Artículo de método

Estrategias de imagen para la intervención con acupuntura en ratones modelo de la enfermedad de Alzheimer

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DOI:

10.3791/70998

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21 de abril de 2026

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1Department of Traditional Chinese Medicine, General Hospital of the Chinese People's Liberation Army, 2Meizhou Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Meizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine), 3School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 4Department of Psychosomatic Medicine, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una estrategia de micro-PET in vivo combinada con ensayos conductuales y moleculares para evaluar dinámicamente los efectos de la electroacupuntura sobre la deposición de β-amiloide y la función cognitiva en un modelo murino con enfermedad de Alzheimer.

Resumen

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado principalmente por una disfunción cognitiva progresiva. Una de sus características patológicas típicas es la formación de placas seniles en el cerebro debido a la deposición de proteínas β-amiloides (Aβ). La acupuntura ha demostrado potencial en la práctica clínica para mejorar la función cognitiva en pacientes con EA. Sin embargo, sus efectos dinámicos sobre la patología de Aβ requieren una elucidación objetiva mediante enfoques tecnológicos modernos. La tomografía por emisión de micropositrones (micro-PET) proporciona una herramienta poderosa para la observación in vivo y no invasiva de la deposición de Aβ en los cerebros de ratones modelo de EA. En este protocolo, detallamos una estrategia de imagen utilizando micro-PET [18F]AV-45 para evaluar los efectos de la intervención electroacupuntura, complementada por pruebas conductuales Morris Water Maze y análisis molecular Western blot. El enfoque integrado permite la visualización y cuantificación de la progresión patológica de Aβ en los cerebros de ratones modelo de EA. Esto proporciona evidencia objetiva y cuantitativa para explorar el efecto regulador de la acupuntura en la deposición de Aβ. Integrando los principios de la medicina tradicional china con las modernas tecnologías de imagen molecular y biología molecular.

Introducción

El monitoreo in vivo de la deposición de β-amiloide(Aβ) en el cerebro es crucial para evaluar la progresión patológica de laAD 1. Tras la aplicación clínica de terapias dirigidas a anticuerpos Aβ (por ejemplo, Lecanemab), la evaluación longitudinal y cuantitativa de la carga cerebral de Aβ mediante PET se ha convertido en un estándar de oro para determinar la eficaciaterapéutica 2. Aunque la acupuntura ha demostrado potencial en estudios preclínicos para modular el metabolismo de Aβ, los enfoques tradicionales de investigación se han basado en gran medida en análisis ex vivo, careciendo de herramientas eficaces para la evaluación directa y objetiva de su impacto dinámico en la deposición de Aβ en organismos vivos. En los últimos años, los avances en tecnologías de imagen molecular han creado oportunidades para cubrir esta brecha. micro-PET ha permitido la observación longitudinal no invasiva de la deposición de Aβ en ratones modelode EA 1. Más importante aún, las nuevas estrategias de imagen están evolucionando desde enfoques de objetivo único hacia paradigmas multimodales. Por ejemplo, estudios han confirmado que diferentes subtipos estructurales de fibrillas Aβ presentan afinidades de unión variables con trazadores PET comúnmente utilizados, lo que genera nuevas demandas de cuantificaciónprecisa 3. Paralelamente, técnicas emergentes como la imagen neuroinmune (por ejemplo, TSPO PET) y las evaluaciones de la función de la barrera hematoencefálica ofrecen perspectivas sin precedentes para esclarecer de manera exhaustiva los complejos mecanismos patológicos del A y los efectos multi-objetivo de las intervencionesterapéuticas 4.

Sobre base en esta base, este estudio pretende desarrollar una estrategia avanzada de micro-PET que utilice las sondas específicas de Aβ más avanzadas para evaluar dinámica y cuantitativamente el impacto de la intervención con acupuntura en la deposición de Aβ en cerebros de ratones modelo de EA in vivo. El estudio no solo validará la eficacia terapéutica de la acupuntura, sino que también se esfuerza por proporcionar evidencia directa de sus mecanismos subyacentes a nivel de imagen molecular.

Protocolo

Realizar todos los experimentos conforme a las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio emitidas por los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética Experimental de Animales de la Universidad de Medicina China de Pekín (n.º: bucm-4-2021102707-5421).

1. Preparación de animales experimentales

  1. Obtén ratones machos APP/PS1 de 6 meses y ratones C57BL/6 con edad y género que pesen 28,0 ± 2,0 g.
  2. Alojar a los ratones en jaulas estándar a una temperatura ambiente de 24 ± 2 °C con una humedad del 40% al 60%.
    NOTA: Los animales fueron alojados en jaulas estándar en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Medicina China de Pekín, Universidad Médica de la Capital.
  3. Mantén a los animales bajo un ciclo estándar de 12 horas luz/oscuridad (periodo oscuro: de 20:00 a 8:00 h) con acceso gratuito a comida y agua. Cambia la ropa de cama a diario para asegurar que las condiciones de vivienda sean limpias y secas.
  4. Aclimata a los animales al ambiente de laboratorio durante 7 días. Comienza los experimentos el octavo día después de la aclimatación.

2. Agrupación e intervenciones de animales

  1. Asignar aleatoriamente veinte ratones machos APP/PS1 de 6 meses a un grupo modelo de enfermedad de Alzheimer (grupo de la EA, n = 10) y a un grupo de electroacupuntura (grupo EA, n = 10). Asignar diez ratones C57BL/6N con edades y sexo a un grupo control normal (grupo N, n = 10).
  2. Identifica los tres puntos de acupuntura en la cabeza para la intervención: GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) y GV29 (Yintang).
    NOTA: La localización de los puntos de acupuntura se basa en el "Atlas de Acupuntura Animal" formulado por la Sociedad de Investigación Experimental de Acupuntura de la Asociación China de Acupuntura-Moxibustión. GV20 está situado en el punto medio entre las puntas de ambas orejas; GV29 se sitúa en el punto medio entre los extremos mediales de las cejas; y GV26 se encuentra debajo del tabique nasal del ratón, en la unión de los dos tercios inferiores y el tercio superior de la línea media de la hendidura labial. El diagrama esquemático se muestra en la Figura 1.
  3. Administrar estimulación con electroacupuntura al grupo EA una vez al día durante 20 minutos durante 15 días consecutivos.
    1. Sujeta al ratón de forma segura usando fundas de sujeción de tela idénticas diseñadas a medida. Asegúrate de que el cuerpo esté cómodamente envuelto mientras la cabeza permanece completamente expuesta para una inserción precisa de la aguja y una respiración normal.
    2. Prepara agujas estériles desechables para acupuntura (0,25 mm × 13 mm).
    3. Aplica un método rápido de pinchazo (inserción rápida y retirada inmediata sin retención) al punto de acupuntura GV26 (Shuigou) usando la aguja estéril de acupuntura.
    4. Conecta las empuñaduras de las agujas en GV20 y GV29 a los clips de salida de un aparato electrónico de electroacupuntura.
    5. Ajusta los parámetros de estimulación del aparato para entregar una onda dispersa continua, con una frecuencia de 2 Hz, un voltaje constante de 2 V y una intensidad de corriente de 0,1 mA.
    6. Observa al ratón detenidamente y verifica que la intensidad de la estimulación induce un leve temblor rítmico en la cabeza del ratón.
  4. Mantener ratones en los grupos N y AD bajo condiciones de vivienda idénticas sin ninguna intervención. Someter a los grupos N y AD a los mismos procedimientos diarios de manejo y sujeción que el grupo EA durante los 15 días para garantizar la coherencia en las condiciones experimentales.

3. La prueba del laberinto acuático Morris (MWM)

NOTA: El marco conductual (Morris Water Maze) se basa en nuestro trabajoprevio 5.

  1. Preparación de aparatos
    1. Coloque un depósito circular de agua (90 cm de diámetro, 50 cm de profundidad) en la sala de pruebas. Llena el depósito con agua (22 ± 2 °C) hasta una profundidad de 30 cm.
    2. Añade 0,5 kg de leche desnatada en polvo al agua para que quede opaca. Prácticamente dividir el tanque en cuatro cuadrantes iguales (I, II, III y IV).
    3. Colocar una plataforma de escape (circular, 5 cm de diámetro, 28 cm de altura) en el centro del cuadrante I.
    4. Coloca señales visuales distintas de diferentes formas en la pared interior de cada cuadrante para ayudar al ratón a aprender y memorizar la ubicación de la plataforma.
    5. Monta una cámara digital a 2 m por encima del centro del acuario en el techo y conéctala a un sistema de adquisiciónde imagen 6.
  2. Habituación
    1. Retira la plataforma del tanque el día antes de la prueba de la plataforma oculta. Permite que el ratón nade libremente en el acuario durante 90 segundos por la mañana y otra por la tarde para aclimatarse al entorno experimental.
  3. Prueba de plataforma oculta
    1. Realiza la prueba de la plataforma oculta durante cinco días consecutivos.
    2. Selecciona los puntos de inicio del segundo, tercer y cuarto cuadrante, respectivamente, asegurando que cada punto de partida esté equidistante del centro del tanque.
    3. Coloca el ratón en el agua, mirando hacia la pared del acuario. Permite que el ratón observe su entorno durante 10 segundos tras ser colocado en el agua.
    4. Registra la latencia de escape y la trayectoria de natación si el ratón localiza la plataforma oculta y permanece en ella durante 5 segundos dentro de un límite de 60 segundos. Guía el ratón manualmente hacia la plataforma si no encuentra la plataforma en un plazo de 60 s.
    5. Permite que el animal permanezca en la plataforma durante 10 segundos para observar y memorizar la ubicación, y registra la latencia de escape en 60 segundos.
  4. Prueba de sonda espacial
    1. Retirar la plataforma oculta del tanque tras cinco días consecutivos de entrenamiento en plataformas ocultas.
    2. Coloca cada ratón en el agua desde uno de los puntos de inicio situados en el segundo, tercer o cuarto cuadrante. Deja que el ratón nade libremente durante 60 segundos. Registra el recorrido de natación y el tiempo que pasas en el cuadrante objetivo (cuadrante I).
    3. Devuelve a todos los ratones a sus jaulas de casa inmediatamente entre pruebas para minimizar el contacto directo con el experimentador.

4. Análisis de Western blot

  1. Eutanasiar a seis ratones por grupo 24 horas después de completar la intervención de 15 días. Disecciona y aísla rápidamente tejidos frescos del hipocampo sobre hielo.
  2. Pesa los tejidos del hipocampo y colócalos en tubos de microcentrífuga preenfriados. Añadir buffer de lisis RIPA frío suplementado con cóctel inhibidor de proteasas al 1% y cóctel inhibidor de fosfatasas al 1% en una proporción de 10 μL de buffer por 1 mg de tejido.
  3. Homogeneiza los tejidos a fondo usando un homogeneizador mecánico de tejidos sobre hielo. Centrifuga los homogeneados a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares. Recoge cuidadosamente el sobrenadante y transfiere a un nuevo tubo microcentrífuga preenfriado.
  4. Mezcla las muestras de proteína con un tampón de carga de 5× SDS y hierve la mezcla a 95 °C durante 10 minutos para desnaturalizar completamente las proteínas. Carga cantidades iguales de proteína (20 μg) por pozo sobre un gel SDS-PAGE al 15%. Incluye un marcador de peso molecular de proteína pre-teñido en un pozo adyacente.
  5. Haz funcionar el gel apilante a un voltaje constante de 80 V durante 30 minutos, y luego resuelve las proteínas en el gel separador a 120 V hasta que el frente del colorante azul de bromofenol llegue al fondo del gel.
  6. Transfiere las proteínas separadas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,22 μm a una corriente constante de 250 mA durante 90 minutos sobre hielo. Bloquear la membrana PVDF con leche desnatada desnatada al 5% disuelta en solución salina con Tris-buffer que contenga 0,1% Tween 20 (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente, con una agitación suave sobre un shaker.
  7. Incubar la membrana con un anticuerpo primario contra Aβ (diluido [1:1000] en buffer bloqueante) y un anticuerpo primario contra GAPDH (diluido [1:5000] en buffer bloqueante) durante la noche a 4 °C en un agitador horizontal. Incubar la membrana con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (diluido [1:2000] en buffer bloqueador) durante 1 hora a temperatura ambiente.
  8. Lava la membrana tres veces con TBST durante 10 minutos cada una para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos.
  9. Aplicar un sustrato de quimioluminiscencia (ECL) mejorada a la membrana y capturar la señal utilizando un sistema de imagen por quimiluminiscencia.
  10. Cuantifica las intensidades de las bandas proteicas usando el software ImageJ (versión 1.53a). Normalizar los valores en escala de grises de las bandas objetivo a los de GAPDH y calcular los niveles relativos de expresión de las proteínas de interés.

5. [18F]Radiosíntesis AV-45

  1. Realizar radiomarcaje mediante sustitución nucleofílica de 3,0 mg del compuesto precursor por [18F]KF.
  2. Purificar el producto mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para lograr una pureza radioquímica (RCP) superior al 95%.
  3. Disuelve el compuesto marcado en etanol.
  4. Diluir la solución con cloruro de sodio al 0,9% y preparar el producto final en etanol al 10% para su usoposterior 7.

6. Imagen PET in vivo

  1. Selecciona al azar cuatro ratones de cada grupo experimental.
    1. Coloque al ratón sobre una almohadilla calefactor de agua circulante (37 °C) o bajo una lámpara térmica durante 5–10 minutos antes del procedimiento para favorecer la vasodilatación de las venas caudales.
    2. Asegura al ratón en un retenedor cilíndrico transparente adecuado, dejando la cola completamente expuesta. Desinfecta la cola y visualiza mejor las venas laterales de la cola limpiando la piel con un hisopo de etanol al 70%.
  2. Extrae el radiotrazador formulado de AV-45 en una jeringuilla de insulina de 0,5 mL equipada con una aguja. Preparar un volumen de inyección de aproximadamente 100–150 μL para lograr una dosis de radiactividad objetivo de 3,0 MBq (pureza radioquímica > 95%)2.
  3. Mide y registra la radiactividad inicial de la jeringuilla llena de trazador usando un calibrador de dosis.
  4. Inserta la aguja, biselado hacia arriba, en un ángulo poco profundo (aproximadamente 10°–20°) en la vena lateral de la cola. Espera 60 minutos después de la administración y luego anestesia al ratón inhalando isoflurano al 2%.
  5. Coloca el ratón y realiza un escaneo PET tridimensional tridimensional de 15 minutos.
  6. Reconstruye los datos PET usando un algoritmo tridimensional de maximización de expectativas de subconjunto ordenado (OSEM).
  7. Procesa los datos reconstruidos con el software PMOD (versión 4.5).
    1. Co-registrar los datos en una plantilla cerebral adecuada para ratones pequeños y medianos dentro del módulo de fusión PMOD. Permite que el software delimite automáticamente las regiones de interés (ROI) en el cerebro del ratón.
  8. Calcula los valores estandarizados de captación (SUVs). Obtén la relación de valor de captación estandarizada (SUVR) comparando el SUV de cada ROI con el delcerebelo 8.
    NOTA: La variabilidad aceptable en la dosis administrada (2,0–3,8 MBq) se adapta a las fluctuaciones diarias del rendimiento del radiotrazador y al peso corporal individual del ratón. Dado que las cuantificaciones posteriores dependen del ratio de valores de captación estandarizado (SUVR), que normaliza la región objetivo frente a una región de referencia (cerebelo)—las variaciones absolutas de dosis dentro de este rango no comprometen los resultados comparativos de imagen. La tomografía por emisión de micropositrones (Micro-PET) se muestra en la Figura 2.

7. Análisis estadístico

  1. Realizar todos los análisis estadísticos utilizando el software SPSS (versión 19.0).
  2. Presenta los datos como media ± desviación estándar (DS).
  3. Aplica ANOVA unidireccional para analizar los resultados ocultos de la prueba de la plataforma.
  4. Analizar los datos de la prueba de sonda espacial y la imagen PET utilizando ANOVA de medidas repetidas o ANOVA unidireccional, seguidos de pruebas post-hoc con LSD para comparaciones por pares.

Resultados

Efecto de la electroacupuntura en la función cognitiva en ratones APP/PS1

Para evaluar la capacidad de aprendizaje espacial, los ratones se sometieron a ensayos de adiestramiento desde el día 1 hasta el día 5. En la prueba de plataforma oculta (Figura 3A,B), la latencia de escape de ratones en todos los grupos mostró una tendencia decreciente durante el periodo de entrenamiento. En comparación con el grupo N, el grupo de DA mostró una latencia de escape significativamente prolongada (p < 0,05), lo que indica déficits pronunciados de aprendizaje y memoria en ratones APP/PS1 de 6 meses. La latencia de escape en el grupo AD era significativamente mayor que en ambos grupos N y EA (p < 0,01). Cabe destacar que, en el día 5, la latencia de escape en el grupo EA fue significativamente menor que en el grupo AD (p < 0,05) (Figura 3C). Tras el periodo de entrenamiento de 5 días, se evaluó la memoria espacial mediante la prueba de sonda espacial. Se calculó la proporción del tiempo dedicado a nadar en el cuadrante objetivo (plataforma) respecto al tiempo total de natación; una proporción mayor indica mejor retención de memoria. Los resultados mostraron que la proporción de tiempo de natación en el grupo de AD era significativamente menor que en el grupo N (p < 0,01). En cambio, el grupo EA mostró una proporción significativamente mayor en comparación con el grupo EA (p < 0,01). Sin embargo, la proporción en el grupo EA se mantuvo menor que en el grupo N (p < 0,05) (Figura 3D).

También se analizó el número de cruces de andenes, que refleja la precisión de la memoria espacial. Un mayor número de cruces sugiere una mejor retención de la memoria. El grupo AD mostró significativamente menos cruces de plataformas que el grupo N (p < 0,05), mientras que el grupo EA mostró un aumento significativo en comparación con el grupo AD (p < 0,05). No obstante, el grupo EA aún tenía menos cruces que el grupo N (p < 0,05) (Figura 3E).

Efectos de la electroacupuntura sobre la deposición de Aβ en el hipocampo de APP/PS1 mice

La deposición de Aβ se evaluó mediante imágenes PET, y se calculó la relación de valores de captación estandarizada (SUVR) del trazador Aβ radiomarcado en el hipocampo de ratones APP/PS1 (Figura 4A). Los escaneos micro-PET revelaron que tanto el grupo N como el grupo EA mostraron valores significativamente más bajos de SUVR en comparación con el grupo AD (Figura 4B). Análisis cuantitativos adicionales confirmaron que el SUVR y Aβ del hipocampo en el grupo EA fueron significativamente más altos que en el grupo N (p < 0,05), mientras que se mantuvieron significativamente más bajos que en el grupo de EA tras la intervención con electroacupuntura (p < 0,05) (Figura 4C).

Efectos de la electroacupuntura en la expresión de la proteína Aβ

Tras las evaluaciones conductuales e imagen, la expresión de la proteína Aβ en el hipocampo se evaluó mediante análisis de Western blot (Figura 5A). El análisis cuantitativo reveló que la expresión relativa de Aβ en el grupo de la DA estaba significativamente elevada en comparación con el grupo N (p < 0,05). El grupo EA mostró una reducción significativa en la expresión de Aβ en el hipocampo en comparación con el grupo de EA (p < 0,05). Sin embargo, los niveles de expresión en el grupo EA se mantuvieron más altos que en el grupo N, lo que indica que, aunque la intervención atenuó efectivamente la acumulación de Aβ, no eliminó completamente las placas existentes (Figura 5B).

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Figura 1: Diagrama esquemático que muestra la ubicación de los puntos de acupuntura GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) y GV29 (Yintang) en ratones. Esta figura ha sido reutilizada con permiso de Sun et al.5. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Tomografía por emisión de micropositrones (Micro-PET). El IRIS PET/CT (Inviscan) es un sistema de imagen preclínico para ratones y ratas, con alta sensibilidad (>9%) y una resolución espacial de 1 mm con un campo de visión axial de 96 mm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Efecto de la electroacupuntura en la función cognitiva. (A) Aparato MWM. (B) Se probaron ratones utilizando el aparato Morris Water Labe (MWM). (C) Tendencias en la latencia de escape durante la prueba de la plataforma oculta. Comparado con el grupo N, ◆◆p < 0,05; en comparación con el grupo de la enfermedad de Alzheimer (EA), ▲▲p < 0,05. (D) Proporción del tiempo de natación en el primer cuadrante. Comparado con el grupo N, ◆◆p < 0,05; comparado con el grupo AD, ▲▲p < 0,05. (E) Número de cruces de andenes en el cuadrante de andén. En comparación con el grupo N, ◆◆p < 0,05; comparado con el grupo AD, ▲▲p < 0,05. Esta figura ha sido reutilizada con permiso de Sun et al.5. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Efectos de la electroacupuntura sobre la deposición de Aβ. (A) La región de interés en el hipocampo del ratón se muestra en verde. (B) Imágenes tomografiadas por microemisión de positrones de Aβ en ratones de cada grupo. (C) Comparación de las relaciones de valores de captación estandarizadas de [18F]45 (SUVR; región objetivo/cerebelo) en el hipocampo de cada grupo, cuantificada por micro-PET. Comparado con el grupo N, ◆◆p < 0,05; en comparación con el grupo de la enfermedad de Alzheimer (EA), ▲▲p < 0,05. Esta figura ha sido reutilizada con permiso de Sun et al.5. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5: Efectos de la electroacupuntura en la expresión de la proteína Aβ. (A) Bandas representativas de Western blot que muestran los niveles de expresión de Aβ (4 kDa) y GAPDH (146 kDa) como control de carga. Las bandas ilustran una baja expresión de Aβ en el grupo N, alta expresión en el grupo de Alzheimer y una expresión reducida en el grupo de Alzheimer en comparación con el modelo de Alzheimer. (B) Análisis cuantitativo de la expresión relativa de Aβ respecto a GAPDH entre los grupos experimentales. Comparado con el grupo N, ◆◆p < 0,05; en comparación con el grupo de la enfermedad de Alzheimer (EA), ▲▲p < 0,05. Esta figura ha sido reutilizada con permiso de Sun et al.5. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Visualizar y cuantificar Una deposición en el hipocampo proporciona una ventana clave sobre la progresión patológica dela 9 d.C. Aunque existen múltiples modalidades de neuroimagen, lograr una traducción de alta resolución, cuantitativa y entre especies sigue siendo un obstáculo importante. Por ejemplo, la imagen de fluorescencia en infrarrojo cercano suele estar restringida por la resolución espacial, y la resonancia magnética —aunque capaz de mapear alteraciones estructurales— a menudo exige dosis de agentes de contraste excesivamente altas para delimitar las placas amiloides in vivo. En cambio, la PET representa una herramienta traduccional óptima, permitiendo la evaluación dinámica de la neuroinflamación, el metabolismo de la glucosa y la acumulación de A tanto en modelos animales como en poblacionesclínicas 10,11. La imagen molecular mediante PET no solo facilita el diagnóstico precoz y la estadificación patológica precisa. pero también es indispensable para monitorizar el compromiso y eficacia del objetivo de las terapias emergentes para la EA. La llegada de la tecnología micro-PET en el ámbito preclínico ha ampliado sustancialmente la utilidad de la PET más allá de los entornos clínicos y la investigación con primates no humanos. Caracterizado por una resolución espacial superior y una alta sensibilidad adaptada a campos de visión pequeños, el micro-PET permite a los investigadores seguir longitudinalmente la progresión neurodegenerativa en modelos deroedores 13,14. De manera crucial, métricas cuantitativas establecidas como el SUVR calculado en relación con regiones de referencia sin patología robusta A, como el cerebelo, pueden trasladarse sin problemas de laboratorio a15 de paciente. Históricamente, la PET con trazadores específicos ha mostrado alta sensibilidad diagnóstica (hasta el 90%) y especificidad (89%) para la DA: 16,17. Aunque el trazador PIB de [11C]revolucionó la visualización temprana del amiloide, su corta vida media limitó su desplieguegeneralizado 18. El desarrollo posterior y la aprobación de la FDA en 2012 de [18F]AV-45 (Florbetapir) mitigaron estaslimitaciones, proporcionando una vida media más larga junto con una excelente afinidad y selectividad de unión para Aβ. En consecuencia, [18F]AV-45 se ha convertido en un elemento básico tanto para diagnósticos clínicos como para evaluacionespreclínicas 20.

Al utilizar este protocolo deben considerarse varios pasos críticos y posibles modificaciones. En primer lugar, es esencial un control riguroso de los parámetros de radiosíntesis; cualquier desviación en la cantidad de precursor o en la temperatura de reacción puede comprometer gravemente la pureza y rendimiento radioquímico de [18F]AV-45. En segundo lugar, la alineación estereotáxica precisa durante la imagen PET es fundamental para evitar efectos de volumen parcial, que pueden distorsionar artificialmente los cálculos de los SUVR en pequeñas regiones hipocampales de ratones. Para la resolución de bajas relaciones señal-ruido en imágenes PET, los investigadores deben verificar la actividad específica del trazador inyectado y asegurarse de que la profundidad de anestesia de isoflurano se mantenga estable, ya que el movimiento respiratorio puede difuminar las imágenes.

Esta metodología tiene ciertas limitaciones. Aunque el micro-PET de AV-45 proporciona una visión macroscópica de la carga regional de Aβ, su resolución espacial no permite la visualización de placas amiloides microscópicas individuales. Además, la intervención electroacupuntura de 15 días implementada en este estudio demostró una atenuación significativa de la carga de Aβ en comparación con ratones de AD no tratados; sin embargo, dado que la eliminación completa de placas Aβ establecidas suele requerir meses de intervención sostenida, el paradigma actual refleja principalmente una modulación temprana de la dinámica soluble de Aβ o una detención progresiva de la deposición más que una eliminación completa de placas estructurales. Además, realizar tomografías PET antes y después de la intervención en el mismo sujeto proporcionaría un control longitudinal más fuerte, una estrategia que debería adoptarse en futuros diseños experimentales.

En resumen, los resultados de este estudio sugieren que la intervención con electroacupuntura (EA) mitiga significativamente la acumulación de Aβ y preserva la función cognitiva espacial en ratones APP/PS1. La base mecanicista de esta mejora puede estar relacionada con los efectos neuromoduladores de estimular los puntos deacupuntura 21 del Vaso Gobernador (Du Mai), que se han vinculado anatómicamente a redes fasciales y neurovasculares que promueven el flujo sanguíneo cefálico y las vías de eliminación. Al proporcionar evidencia sólida y cuantificable de imagen molecular, este protocolo subraya la importancia de integrar modalidades terapéuticas tradicionales con neuroimagen avanzada. Este marco metodológico allana el camino para investigaciones más profundas sobre las vías terapéuticas de la acupuntura en la lucha contra la EA.

Divulgaciones

Todos los autores han declarado que no existen posibles conflictos de interés.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (N.º 82004482, 82274654, 82274644), la Fundación de Ciencias Naturales de Pekín (N.º 7252219) y el Fondo de Cultivo de la Innovación del Sexto Centro Médico del Hospital General del EPL (N.º CXPY202405). Agradecemos a Biorender (biorender.com) por proporcionar las herramientas gráficas utilizadas en este estudio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
[18F]AV-45Laboratorio de Radiofarmacéutica de la Universidad Normal de Pekín— —El trazador más utilizado en la industria
0,22 & mu; Membrana m PVDFBeyotimeFFP71Transferencia eficiente de película
Gel SDS-PAGE al 15%BeyotimeP0066Dificultar la migración de proteínas de moléculas pequeñas
5 y veces; Búfer de carga SDSBeyotimeP0015Asegúrate de rayas claras y una separación precisa.
Ratones machos de 6 meses con APP/PS1Cavenberg (Suzhou) Laboratorio de Investigación Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Ampliamente utilizado para la investigación sobre la enfermedad de Alzheimer.
 
Ratones machos C57BL/6 de 6 mesesCavenberg (Suzhou) Laboratorio de Investigación Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Para el grupo de control normal
Aβ anticuerpoProteintech25524-1-APDetección de A y beta; Monómero
Agujas estériles desechables para acupunturaZhongYan TaiHe Medical Instrument Co., LtdZYTH2013030504Herramientas comunes de acupuntura
Sustrato ECLThermo Fisher (Pierce)  32106 (500 mL)Detección de proteínas objetivo
Aparato de electroacupuntura (EA)Beijing Huawei Industrial Development Co., Ltd.HANSLH202Equipos de electroacupuntura comúnmente utilizados en China
GAPDHProteintech23567-1-CBProteína de referencia clásica (1:5000)
Anticuerpo secundario conjugado con HRPThermo Fisher Scientific (Invitrogen)31430 (2mL) / C31430100 (100μ L)Detección de proteínas objetivo (1:2000)
Software ImageJNIH  Versión 1.53aAnálisis de los valores en escala de grises de las tiras
IsofluranoCentauro30135687 (250ml)Anestesia rápida y segura de ratones
PET-CTSistema de imagen PET/TC del irisIRISAlta sensibilidad al PET y excelente rendimiento cuantitativo
Cóctel inhibidor de fosfatasasBeyotimeP0055BMantener el estado de fosforilación de las proteínas
Software PMODPMOD Technologies  Versión 4.5 Usado para  procesamiento y análisis de datos de imágenes PET
Marcador de peso molecular de proteínas pre-teñidasThermo Fisher (Pierce)26619 (2 y veces; 250 y micro; L) Monitorización de electroforesis y transferencia de membranas 
Cóctel inhibidor de proteasasBeyotimeP1046Inhibición de amplio espectro de la actividad de la proteasa endógena
Búfer de lisis RIPABeyotimeP0013CMantenimiento de la modificación por fosforilación de proteínas
Leche en polvo desnatada utilizada en el aparato Morris Water MazeYili6907992637815Haz el agua opaca y esconde las plataformas submarinas
El sistema de laberinto acuático MorrisChengdu Taimeng Software Co., Ltd.WMT-100SEquipos para laberinto acuático ampliamente utilizados en China

Referencias

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