Mecanismos de la decocción de Quyu de Shengxian en insuficiencia cardíaca utilizando un enfoque de metabolómica no dirigida y farmacología de redes en ratas

Resumen

Este estudio confirmó el efecto terapéutico de la Decocción Quyu de Shengxian sobre la insuficiencia cardíaca mediante experimentos con animales. Cromatografía líquida de ultra-rendimiento, espectrometría de masas y análisis de farmacología en redes identificaron posibles objetivos y mecanismos terapéuticos.

Resumen

Se ha sugerido que la decocción de Quyu de Shengxian (SXQY) podría ser una estrategia terapéutica para la insuficiencia cardíaca (IC), pero sus mecanismos terapéuticos siguen sin estar claros. Este estudio investigó los efectos terapéuticos y los mecanismos subyacentes de la SXQY en la IC. Un modelo de rata de HF fue inducido por constricción aórtica transversal (TAC) y tratado con SXQY. Se evaluó la función cardíaca mediante ecocardiografía transtorácica, y la estructura miocárdica y fibrosis se evaluaron utilizando hematoxilina y eosina y la tinción tricroma de Masson. Las muestras de suero fueron analizadas mediante metabolómica no dirigida mediante cromatografía líquida de ultra-rendimiento–espectrometría de masas en tándem. Los componentes que entran en sangre se mapearon a objetivos, y se analizaron objetivos relacionados con la HF que se intersectaron mediante análisis de redes de interacción proteína-proteína (PPI), seguido de análisis de Gene Ontology y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). SXQY mejoró significativamente la función cardíaca en ratas TAC, como se evidenció por la disminución del diámetro interno del ventrículo izquierdo en la diástole, el grosor de la pared posterior del ventrículo izquierdo en la diástole, el aumento de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo, y alivió la hipertrofia miocárdica, inflamación y fibrosis. Se identificaron un total de 563 compuestos de entrada en sangre (367 prototipos y 196 metabolitos), con 5 compuestos activos clave identificados en la base de datos de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China correspondientes a 63 objetivos. El análisis de redes reveló 44 genes superpuestos, con Formononetina, Timosaponina BII y Sinensetina como componentes principales, y PTGS2, PPARG y HSP90AA1 como objetivos centrales. El análisis de IBP identificó además genes clave, incluyendo ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN y 15 genes adicionales. El análisis de KEGG indicó que SXQY actúa principalmente a través de Ca²⁺, fosfatidilinositol 3-quinasa–quinasa proteína quinasa B, monofosfato cíclico de adenosina y vías relacionadas con inflamación y hormonas. En conclusión, SXQY ejerce efectos protectores contra la IC al mejorar la función cardíaca y atenuar la remodelación miocárdica mediante mecanismos multicomponente, multiobjetivo y multivía.

Introducción

La insuficiencia cardíaca (IC) es un síndrome clínico caracterizado por un empaste ventricular alterado y una capacidad de eyección debido a anomalías estructurales o funcionales cardíacas, lo que da lugar a una constelación de signos y síntomas^clínicos. Como etapa terminal de diversas enfermedades cardíacas, la IC compromete significativamente la calidad de vida de los pacientes y provoca una alta mortalidad y frecuentes reingresos hospitalarios, imponiendo así una carga de enfermedad considerable tanto para las familias como para la^{sociedad 2,3}. En el manejo clínico, la farmacoterapia para la IC constituye la base y la piedra angular del tratamiento, comprendiendo principalmente clases clave de fármacos como diuréticos, inhibidores del sistema renina-angiotensina, betabloqueantes, antagonistas de los receptores mineralocorticoides e inhibidores del cotransportador sodio-glucosa² 3,4,5,6 . Aunque estos medicamentos han mejorado parcialmente el pronóstico de los pacientes con IC, cada uno conlleva ciertas limitaciones y efectos adversos, como alteraciones electrolíticas, bradicardia e infecciones^urinarias. Por lo tanto, las terapias farmacológicas para la IC aún requieren una investigación más profunda.

La Medicina Tradicional China (MTC) ha acumulado una amplia experiencia clínica en el manejo a largo plazo de la IC. Con énfasis en la regulación holística y la intervención multiobjetivo, ofrece un enfoque distintivo para el tratamiento⁸. En los últimos años, varios ensayos controlados aleatorizados (ECA) han demostrado la eficacia terapéutica de las fórmulas herbales chinas para la IC 9,10,11,12,13,14,15. La decocción Shengxian Quyu (SXQY) ya ha comenzado a someterse a rigurosos ECA para confirmar su eficacia terapéutica, pero sus mecanismos terapéuticos específicos aún requieren una investigación más profunda^{y exhaustiva 16}. La farmacología de redes, como disciplina emergente que integra biología de sistemas, polifarmacología y análisis computacional, ofrece una herramienta poderosa para esclarecer los mecanismos holísticos de acción de las fórmulas herbales^chinas 17,18,19. Por ello, este estudio emplea una estrategia integrada que combina metabolómica no dirigida y farmacología en redes para identificar componentes absorbidos en sangre de SXQY y dilucidar sus posibles mecanismos terapéuticos. Este trabajo tiene como objetivo proporcionar una base para la aplicación clínica posterior de SXQY.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron examinados y aprobados por el Comité de Ética y Bienestar Animal del Hospital de la Amistad China–Japón (aprobación nº zryhyy21-23-01-09) y se llevaron a cabo de acuerdo con los principios de reemplazo, reducción y refinamiento para minimizar el uso y sufrimiento animal. Los investigadores que realizaron la adquisición y análisis de datos (incluyendo mediciones de ecocardiografía y evaluación histológica) quedaron ciegos ante la asignación de grupos.

Preparación de la muestra SXQY

SXQY está compuesto por los siguientes componentes herbales: Astragalus membranaceus (Huangqi) (30 g), Codonopsis pilosula (Dangshen; 20 g), Cornus officinalis (Shanyurou; 15 g), Sparganium stoloniferum (Sanleng; 12 g), Curcuma zedoaria (Erzhu; 15 g), Cimicifuga heracleifolia (Shengma; 10 g), Bupleurum chinense (Chaihu; 10 g), Platycodon grandiflorus (Jiegeng; 10 g), Anemarrhena asphodeloides (Zhimu; 15 g) y Leonurus japonicus (Yimu; 15 g), con un peso total de hierba cruda de 152 g por receta. Todos los materiales herbales se adquirían en el Departamento de Farmacia del Hospital de la Amistad China-Japón y eran autenticados por un farmacéutico jefe según los métodos estándar de identificación farmacognóstica. Clínicamente, SXQY se administra con una dosis de una sola prescripción (152 g) al día. Asumiendo un peso corporal adulto medio de 70 kg, la dosis humana correspondiente es de 2,17 g (hierba cruda)/kg. Según la normalización de la superficie corporal entre humanos y ratas, la dosis equivalente para rata se calculó en 13,67 g (hierba cruda)/kg. Para la preparación de la decocción, una receta de SXQY se remojo en agua destilada a una proporción de 10 mL por gramo de hierbas crudas (p/v, basado en el volumen inicial del disolvente sin ajuste tras el remojo) durante 1 hora, seguida de hervido con un manto eléctrico de calentamiento y mantenido a 100°C bajo ebullición continua durante 1 hora. El extracto se filtraba luego a través de gasa (poro de 200–300 μm). El residuo se extrajo dos veces más bajo condiciones idénticas. Los filtrados agrupados se concentraron a presión reducida usando un evaporador rotativo a 60°C hasta un volumen final de 111 mL, dando una concentración de 1,37 g (fármaco crudo)/mL. La decocción concentrada se filtró de nuevo con gasa (poro de 200–300 μm) y se almacenó a 4°C y se utilizó en un plazo de 24–48 horas. Para la administración, se utilizó la solución directamente y el volumen de gavage se calculó en función de la concentración de 1,37 g/mL, resultando en un volumen de administración de aproximadamente 10 mL/kg para alcanzar la dosis objetivo de 13,67 g/kg.

Modelo animal

Dieciocho ratas machos de 8 semanas de Sprague–Dawley (SD) fueron alojados en un entorno acondicionado estándar (23°C ± 2°C, 50 ± 5% de humedad relativa y un ciclo de 12 horas luz/oscuridad) con libre acceso a comida y agua. Los animales fueron asignados aleatoriamente a tres grupos (n = 6 por grupo) mediante una tabla de números aleatorios: un grupo operado por simulación (Sham), un grupo de constricción aórtica transversal (TAC) y un grupo tratado con SXQY (SXQY). Las ratas de los grupos tratados con TAC y SXQY fueron anestesiadas por inhalación de isoflurano (inducción 4%, mantenimiento 2%) y colocadas en posición supina sobre una almohadilla térmica controlada termostáticamente mantenida a 37°C. Se confirmó una anestesia adecuada por la ausencia de respuestas reflejas al pellizco de la pata, junto con una frecuencia respiratoria estable y ausencia de movimiento espontáneo. Se aplicó pomada oftálmica en ambos ojos para evitar la sequedad corneal. Tras la intubación endotraqueal, los animales fueron conectados a un ventilador de pequeños animales con un volumen tidal de 4–6 mL por 200 g de peso corporal, una frecuencia respiratoria de 70 respiraciones por minuto y una proporción inspiratorio-espiratorio de 1:1.

Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones asépticas. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron mediante autoclav, y la zona operatoria se preparó afeitando y desinfectando con povidona–yodo seguido de un 70% de etanol. Tras la preparación del sitio quirúrgico, se realizó una incisión en la piel torácica izquierda y se diseccionaron de forma sin rodeos los músculos pectorales mayores y menores para exponer las costillas. Se creó una incisión horizontal de aproximadamente 1,0 cm en el segundo al tercer espacio intercostal adyacente al borde esternal izquierdo. Los vasos sanguíneos y la fascia se separaron de forma brusca, y el timo se retrajo suavemente para exponer completamente el arco aórtico.

El arco aórtico se elevó cuidadosamente entre la arteria innominada derecha y la arteria carótida común izquierda usando pinzas curvas estériles, y se colocó una sutura de seda 2-0 por debajo. Una aguja curva de calibre 16 con punta roma (diámetro exterior 1,6 mm) se modificaba manualmente embotando la punta y doblándola a la curvatura adecuada antes de su uso, seguida de esterilización con autoclave. La aguja curva de punta roma preparada se colocaba entonces paralela al arco aórtico, tras lo cual la sutura se ataba firmemente alrededor de la aorta y la aguja. La aguja se retiró inmediatamente para crear una constricción estandarizada y el timo se reposicionó. Tras confirmar la ausencia de hemorragia activa, la pared torácica y la piel se cerraron en capas. Tras la operación, la ventilación mecánica se mantuvo durante aproximadamente 10 minutos hasta que se restauró la respiración espontánea, como lo indica una frecuencia respiratoria estable y regular y la capacidad de mantener la respiración espontánea sin soporte ventilatorio. En ese momento, se retiró el tubo endotraqueal. Los animales operados por simulación se sometieron a los mismos procedimientos quirúrgicos, salvo que el arco aórtico no estaba ligado.

Tras la cirugía, se desinfectó el lugar de la incisión y se colocó a los animales en jaulas limpias de recuperación para reducir el riesgo de infección. Las ratas fueron devueltas a la instalación animal para su recuperación y alojamiento rutinario. Se administró analgesia utilizando buprenorfina (0,05 mg/kg, subcutánea). Se observaron ratas cada 12 horas durante las primeras 72 horas por signos de dolor, malestar o complicaciones quirúrgicas, incluyendo movilidad reducida, piloerección, postura anormal, dificultad para respirar o dehiscencia de heridas.

Tres días después de la cirugía, las ratas del grupo tratado con SXQY fueron administradas oralmente con 1 mL/100 g de peso corporal de la decocción SXQY durante 9 semanas. Mientras tanto, las ratas de los grupos de operación simulada y TAC recibieron un volumen igual (1 mL/100 g de peso corporal) de agua destilada por gavage.

Ecocardiografía transtorácica

Al finalizar el periodo de tratamiento, se realizó una ecocardiografía transtorácica en todos los grupos. Las ratas fueron anestesiadas por inhalación de isoflurano y colocadas en posición supina sobre una plataforma de imagen dedicada. La parte anterior del pecho fue cuidadosamente afeitada y recubierta con una generosa capa de gel para ultrasonidos. La imagen por ultrasonido se realizó utilizando un sistema de ultrasonido de alta resolución para animales pequeños equipado con un transductor de alta frecuencia (18–40 MHz) en modo B y modo M. El transductor se posicionó suavemente sobre la zona cubierta de gel, con una profundidad ajustada a 12,29 mm y una ganancia de 22 dB; El enfoque se ajustó para optimizar la calidad de imagen. Se adquirieron imágenes y bucles de vídeo para análisis cuantitativos posteriores. Se midieron el diámetro interno del ventrículo izquierdo al final de la diastólia (LVIDd) y el grosor de la pared posterior del ventrículo izquierdo en la diástole final (LVPWd), y se calculó la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF) utilizando la fórmula de Teichholz basada en mediciones en modo M. Para cada parámetro, las mediciones se promediaron durante 3–5 ciclos cardíacos consecutivos. Todas las adquisiciones y análisis ecocardiográficos fueron realizados por un operador certificado con formación formal en ecocardiografía, de acuerdo con protocolos estandarizados de ecocardiografía.

Recogida y procesamiento de muestras

Tras el procedimiento de ecografía, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano. Los animales se colocaban en posición supina y se abría la cavidad torácica para exponer el corazón. Los corazones se extirpaban rápidamente, se enjuagaban con solución salina fría protegida con fosfato y se seccionaban a lo largo del plano sagital. Los tejidos cardíacos se fijaron inmediatamente en paraformaldehído al 4% a 4°C durante 24 horas, seguido de deshidratación mediante una serie graduada de etanol (70%, 80%, 90%, 95% y 100%) durante 1 hora en cada paso, durante la cual los tejidos se volvieron translúcidos gradualmente sin una contracción notable. Las muestras se eliminaron en xileno, se infiltraron con parafina fundida a 60°C durante 3 horas y se dejaron solidificar a temperatura ambiente (RT; 20°C–25°C). Los bloques de tejido cardíaco incrustados en parafina se recortaron y seccionaron con un grosor de 4–6 μm usando un microtomo. Las secciones flotaban en un baño maria mantenido a 45°C, se montaban sobre portacristales y se secaban a 37°C–40°C durante la noche. Las láminas se almacenaban en RT bajo condiciones de baja humedad y se usaban en un plazo de 1 semana para la tinción histológica.

Tinción de hematoxilina y eosina (HE)

Las secciones incrustadas en parafina se procesaron de la siguiente manera. Las secciones se desparafinizaban primero por inmersión en xileno I, II y III durante 5 minutos cada una, seguidas de hidratación mediante una serie de etanol anhidro I y II y soluciones de etanol graduadas (95%, 90%, 80%, 70% y 50%) durante 5 minutos cada una, y finalmente se enjuagaban en agua destilada, sin residuos visibles de cera. Las secciones se teñieron con hematoxilina Harris durante 5 minutos y se enjuagaron bajo agua del grifo corriente durante 1–2 minutos. La diferenciación se realizó en solución ácida-alcohol durante aproximadamente 1–2 segundos, determinando el desenlace mediante inspección visual cuando el fondo parecía pálido mientras la tinción nuclear permanecía claramente definida. A esto le seguía el azulado en agua a 37°C–45°C y el enjuague con agua destilada. Posteriormente, las secciones se contrateñieron con eosina soluble en alcohol durante 40 s, se lavaron con agua destilada, se deshidrataron mediante etanol graduado, se limpiaron en xileno y finalmente se montaron con resina neutra.

Tinción de masón

Las secciones incrustadas en parafina se desparafinizaron secuencialmente en xileno I, II y III durante 5 minutos cada una, seguidas de hidratación con etanol anhidro I y II y soluciones de etanol graduadas (95%, 90%, 80%, 70% y 50%) durante 5 minutos cada una, y finalmente se enjuagaron en agua destilada. Las secciones se sumergieron en ácido acético al 0,5% (preenfriado a 4°C) durante 1 s, seguidas de teñido con la solución de fucisina de un kit comercial de tinción tricroma de Masson's durante 10 minutos, después de diferenciación en ácido fosfomolíbdico durante 5 minutos y contratinción con azul anilina durante 3 minutos. Todos los reactivos eran componentes del mismo kit comercial y se usaban según las instrucciones del fabricante. Tras la tinción, las secciones se enjuagaban tres veces con ácido acético preenfriado a 4°C (aproximadamente 30 s por enjuague), se deshidrataban mediante etanol clasificado, se limpiaban en xileno y se montaban con resina neutra.

Recogida de muestras de suero para análisis metabolómico

Seis ratas SD machos de 8 semanas fueron alojadas bajo las mismas condiciones que las del experimento in vivo mencionado anteriormente. Los animales fueron asignados aleatoriamente a un grupo tratado con SXQY y a un grupo de control de vehículos (agua destilada; n = 3 por grupo) mediante un método de aleatorización generado por ordenador. Las ratas del grupo SXQY recibieron SXQY por vía oral a una dosis de 1 mL/100 g de peso corporal, mientras que el grupo de control del vehículo recibió un volumen igual de agua destilada. Tras siete días de mando diario, la dosis final del séptimo día se duplicó. Tras la última administración, los animales fueron ayunados durante 12 horas. Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano hasta que se confirmó la pérdida del reflejo de retirada del pedal como indicador de anestesia adecuada. Se recogieron muestras de sangre del plexo venoso retroorbitario utilizando tubos capilares estériles y se transfirieron inmediatamente a tubos microcentrífugas de 1,5 mL sin anticoagulante. Después, la sangre entera se dejó reposar en RT durante 1 hora y se centrifugó a 1000 × g durante 15 minutos a 4°C para obtener suero. Cuando se detectó una separación clara entre la capa superior transparente del suero y el coágulo, el suero sobrenadante se aspiró cuidadosamente y se transfirió a tubos limpios de microcentrífuga. Las muestras de suero se almacenaron a −80°C hasta el análisis de los componentes que entran en la sangre.

Pretratamiento de ejemplo para análisis metabolómico

Las muestras de suero se descongelaron sobre hielo tras retirarse del almacenamiento a −80°C y se mezclaron brevemente en vórtices (10 s) para asegurar la homogeneidad. Se transfirió una cuota de suero de 100 μL a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL, seguida de la adición de 500 μL de disolvente de extracción (20% acetonitrilo–metanol que contiene 2-cloro-L-fenilalanina como estándar interno a una concentración final de 1 μg/mL) para inducir la precipitación de proteínas. La mezcla se vórtizó vigorosamente durante 3 minutos y centrifugó a 12.000 × g durante 10 minutos a 4°C. Una porción de 470 μL del sobrenadante resultante se transfirió a un nuevo tubo y se evaporó hasta la sequedad usando un evaporador de nitrógeno bajo un flujo bajo y controlado de nitrógeno. Tras la reconstitución en 200 μL de metanol–agua al 70% y el vórtice durante 1 minuto, las muestras se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 minutos a 4°C, y 180 μL del sobrenadante clarificado se transfirieron a viales de automuestreo para el análisis de cromatografía líquida–espectrometría de masas tándema (LC-MS/MS).

A continuación, se transfirió una cuota de 200 μL de muestra SXQY a un tubo centrífugo preetiquetado de 1,5 mL. La solución interna estándar de extracción se añadió a cada muestra con una relación de volumen de 1:1 (v/v). La mezcla se mezcló en vórtice durante 15 minutos y centrifugó a 12.000 × g durante 3 minutos a 4°C. El sobrenadante resultante fue cuidadosamente recogido y filtrado a través de una membrana microporosa de 0,22 μm, resultando en un filtrado transparente sin partículas visibles. El filtrado se transfirió a viales de automuestreador y se almacenó a 4°C antes del análisis LC-MS/MS (UPLC–MS/MS) de ultra-rendimiento.

Preparación de Soluciones Internas de Estándares

La solución estándar interna (2-cloro-L-fenilalanina) se preparó disolviendo 1 mg del estándar de referencia en 1 mL de metanol–agua al 70% (v/v), dando una concentración de 1.000 μg/mL. Esta solución estándar se diluyó aún más con el mismo disolvente para obtener una solución estándar interna funcional con una concentración final de 1 ppm, que se preparó de nuevo, se almacenó a 4°C y se utilizó en un plazo de 48–72 horas.

Condiciones UPLC–MS/MS

La separación cromatográfica se realizó utilizando un sistema UPLC acoplado a un espectrómetro de masas tándem. La separación se logró en una columna de C18 mantenida a 40°C, con un caudal de 0,35 mL/min y un volumen de inyección de 4 μL. La fase móvil consistía en agua ultrapura que contenía 0,1% (v/v), ácido fórmico (A) y acetonitrilo que contenía 0,1% (v/v) ácido fórmico (B). La elución por gradiente se aplicó de la siguiente manera: 5% B a 0,0 min; incrementó linealmente a 25% B a 2,0 min, 35% B a 3,0 min, 60% B a 5,0 min y 99% B a 6,0 min; se mantuvo en un 99% B durante 1,5 minutos; volvió al 5% B a los 7,6 minutos; y se equilibró en un 5% B hasta 10,0 min.

La detección por espectrometría de masas se realizaba utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución equipado con una fuente de ionización por electrospray que operaba en modos de iones positivos y negativos. Las tensiones de pulverización se ajustaron a 3500 V en modo positivo y 3200 V en modo negativo. El gas de la vaina y el gas auxiliar se ajustaron a 30 y 5 unidades arbitrarias (definidas por instrumentos), respectivamente. La temperatura del tubo de transferencia iónica y la del vaporizador se mantuvieron en 320°C y 300°C, respectivamente. Se adquirieron escaneos completos de MS en un rango m/z de 84–1250 con una resolución de 35.000 con un objetivo de control automático de ganancia (AGC) de 1,0 × 10⁶, seguido de la adquisición MS/MS dependiente de datos (top 10) con una resolución de 17.500 con un objetivo AGC de 2,0 × 10,5 y una ventana de aislamiento de 1,0–1,5 m/z. Se aplicaron energías de colisión escalonadas normalizadas de 30, 40 y 50. Los 10 iones precursores más intensos fueron seleccionados para fragmentación con una duración dinámica de exclusión de 3 s.

Procesamiento de datos en bruto

Los datos brutos de espectrometría de masas se convertían a formato mzML usando ProteoWizard. Para garantizar la fiabilidad analítica, se prepararon muestras agrupadas de control de calidad (QC) mezclando volúmenes iguales de todas las muestras de suero. Se inyectaron muestras de QC a intervalos regulares (una inyección de QC cada 5–10 muestras analíticas) durante el análisis UPLC–MS/MS para monitorizar la estabilidad del instrumento, la consistencia del tiempo de retención y la reproducibilidad de la señal. La reproducibilidad se evaluó en función de la desviación estándar relativa de las intensidades máximas en muestras de control de calidad.

La detección de picos, corrección del tiempo de retención y alineación de picos se realizaron utilizando el paquete XCMS. Las características con una tasa de ausencia superior al 50% dentro de cualquier grupo fueron excluidas de análisis posteriores. Posteriormente, la corrección de deriva de señal se aplicó a áreas de pico utilizando un método de normalización basado en regresión vectorial de soporte (SVR) implementado en el software estadístico R mediante modelado basado en control de calidad para corregir la deriva de señal a lo largo de la ejecución analítica.

La identificación de metabolitos se realizó comparando las características corregidas con una biblioteca estándar de referencia interna (que contiene aproximadamente 5.000 compuestos con datos espectrales tanto de MS1 como de MS2; propietarios y no públicos disponibles), así como bases de datos espectrales públicas como Human Metabolome Database (HMDB), Metabolite and Tandem Mass Spectrometry Database (METLIN), MassBank y Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS). basado en la coincidencia precisa de masa, la alineación temporal de retención y la similitud espectral MS/MS. La compatibilidad de masas se realizó utilizando una tolerancia de ±25 ppm para iones precursor (MS1) y fragmento (MS2), con una tolerancia de tiempo de retención de ±6 s. Para la búsqueda en bibliotecas, se aplicó una tolerancia de ±25 ppm a iones precursores (Q1) y ±50 ppm a fragmentos MS/MS, con una puntuación mínima de coincidencia MS/MS de 0,3. Solo se retuvieron metabolitos con una puntuación de identificación integral superior a 0,5 para la identificación no dirigida. La puntuación final se calculó como una suma ponderada de fragmentos (0,1), avances (0,3) y reversos (0,6) puntuaciones coincidentes. Los datos adquiridos en modos de ionización positivo y negativo se fusionaron a nivel de compuesto. Para las anotaciones duplicadas, se seleccionó la entrada con mayor confianza en la identificación y la puntuación más alta. Las anotaciones finalizadas se compilaron en un archivo de anotación de metabolitos.

Criterios para la identificación de compuestos absorbidos

Los componentes absorbidos del prototipo se definieron como compuestos detectados en el extracto SXQY y en el grupo tratado con SXQY, con tiempos de retención coincidentes dentro de una tolerancia de ±0,1 min. Además, estos compuestos debían mostrar un área máxima en el grupo tratado con SXQY que fuera al menos el doble que en el grupo de control del vehículo o que estuvieran ausentes de las muestras de control del vehículo.

Los metabolitos absorbidos se identificaron mediante un conjunto diferente de criterios. Estos compuestos no se detectaron en el extracto SXQY, pero sí estaban presentes en el grupo tratado con SXQY. Sus características espectrométricas de masas debían ser consistentes con transformaciones metabólicas características, incluyendo hidroxilación (Δm/z = +15,9949 Da) y desmetilación (Δm/z = −14,0157 Da). Además, el área de pico en el grupo tratado con SXQY debía ser al menos el doble que en el grupo de control del vehículo según las áreas de pico normalizadas tras la corrección de desvio de señal, o la señal correspondiente debía ser indetectable en las muestras de control del vehículo.

Recuperación de genes relacionados con compuestos absorbidos

Los componentes que entran en sangre fueron analizados en la Plataforma de Datos y Análisis de Sistemas de Farmacología de Medicina Tradicional China (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph; consultada en enero de 2026^). Los compuestos documentados en TCMSP fueron evaluados como constituyentes bioactivos candidatos basándose en umbrales farmacocinéticos establecidos de biodisponibilidad oral ≥ 30% y similitud con fármacos ≥ 0,18²¹. Los supuestos objetivos correspondientes a los compuestos retenidos fueron recuperados posteriormente, y todos los identificadores de objetivos se estandarizaron a símbolos génicos oficiales utilizando la base de datos^{UniProt 22}.

Recuperación de dianas relacionadas con enfermedades y genes de intersección

Los genes relacionados con la HF se recogieron de la base de datos GeneCards (https://www.genecards.org/; consultada en enero de 2026) usando "insuficiencia cardíaca" como término de búsqueda, y se seleccionaron genes con una puntuación de relevancia ≥ 10 para un análisis posterior. Los objetivos relacionados con HF se intersectaron posteriormente con objetivos asociados a compuestos identificados en TCMSP utilizando la plataforma Weishengxin (https://www.bioinformatics.com.cn; consultada en enero de 2026). Los genes superpuestos se definieron como objetivos de intersección y se utilizaron para la construcción posterior de redes de interacción proteína-proteína (PPI) y análisis de enriquecimiento funcional.

Construcción de redes y análisis de enriquecimiento funcional

El análisis PPI de los objetivos identificados se realizó utilizando la base de datos STRING (http://cn.string-db.org/; consultada en enero de 2026)²³ con la especie configurada como Homo sapiens y un umbral de puntuación de confianza de ≥0,7. Los datos de interacción se importaron a la herramienta de visualización Cytoscape para la visualización de la red. El análisis topológico se realizó utilizando el plugin NetworkAnalyzer en la herramienta de visualización, y los genes hub se identificaron usando el plugin^{CytoHubba 24,25}. Se realizó un análisis de enriquecimiento por Ontología Génica (GO) en los objetivos de intersección, incluyendo las categorías de proceso biológico (BP), componente celular (CC) y función molecular (MF). Los términos GO con un valor P < 0,05 se consideraron significativos, y los 10 términos enriquecidos más destacados de cada categoría fueron seleccionados para la^{visualización 26}. Los objetivos de intersección fueron además sometidos a un análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) utilizando el paquete clusterProfiler en el software estadístico. Se consideraron estadísticamente significativas las vías con un valor P < 0,05, y se seleccionaron las 20 vías enriquecidas más enriquecidas para su visualización. Estas vías se utilizaron posteriormente para construir una red de interacción objetivo–^{vía 27}.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± SD. La normalidad de la distribución de los datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro–Wilk, y la homogeneidad de la varianza se evaluó mediante la prueba de Levene o la prueba de Brown-Forsythe antes del análisis. Las comparaciones estadísticas entre grupos se realizaron mediante análisis unidireccional de la varianza, seguido de la prueba post hoc de Tukey con GraphPad Prism. Se consideró estadísticamente significativo un P < 0,05.

Resultados

Ecocardiografía transtorácica

El análisis ecocardiográfico reveló un marcado remodelado y disfunción cardíaca en ratas TAC (Figura 1). En comparación con los controles simulados, el TAC aumentó significativamente la LVIDd y LVPWd, mientras que la LVEF disminuyó notablemente. Cabe destacar que la administración de SXQY revirtió parcialmente estos cambios patológicos, reflejados en una reducción significativa de LVI...

Discusión

SXQY se ha utilizado extensamente en la práctica clínica durante más de dos décadas, demostrando eficacia en el tratamiento de diversas afecciones cardiovasculares. Recientemente, su uso se ha extendido a pacientes con insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida y fracción de eyección^{ligeramente reducida 16}. En el presente estudio, se estableció un modelo de rata mediante cirugía TAC para imitar cambios patológicos de la IC, y mientras tanto, algunas ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-cloro-L-fenilalanina	Aladdín	C105993-1g	Estándar interno; ≥ 98%
Acetonitrilo (grado LC-MS)	Aladdín	A120771-1L	Disolvente de extracción
Ácido acético	Solarbio	G1340	Manchas de masón; preenfriado a 4 °F; C
Vials de automuestreador	Agilent	5190-9590	Para la carga de muestras de LC-MS/MS
Buprenorfina	Cerilliant	B-044S	Analgésicos
Columna C18 (1.8 y mu; m, 2,1 mm y multiplicados; 100 mm)	Aguas	176001125	Columna ACQUITY Premier HSS T3
Tubos capilares, estériles	Fisherbrand	22-362-566	Recogida de sangre retroorbital
Centrífuga (refrigerada)	KUBOTA	N61196-F000	Para el procesamiento de suero y muestras
Paquete clusterProfiler	Bioconductor	—	Paquete R para análisis de enriquecimiento KEGG; v4.0.2
Pinzas curvas, estériles	HL-SQX	HL-JP	Manipulación del arco aórtico
Software Cytoscape	NHGRI	NIH NHGRI Sub-24 HG012107	Versión 6.4.1
Plataforma dedicada a la imagen	Fujifilm VisualSonics	Sistema de ultrasonido VisualSonics Vevo 1100	Posicionamiento animal durante la ecocardiografía
Agua destilada	N/A	N/A	Preparación de la decocción y control del vehículo
Reside de calefacción eléctrica	Midea	WK2102	Evaporación por decocción
Trompa endotraqueal	CWE Inc., EE. UU.	SAR-1000	Intubación endotraqueal; El tubo endotraqueal utilizado en este estudio estaba integrado en la configuración del ventilador y no era un dispositivo separado ni independiente
Etanol (absoluto)	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd.	64-17-5	Deshidratación y esterilización
Ácido fórmico	Aladdín	O930702	Aditivo de fase móvil
Gasa	Solarbio	YA0720	Filtración por decocción; 200– 300 & mu; m tamaño de poro
Base de datos GeneCards	GeneCards	—	Recuperación de objetivos relacionados con enfermedades; consultado en enero de 2026
Base de datos GNPS	Universidad de California en San Diego	—	Base de datos espectral; versión 1.3.16, datos archivados en diciembre de 2025
Software GraphPad Prism	GraphPad Software	—	Versión 10.1.2; SCR_002798
Almohadilla térmica (termostática)	Fisitempo	HP-4M	Mantenido en 37 °F; C
Hematoxilina y eosina (H&; E) Kit de tinte	Solarbio	G1120	Tinción histológica
Transductor de alta frecuencia	VisualSonics	Vevo F2	18– 40 MHz
Espectrómetro de masas de alta resolución	Thermo Fisher Scientific	P Exactivo	P Exactivo HF-X
Sistema de ultrasonido de alta resolución para animales pequeños	Fujifilm VisualSonics	Sistema de ultrasonido VisualSonics Vevo 1100	Vevo 2100
Base de datos HMDB	Grupo de Investigación Wishart / Centro de Innovación en Metabolómica, Universidad de Alberta	—	Base de datos espectral; HMDB versión actual 5.0; versión 5.0; Enero de 2022
Biblioteca de referencia estándar interna	METWARE	—	Composición de la biblioteca estándar de referencia interna: La biblioteca contiene un total de 5.000 compuestos e incluye tanto información MS1 (precursora) como datos espectrales MS2 (fragmentación). Declaración de disponibilidad: El formato de datos de la biblioteca es .txt. Condición de almacenamiento: La base de datos se almacena en el servidor interno de la empresa. Permisos de acceso: Esta biblioteca estándar autoconstruida es una biblioteca espectral propietaria interna de la empresa. Se utiliza únicamente para la identificación de metabolitos, la verificación de resultados y la trazabilidad de calidad dentro de los flujos de trabajo analíticos controlados de la empresa. La biblioteca no está disponible públicamente para su descarga. Los clientes pueden obtener resultados de anotaciones, información de resultados y descripciones de campos necesarias generadas en base a esta biblioteca.
Isoflurano	Sigma-Aldrich	792632	Anestésico inhalatorio
Sistema de cromatografía líquida (UPLC)	SCIEX	ExionLC d.C.	ExionLC d.C.
Base de datos MassBank	consorcio MassBank; Sociedad de Espectrometría de Masas de Japón / MassBank Europa	—	Base de datos espectral; versión 2024.06; datos archivados en diciembre de 2025
Masson' s Kit de tinte tricromo	Solarbio	G1340	Tinción histológica
Filtro de membrana (0,22 & mu; m)	Beyotime	FF362	Polietersulfona (PES)
Base de datos METLIN	El Instituto de Investigación Scripps / Laboratorio Siuzdak	RRID: SCR_010500	Base de datos espectral; Esta base de datos no proporciona un número de versión anual fijo; Datos descargados en 2023
Metanol (grado LC-MS)	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd.	67-56-1	Disolvente de extracción
Tubos microcentrífugas (1,5 mL)	Corning Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd.	MCT-150-C	Procesamiento de muestras
Microtomo	Leica	DSC1	Seccionamiento de tejidos
Resina neutra	Solarbio	G8590	Montaje de corredera
Evaporador de nitrógeno/fuente de gas	Organomación	N-EVAP	Secado de muestras
Pomada oftálmica	Aladdín	08-03-8009	Protección ocular durante la anestesia
Parafina	Solarbio	YA0010	Incrustación de tejido
Paraformaldehído (4%)	Solarbio	P1110	Fijación tisular
Solución salina tamponada con fosfato	¡QUÉ TÚ	DYP1021	Lavado de tejidos
Ácido fosfomolíbdico	Solarbio	G1340	Tinción de masón
Povidone– Yodo	Solarbio	IP3800	Desinfección quirúrgica
Software ProteoWizard	Fundación ProteoWizard	—	Versión 3.0.19254
Software R	Fundación R	—	Versión 4.2.2
Evaporador rotatorio	QINGDAO JINGCHENG INSTRUMENT CO., LTD	JC-2LZF	Concentración de decocción bajo presión reducida
Sutura de seda (2-0)	FULAN	NL30RH26A-76	Constricción aórtica
Ventilador para pequeños animales	CWE Inc., EE. UU.	SAR-1000	Ventilación mecánica
Sprague y dash; Ratas Dawley (macho, 8 semanas)	SPF Bio Co., Ltd.	—	RGD_70508; Matrícula nº SCXK(jing)2024-0001
Base de datos STRING	Consorcio STRING	—	Análisis de interacciones proteicas; consultado en enero de 2026
Paquete/script de normalización de regresión vectorial de soporte	MetNormalizador	—	Corrección de desviación de señal; v1.3.02
Base de datos TCMSP	TCMSP	—	Recuperación de compuestos y objetivos; consultado en enero de 2026
Base de datos UniProt	Consorcio UniProt	—	Estandarización de símbolos génicos
Gel de ultrasonidos	MAGNAFLUX	25-912	Ecocardiografía
Agua ultrapura	Preparado en laboratorio	—	Disolvente de fase móvil
Mezclador de vórtice	Yalin	VM-ST	Mezcla de muestras
Baños María	Julabo	PURA22	Sección flotante a 45 °F; C
Andén Weishengxin	Weishengxin	—	Análisis de intersección de objetivos; consultado en enero de 2026
Software XCMS	Fundación R	—	Versión 3.16.1
Xileno	Aladdín	X775162	Deparafinización