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Artículo de investigación
La sobrecarga de hierro redujo la expresión de MEG3 en el tejido pancreático. MEG3 podría desempeñar un papel protector contra la apoptosis de β células de islotes inducida por hierro, implicando potencialmente la modulación de la vía NF-ĸB. Este mecanismo puede contribuir a la disfunción de los islotes en pacientes con β-TM y sobrecarga de hierro.
Los pacientes con beta-talasemia mayor (β-TM) suelen presentar un metabolismo anormal de la glucosa, y factores como la sobrecarga de hierro, la anemia crónica, los desequilibrios hormonales, la disfunción hepática y la resistencia a la insulina asociada a la inflamación se consideran contribuyentes importantes a la disfunción de los islotes pancreáticos. Los ácidos ribonucleicos largos no codificantes (ARNnc) son cada vez más reconocidos por su papel regulador en la apoptosis celular y la homeostasis de la glucosa. Este estudio explora la función del ARNnc, gen 3 expresado maternamente (MEG3), en la lesión de β células de islotes inducida por hierro. Se indujo un modelo murino con sobrecarga de hierro mediante inyección intraperitoneal de dextrón de hierro. La deposición de hierro y el daño tisular en el páncreas se evaluaron utilizando azul de Prusia y tinción de hematoxilina y eosina, y la expresión de MEG3 se cuantificó mediante reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa (RT-PCR). In vitro, las células MIN6 fueron transfectadas con ARN interferente pequeño MEG3 para examinar la apoptosis mediante citometría de flujo, y la actividad de la vía de señalización NF-kappa (ĸ)B fue evaluada mediante Western bloting. La tinción histológica confirmó una deposición significativa de hierro y daños estructurales en el tejido pancreático de ratones con sobrecarga de hierro. El análisis RT-PCR reveló una reducción notable de la expresión de MEG3 en el páncreas (p<0,05). In vitro, el knockdown de MEG3 aumentó significativamente la apoptosis de las células MIN6 en comparación con los controles. El análisis de Western blot mostró un nivel elevado de NF-ĸB, lo que indica la activación de la vía de señalización de NF-ĸB en células silenciadas por MEG3. Estos hallazgos sugieren que la regulación a la baja de MEG3 podría potenciar la apoptosis de β células de islotes mediante la señalización NF-ĸB bajo condiciones de sobrecarga de hierro. El gen MEG3 podría desempeñar un papel protector contra la apoptosis de β células de islotes inducida por hierro, lo que podría implicar la modulación de la vía NF-ĸB. Este mecanismo puede contribuir a la disfunción de los islotes en pacientes con β-TM y sobrecarga de hierro.
Las beta (β)-talasemias son un grupo de trastornos hematológicos hereditarios caracterizados por una producción reducida o ausente de la cadena de β-globina, que resulta en anemia crónica y eritropoiesisineficaz 1. En pacientes con β-talasemia mayor (β-TM) dependiente de transfusiones, las transfusiones repetidas de sangre y la hemólisis suelen provocar una sobrecarga sistémica de hierro, que puede dañar múltiples órganos y contribuir a una serie de complicaciones endocrinas, incluido un metabolismo anormalde la glucosa 2. Además, la anemia crónica aumenta la carga sobre el páncreas, los desequilibrios hormonales que afectan la regulación de la glucosa, la disfunción hepática que afecta el metabolismo de la glucosa y la resistencia a la insulina inducida por procesos inflamatorios pueden contribuir a la hiperglucemia en pacientes con β-TM. Por lo tanto, las alteraciones metabólicas de la glucosa en β-TM son de naturalezamultifactorial 2,3. Un metaanálisis reciente informó que la prevalencia de glucosa en ayunas alterada, tolerancia a glucosa (IGT) deteriorada y diabetes mellitus (DM) en pacientes con β-TM fue del 17,21%, 12,46% y 6,54%, respectivamente, lo que indica una carga creciente de trastornos metabólicos de la glucosaen esta población 3.
A pesar de su creciente relevancia clínica, los mecanismos subyacentes del metabolismo anormal de la glucosa en β-TM siguen siendo poco comprendidos. Estudios previos han demostrado que la sobrecarga crónica de hierro, principalmente por transfusiones repetidas y hemólisis, puede provocar una deposición excesiva de hierro en el páncreas, especialmente en las células β islotes. Esta acumulación favorece la generación de especies reactivas de oxígeno y agrava el estrés oxidativo, desencadenando disfunción mitocondrial, afectando la síntesis y secreción de insulina, y finalmente induciendo apoptosis β-celular y deficiencia de insulina 4,6. Además, la sobrecarga de hierro puede contribuir a la resistencia periférica a la insulina mediante la inflamación mediada por estrés oxidativo y la interferencia en las vías de señalización de la insulina. Sin embargo, las vías moleculares que vinculan la sobrecarga de hierro con la lesión de las células β y la desregulación sistémica de la glucosa son complejas y aún no se han aclarado completamente. Los ácidos ribonucleicos largos no codificantes (lncARN) —una clase de transcritos con más de 200 nucleótidos que no codifican proteínas— han emergido como reguladores importantes en diversos procesos biológicos, incluyendo la homeostasis de la glucosa, la secreción de insulina y las respuestas al estrésoxidativo 7,8,9. Se sabe que las células de β de islote pancreático expresan más de 1.000 ARNlc, lo que sugiere su posible papel regulador en el mantenimiento de la funciónendocrina 10.
Sin embargo, se sabe poco sobre los perfiles de expresión de ARNnc y sus funciones en el contexto del daño a las células β islotes inducido por sobrecarga de hierro, especialmente en β-TM. Avances recientes revelaron que el ARNlnc MEG3 (MEG3) promueve la secreción de insulina e inhibe la apoptosis11 de las células β pancreáticas. Sin embargo, su efecto sobre las células β pancreáticas en condiciones de sobrecarga de hierro sigue siendo esquivo. En otros contextos patológicos, se ha demostrado que los lncARN interactúan con vías clave de señalización como NF-kappa (ĸ)B, JNK y Nrf2, que también están implicadas en el estrés oxidativo y la daño celular relacionado con la sobrecargade hierro 12,13,14. Específicamente, NF-ĸB es un factor de transcripción central activado bajo estrés oxidativo y ha sido implicado en la apoptosis de células β en condiciones de sobrecarga de hierro 15,16,17. Por ello, este estudio investiga que la regulación a la baja de MEG3 puede potenciar la apoptosis de β-célula de islotes mediante la señalización de NF-ĸB bajo condiciones de sobrecarga de hierro. Este trabajo podría aportar nuevas perspectivas sobre los mecanismos moleculares que subyacen al metabolismo anormal de la glucosa en β-TM.
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Los protocolos experimentales empleados en el presente estudio fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital General de Hainan (protocolo nº 2021-239). La Guía de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Declaración de Helsinki se siguieron estrictamente en todos los procedimientos experimentales. Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Diseño de modelos animales y experimentales
En este estudio se utilizaron treinta y seis ratones machos C57BL/6J (4 semanas, aprox. 20 g). Todos los ratones fueron alojados bajo condiciones estándar de laboratorio (20–25 °C, 50%–65% de humedad relativa, ciclo de 12 horas luz/oscuridad) con acceso ad libitum a comida y agua. Tras un periodo de aclimatación de 7 días, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n=18 por grupo): el grupo de sobrecarga de hierro (grupo modelo), que recibió inyecciones intraperitoneales de dextrano de hierro (0,2 g/kg) dos veces por semana durante 4 semanas; y el grupo de control, que recibió volúmenes equivalentes de solución fisiológica normal mediante inyección intraperitoneal. Tras 4 semanas, los ratones fueron eutanasiados y se extrajeron tejidos pancreáticos para su posterior análisis.
2. Medición de hierro sérico
Se recogieron muestras de sangre del seno retroorbitario bajo anestesia pentobarbital al 1% durante el diestro. Tras dejarse a temperatura ambiente durante 1 hora, la sangre se centrifugó a 4 °C, 3.000 rpm durante 15 minutos. El suero se separaba y almacenaba a -80 °C. Las concentraciones de hierro sérico se determinaron utilizando un kit de ensayo colorimétrico de hierro siguiendo el protocolo del fabricante.
3. Análisis histológico
Las muestras de tejido pancreático se sumergieron en paraformaldehído al 4% para su fijación, seguidas de la incrustación de parafina antes de la preparación de la sección. Se obtuvieron secciones de tejido en serie con un grosor que variaba entre 4 y 5 μm y se procesaron mediante procedimientos estándar de deparafinización y rehidratación. Posteriormente se realizó un examen histomorfológico mediante tinción por hematoxilina y eosina, mientras que la deposición de hierro en los tejidos pancreáticos se evaluó mediante tinción con azul de Prusia según protocolos histológicos convencionales.
4. Cultivo celular y transfección de pequeños ácidos ribonucleicos interferentes
Las células β pancreáticas de ratón MIN6 se cultivaron en el medio Eagle modificado de Dulbecco con alta glucosa, suplementado con suero bovino fetal al 15%, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 10 mM de HEPES, 50 mM de piruvato sódico y 50 μmol/L de β-mercaptoetanol. Todos los experimentos se realizaron en una confluencia celular del 80%. Cada vez durante el cultivo, se toman entre 6 y 8 ml de medio de cultivo. Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO₂. Para estudios funcionales, las células MIN6 en fase de crecimiento logarítmico fueron transfectadas con ARNn interferente pequeño específico de ARNn (que se dirigía a ARNa seleccionado basándose en resultados de microarrays); Grupo inhibidor) o siRNA de control negativo (grupo inhibidor NC) usando Lipofectamina 2000, según las instrucciones del fabricante. Tras el cultivo durante 24 horas, las células fueron analizadas mediante reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (qRT-PCR) o western blot para determinar la eficiencia del knockdown. Las secuencias objetivo de este siRNA fueron las siguientes: siMEG3: GCGUCUUCCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACACAGGAAGACGCTT; siNC: UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACGUUCGGAGAATT. Cada experimento se realizó en triplicado y se repitió tres veces.
5. Ensayo de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa
El ARN total se extrajo de muestras de tejido pancreático y células MIN6 utilizando un reactivo de aislamiento de ARN basado en fenol disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante. El ADN complementario se sintetizó utilizando un kit de transcripción inversa en un volumen total de reacción de 20 μL. Tras la transcripción inversa, la concentración de ADNc en la mayoría de las muestras fue de aproximadamente 1 μg/μL según el análisis de cuantificación de la muestra. Posteriormente, se utilizó 1 μL de plantilla de ADNc para amplificación cuantitativa por PCR en tiempo real. qRT-PCR se realizó utilizando un kit de detección de PCR basado en SYBR Green bajo las siguientes condiciones de ciclo: 95 °C durante 30 s, 90 °C durante 15 s, 60 °C durante 34 s y 68 °C durante 30 s. Se determinaron los niveles relativos de expresión génica utilizando el método del ciclo umbral comparativo (método 2-ΔCT ). GAPDH se utilizó como gen de referencia interno para la normalización de datos de PCR en tiempo real. Todos los procedimientos experimentales se realizaron según los protocolos de los respectivos fabricantes, y cada experimento se repitió de forma independiente al menos tres veces. Las secuencias de cebadores utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla Suplementaria 1 y la Tabla 2.
6. Ensayo de Kit de Conteo de Celdas-8
La capacidad de proliferación celular se determinó mediante un ensayo de kit de conteo celular 8 conforme a las directrices del fabricante. Brevemente, las células MIN6 se emplacaron en placas de cultivo de 96 pozos con una densidad de 5 x 103 células por pozo tras la transfección con si-MEG3 o si-NC y se mantuvieron durante 24 horas. En los puntos de tiempo designados, se introdujeron 10 μL de reactivo de viabilidad celular en cada pozo, y las placas se incubaron a 37 °C durante 2 horas. Los valores de absorbancia se midieron posteriormente a 450 nm usando un lector de microplacas. La viabilidad celular se calculó como porcentaje respecto al grupo control.
7. Detección de apoptosis mediante citometría de flujo
Los cambios apoptóticos en las células MIN6 se examinaron utilizando un kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC/PI según las instrucciones del fabricante. Tras 48 horas de transfección de siRNA, se extrayeron las células, se lavaron dos veces con solución salina fría tamponada con fosfato y se resuspendieron en un tampón de unión. Posteriormente, las células se incubaron con 5 μL de Annexin V-FITC y 5 μL de yoduro propidio durante 15 minutos a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad. Inmediatamente después de la tinción, las muestras se analizaron mediante citometría de flujo. Las poblaciones celulares apoptóticas tempranas y tardías se cuantificaron mediante software de análisis citométrico de flujo. Posteriormente, se calculó la proporción de células apoptóticas para comparaciones entre grupos. Cada experimento se llevó a cabo de forma independiente tres veces.
8. Análisis de Western Blot
Los experimentos con Western blot se realizaron según los protocolos18 previamente reportados. Las células fueron primero digeridas con tripsina, recogidas y lisadas sobre hielo utilizando un tampón de lisis por radioinmunoprecipitación. Se cuantificaron concentraciones de proteínas y se sometieron cantidades equivalentes de proteína a separación en geles de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida al 10% antes de transferirse a membranas de polivinilideno fluoruro. Tras el bloqueo de membrana, se incubaron muestras con anticuerpos primarios contra NF-κB (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), caspasa-3 (1:1000) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1:2000) en las proporciones de dilución indicadas, seguidas de incubación con anticuerpos secundarios ligados a la peroxidasa de rábano picante. Las señales proteicas se detectaban mediante un sistema de quimioluminiscencia y se cuantificaban con el software ImageJ. Se utilizó GAPDH como control de carga interna, y los niveles de expresión proteica se expresaron como cambios en el pliegue en relación con el grupo de control.
9. Análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DS). Se realizaron comparaciones entre grupos utilizando la prueba Mann–WhitneyU 19 mediante análisis estadístico. Se consideró estadísticamente significativo un valor p <0,05.
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Evaluación del modelo murino con sobrecarga de hierro y medición de la expresión materna del gen 3 en tejidos pancreáticos
Para investigar el papel de MEG3 in vivo, establecimos un modelo de sobrecarga de hierro en ratones mediante inyección intraperitoneal de dextrano de hierro. En comparación con el grupo de control, los niveles de hierro sérico en el grupo modelo aumentaron significativamente (p<0,05) (Figura 1A). El examen histológico revel...
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El metabolismo anormal de la glucosa es una complicación común y grave en pacientes con β-TM, que a menudo se manifiesta como IGT o DM. En este estudio, descubrimos que la sobrecarga de hierro provocaba daño pancreático y disminuía significativamente la expresión de ARNlnc MEG3 en el tejido pancreático, acompañada de un aumento de la apoptosis de las células β islotes. Además, la reducción de MEG3 en células MIN6 promovió la apoptosis de células β y se asoció con la activación de NF-ĸB, ...
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Los autores no declaran conflictos de interés.
Esta investigación fue financiada por la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Hainan de China (822QN445) y la Fundación del Comité Educativo de Hainan (Hnky2024-30).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1M Tris-HCL (pH=6.8) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | T1020 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TIANGEN | GH101-01 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TRANS | GH101-01 | |
| -80ºC refrigerator | BIOBASE | BDF-86V348 | |
| ABI 7500 real-time PCR system | Applied Biosystems, USA | ||
| Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit | MULTI SCIENCES | AP101-100-kit | |
| BCA Protein Assay Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd. | E-BC-K318-M | |
| Biopulverizer | biospec | ||
| BSA | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | A8020 | |
| C57BL/6J male mice | Gempharmatech Co,Jiangsu,China | ||
| CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit | KeyGEN BioTECH | KGA317 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| DMEM | KeyGEN BioTECH | ||
| Flow cytometry | ACEA Biosciences, USA | NovoCyte 2060R | |
| Fluorescence PCR instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | ||
| Glycine | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | G8200 | |
| High-capacity cDNA reverse transcription kit | Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA | ||
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Servicebio | GB23301 | 1/2000 |
| HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Servicebio | GB23303 | 1/2000 |
| Human LncRNA Array V5.0 | Arraystar,Rockville, Maryland, USA | ||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| Microarray scanner | Agilent Technologies,California, USA | ||
| MIN6 cell | procell | KGM12800N | |
| Mini-Bead-Beater-16 | biospec | ||
| Mouse Anti-GAPDH | TransGen Biotech | HC301 | 1/2000 |
| NanoDrop spectrophotometer | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | ND-2000 | |
| PAGE Pre-Solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | A1010 | |
| Primers | Generay Biotech,Anhui, China | ||
| PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Rabbit Anti Bax | proteintech | 50599-2-ig | 1/5000 |
| Rabbit Anti Bcl-2 | abcam | ab194583 | 1/1000 |
| Rabbit Anti Caspase3 | abcam | ab184787 | 1/2000 |
| Rabbit Anti P65 | abcam | ab32536 | 1/8000 |
| Rabbit Anti p-P65 | Affinity | af2006 | 1/1000 |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa, Japan | ||
| TRIzol | Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA | ||
| TRIzol reagent | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | Chemi DocTM XRS+ | |
| Ultraviolet spectrophotometer | NanoPhotometer | NP80 |