 0,22 µm. Se verificó la transferencia exitosa confirmando la migración esperada del marcador de peso molecular previamente teñido y la ausencia de regiones de transferencia desiguales u obviamente interrumpidas. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% y albúmina de suero bovino al 3% durante 2 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) o GAPDH (1:2.000). Después de lavar con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 al 0,05% (pH 7,4), las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:5.000) durante 1 h a temperatura ambiente. Las señales se desarrollaron mediante quimioluminiscencia mejorada y se registraron en película utilizando el mismo rango de exposición dentro de cada blanco. Un investigador cegado respecto a la asignación de los grupos analizó la densidad de las bandas con software de análisis de imágenes. Las imágenes se convirtieron a escala de grises de 8 bits, se aplicó una región rectangular idéntica de interés a cada banda, se restó el fondo local de una región adyacente en blanco y se registró la densidad integrada. Se utilizó el mismo tamaño de región y procedimiento de fondo para todos los carriles en cada membrana. NeuN, GFAP, Iba-1 y t-ERK1/2 se normalizaron respecto a GAPDH; p-ERK1/2 se normalizó respecto a t-ERK1/2; y luego los valores se expresaron en relación con el grupo en blanco.

Inmunofluorescencia

En los momentos predeterminados, las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico al 3 % (1,5 mL/kg) y perfundidas a través del corazón con 300 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) preenfriada 0,01 mol/L (pH 7,4), seguido de 250 mL de paraformaldehído al 4 % preenfriado. La médula espinal L4–L6 se postfijó en paraformaldehído al 4 % durante 6 h, se crioprotegió durante la noche en sacarosa al 20–30 % en PBS a 4 °C y se cortó en secciones de 10 µm a −22 °C. Las secciones se lavaron en PBS 0,01 mol/L, se bloquearon con suero de cabra al 10 % durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) o COX-2 (1:50). Tras tres lavados con PBS, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con fluoróforo verde o rojo (1:400) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron tres veces más con PBS y se montaron con medio antidesvanecimiento y una cubreobjetos. En cada tanda de tinción se incluyeron secciones de control negativo procesadas sin el anticuerpo primario. Las imágenes fueron adquiridas por un investigador cegado mediante un microscopio de fluorescencia. Se obtuvieron imágenes generales de baja magnificación utilizando un objetivo de 10×, mientras que las imágenes de inmunorreactividad celular y de co-localización se adquirieron con objetivos de 20× o 40× según el panel de la figura correspondiente. Para comparaciones dentro de la misma figura y tanda de tinción, se fijaron la magnificación del objetivo, la intensidad de iluminación, el tiempo de exposición, la ganancia del detector, la configuración de la cámara y los parámetros de procesamiento de imágenes tras la optimización por debajo de la saturación. Los canales de fluorescencia separados se adquirieron secuencialmente para minimizar el solapamiento entre canales. Por animal se capturaron tres campos no superpuestos en el asta dorsal ipsilateral. La intensidad de fluorescencia se cuantificó mediante software de análisis de imágenes tras la conversión a 8 bits, la sustracción del fondo utilizando una región sin células y la aplicación de una región de interés y un umbral idénticos dentro de cada tanda de tinción; los valores de los campos se promediaron para obtener un valor por animal. Se excluyeron y volvieron a adquirir bajo las mismas condiciones sin saturación los campos con sobreexposición, plegado del tejido, desgarros, enfoque deficiente o fondo irregular. La tinción se aceptó cuando la arquitectura del tejido estaba intacta, la señal objetivo superaba el control sin anticuerpo primario y no había pliegues, desgarros o regiones saturadas que afectaran al análisis.

In vitro experimentos con astrocitos espinales primarios

Los astrocitos espinales primarios de rata se cultivaron bajo condiciones estériles estándar en medio de cultivo completo a 37 °C en una incubadora humedecida con 5 % de CO2. Las células se utilizaron cuando alcanzaron aproximadamente un 70 %–80 % de confluencia y se asignaron a los grupos control, estimulados con LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 y rescate de ERK1/2. El PPF y el U0126 se añadieron a 10 µM. La estimulación con LPS, el tratamiento con fármacos y las condiciones de recolección se mantuvieron idénticas en los pocillos paralelos dentro de cada experimento. Para el análisis de selectividad de vías, se recogieron lisados celulares para la inmunotransferencia de p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, p38 total, p-JNK y JNK total, junto con el control de carga correspondiente. Los sobrenadantes del cultivo de los pocillos paralelos se recogieron, se clarificaron mediante centrifugación y se analizaron para TNF-α, PGE2 e IL-6 mediante ensayo inmunoenzimático tipo ELISA según las instrucciones del fabricante. La densitometría de inmunotransferencia siguió los mismos principios de análisis de imagen descritos anteriormente. Para los experimentos de rescate, la ERK1/2 endógena se suprimió mediante transfección con siRNA, y se introdujo un constructo de expresión de ERK1/2 constitutivamente activa (CA-ERK1/2) antes del tratamiento. La eficiencia del silenciamiento y sobreexpresión se confirmó mediante inmunotransferencia antes de interpretar los datos de citocinas. Las células expuestas al reactivo de transfección sin siRNA activo ni constructo sirvieron como controles del procedimiento cuando fue aplicable.

Diseño experimental

Subagrupamiento de animales experimentales

Las ratas se asignaron a seis grupos mediante un método de tabla de números aleatorios, y la asignación a los grupos se completó antes de las pruebas conductuales y la recolección de tejidos. Los seis grupos comprendieron un grupo en blanco (n = 6), un grupo de dolor incisional (IP) (n = 18), un grupo de suero salino normal (NS) (NS al 0,9 %, 10 µL; n = 9), un grupo de PPF (10 µg en 10 µL; n = 12), un grupo de dimetilsulfóxido (DMSO) (DMSO al 10 %, 10 µL; n = 9) y un grupo U0126 (10 µg en 10 µL; n = 12). Las ratas del grupo en blanco no recibieron ni incisión plantar ni inyección intratecal y sirvieron como controles no tratados. Las ratas del grupo IP sufrieron una incisión plantar sin pretratamiento mediante inyección intratecal. Las ratas de los grupos NS, PPF, DMSO y U0126 recibieron la administración intratecal de sus respectivos agentes 30 min antes de la incisión plantar. El grupo NS sirvió como control vehicular para PPF, mientras que el grupo DMSO sirvió como control vehicular para U0126.

Dosis de propentofilina y U0126

La propentofilina es un modulador glial, y se seleccionó una dosis de 10 µg porque había aliviado la hiperalgesia aguda en estudios previos del grupo de investigación. U0126 es un inhibidor no competitivo con respecto al trifosfato de adenosina de MEK1/2 utilizado para bloquear la fosforilación de ERK1/2. Se han reportado dosis intratecales efectivas de 1–10 µg en diversos modelos de dolor30,31,32; en el presente estudio se utilizó la dosis de 10 µg. U0126 se disolvió en dimetilsulfóxido al 10%, mientras que PPF se disolvió en solución salina normal al 0,9%. Las concentraciones finales fueron de 1 µg/µL. Los fármacos y los vehículos se prepararon antes de la cirugía, se mantuvieron a 4 °C y se utilizaron dentro de las 12 horas.

Efecto de la administración intratecal preoperatoria de propentofilina o U0126 sobre la hiperalgesia

Se seleccionaron aleatoriamente seis ratas de cada grupo para la medición del comportamiento 24 h antes de la operación, y los valores resultantes de PWMT y PWTL se designaron como valores basales. Las inyecciones intratecales se administraron 30 min antes de la operación. Para evaluar los efectos de la administración intratecal preoperatoria de PPF y U0126 sobre la hiperalgesia mecánica y térmica, se determinaron el PWMT y el PWTL a las 2 h, 4 h, 8 h, 24 h y 72 h posteriores a la incisión.

Diseño experimental para evaluar los efectos del propentofilina o la U0126 administradas intratecalmente antes de la cirugía sobre la expresión de marcadores neuronales y gliales en la médula espinal tras una incisión

Para determinar el punto temporal adecuado tras la incisión para la evaluación del efecto del tratamiento, primero se realizó un análisis preliminar de curso temporal en el grupo IP. Concretamente, las ratas del grupo IP fueron sacrificadas a las 2 h, 4 h, 24 h y 72 h posteriores a la incisión, y los niveles de expresión de los marcadores celulares NeuN, GFAP e Iba-1 en la médula espinal se midieron mediante inmunotransferencia (n = 3 por punto temporal). Según este análisis preliminar, las primeras 4 h tras la incisión se seleccionaron como una ventana temprana de observación postoperatoria porque la expresión de NeuN alcanzó su nivel máximo en el punto temporal de 4 h, y porque se consideró que los cambios moleculares tempranos eran los más relevantes para el desarrollo inicial de la hiperalgesia por incisión. Sin embargo, el punto temporal de 4 h no pretendía representar todos los cambios moleculares temporales posteriores a la incisión.

En este punto temporal seleccionado, las ratas que habían recibido una inyección intratecal fueron sacrificadas para realizar un análisis por inmunotransferencia de diferentes marcadores celulares (n = 3 por grupo) y una evaluación por inmunofluorescencia de la morfología de distintos tipos celulares (n = 3 por grupo). En el grupo control, las ratas fueron sacrificadas aleatoriamente para determinar los niveles básicos de expresión de diferentes marcadores celulares (NeuN, GFAP e Iba-1) en la médula espinal mediante inmunotransferencia (n = 3) y la morfología de diferentes células (neuronas, astrocitos y microglía) mediante inmunofluorescencia (n = 3). Por lo tanto, el grupo control sirvió como referencia basal sin incisión ni tratamiento.

Efectos del tratamiento sobre la p-ERK1/2 espinal y los mediadores inflamatorios

Para determinar el punto temporal postincisión adecuado para evaluar los efectos del tratamiento sobre la expresión de p-ERK1/2 y los niveles de citocinas inflamatorias, primero se realizó un análisis preliminar de curso temporal en el grupo IP. Específicamente, las ratas del grupo IP fueron sacrificadas a las 2 h, 4 h, 24 h y 72 h tras la incisión, y la expresión de p-ERK1/2 en la médula espinal se midió mediante inmunotransferencia (n = 3 por punto temporal). Con base en este experimento de curso temporal, junto con el momento en que la expresión de NeuN fue máxima tras la incisión, se seleccionó el tiempo de 4 h después de la incisión como punto fijo para la evaluación posterior de los efectos de la administración intratecal preoperatoria de PPF o U0126 sobre la expresión de p-ERK1/2 y las citocinas inflamatorias en la médula espinal. Este punto temporal se eligió como una ventana temprana de observación mecanicista, y no como una representación integral de todos los cambios temporales posteriores a la incisión.

En este punto temporal seleccionado, las ratas que habían recibido una inyección intratecal fueron sacrificadas para el análisis por inmunotransferencia de la expresión de p-ERK1/2 (n = 3 por grupo) y para la evaluación por inmunofluorescencia de citocinas inflamatorias (n = 3 por grupo). En el grupo control, las ratas fueron sacrificadas aleatoriamente para determinar los niveles básicos de expresión de p-ERK1/2 en la médula espinal mediante inmunotransferencia (n = 3) y de citocinas inflamatorias (TNF-α y COX-2) mediante inmunofluorescencia (n = 3). Por lo tanto, el grupo control sirvió como referencia sin incisión ni tratamiento.

Localización celular de la p-ERK1/2 espinal en neuronas, astrocitos y microglía

Para evaluar más a fondo la distribución celular de la p-ERK1/2 espinal tras la incisión, se realizó una tinción de inmunofluorescencia en los grupos Control e IP a las 4 h posteriores a la incisión (n = 3).

Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± desviación estándar. El tamaño de la muestra se determinó con referencia a estudios previos del grupo de investigación y experimentos preliminares. Los datos conductuales se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías con medidas repetidas, utilizando el grupo como factor entre sujetos y el tiempo como factor dentro de los sujetos. Los datos de inmunotransferencia en función del tiempo se evaluaron mediante ANOVA de una vía seguido de comparaciones por pares ajustadas según Bonferroni. Los datos de inmunotransferencia e inmunofluorescencia en tiempos fijos se evaluaron mediante ANOVA de una vía con comparaciones planificadas ajustadas según Bonferroni; las comparaciones entre dos grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. La normalidad y la homogeneidad de la varianza se evaluaron con las pruebas de Shapiro–Wilk y de Levene, respectivamente. Se consideró significativo un valor p bilateral < 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron con el software de análisis estadístico que se enumera en la Tabla de Materiales. Para los experimentos in vitro con astrocitos, los experimentos independientes de cultivo se trataron como la unidad de análisis; la densitometría de inmunotransferencia y las concentraciones de citocinas se compararon utilizando ANOVA de una vía seguido de comparaciones planificadas ajustadas según Bonferroni o la prueba t de Student para comparaciones prespecificadas entre dos grupos, según correspondiera.

DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

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Resultados

Los efectos de la incisión y de la administración intratecal preoperatoria de propentofilina o U0126 sobre la hiperalgesia después de la incisión

hiperalgesia mecánica

No hubo diferencias significativas en los PWMT entre los seis grupos a las 24 h antes de la operación (p > 0,05; Figura 1A,B). En el grupo IP, el PWMT disminuyó después de la incisión y se mantuvo significativamente m...

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Discusión

La mayoría de los pacientes sufren dolor agudo después de la cirugía, no solo físicamente sino incluso en ocasiones mentalmente33, aunque aún se desconocen muchos aspectos sobre los mecanismos detallados del dolor postoperatorio agudo. Junto con los potentes efectos de los medicamentos analgésicos vienen sus efectos secundarios inevitables, lo que hace de vital importancia la exploración de analgésicos más seguros y eficaces. Este estudio se basó en un modelo de rata con incisión previamente valid...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses personales, financieros, comerciales o académicos.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Haijiao Zhou y Ming Wang por el apoyo técnico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Buffer PBS 0,01 MSolarbioP1020
Buffer Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)SolarbioT1020
Buffer Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)SolarbioT1010
SDS al 10 % (dodecilsulfato de sodio)SolarbioS1010
Solución stock TBST 10×SolarbioT1081
Acrilamida al 30 %SolarbioA1010
Buffer de carga de proteínas 4×SolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
Persulfato de amonioSolarbioA1030
Máquina automática de hielo en escamasChangshu XuekeIMS-40
Albúmina sérica bovina (BSA)SolarbioA8020
Criostato CM150LeicaCM150
Medidor digital de pH—PHS-3C
DMSO (dimetilsulfóxido)SolarbioD8371
Balanza analítica electrónicaCany—
Reactivo de quimioluminiscencia mejorado (ECL)SolarbioPE0010
PelículaKodak—
Microscopio de fluorescencia DP71OlympusDP71
Medio de inclusión para secciones congeladasSakura4583
Aparato de electroforesis en gelBIO-RAD—
GlicerolSolarbioIG0910
GlicinaSolarbioG8200
Anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 594 de cabra anti-ratónProteintechSA00013-3
Anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra anti-ratónZSGB-BIOZB2305
Anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 de cabra anti-conejoProteintechSA00013-2
Anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra anti-conejoZSGB-BIOZB2301
Suero de cabraSolarbioSL038
GraphPad PrismGraphPad Software5
Centrífuga refrigerada de alta velocidad 3K15Sigma3K15
Agitador orbital horizontal TS-1000Haimen QilinbeierTS-1000
ImageJNational Institutes of Health1.51j8
MetanolTianjin Guangfu—
Anticuerpo primario anti-GAPDH de ratón anti-rataProteintech60004-1-Ig
Anticuerpo primario anti-p-ERK1/2 de ratón anti-rataCST9101S
Na2HPO3Tianjin Beichen Fangzheng—
NaH2PO3Tianjin Damao—
ParaformaldehídoBiosharpBL539A
Láminas de microscopio de grado patológicoShitai—
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)BeyotimeST506
Prueba plantar 37370UGO BASILE37370
Membrana de fluoruro de polivinilidenoSolarbio—
Propentofilina (PPF)TaosuT19812
Anticuerpo primario anti-COX-2 de conejo anti-rataAbcamAb179800
Anticuerpo primario anti-GFAP de conejo anti-rataProteintech16825-1-AP
Anticuerpo primario anti-Iba-1 de conejo anti-rataProteintech10904-1-AP
Anticuerpo primario anti-NeuN de conejo anti-rataAbcamAb279297
Anticuerpo primario anti-t-ERK1/2 de conejo anti-rataProteintech11257-1-AP
Anticuerpo primario anti-TNF-α de conejo anti-rataProteintech29652-1-AP
Buffer de lisis RIPASolarbioR0010
SDSSolarbioS8010
Leche en polvo descremadaSolarbioD8340
SPSSIBM22
Tetrametiletilendiamina (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
Tritón X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
Congelador de temperatura ultra bajaHaier—
Congelador de temperatura ultra bajaSanyo—
Sistema de purificación de agua ultrapuraHeal Force—
Hebras de von FreyNorth Coast Medical—

Referencias

  1. Bateman C. Pain management—the global sound of silence. S Afr Med J. 2015;105:621-3.
  2. Pogatzki-Zahn EM, Segelcke D, Schug SA. Postoperative pain—from mechanisms to treatment. Pain Rep. 2017;2:e588.
  3. Kaiser U, Kopkow C, Deckert S, Neustadt K, Jacobi L, Cameron P, et al. Validation and application of a core set of patient-relevant outcome domains to assess the effectiveness of multimodal pain therapy (VAPAIN): a study protocol. BMJ Open. 2015;5:e008146.
  4. Tawfik VL, Nutile-McMenemy N, Lacroix-Fralish ML, DeLeo JA. Efficacy of propentofylline, a glial modulating agent, on existing mechanical allodynia following peripheral nerve injury. Brain Behav Immun. 2007;21:238-46.
  5. Wu F, Li H, Sun J, Li X, Jiang W, Huang Y, et al. Inhibition of GAP-43 by propentofylline in a rat model of neuropathic pain. Int J Clin Exp Pathol. 2013;6:1516-22.
  6. Norsted Gregory E, Codeluppi S, Gregory JA, Steinauer J, Svensson CI. Pentoxifylline and propentofylline prevent proliferation and activation of the mammalian target of rapamycin and mitogen-activated protein kinase in cultured spinal astrocytes. J Neurosci Res. 2013;91:300-12.
  7. Ji RR, Chamessian A, Zhang YQ. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 2016;354:572-7.
  8. Grace PM, Hutchinson MR, Maier SF, Watkins LR. Pathological pain and the neuroimmune interface. Nat Rev Immunol. 2014;14:217-31.
  9. Ji RR, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain: is chronic pain a gliopathy? Pain. 2013;154 Suppl 1:S10-28.
  10. Chen G, Park CK, Xie RG, Ji RR. Connexin-43 induces chemokine release from spinal cord astrocytes to maintain late-phase neuropathic pain in mice. Brain. 2014;137:2193-209.
  11. Liu Y, Hou B, Zhang W, Wang D, Wang H, Yu G, et al. The activation of spinal astrocytes contributes to preoperative anxiety-induced persistent postoperative pain in a rat model of incisional pain. Eur J Pain. 2015;19(5):733-40.
  12. Obata H, Eisenach JC, Hussain H, Bynum T, Vincler M. Spinal glial activation contributes to postoperative mechanical hypersensitivity in the rat. J Pain. 2006;7:816-22.
  13. Masaki E, Mizuta K, Ohtani N, Kido K. Early postoperative nociceptive threshold and production of brain-derived neurotrophic factor induced by plantar incision are not influenced by minocycline in a rat: role of spinal microglia. Neurosignals. 2016;24:15-24.
  14. Cargnello M, Roux PP. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases. Microbiol Mol Biol Rev. 2011;75:50-83.
  15. Roskoski R Jr. ERK1/2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66:105-43.
  16. Berta T, Liu YC, Xu ZZ, Ji RR. Tissue plasminogen activator contributes to morphine tolerance and induces mechanical allodynia via astrocytic IL-1β and ERK signaling in the spinal cord of mice. Neuroscience. 2013;247:376-85.
  17. Bi RY, Meng Z, Zhang P, Wang XD, Ding YQ, Gan YH, et al. Involvement of trigeminal ganglionic Nav1.7 in hyperalgesia of inflamed temporomandibular joint is dependent on ERK1/2 phosphorylation of glial cells in rats. Eur J Pain. 2013;17(7):983-94.
  18. Mikuzuki L, Saito H, Katagiri A, Okada S, Kubo A, Suzuki T, et al. Phenotypic change in trigeminal ganglion neurons associated with satellite cell activation via extracellular signal-regulated kinase phosphorylation is involved in lingual neuropathic pain. Eur J Neurosci. 2017;46:2190-202.
  19. Song Z, Xie W, Chen S, Strong JA, Print MS, Wang JI, et al. STAT1 as a downstream mediator of ERK signaling contributes to bone cancer pain by regulating MHC II expression in spinal microglia. Brain Behav Immun. 2017;60:161-73.
  20. Duncia JV, Santella JB III, Higley CA, Pitts WJ, Wityak J, Frietze WE, et al. MEK inhibitors: the chemistry and biological activity of U0126, its analogs, and cyclization products. Bioorg Med Chem Lett. 1998;8:2839-44.
  21. Ji RR, Gereau RW IV, Malcangio M, Strichartz GR. MAP kinase and pain. Brain Res Rev. 2009;60:135-48.
  22. Li F, Zhang H, Ma X, Zhang X, Wang Y, Zhang J, et al. Annexin A10 contributes to chronic constrictive injury-induced pain through activating ERK1/2 signalling in rats. Int J Neurosci. 2018;128(2):125-32.
  23. Qiu Q, Chai S, Jiang Z, Zhang Y, Liu X, Li M, et al. Propofol produces preventive analgesia via GluN2B-containing NMDA receptor ERK1/2 signaling pathway in a rat model of inflammatory pain. Mol Pain. 2017;13:1744806917737462.
  24. van den Heuvel I, Reichl S, Segelcke D, Zahn PK, Pogatzki-Zahn EM. Selective prevention of mechanical hyperalgesia after incision by spinal ERK1/2 inhibition. Eur J Pain. 2015;19(2):225-35.
  25. Zhang YB, Guo Y, Li H, Wang LN. Gabapentin effects on PKC-ERK1/2 signaling in the spinal cord of rats with formalin-induced visceral inflammatory pain. PLoS One. 2015;10:e0141142.
  26. Zimmermann M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 1983;16:109-10.
  27. Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. Characterization of a rat model of incisional pain. Pain. 1996;64:493-9.
  28. Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1980;20:441-62.
  29. Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 1988;32:77-88.
  30. Hao J, Chen H, Madigan MC, Coote JH, Zhang Y, Xu XJ, et al. Roles of peripheral mitogen-activated protein kinases in melittin-induced nociception and hyperalgesia. Neuroscience. 2008;152:1067-75.
  31. Wang LN, Yao M, Yang JP, Peng J, Peng Y, Li CF, et al. Cancer-induced bone pain sequentially activates the ERK/MAPK pathway in different cell types in the rat spinal cord. Mol Pain. 2011;7:48.
  32. Yang F, Sun W, Yang Y, Wang Y, Li CL, Fu H, et al. SDF1-CXCR4 signaling contributes to persistent pain and hypersensitivity via regulating excitability of primary nociceptive neurons: involvement of ERK-dependent Nav1.8 up-regulation. J Neuroinflammation. 2015;12:219.
  33. Apfelbaum JL, Chen C, Mehta SS, Gan TJ. Postoperative pain experience: results from a national survey suggest postoperative pain continues to be undertreated. Anesth Analg. 2003;97:534-40.
  34. Latremoliere A, Woolf CJ. Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. J Pain. 2009;10:895-926.
  35. Zhuang ZY, Gerner P, Woolf CJ, Ji RR. ERK is sequentially activated in neurons, microglia, and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model. Pain. 2005;114:149-59.
  36. Marchand F, Perretti M, McMahon SB. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 2005;6:521-32.
  37. Bath PM, Bath-Hextall FJ. Pentoxifylline, propentofylline and pentifylline for acute ischemic stroke. Cochrane Database Syst Rev. 2004;3:CD000162.
  38. Cui XY, Chen Y, Chen J, Ma ZL, Zhao YL, Li YQ, et al. Differential activation of p38 and extracellular signal-regulated kinase in spinal cord in a model of bee venom-induced inflammation and hyperalgesia. Mol Pain. 2008;4:17.
  39. Ji RR. ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity. J Neurosci. 2002;22:478-85.

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