La aconitina induce daño miocárdico en ratas asociado con la activación de la vía de señalización JNK1/2

Resumen

Este estudio investigó el posible papel de la señalización JNK1/2 en el daño miocárdico inducido por aconitina en ratas. El aumento de la fosforilación de JNK1/2 se asoció con daño miocárdico, mientras que la inhibición farmacológica de la vía JNK alivió parcialmente el daño miocárdico, lo que sugiere que la señalización JNK podría participar en la cardiotoxicidad inducida por aconitina.

Resumen

El envenenamiento agudo por aconitina (Acon) puede causar arritmia y daño miocárdico; sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. Este estudio investigó el mecanismo de la lesión miocárdica inducida por intoxicación aguda por Acon. Se estableció un modelo en rata (n = 51) de intoxicación aguda por Acon mediante administración intragástrica. Se utilizaron trazos electrocardiográficos para registrar los cambios en el ritmo cardíaco. Se realizaron tinciones de hematoxilina y eosina (HE) y de Masson para evaluar la lesión patológica miocárdica y la deposición de colágeno. Los niveles de expresión de enzimas y proteínas cardíacas en sangre venosa se detectaron mediante kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La relación estructura-actividad entre Acon y la vía JNK fue investigada mediante acoplamiento molecular. Los niveles de expresión de las proteínas fosforiladas de la quinasa C-Jun N-terminal 1/2 (JNK1/2) fueron detectados por Western bloting. En este estudio, se observaron arritmias ventriculares en ratas tras la administración intragástrica de Acon. El tejido miocárdico mostró una disposición desordenada de fibras y células miocárdicas, acompañada de deposición anormal de colágeno. Los resultados del acoplamiento molecular indicaron posibles interacciones entre Acon y JNK1/2. Mientras tanto, los niveles de expresión de enzimas y proteínas cardíacas, así como de JNK1/2 fosforilados, aumentaron significativamente. Estudios posteriores demostraron que el tratamiento con el inhibidor de JNK SP600125 revertido parcialmente la lesión miocárdica inducida por Acon en ratas. Estos resultados indican que la fosforilación de JNK1/2 está implicada en el desarrollo de lesiones miocárdicas inducidas por intoxicación aguda por aconitina. Los hallazgos sugieren que la activación de la vía de señalización JNK1/2 contribuye al daño miocárdico inducido por aconitina, y que la inhibición de la vía JNK1/2 puede aliviar la lesión miocárdica causada por una intoxicación aguda por aconitina.

Introducción

Acon es un extracto natural de alcaloides diterpenos de la planta Aconitum de la familia Ranunculaceae. Tiene efectos^{antiinflamatorios 1,2}, analgésicos, antitumorales, antirreumáticos, inmunometabolismos y promoción de la circulación^{sanguínea 3,4,5}. Sin embargo, el uso inapropiado o excesivo de preparaciones que contengan Acon puede provocar episodios graves de intoxicación. Los síntomas causados por la intoxicación por aconitina incluyen síntomas^{cardíacos 6}, síntomas^{neurológicos 7} y síntomas^{gastrointestinales 8}. En los últimos años, ha habido frecuentes informes en todo el mundo de casos de envenenamiento por acónito o^{muertes 9, 10, 11}. La intoxicación por acón se manifiesta principalmente en el sistema cardiovascular, nervioso y digestivo. Entre ellas, la principal causa de muerte por intoxicación es la cardiotoxicidad. El daño cardíaco causado por Acon es muy grave; en particular, el inicio corto del síndrome dificulta llevar a cabo el tratamiento clínico de manera oportuna. Normalmente, la intoxicación aguda por Acon provoca náuseas, diarrea, mareos, dolor en el pecho, dispnea y otros primeros síntomas en unas pocas horas^. Actualmente, el mecanismo detallado del daño miocárdico causado por la intoxicación aguda por Acon sigue sin estar claro, y no existen medicamentos clínicamente eficaces que puedan aliviar eficazmente el daño miocárdico causado por la intoxicación por^{Acon 12,13}.

El daño en la intoxicación aguda por Acon que permita explorar el mecanismo del daño miocárdico podría proporcionar un medio significativo para una investigación dependiente del tiempo. Dicho modelo podría tener potencial para el tratamiento futuro de pacientes con intoxicación aguda por Acon y podría prevenir el desarrollo temprano del síndrome de forma temprana. Los estudios han especulado sobre el papel de la vía de señalización de la quinasa n-terminal c-Jun (JNK) en la respuesta inmunitaria a los venenos. La vía de señalización JNK es una de las vías de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK). La familia JNK tiene tres genes (JNK1/MAPK8, JNK2/MAPK9 y JNK3/MAPK10). JNK1 y JNK2 pueden expresarse en la mayoría de los tejidos, incluido el corazón, mientras que JNK3 se encuentra principalmente en el cerebro¹⁴, y está principalmente relacionado con el estrés oxidativo y la respuesta inflamatoria de las células¹⁵. Los estudios han encontrado que la vía de señalización mediada por JNK desempeña un papel importante en la isquemia/reperfusión cerebral y^{miocárdica 16,17}. La administración de C66 alivia la inflamación miocárdica inducida por dietas ricas en grasas al inhibir la activación de JNK en corazones de^{ratón 18}. El ácido clorogénico alivia la lesión cardiomiocítica inducida por el TNF-α inhibiendo la señalización de^{JNK 19}. Pinocembrin alivia el daño miocárdico inducido por LPS y la respuesta inflamatoria inhibiendo la vía de señalización p38/JNK MAPK, y alivia la disfunción cardíaca y la^{arritmia 20}. Estos estudios indican que los cambios en la señalización JNK, principalmente JNK1/2, están estrechamente relacionados con el daño miocárdico. Mientras tanto, JNK también es un objetivo aguas abajo de Acon para una serie de actividades. Un estudio encontró que altas dosis de exposición a Acon pueden mediar la vía de activación enzimática JNK, causando toxicidad del desarrollo en embriones de pez cebra (juveniles), como acortamiento de la longitud corporal, forma curva y defectos en el desarrollo cerebral²¹. Este estudio sugiere que Acon podría activar la vía de señalización JNK. Sin embargo, el papel de la vía de señalización JNK en el daño miocárdico causado por intoxicación aguda por aconitina no está claro.

Este estudio estableció un modelo en ratas de intoxicación aguda por Acon en daño miocárdico mediante diferentes dosis intragástricas e intervalos de tiempo. Además, exploramos el efecto de Acon en el nivel de fosforilación de JNK1/2 en el miocardio y la activación de la vía de señalización JNK en este modelo. Explorar el papel de la fosforilación JNK1/2 en la lesión miocárdica en ratas inducida por intoxicación aguda por Acon proporciona una base teórica para el estudio del daño miocárdico causado por una intoxicación aguda por Acon.

Protocolo

El diseño experimental y el plan de implementación fueron aprobados por el Comité de Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Kunming para su aprobación (número de aprobación: Kmmu20220652) el 06/2022. Todos los planes experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las "Directrices para Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Kunming". La lista de todos los materiales utilizados en este estudio se encuentra en la Tabla de Materiales.

PRECAUCIÓN: Debido a la alta toxicidad de Acon, todos los procedimientos de preparación y administración se realizaron conforme a las normativas de seguridad de laboratorios institucionales. El personal que manejaba Acon llevaba el equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, batas de laboratorio y mascarillas, y se realizaron procedimientos que implicaban la preparación de Acon con las precauciones adecuadas para minimizar el riesgo de exposición. Los animales fueron monitoreados de cerca durante y después de la administración de Acon en busca de signos de toxicidad y malestar severos, y se aplicaron criterios humanos cuando fue necesario para minimizar el sufrimiento. Los residuos biológicos y los materiales contaminados con Acon se eliminaron conforme a las normativas institucionales de bioseguridad.

Tratamiento animal

Se criaron ratas machos adultas Sprague-Dawley (SD) (2 meses, 230 g) en el edificio de experimentos con SPF, centro experimental de animales de la Universidad Médica de Kunming. Las condiciones de alimentación de todas las ratas SD se trataron según los requerimientos de alimentación de las ratas SPF. Fueron criados adaptativamente durante una semana y ayunaron 12 horas antes del experimento. El Acon se disolvió en un tampón de acetato de 0,05 M (Acet), y las ratas SD se dividieron en 4 grupos según el principio de control aleatorio: Grupo 1 (Acon-1 mg) administrado 1 mg/kg de Acon por gavage; Grupo 2 (Acon-2 mg) administrados 2mg/kg de Acon por vía intragástrica; Grupo 3 (acet), administrados 2 mL de acetato 0,05 M tamponado por intragástrico; y Grupo 4 (Control, sin tratamiento). Las muestras se recogieron a las 1, 3 y 6 horas tras la administración intragástrica. Se estudiaron un total de 36 ratas, con 3 por grupo a 1 h, 3 h y 6 h. En cada momento designado, se realizaban primero grabaciones de ECG. Posteriormente, se anestesió a las ratas y se recogieron muestras de sangre para análisis bioquímicos séricos. Tras la extracción de sangre, las ratas eran sacrificadas y el tejido cardíaco se extirpa rápidamente. Se fijaron porciones del tejido miocárdico para análisis histológico (tinción HE y Masson), mientras que los tejidos restantes se almacenaron para el análisis de expresión proteica mediante Western bloting. En experimentos que analizaron los activadores e inhibidores JNK1/2, las ratas SD se dividirán en 5 grupos según el principio del control aleatorio: el grupo modelo recibió la administración de 2 mg/kg de Acon intragástrico, y el grupo inhibidor recibió una inyección intraperitoneal de 6 mg/kg SP600125²² inicialmente, seguida de 2 mg/kg de Acon por gavage 2 horas después. El grupo agonista recibió inicialmente una inyección intraperitoneal de 0,1 mg/kg de anisomicina (Anis^)23,24, seguida de 2 mg/kg de Acon por gavage 2 horas después. El grupo DMSO recibió una inyección intraperitoneal de 2 mL de solución mixta con cosolvente DMSO al 0,8%. El grupo control no recibió ningún tratamiento. Se estudiaron un total de 15 ratas. Todos los resultados de la tinción se analizaron de forma cega para minimizar el sesgo observacional. Durante el periodo experimental, las ratas fueron monitorizadas continuamente para detectar su estado de supervivencia y signos de toxicidad severa tras la administración de Aconitina. La mortalidad se registró en cada punto de observación designado (1 h, 3 h y 6 h). La muerte se definía como la cesación total de la respiración y el latido cardíaco. Se consideró que los animales que presentaban un malestar severo, incluyendo disnea persistente, pérdida del reflejo de enderezamiento, incapacidad para caminar o estado moribundo, habían alcanzado puntos humanos y fueron sacrificados inmediatamente bajo anestesia profunda para minimizar el sufrimiento. El número de muertes por cada grupo de ratas (Tabla 1–4).

Trazado electrocardiográfico de rata (ECG)

Las ratas de cada grupo fueron sometidas a trazos por ECG. El método específico fue el siguiente: tras anestesia mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 30 mg/kg. Las ratas estaban fijadas en posición supina en la consola de experimentos con animales. El ordenador se conectaba al sistema de adquisición y análisis de señales biológicas BL-420N, y el conector del cable de derivación del ECG se insertaba en el puerto de entrada de 3 canales del sistema BL-420N. Los alfileres se insertaban subcutáneamente en la parte interna de la extremidad anterior derecha, la extremidad trasera derecha y la extremidad posterior izquierda de las ratas. Los pasadores se remojaron y esterilizaron en un 75% de alcohol antes de la operación, y se tuvo cuidado para evitar insertarlos en los músculos. Los clips de electrodo del cable de plomo del ECG se conectaban entonces a los pines de cada extremidad. Se activaron el interruptor de encendido y el software del sistema de adquisición y análisis de señales biológicas BL-420N. Se seleccionó el canal 3 para la adquisición de señal y el tipo de señal se configuró como ECG de ratos. Los parámetros se establecieron de la siguiente manera: tasa de muestreo, 1 kHz; alcance, 2,0 mV; constante de tiempo (filtrado pasa altos), 200 ms (0,80 Hz); filtrado pasa-bajos, 100 Hz; velocidad de barrido, 200,0 ms/div; y el filtro de muesca de 50 Hz estaba apagado. Se registró el ECG de derivación II y se observaron cambios en el ECG. Una vez que el ECG se estabilizó, se realizaron monitorizaciones y registros durante 3 minutos, y los datos se guardaron en grupos para su posterior análisis. Tras la grabación del ECG, se retiraron los clips y pasadores de electrodo, y las ratas fueron devueltas a sus jaulas. Las ratas se mantuvieron calientes y se monitorizó su respiración hasta la recuperación completa de la anestesia para evitar muertes por asfixia. Los registros basales de ECG se realizaron el primer día antes de cualquier tratamiento. En el segundo día, se administró Acon a las ratas por gavage intragástrico, y posteriormente se realizaron registros de ECG a las 1 h, 3 y 6 horas después de la administración, utilizando el mismo procedimiento.

Tinción por hematoxilina y eosina (HE) y tinción por Masson

Los corazones se cortaron en el plano horizontal del eje corto, y el tejido cardíaco del ápice cardíaco de ratas SD se recogió y fijó en poliformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 24 horas. Los tejidos fijos se deshidrataron, se eliminaron en xileno e incrustaron cera de parafina. Luego, se teñieron secciones (de 4 μm de grosor) con tinción HE y Masson según el procedimiento estándar. En la tinción con HE, la tinción por hematoxilina se realizó durante 2 minutos, luego las muestras se remojaron en agua tibia durante 1 minuto, y después se realizó la tinción con eosina durante 30 segundos. En la tinción Masson, tiñe con solución de hematoxilina de hierro Weigert durante 5 minutos, luego con solución de azul Masson durante 3–5 minutos, y finalmente con solución azul anilina durante 1–2 minutos. Las láminas se observaron bajo un microscopio óptico ordinario. Para cada sección, se seleccionaron al azar cinco campos microscópicos no solapados con la misma ampliación, evitando grandes recipientes y artefactos evidentes. La fracción volumétrica de colágeno (CVF) se calculó usando ImageJ, según la ecuación (1):

(1)

Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA)

Tras registrar el ECG, las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico y luego se realizó una laparotomía de la línea media para recoger sangre venosa. Las muestras de sangre se recogieron mediante punción de la vena cava inferior utilizando una aguja desechable para la recogida venosa. La sangre se incubó a 4 °C durante la noche y el sobrenadante se recogió tras centrifugación a 1000 × g durante 20 minutos. Las concentraciones de CK-MB, AST, LDH, cTn-1 y h-FABP se determinaron utilizando un kit de ensayo ELISA. El ELISA se realizó según las instrucciones del fabricante. Los valores de densidad óptica (OD) de cada pozo se determinaron a 450 nm, utilizando un lector de microplacas.

Análisis de Western blot

La proteína total se extrajo de los tejidos cardíacos utilizando un kit de extracción de proteínas. Se utilizó un kit de ensayo de proteínas BCA para determinar la concentración de proteínas. La proteína total (el volumen de muestra de la proteína a analizar fue de 10 μL) se separó con electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida al 10% y se transfirió a la membrana PVDF, bloqueando el 5% de leche desnatada durante 30 minutos. Posteriormente, la membrana fue incubada durante la noche con anticuerpos primarios JNK1/2(1:500), p-JNK1/2 (1:1000) y GAPDH (1:4000). Al día siguiente, se lavaron todas las membranas con PBST tres veces y luego se incubaron con el anticuerpo secundario adecuado (1:5000) durante 1 hora. Finalmente, se utilizaron reactivos de quimioluminiscencia mejorados para la detección de señales; la solución reveladora se aplicó de forma uniforme en gota a gota sobre las tiras de membrana PVDF y se dejó incubar durante 10 segundos, seguido de exposición, revelado e imagen. Las intensidades de las bandas Western Blot se midieron utilizando el software ImageJ.

Validación de acoplamiento molecular

La estructura molecular SDF 3D de Aconitine se descargó de la base de datos PubChem, y la estructura SDF se convirtió en una estructura mol2 usando el software OpenBabel. Las estructuras proteicas PDB de mayor resolución y más largas de JNK1 y JNK2 se descargaron de las bases de datos Uniprot y Protein Data Bank. Se realizaron hidrogenación, eliminación de ligandos y adición total de hidrógeno en proteínas macromoleculares, mientras que la adición completa de hidrógeno y la carga electrónica se realizaron en compuestos de moléculas pequeñas, y se establecieron enlaces de torsión. Se realizaron experimentos de acoplamiento molecular mediante AutoDock Vina, donde las afinidades de unión ≤ -7,0 kcal/mol se definieron como indicativas de fuertes interacciones ligando-proteína. Se utilizó PyMol para visualizar la estructura 3D del complejo de acoplamiento, y Discovery Studio se empleó para visualizar la estructura 2D del complejo de acoplamiento.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente. GraphPad Prism 8 se utilizó para analizar y graficar todos los datos estadísticamente. Todos los datos se mostraron como media ± desviación estándar (DS). El test t de Student se utilizó para comparar entre dos grupos. Para comparaciones entre múltiples grupos en el mismo momento o análisis de curso temporal dentro del mismo grupo, se utilizó ANOVA unidireccional. Se consideró que p < 0,05 indicaba un²⁵ estadísticamente significativo.

Resultados

Resultados del ECG en ratas tras Acon gavage

Estudios previos han demostrado que los efectos tóxicos de la aconitina ocurren en la fase temprana, normalmente en las primeras horas tras la administración^26,27. Por lo tanto, para captar la aparición temprana y progresión de la cardiotoxicidad aguda dentro de esta ventana temporal, seleccionamos tres puntos temporales: 1 h, 3 h y 6 h para los experimentos. Los resultados del electrocardiograma mostraron que tras 1, 3 horas y 6 horas de acción de Acon, no se produjeron arritmias en el grupo control ni en el grupo Acet, y los cambios en el ECG no fueron evidentes. Las ratas del grupo Acon-1mg presentaron contracciones ventriculares prematuras y bigemina ventricular prematura, respectivamente, triplete ventricular prematuro, taquicardia ventricular de ráfaga corta, taquicardia ventricular monomórfica, taquicardia ventricular bidireccional y una o más arritmias ventriculares. Las ratas del grupo Acon-2 mg desarrollaron contracciones ventriculares prematuras, una o más arritmias ventriculares, incluyendo bigeminia ventricular prematura, taquicardia ventricular de ráfaga corta y taquicardia ventricular bidireccional (Figura 1, Figuras suplementarias 1–2). El acon promueve el daño patológico miocárdico y aumenta la tinción de colágeno en el tejido miocárdico de ratas.

El tejido miocárdico fue evaluado mediante tinción hecrófona. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo de control y el grupo Acet, tras 1, 3 horas y 6 horas de tratamiento con Acon, el tejido miocárdico de ratas SD en el grupo Acon-1 mg mostró ruptura parcial de fibras musculares miocárdicas, disposición desordenada de las células miocárdicas, el intersticio miocárdico se ensancha y se produce edema en el intersticio miocárdico, La mayoría de las células miocárdicas están hinchadas, los núcleos están profundamente teñidos y condensados, un gran número de células miocárdicas sufren degeneración y se forman vacuolas redondas en el citoplasma de la fibra miocárdica (indicadas por flechas). Las estrías de fibras musculares en el tejido miocárdico de ratas SD del grupo Acon-2 mg eran poco claras o desaparecían; La disposición de los haces musculares era suelta y desordenada, los espacios intermusculares se ensancharon, un gran número de núcleos celulares estaban profundamente teñidos, la picnosis nuclear, el edema intercelular y las células miocárdicas estaban hinchadas y degeneradas. El citoplasma de las fibras miocárdicas mostró vacuolas redondas (mostradas por flechas) (Figura 2A, Figura suplementaria 3A, Figura suplementaria 4A).

Se realizó una tinción de Masson para evaluar la deposición de colágeno en tejido miocárdico. En los grupos Control y Acet, los cardiomiocitos mostraron morfología normal, observándose una deposición mínima de colágeno en el intersticio miocárdico. En el grupo Acon-1 mg, se observaron aumentos leves de colágeno teñido de azul en algunas zonas intersticiales. En el grupo Acon-2 mg, las regiones más extensas tintadas de azul se distribuyeron difusamente por todo el tejido miocárdico, acompañadas de una disposición desorganizada del miofilamento y alteración de la estructura miocárdica normal. La gradidad de tinción por colágeno en el grupo Acon-2 mg fue mayor que en el grupo Acon-1 mg. El análisis cuantitativo mostró que la fracción volumétrica de colágeno (CVF) aumentó significativamente tanto en los grupos Acon-1 mg como en Acon-2 mg en comparación con los grupos Control y Acet (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05). Cabe destacar que el valor de CVF alcanzó su nivel más alto en el grupo de Acon-2 mg a las 6 horas tras la administración intragástrica (Figura 2B, Figura suplementaria 3B, Figura suplementaria 4B). Considerando el corto periodo de observación (1–6 h), estos hallazgos son más propensos a reflejar cambios intersticiales agudos, como edema o alteraciones en los patrones de tinción de colágeno, en lugar de fibrosis miocárdica establecida. Además, no hubo diferencias significativas en el peso cardíaco entre los grupos a 1 h, 3 h y 6 h tras el tratamiento con Acon-1 mg o Acon-2 mg (Tabla 5).

El acon promueve enzimas cardíacas y niveles de proteínas cardíacas en la sangre venosa de las ratas

Para evaluar el daño miocárdico inducido por Acon, medimos los niveles séricos de marcadores de lesión cardíaca, incluyendo CK-MB, AST, LDH, cTn-I y h-FABP. En comparación con los grupos Control y Acet, los grupos Acon-1 mg y Acon-2 mg mostraron niveles significativamente aumentados de CK-MB, AST, LDH, cTn-I y h-FABP a 1 h, 3 h y 6 h (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05). Además, en los mismos momentos, los aumentos en estos marcadores fueron más pronunciados en el grupo Acon-2 mg que en el grupo Acon-1 mg (p < 0,05) (Figura 3).

Resultados del acoplamiento molecular

Para examinar más a fondo el efecto de Acon en la vía de señalización del daño miocárdico en ratas, utilizamos acoplamiento molecular para identificar proteínas relacionadas con Acon. Los resultados del acoplamiento mostraron que Acon podía unirse establemente a los bolsillos activos tanto de JNK1 como de JNK2 mediante múltiples interacciones no covalentes. En JNK1, la aconitina formó dos enlaces de hidrógeno convencionales con ALA267 y SER299, con distancias de enlace de 2,0 Å y 2,1 Å, respectivamente, indicando fuertes interacciones direccionales que contribuyen al anclaje de ligandos. Además, se observaron extensas interacciones de van der Waals entre la aconitina y los residuos circundantes, facilitando una estrecha complementariedad espacial dentro del bolsillo de unión. Las interacciones hidrofóbicas, incluidas las interacciones Alquilo/π-Alquilo con ILE304, estabilizaron aún más el ligando dentro del microambiente hidrofóbico. También se identificaron enlaces carbono-hidrógeno, formando una red de interacción cooperativa que sostiene la unión de ligandos (Figura 4A–C). En JNK2, la aconitina formó un enlace de hidrógeno convencional con LEU302 (2,1 Å), sirviendo como una interacción clave de anclaje. De forma similar a JNK1, las interacciones de van der Waals, las interacciones hidrofóbicas y los enlaces carbono-hidrógeno contribuyeron colectivamente a la estabilización del complejo ligando-proteína (Figura 4D–F). Los resultados del acoplamiento de los compuestos probados se informan como puntuaciones de unión (kcal/mol) y se presentan en la Tabla 6. En general, los enlaces de hidrógeno proporcionaron especificidad y anclaje, las interacciones hidrofóbicas mejoraron la incrustación de ligandos y la afinidad de unión, y las interacciones de van der Waals contribuyeron a la estabilidad compleja general. Estos hallazgos indican que la aconitina puede formar complejos estables tanto con JNK1 como con JNK2, lo que respalda su potencial como agente de señalización.

Acon subregula el nivel de fosforilación de JNK

Para investigar más a fondo el efecto de Acon en la vía de señalización JNK en tejido miocárdico, se evaluó la expresión de fosforilación de JNK1/2 mediante Western bloting. En comparación con los grupos Control y Acet, los grupos Acon-1 mg y Acon-2 mg mostraron niveles significativamente aumentados de p-JNK1/2 (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05). Además, el nivel de fosforilación de JNK1/2 fue significativamente mayor en el grupo Acon-2 mg que en el grupo Acon-1 mg (p < 0,05) (Figura 5A). Dentro del grupo Acon-2 mg, las comparaciones entre diferentes momentos mostraron que los niveles de p-JNK1/2 aumentaron significativamente a 1 h, 3 h y 6 h, observando el nivel más alto a las 6 h (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05) (Figura 5B). A partir de estos resultados, se seleccionó el grupo Acon-2 mg a las 6 horas para experimentos posteriores.

El inhibidor de JNK alivia el daño patológico miocárdico y la tinción de colágeno en el tejido miocárdico de rata

Para evaluar más a fondo el papel regulador de la vía de señalización JNK, se evaluaron los niveles de expresión de p-JNK1 y p-JNK2 en el tejido miocárdico mediante Western bloting. En comparación con los grupos Control y DMSO, el grupo Acon mostró niveles de expresión significativamente aumentados de p-JNK1 y p-JNK2 (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05). En comparación con el grupo Acon, el grupo Acon+SP600125 mostró niveles significativamente disminuidos de p-JNK1 y p-JNK2 (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05). En contraste, en comparación con el grupo Acon+SP600125, el grupo Acon + Anis mostró niveles de expresión significativamente aumentados de p-JNK1 y p-JNK2 (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05) (Figura 6).

Se investigaron más a fondo los efectos de Anis y SP600125 sobre el daño miocárdico. Los resultados de la tinción con HE mostraron que, en comparación con el grupo Acon, el edema intersticial del tejido miocárdico en el grupo Acon+SP600125 se redujo, la hinchazón de algunos cardiomiocitos desapareció y el citoplasma celular fue uniforme. El espacio muscular está lleno, el espacio intermuscular se vuelve más delgado, algunas fibras miocárdicas están dispuestas de forma estrecha y ordenada, un pequeño número de núcleos celulares están profundamente teñidos, y el citoplasma de las fibras miocárdicas muestra pequeñas vacúolas redondas, aliviando el daño patológico miocárdico. En comparación con el grupo Acon+SP600125, el grupo Acon + Anis tenía fibras miocárdicas rotas, huecos musculares ensanchados, fibras miocárdicas dispuestas de forma suelta y desordenada, células miocárdicas hinchadas y degeneradas, cromatina nuclear profundamente teñida y edema intercelular (Figura 7A).

Se realizó una tinción de Masson para evaluar la tinción de colágeno en tejido miocárdico. En el grupo Acon+SP600125 se observaron áreas moderadas con tinción azul en el intersticio miocárdico. En comparación con el grupo Acon, la fracción volumétrica de colágeno (CVF) en el grupo Acon+SP600125 se redujo significativamente, lo que indica una atenuación de los cambios intersticiales inducidos por aconitina. En contraste, en el grupo Acon + Anis se observaron áreas de colágeno teñidas de azul más extensas en el intersticio miocárdico en comparación con el grupo Acon+SP600125, acompañadas de un aumento significativo del CVF (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05) (Figura 7B). Además, no hubo diferencias significativas en el peso cardíaco entre los grupos (Tabla 5). Teniendo en cuenta el corto periodo de observación (1–6 h), estos cambios son más propensos a reflejar alteraciones intersticiales agudas, como edema o cambios en los patrones de coloración del colágeno, en lugar de fibrosis miocárdica establecida. Estos hallazgos sugieren que SP600125 alivia la lesión miocárdica inducida por aconitina, mientras que la anisomicina agrava aún más el daño miocárdico bajo estas condiciones experimentales.

El inhibidor de JNK alivia la expresión de enzimas cardíacas y proteínas cardíacas en el suero de rata

Los resultados de ELISA mostraron que, en comparación con el grupo Acon, las expresiones de CK-MB, AST y LDH se redujeron significativamente en el grupo Acon + SP600125, mientras que las expresiones de CK-MB, AST y LDH aumentaron tras la acción de Anis (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05). Además, en comparación con el grupo Acon, la expresión de cTn-I y h-FABP se redujo significativamente en el grupo Acon + SP600125 (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05). En comparación con el grupo Acon + SP600125, la expresión de cTn-I y h-FABP aumentó significativamente en el grupo Acon + Anis (n = 3 ratas por grupo, ANOVA unidireccional, p < 0,05) (Figura 8A–8B).

DISPONIBILIDAD DE DATOS:

Todos los datos en bruto utilizados en este estudio están disponibles en los archivos suplementarios adjuntos al manuscrito.

Figura 1: Ilustración electrocardiográfica de arritmia en ratas (tras 6 horas de acción de Acon). De arriba a abajo, el grupo de control, el grupo Acet, el grupo Acon-1 mg y el grupo Acon-2 mg. Tipos de arritmias en Acon-1mg-A-gavage y Acon-2 mg-A-gavage (en orden de aparición de arritmias de arriba a abajo): Acon-1mg-A-gavage: contracciones ventriculares prematuras; bigeminia ventricular prematura; taquicardia ventricular bidireccional. Acon-2 mg-A-gavage: contracciones ventriculares prematuras; bigeminia ventricular prematura; breve estallido de taquicardia ventricular. Abreviaturas; B-gavage = Antes de Acon gavage; A-gavage = Después de Acon gavage. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Daño miocárdico y tinción por colágeno en el tejido miocárdico de rata indicados por tinción HE y Masson. (A) Los cambios patológicos en el tejido miocárdico de rata fueron detectados por tinción HE (la flecha amarilla indica las vacuolas redondas formadas por cardiomiocitos dañados); barra de escala = 100 μm. (B) Se detectó tinción de colágeno en tejido miocárdico de rata mediante tinción Masson; escala = 50 μm. Media ± DS, n = 3. Todos los valores P se calcularon mediante análisis independiente unidireccional de la varianza. *p < 0,05, **p < 0,01. 40x y 400x. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Los niveles de CK-MB, AST, LDH, cTn-I y h-FABP en el suero de rata indicaron daño miocárdico. (A–F). Los niveles de CK-MB, AST, LDH, cTn-I y h-FABP se midieron utilizando kits ELISA. Media±SD, n = 3. Todos los valores p se calcularon mediante análisis independiente unidireccional de la varianza. *p < 0,05, **p < 0,01. Abreviaturas; CK-MB = Creatina Quinasa-MB; AST = Aspartato aminotransferasa; LDH = lactato deshidrogenasa; cTn-I = Troponina cardíaca I; H-FABP = proteína de unión a ácidos grasos tipo corazón. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Resultados del acoplamiento molecular de Acon con la vía JNK. (A–B) y (D–E) Los diagramas de interacción 2D de Acon con la proteína JNK1/2. (C) y (F) Los diagramas de interacción 3D de Acon con la proteína JNK1/2. Abreviaturas; JNK = c-Jun Kinasa N-terminal. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Acon regula al alza el nivel de fosforilación de JNK. (A–B) Los niveles de expresión de p-JNK1/2 y JNK1/2 en tejidos miocárdicos de rata fueron detectados mediante Western bloting. Media ± DS, n = 3. Todos los valores p se calcularon mediante análisis independiente unidireccional de la varianza. *p < 0,05, *p < 0,01. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: El inhibidor de JNK inhibe la fosforilación de JNK inducida por Acon. Los niveles de expresión de p-JNK1/2 y JNK1/2 en tejidos miocárdicos de rata fueron detectados mediante Western bloting. Media ± DS, n = 3. Todos los valores p se calcularon mediante análisis independiente unidireccional de la varianza. *p < 0,05, **p < 0,01. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: El inhibidor de JNK alivia el daño patológico miocárdico y la tinción por colágeno en ratas. (A) Los cambios patológicos en los tejidos miocárdicos de rata fueron detectados mediante tinción con HE (la flecha amarilla muestra las vacúolas redondas formadas por cardiomiocitos dañados); escala = 100 μm. (B) Se detectó tinción por colágeno en tejido miocárdico de rata mediante tinción de Masson; escala = 50 μm. Media±SD, n = 3. Todos los valores p se calcularon mediante análisis independiente unidireccional de la varianza. *p < 0,05, **p < 0,01. 40 y 400x. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: El inhibidor de JNK regula a la baja los niveles de CK-MB, AST, LDH, cTn-I y h-FABP en el suero de rata. (A–B) Los niveles de expresión de CK-MB, AST, LDH, cTn-I y h-FABP fueron detectados por kits de ensayo ELISA. Todos los valores p se calcularon mediante análisis independiente unidireccional de la varianza. Media±SD, n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Abreviaturas; CK-MB = creatina quinasa-MB; AST = aspartato aminotransferasa; LDH = lactato deshidrogenasa; cTn-I = troponina cardíaca I; H-FABP = proteína de unión a ácidos grasos tipo corazón. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

	Control	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Ratas	9	9	9	9
Número de muertes de ratas	0	0	0	0

Tabla 1: Número de muertes de ratas tras 1 hora de acción Acon. Una hora después de la administración de Acon, no murieron ratas en el grupo de control, grupo Acet, grupo Acon-1 mg y grupo Acon-2 mg. (El número de animales finalmente incluidos en el análisis por grupo fue 3, y las ratas muertas no fueron reemplazadas).

	Control	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Ratas	9	9	9	9
Número de muertes de ratas	0	0	0	0

Tabla 2: Número de ratas muertos tras 3 horas de acción Acon. 3 horas después de la administración de Acon, no murieron ratas en el grupo de control, grupo Acet, grupo Acon-1 mg y grupo Acon-2 mg. (El número de animales finalmente incluidos en el análisis por grupo fue 3, y las ratas muertas no fueron reemplazadas).

	Control	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Ratas	9	9	9	9
Número de muertes de ratas	0	0	4	4

Tabla 3: Número de muertes de ratas tras 6 horas de acción Acon. 6 horas después de la administración de Acon, 4 de cada 9 ratas murieron en el grupo Acon-1 mg, y 4 de 9 ratas murieron en el grupo Acon-2 mg. (El número de animales finalmente incluidos en el análisis por grupo fue 3, y las ratas muertas no fueron reemplazadas).

	Control	DMSO	Acon	Acon + SP600125	Acon + Anis
Ratas	9	9	9	9	9
Número de muertes de ratas	0	0	3	1	3

Tabla 4: Número de muertes de ratas tras Anis y SP600125 acción. El número de muertes de ratas varió entre los distintos grupos de tratamiento: en el grupo Acon-2 mg, 3 de cada 9 ratas murieron; en el grupo Acon+SP600125, 1 de cada 9 ratas murió; y en el grupo Acon + Anis, murieron 3 de cada 9 ratas. (El número de animales finalmente incluidos en el análisis por grupo fue 3, y las ratas muertas no fueron reemplazadas).

Grupo	Peso cardíaco (g)
Control	0,71 ± 0,03
Acet	0,73 ± 0,02
Acon-1mg (1 h)	0,73 ± 0,06
Acon-2mg (1 h)	0,75 ± 0,02
Acon-1mg (3 h)	0,71 ± 0,04
Acon-2mg (3 h)	0,77 ± 0,03
Acon-1mg (6 h)	0,72 ± 0,03
Acon-2mg (6 h)	0,77 ± 0,02
DMSO	0,70 ± 0,03
Acon + SP600125	0,74 ± 0,03
Acon + Anis	0,75 ± 0,04

Tabla 5: El peso del corazón de las ratas. No hubo diferencias significativas en el peso cardíaco entre los grupos.

Ligando	JNK1	JNK2
Acon	-7,8 Kcal/mol	-8,41 Kcal/mol

Tabla 6: Resultados de los estudios de acoplamiento molecular. Las puntuaciones de acoplamiento entre Acon y JNK1 son de -7,8 Kcal/mol, y las puntuaciones de acoplamiento entre Acon y JNK2 son de -8,41 Kcal/mol.

Figura suplementaria 1: Ilustración electrocardiográfica de arritmia en ratas (tras 1 hora de acción de Acon). De arriba a abajo, el grupo de control, el grupo Acet, el grupo Acon-1 mg y el grupo Acon-2 mg. Tipos de arritmias en Acon-1mg-A-gavage y Acon-2 mg-A-gavage (en orden de aparición de arritmias de arriba a abajo): contracciones ventriculares prematuras; bigeminia ventricular prematura; triplizo ventricular prematuro; taquicardia ventricular de ráfaga corta; latido ventricular monomórfico Taquicardia; taquicardia ventricular bidireccional. Acon-2 mg-A-gavage: Taquicardia ventricular bidireccional. Abreviaturas; B-gavage = Antes de Acon gavage; A-gavage = Después de Acon gavage. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Ilustración electrocardiográfica de arritmia en ratas (tras 3 horas de acción de Acon). De arriba a abajo, el grupo de control, el grupo Acet, el grupo Acon-1 mg y el grupo Acon-2 mg. Tipos de arritmias en Acon-1mg-A-gavage y Acon-2 mg-A-gavage (en orden de aparición de arritmias de arriba a abajo): contracciones ventriculares prematuras; breves ráfagas de taquicardia ventricular; taquicardia ventricular bidireccional. Acon-2 mg-A-gavage: Contracciones ventriculares prematuras; taquicardia ventricular bidireccional. Abreviaturas; B-gavage = Antes de Acon gavage; A-gavage = Después de Acon gavage. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Acon promueve el daño miocárdico y la tinción de colágeno tras 1 hora de acción de Acon. (A) Los cambios patológicos en los tejidos miocárdicos de rata se detectaron mediante tinción con HE (Nota: la flecha amarilla muestra las vacuolas redondas formadas por cardiomiocitos dañados); escala = 100 μm. (B) La fibrosis en el tejido miocárdico de rata fue detectada mediante tinción de Masson; escala = 50 μm. Media ± DS, n = 3. Todos los valores p se calcularon mediante análisis independiente unidireccional de la varianza. *p < 0,05, **p < 0,01, 40x y 400x. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Acon promueve el daño miocárdico y la tinción de colágeno tras 3 horas de acción de Acon. (A) Los cambios patológicos en los tejidos miocárdicos de rata fueron detectados mediante tinción con HE (la flecha amarilla muestra las vacúolas redondas formadas por cardiomiocitos dañados); escala = 100 μm. (B) Se detectó tinción por colágeno en tejido miocárdico de rata mediante tinción de Masson; escala = 50 μm. Media ± DS, n = 3. Todos los valores p se calcularon mediante análisis independiente unidireccional de la varianza. *p < 0,05, **p < 0,01. 40x y 400x. Por favor, haz clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La acon puede inducir arritmias y daño miocárdico; sin embargo, los mecanismos subyacentes del daño miocárdico inducido por Acon siguen sin estar claros. En este estudio, se estableció con éxito un modelo en rata de intoxicación aguda por Acon con lesión miocárdica. Estos resultados demostraron que la activación de la vía de señalización JNK podría representar un mecanismo clave posterior en el daño miocárdico inducido por intoxicación aguda por Acon. Específicamente, los niveles de fosforilación de JNK1/2 estaban significativamente elevados en ratas con arritmias inducidas por Acon y daño miocárdico. Además, la inhibición de la vía JNK revirtió parcialmente el daño miocárdico causado por la intoxicación aguda por Acon. Estos hallazgos sugieren que la activación de la vía JNK desempeña un papel importante en la patogénesis del daño miocárdico inducido por aconitina.

La principal causa de muerte por intoxicación aguda por Acon es la cardiotoxicidad. Estudios previos han demostrado que, tras el tratamiento con Acon, las fibras miocárdicas en ratas se degradaron y desordenaron, la tinción nuclear se profundizó, se produjo infiltración de neutrófilos y aparecieron vacuolas^{redondas 28}. Es coherente con los resultados de la investigación. La tinción con HE reveló que el tejido miocárdico en el grupo tratado con Acon presentaba cambios patológicos, incluyendo disposición desordenada del haz muscular, ensanchamiento de huecos musculares y rotura de fibras musculares. Además, en condiciones normales, las enzimas cardíacas CK-MB, AST, LDH y las proteínas cardíacas cTn-I y h-FABP se encuentran en cantidades muy pequeñas en el^{sérum 29}. Cuando las células miocárdicas se dañan, estos marcadores se liberan en la sangre en grandes cantidades 30,31,32,33.

Los resultados de este estudio muestran que CK-MB, AST, LDH, cTn-I y h-FABP en el suero venoso de ratas del grupo Acon Gavage aumentaron en distintos grados en cada punto de observación. El nivel de expresión es más alto después de 6 horas en la administración intragástrica. Este hallazgo es coherente con estudios^{previos 34}. Encontraron que Acon causaba daños en los cardiomiocitos H9C2 de rata y aumentaba los niveles de AST. Mientras tanto, estudios previos utilizaron Acon para inducir daño miocárdico en ratas y así estudiar los efectos de los antídotos sobre el daño^{miocárdico 35}. Encontraron que los niveles de LDH y CK-MB en el suero de ratas con daño miocárdico estaban elevados. En resumen, los resultados experimentales de la detección articular de marcadores de daño miocárdico muestran que el modelo en rata de daño miocárdico inducido por intoxicación aguda por Acon puede establecerse con éxito 1, 3 y 6 horas después de la administración intragástrica de 1–2 mg/kg de Acon. El efecto de modelización de 2 mg/kg de Acon tras administración intragástrica durante 6 horas es el mejor, cumpliendo con los requisitos de los experimentos posteriores.

Los estudios han encontrado que el efecto de Acon sobre los canales iónicos Na⁺ y Ca²⁺ conduce a un aumento en la concentración intracelular de iones calcio, lo que activa aún más la vía de señalización P38-MAPK y posteriormente desencadena la reacción en cascada^JNK 36,37,38. La activación de JNK promoverá daño^{miocárdico 39,40}. Esto es coherente con los resultados de este experimento. En este estudio, descubrimos que Acon promovía la fosforilación de JNK1/2 en los cardiomiocitos y activaba la vía de señalización JNK. Esto sugiere que la activación de JNK puede representar una respuesta de señalización posterior que contribuye al daño miocárdico inducido por aconitina. Sin embargo, los mecanismos moleculares y farmacocinéticos subyacentes a la estimulación de la fosforilación de JNK1/2 por parte de Acon requieren una investigación adicional.

Los estudios han demostrado que cuando una gran cantidad de JNK1/2 se fosforila, se activa la vía de señalización JNK, lo que a su vez media la expresión descontrolada de genes en el núcleo de los cardiomiocitos y altera el ciclo celular. La inhibición de la vía de señalización JNK puede aliviar el daño miocárdico ^41,42. En los resultados de HE, el SP600125 inhibidor de la vía JNK puede reducir significativamente los cambios patológicos en el tejido miocárdico inducidos por Acon. Mientras tanto, estudios previos demostraron que, en un modelo de rata de infarto agudo de miocardio inducido por ligadura de las arterias coronarias, las fibras de colágeno teñidas de azul y la deposición de colágeno en el tejido miocárdico aumentaron notablemente, acompañadas de la activación de la vía de señalización JNK. El tratamiento con gránulos de medicina tradicional china redujo la deposición de colágeno miocárdico mediante la inhibición de la vía de señalización JNK^43,44.

En ratas con lesión miocárdica diabética, el contenido de fibra de colágeno (tinción azul) y la fracción volumen de colágeno (CVF) aumentaron significativamente. Simultáneamente, se activó la vía de señalización JNK. Se ha informado que el etanol en dosis bajas inhibe la activación de la vía JNK, atenuando así el aumento en la deposición de fibra de colágeno y en el CVF en el tejido miocárdico de^{rata 45}. En el presente estudio, el análisis de acoplamiento molecular indicó que la aconitina podría interactuar con JNK1 y JNK2 a través de múltiples interacciones no covalentes; Sin embargo, estos resultados deben considerarse evidencia de apoyo y no constituyen una prueba directa de unión fisiológica. Además, experimentos in vivo demostraron que Acon, como factor de estrés, aumentaba la fosforilación de JNK1/2, activando así la vía de señalización JNK. Esta activación se asoció con un aumento de la deposición de colágeno (tinción azul) y un elevado del FVC en el tejido miocárdico de rata, lo que finalmente llevó a daño miocárdico. Sin embargo, la adición del inhibidor de JNK SP600125 inhibido significativamente los efectos tóxicos de Acon, reduciendo el aumento del valor de FVC en el tejido miocárdico. El daño miocárdico altera la integridad normal de la membrana miocídica cardíaca y la pérdida de contenido intracelular hacia el espacio extracelular, lo que se manifiesta como niveles aumentados de enzimas miocárdicas en la sangre^46,47. Estos resultados mostraron que el aumento de los niveles de enzimas miocárdicas en la sangre de rata también indicaba que Acon causaba daño miocárdico. Al mismo tiempo, los inhibidores de JNK inhibían la secreción de enzimas miocárdicas, lo que sugiere que los inhibidores de JNK podrían aliviar parcialmente el daño miocárdico causado por Acon.

Deben reconocerse varias limitaciones de este estudio. Primero, el tamaño de la muestra en cada punto temporal era relativamente pequeño (n = 3 por grupo), lo que puede limitar el poder estadístico de los análisis, y no se realizó ningún análisis formal de potencia antes de determinar el tamaño de la muestra. Además, solo se evaluó un único rango de dosis de Aconitina y periodos de observación relativamente cortos (1–6 horas), lo que limitó la valoración de los cambios patológicos a largo plazo y las relaciones de respuesta a la dosis. En segundo lugar, aunque el aumento de la fosforilación de JNK1/2 y la intervención farmacológica sugerían la implicación de la vía de señalización JNK en la lesión miocárdica inducida por aconitina, los mecanismos aguas arriba que vinculan la exposición a la aconitina con la activación de JNK no se investigaron completamente. Se sabe que la aconitina afecta principalmente a los canales de Na⁺ dependientes de voltaje y a la homeostasis intracelular de Ca²⁺, lo que puede contribuir a la activación posterior de JNK. Sin embargo, en el presente estudio no se examinaron directamente los eventos de señalización relacionados, incluyendo el estrés oxidativo y las vías de sobrecarga de calcio. En tercer lugar, el análisis de acoplamiento molecular solo proporcionó evidencia de apoyo para posibles interacciones entre Aconitina y JNK1/2 y no representó una unión fisiológica directa. No se realizó ninguna validación experimental adicional, como resonancia de plasmones superficiales ni ensayos de pull-down. Además, solo se investigaron JNK1/2, mientras que el posible papel de JNK3 en la cardiotoxicidad inducida por acontina sigue siendo incierto. Finalmente, no se realizó una evaluación electrocardiográfica tras SP600125 ni intervención con anisina. Por lo tanto, si la regulación de la vía JNK afecta directamente a las arritmias ventriculares inducidas por aconitina requiere una investigación adicional.

En resumen, Acon activa la vía de señalización JNK, como se evidencia por el aumento de la fosforilación de JNK1/2, que puede contribuir al daño miocárdico, como se indica por un aumento de la deposición de colágeno y una liberación elevada de enzimas cardíacas en el tejido miocárdico de ratas. Teniendo en cuenta que la cardiotoxicidad inducida por aconitina implica múltiples eventos aguas arriba, incluyendo la activación del canal Na⁺, la sobrecarga de Ca²⁺ y el estrés oxidativo, la activación de la vía JNK puede representar un evento clave de señalización posterior que contribuye al daño miocárdico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4% de paraformaldehído	Wuhan Service-bio Co., Ltd.	HJ203501	Fijación tisular
Aconitine (Acon)	Chengdu DeSiTe Biological Technology Co., Ltd.	DRK-0335-960330	Compuesto tóxico para el modelo de gavage
Solución azul de anilina	Beijing Solarbio Co., Ltd.	G1350	Tinción de masón
Anisomicina (Anis)	MedChemExpress Co., Ltd.	153154	Activador/control de vías JNK
AST ELISA Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E13023r	Detección de enzimas cardíacas
AutoDock Vina	Código abierto	N/A	Acoplamiento molecular
Kit de ensayo de proteínas BCA	Sangon Biotech (Shanghái, China)	No especificado	Cuantificación de proteínas
Centrifugadora	Dongguan cnzcn Co., Ltd.	TD5M-WS	1000 y más veces; Centrifugación G
Chem3D Software	PerkinElmer	N/A	Minimización de energía de ligando
CK-MB ELISA Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E14403r	Detección de enzimas cardíacas
Kit ELISA cTn-I	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E08594r	Detección de proteínas cardíacas
Aguja desechable para la recolección de sangre venosa	KINDLY Co., Ltd.	https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html	Recogida de sangre
Reactivo de Quimioluminiscencia Mejorada (ECL)	Millipore Co., Ltd.	21302A4	Visualización de manchas occidentales
Eosina	Beijing Solarbio Co., Ltd.	20200905	H& Tinción con E
GraphPad Prism 8	GraphPad Software, Inc.	N/A	Análisis estadístico
Hematoxilina	Wuhan Service-bio Co., Ltd.	CR2203066	H& Tinción con E
Kit h-FABP ELISA	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E16184r	Detección de proteínas cardíacas
ImageJ Software	Institutos Nacionales de Salud (NIH)	N/A	Cuantificación Western blot
Anticuerpo primario JNK1/2	HuaAn Biotechnology (Hangzhou, China)	ET1609-42	Anticuerpo Western blot
LDH ELISA Kit	Biotecnología Enzimática Vinculada a Shanghái	ml003416	Detección de enzimas cardíacas
Solución Masson Blue	Beijing Solarbio Co., Ltd.	20220303	Tinción de masón
Lector de microplacas	Thermo Fisher Scientific	ME001000C	Medición del OD de ELISA (450 nm)
Microscopio óptico (Olympus C33)	Olympus (Tokio, Japón)	C33	Imagen histológica
Cera de parafina	Leica  Co., Ltd.	2110068	Incrustación de tejido
PBST Buffer	Meilunbio Co., Ltd.	MA0015-Apr-27G2	Amortiguador de lavado
anticuerpo primario p-JNK1/2	HuaAn Biotechnology (Hangzhou, China)	ET1601-28	Anticuerpo JNK fosforilado
Banco de Datos de Proteínas (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	Fuente de estructura proteica
Kit de extracción de proteínas	Sangon Biotech (Shanghái, China)	C510003-0050	Extracción de proteínas tisulares
Base de Datos PubChem	NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov	Fuente de estructura de ligandos
Membrana PVDF	Millipore Co., Ltd.	R1PB81493	Membrana de transferencia Western blot
PyMOL	Schrö dinger, Inc.	https://pymol.org/	Visualización de acoplamiento
Gel SDS-PAGE (10%)	Beijing Solarbio Co., Ltd.	817X031	Electroforesis proteica
Leche en polvo desnatada	Beijing Solarbio Co., Ltd.	http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/	Reactivo bloqueador (5%)
Pentobarbital sódico	Thermo Fisher Scientific Inc.	57-33-0	Anestésico para procedimientos animales
SP600125 (inhibidor de JNK)	MedChemExpress Co., Ltd.	112518	Inhibidor de la vía JNK
Instalación de Alojamiento Animal SPF	Universidad Médica de Kunming	N/A	Condiciones de alojamiento animal
Ratas Sprague-Dawley (macho, 2 meses, ~230 g)	Beijing Huafukang Biological Technology Co., Ltd.	http://www.hfkbio.com/	Animales experimentales (n = 51)
Hematoxilina de hierro Weigert	Guangzhou Wexis Co., Ltd.	18092001	Tinción de masón
Xileno	Tianjin Tjhxsj Co., Ltd.	20220208	Limpieza de tejidos