Investigación del microambiente ovárico: métodos para aislamiento, cultivo 2D y cultivo organoide de células somáticas ováricas de ratón

Resumen

Describimos métodos para aislar células somáticas ováricas de ratón a partir de una fracción del ovario enriquecida con estroma y para generar organoides somáticos ováricos de ratón utilizando un enfoque sin andamiaje.

Resumen

El ovario está formado por poblaciones heterogéneas de células somáticas, tanto dentro del folículo como del estroma circundante, que son fundamentales para apoyar la función ovárica y para la generación de gametos de alta calidad. Informamos de métodos para aislar células somáticas de ovarios de ratón, incluyendo células endoteliales, epiteliales, esteroidogénicas, estromales e inmunes. Cuando estas células somáticas ováricas primarias se placan y cultivan en un sistema tradicional de cultivo 2D, se pierden la heterogeneidad celular, la organización, así como las interacciones célula-célula y matriz celular que normalmente se encuentran en el ovario. Así, también describimos cómo generar organoides somáticos ováricos de ratón utilizando un enfoque sin andamiaje. Estos organoides se autoensamblan, mantienen poblaciones celulares diversas y producen la matriz extracelular y factores secretados, incluidas las citocinas. Los organoides pueden utilizarse para experimentos de co-cultivo y pueden mantenerse en cultivo durante al menos 3 semanas con alta viabilidad. En conjunto, estos modelos permiten analizar la fisiología y patología ovárica desde la perspectiva de las células somáticas.

Introducción

Aunque el ovocito, o gameto femenino, es esencial para dar lugar a la siguiente generación, las poblaciones celulares somáticas en el ovario desempeñan un papel fundamental en el desarrollo de gametos, la producción de hormonas esteroides y la homeostasis ovárica. Los ovocitos, rodeados por células somáticas de la granulosa y la teca, forman las unidades funcionales del ovario conocidas como folículos. Las células de la granulosa están físicamente conectadas al ovocito mediante proyecciones transzonales y proporcionan soporte metabólico y nutritivo al ovocito, además de regular la detención meiótica ^1,2. Además, en respuesta a las gonadotropinas, las células granulosa y teca producen hormonas esteroides, incluyendo estrógenos, progesterona y andrógenos, que tienen efectos más allá del sistema reproductor, afectando los sistemas cardiovascular, musculoesquelético y nervioso, y por tanto afectando la salud general^{femenina 3}. Los folículos ováricos se desarrollan dentro de un estroma ovárico heterogéneo compuesto por vasculatura, células inmunitarias, varias poblaciones de fibroblastos intersticiales y células mesenquimales, así como una matriz extracelular (^ECM)4 altamente ordenada. Este microambiente estromalo proporciona señales físicas y químicas que afectan al crecimiento del folículo, la ovulación y la luteinización⁴.

Existen varios métodos para aislar y cultivar gametos y folículos in vitro, y estos métodos han avanzado nuestra comprensión de la oogénesis y la foliculogénesis⁵. Sin embargo, el compartimento somático del ovario está relativamente poco estudiado, en parte debido a la falta de modelos in vitro robustos. Los modelos actuales del compartimento somático ovárico están en gran medida restringidos a un solo tipo celular, como fibroblastos, células epiteliales de la superficie ovárica, endoteliales, inmunes o de la granulosa 6,7,8,9,10,11. El cultivo de células somáticas ováricas primarias definidas de forma amplia en 2D favorece las poblaciones de macrófagos a lo largo del tiempo, lo que resulta en una pérdida de heterogeneidad celular¹². Además, el cultivo tradicional bidimensional (2D) de monocapas no permite las diversas interacciones célula-célula y matriz celular que están presentes en el ovario. Los explantes de tejido ovárico mantienen la complejidad celular y estructural del tejido nativo, pero varían en composición dependiendo de dónde se hayan derivado dentro del^{ovario 13,14}.

Los organoides son versiones tridimensionales (3D), multicelulares y miniaturizadas de órganos o tejidos que recapitulan la organización y función in vivo ^15,16. Los organoides pueden generarse a partir de células madre o células primarias aisladas de tejido normal^{o enfermo 15}. En el contexto del sistema reproductor femenino, se han generado organoides para modelar el endometrio, la trompa de Falopio, el cuello uterino y la^{placenta 17}. Sin embargo, en lo que respecta al ovario, hasta hace poco, los modelos organoides se han limitado a un solo tipo celular, como células epiteliales de la superficie ovárica o células cancerosas, o se han generado a partir de células madre pluripotentes inducidas para asemejarse a estructuras foliculares en lugar del estroma^{ovárico 17,18}. Estudios recientes han generado y caracterizado organoides utilizando poblaciones heterogéneas de células somáticas aisladas de tejido de ratón, macaco rhesus y ovárico^humano 19,20,21. Estos modelos organoides han permitido investigar los mecanismos celulares subyacentes al envejecimiento ovárico, así como los efectos de la exposición a ftalatos en la composición de la^{ECM 19,21}.

Dada la importancia crítica de las células somáticas, tanto en el folículo como en el estroma, para la función ovárica, describimos métodos para aislar células somáticas de una fracción enriquecida con estroma de ovarios de ratón y para cultivarlas in vitro utilizando cultivo monocapa tradicional o en un modelo organoide. Utilizando micromoldes de agarosa libres de andamiaje, las células somáticas ováricas forman organoides en 1–3 días. Los organoides preservan poblaciones clave de células ováricas, incluyendo fibroblastos, macrófagos y células esteroidogénicas, y pueden cultivarse hasta 3 semanas con alta viabilidad. Los organoides somáticos ováricos son propicios para evaluaciones transcriptómicas e histológicas, análisis de medios condicionados, co-cultivo con otros tipos celulares y métodos de cribado de compuestos. En conjunto, estos organoides son un modelo sólido para la interrogación in vitro y la modulación del compartimento somático ovárico y pueden aplicarse al estudio del desarrollo ovárico, el envejecimiento, la fisiología y la patología.

Protocolo

El uso de animales para desarrollar este protocolo se realizó de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales de la Universidad Northwestern y con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (Número de Garantía de Bienestar Animal de la Universidad Northwestern: A3283-01; ID del protocolo IACUC: IS00013082_IM12). La información del fabricante y los números de catálogo para todos los materiales, incluidos moldes de silicona para micromoldes, medios y suplementos de agarosa, se muestran en la Tabla de Materiales. En la Figura 1 se presenta una visión general de los pasos del protocolo. Todos los pasos del protocolo deben realizarse utilizando el equipo de protección individual adecuado, en cumplimiento de todas las normativas institucionales de bioseguridad y salud y seguridad ambiental, y, salvo que se especifique lo contrario, dentro de un gabinete de bioseguridad de Clase II.

Figura 1: Esquema del aislamiento de células somáticas ováricas en ratones, generación de organoides somáticos ováricos y aplicaciones posteriores. Los ovarios del ratón se aíslan y la fracción estromal se enriquece. La fracción estromal enriquecida se digiere enzimática y mecánicamente. El tejido no digerido se disforma para extraerlo. Las células se pelletan, lavan, cuentan y se emplacan para su cultivo en 2D. Para la generación de organoides, tras un cultivo 2D durante la noche, se extraen células utilizando tripsina y se granulan, lavan y cuentan. Las células se siembran en micromoldes de agarosa para el cultivo de organoides. Los organoides pueden utilizarse para histología, extracción de ARN/proteínas, análisis de medios condicionados, tratamientos y cribado de fármacos, así como para el cocultivo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

1. Preparación de medios para el aislamiento y cultivo de células somáticas ováricas

NOTA: La digestión del tejido ovárico y el posterior aislamiento y cultivo de células somáticas primarias requieren cuatro tipos de medios: medios de disección (DM; usados en los pasos 2.3–2.4 para disección y punción de ovarios de ratón), medios enzimáticos (EM; usados en los pasos 2.5–2.8 para la digestión enzimática de ovarios de ratón enriquecidos con estroma), medios de temple (MQ; usados en el paso 2.9 para ralentizar la digestión enzimática), y medios de blindaje (PM; usados en los Pasos 2.11–2.14 y 4.6 para lavado, recubrimiento y cultivo 2D de células somáticas ováricas primarias, así como para la inactivación de tripsina al extraer las células de cultivos 2D). Todos los medios deben prepararse en un armario de seguridad biológica esterilizado de Clase II o campana de flujo laminar. Las recetas de medios que se enumeran a continuación son suficientes para procesar ovarios de 5–6 ratones, pero deben ajustarse según sea necesario. Todos los medios pueden prepararse hasta una semana antes y almacenarse a 4 °C, pero las enzimas para la EM deben añadirse frescas el día del aislamiento celular.

1. Preparar DM (15 mL) que contiene suero bovino fetal al 1% (FBS) y 0,5% penicilina-estreptomicina (PS) en el medio L-15 de Leibovitz. Esteriliza el medio con un filtro estéril.
   NOTA: La DM se amortigua para el intercambio de aire ambiental y se utiliza durante la microdisección del ovario de los tejidos circundantes, así como para el enriquecimiento de la fracción estromal.
2. Preparar EM (10 mL) que contenga un 1% de FBS y un 0,5% de PS en αMEM. Añade 82 unidades enzimáticas/mL de colagenosa IV y 0,2 mg/mL de DNasa I (≥400 unidades de actividad enzimática/mg). Disuelve las enzimas invirtiendo y luego esteriliza el medio usando un filtro estéril.
   NOTA: El medio enzimático está amortiguado con bicarbonato de sodio para el intercambio de aire al 5% de_CO2 y se utiliza para la digestión enzimática de fragmentos de tejido ovárico.
3. Preparar QM (20 mL) que contenga un 10% de FBS y 0,5% de PS en un medio αMEM. Esteriliza el medio con un filtro estéril.
   NOTA: La MQ es un buffer de bicarbonato de sodio para el intercambio de aire al 5% de_CO2 y se utiliza para el apagado de la digestión enzimática.
4. Preparar PM (30 mL) que contiene 10% FBS y 1% PS en RPMI 1640 (que contiene 25 mM HEPES y 2 mM L-Glutamina). Esteriliza el medio con un filtro estéril.
   NOTA: El PM está amortiguado con bicarbonato de sodio para el intercambio de aire al 5% de_CO2 y se utiliza para el placado de células somáticas ováricas primarias, así como para el cultivo en 2D.

2. Digestión del tejido ovárico y aislamiento de células somáticas primarias

NOTA: Los ovarios del ratón se aíslan y digieren tanto enzimática como mecánicamente para aislar las células somáticas primarias. Los ovarios de 5–6 ratones pueden procesarse juntos en el mismo plato. Los siguientes pasos deben realizarse mediante técnica aséptica, preferiblemente con un microscopio disecable en una campana de flujo laminar.

1. Añade 10 mL de electromagnetismo, 20 mL de mecánica cuántica y 20 mL de PM en placas de Petri de 100 mm separadas. Equilibrar los platos en una incubadora de cultivo de tejidos (ambiente humidificado, 37 °C con 5% de CO₂) durante un mínimo de 1 hora antes de su uso.
2. Calienta el diez mezquino en un baño maria (37 °C) antes de usarla.
3. Disecciona los ovarios del ratón en una placa de Petri de 35 mm que contiene 3 mL de DM. Separa los ovarios del tejido adiposo adherido, el oviducto y la bursa ovárica utilizando pinzas de punta fina y/o microtijeras (Figura 2Ai,ii). Utiliza un microscopio de disección según sea necesario para la microdisección.
4. Transfiere los ovarios disecados a un cristal de reloj de 45 mm con 2–3 mL de DM. Bajo un microscopio disecador, ancla y perfora todas las áreas de los ovarios usando agujas de insulina de 28 G con las manos no dominante y dominante, respectivamente, durante aproximadamente 10 minutos. Rota frecuentemente el tejido ovárico para asegurarte de que todas las zonas estén alteradas.
   NOTA: La perforación de los ovarios enriquece la fracción estromal liberando folículos preantrales, así como complejos cúmulo-ovocito y células de granulosa de los folículos antrales (Figuras 2Aiii–iv).
5. Utiliza pinzas de punta fina para mover los ovarios del ratón enriquecidos con estroma hacia la placa de Petri con EM equilibrada (Figura 2Bi).
6. Trabajando rápidamente para minimizar los cambios de temperatura y pH en el medio, rasga los ovarios enriquecidos con estroma en pedazos de aproximadamente 2–3 mm con pinzas de punta fina (Figura 2Bii).
7. Sujeta la placa de Petri en ángulo y pipeta repetidamente EM que contenga fragmentos de tejido ovárico con una pipeta p1000, ajustada a 1 mL, 100× o durante 3 minutos, lo que ocurra primero (Figura 2Biii). Haz girar la placa de Petri según sea necesario para asegurarte de que todas las piezas de tejido estén pipeteadas.
   NOTA: Si el tejido es demasiado grande para ser pipeteado con una punta p1000, la punta puede cortarse con un bisturí estéril para ensanchar la abertura. El tubo debe ser lo suficientemente ancho para permitir la entrada de la mayoría (>50%), pero no de todas, las piezas de tejido, creando un efecto de cizallamiento.
8. Transfiere la placa de Petri que contiene fragmentos de tejido electromagnético y ovárico a una incubadora de cultivo tisular (ambiente humidificado, 37 °C con 5% de_CO2) e incuba durante un total de 30 minutos, retirando la placa y pipeteando repetidamente (100× o durante 3 minutos) después de 15 minutos, y luego de nuevo al final de los 30 minutos de incubación (Figura 2Biii).
   NOTA: Tras los primeros 15 minutos de incubación, los fragmentos de tejido deben ser digeridos lo suficiente para que el >80% pase por la punta de una pipeta p1000 sin necesidad de cortar la punta para ensanchar la abertura. La duración total de la digestión y la cantidad de pipeteo necesaria dependerán del tamaño inicial de los fragmentos de tejido desgarrados. Además, la edad y la tensión del ratón, la variabilidad de lote en la actividad de las enzimas y el tamaño del tubo de la pipeta pueden influir en la velocidad de descomposición del tejido. La digestión debe calmarse cuando los fragmentos de tejido ovárico se descomponen en fragmentos de aproximadamente 1 mm que aún son visibles a simple vista (Figura 2Biv). La sobredigestión puede provocar pérdida celular y disminución de la viabilidad celular.
9. Diluir las enzimas para ralentizar la digestión tisular añadiendo 20 mL de MQ preequilibrada (Figura 2Ci).
10. Pasar la suspensión celular por un colador de 40 μm colocado sobre un tubo cónico de 50 mL para extraer fragmentos de tejido no digerido (Figura 2Cii). Centrifuga el filtrado a 300 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente para pelletar las células (Figura 2Ciii).
11. Lavar las células eliminando el sobrenadante por aspiración, volver a suspender el pellet celular en 1 mL de PM preequilibrado, transferir la suspensión celular a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente para volver a pelletar las células (Figura 2Civ).
12. Retirar el sobrenadante, volver a suspender el pellet celular en 1 mL de PM, teñir una alicuota de 10 μL de células con azul tripánico para evaluar la viabilidad celular y contar las células con un hemocitómetro.
    NOTA: Consulte la Tabla 1 para el número anticipado de células somáticas ováricas primarias, según la cepa y edad del ratón, en esta fase del protocolo de aislamiento. La viabilidad celular en esta etapa debería ser del >80%.
13. Placar las células en un recipiente tratado con cultivo de tejidos a una densidad aproximada de 1,25 × 10 5-1,5 × 10⁵/^cm2 (por ejemplo, para recuentos celulares de aproximadamente 3 × 10⁶, las células de placa en una placa de 60 mm tratada con cultivo de tejidos, y para recuentos celulares de aproximadamente 1 × 10⁶, las células de placa en un pozo de una placa de 6 pozos tratada con cultivo de tejidos).
    1. Añade PM adicional dependiendo del volumen total de la placa o plato (por ejemplo, añadir 4 mL adicionales de PM si usas una placa de 60 mm o 2 mL adicionales de PM si usas un pozo de una placa de 6 pozos).
       NOTA: Se recomienda la densidad de placas indicada anteriormente si las células se van a utilizar para la generación de organoides tras un cultivo 2D durante la noche. Para un cultivo 2D más largo, las células pueden ser placadas a menor densidad. El medio de emplatado extra que no ha sido equilibrado puede almacenarse a 4 °C durante hasta 1 semana. El PM es necesario tanto para la generación de organoides como para mantener las células somáticas ováricas en cultivo 2D. En este punto del protocolo, las células somáticas ováricas pueden mantenerse en un cultivo monocapa 2D (paso 2.14) o pueden usarse para generar organoides (proceder a la Sección 3). Es necesario cultivar 2D durante la noche antes de la generación de organoides para eliminar cualquier ovocito de folículos en fase inicial que haya podido pasar por el colador celular de 40 μm.
14. Tras el chapado durante la noche (mínimo 16 h), lava las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS; Mg/Ca-free (pH 7,0–7,3) para eliminar células muertas y residuos (Figura 3A). Añade PM fresca tras lavar y sustituye el material por PM fresco cada dos días durante toda la cultura (Figura 3B).
    NOTA: A pesar de la alta viabilidad celular tras el aislamiento, normalmente se observa una gran pérdida en el recuento total de células tras el placado durante la noche, ya sea debido a la muerte celular o a la incapacidad de adherirse al vaso de cultivo tisular (Figura 3A).

Figura 2: Esquema del aislamiento de células somáticas ováricas del ratón. (A) Imágenes representativas de (i,ii) disección de ovario de ratón y (iii,iv) enriquecimiento estromático. El ovario del ratón está delineado con una línea discontinua en Ai. (B) Imágenes representativas de fragmentos de tejido ovárico a lo largo de la digestión mecánica y enzimática. Ovarios enriquecidos con estroma (i) antes y (ii) después del desgarro, (iii) fragmentos de tejido ovárico durante la pipeta, y (iv) fragmentos de tejido ovárico tras la digestión. (C) Imágenes representativas de (i) la templación de la digestión, (ii) el filtrado de la suspensión celular y (iii,iv) la pelletificación de las células somáticas ováricas primarias del ratón. Los recreos en Cii y Ciii muestran fragmentos de tejido no digerido capturados por el colador celular y el pellet celular tras la centrifugación, respectivamente. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Las células somáticas ováricas primarias pueden cultivarse en 2D. (A) Imágenes representativas de luz transmitida de células somáticas ováricas primarias en placas en una antena de 60 mm 16 horas después del emplacado, antes y después del lavado con PBS. (B) Imágenes representativas de luz transmitida de células somáticas ováricas primarias placadas en una placa de 24 pozos durante 3 días en cultivo. Barras de escala = 400 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Preparación de micromoldes y medios de agarosa para la generación y cultura de organoides

NOTA: Los organoides somáticos ováricos se generan y cultivan en micromoldes de agarosa sin andamios con medios organoides ováricos. Los micromoldes de agarosa y los medios organoides ováricos deben prepararse mediante técnica aséptica en un armario de seguridad biológica esterilizado de Clase II o campana de flujo laminar.

1. Preparación de micromoldes de agarosa
   1. Coloca moldes de silicona para micromoldes y pinzas Graefe en una bolsa de esterilización y autoclave usando un ciclo de secado para esterilizar (Presión en la camisa: 20 psi, Temperatura de la cámara: 250 °F (121,11 °C, Tiempo de esterilización: 15 min).
      NOTA: Varios moldes de silicona pueden ser autoclavados y utilizados simultáneamente para una generación más rápida de micromoldes de agarosa.
   2. Añadir 1 mL de PBS que contenga un 1% de PS a cada pozo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pozos para el almacenamiento de los micromoldes de agarosa.
   3. Disuelve agarosa estéril al 1,5% (p/v) en PBS calentándola en un microondas, en un baño de agua caliente o en una placa caliente.
      NOTA: Disolver la agarosa al microondas en un tubo cónico de 50 mL colocado en un vaso de precipitados de 100 mL lleno de agua funciona bien (Figura 4Ai). Además de permitir un hervimiento controlado, el baño de agua caliente creado en el vaso ralentiza la resolidificación de la agarosa.
   4. Deja que la agarosa líquida se enfríe hasta aproximadamente 50 °C hasta que el tubo pueda manipularse cómodamente.
   5. Pipetear lentamente 300–350 μL de agarosa al 1,5% en la fundición de silicona, asegurándose de no sobrellenar ni rellenar demasiado la fundición y evitar crear burbujas (Figura 4Aii). Asegúrate de que la agarosa crea una capa plana en la parte superior del molde en lugar de un borde cóncavo o convexo (Figura 4Aiii,iv). Haz burbujas usando una punta de pipeta p10 estéril antes de que la agarosa empiece a solidificarse (Figuras 4Bi–iii).
   6. Deja que la agarosa solidifique en la fundición de silicona durante 2–3 minutos a temperatura ambiente (Figura 4Biv).
   7. Una vez sólido, invierte la silicona fundida sobre un pozo de la placa de cultivo de tejido de 24 pozos que contiene PBS + 1% PS. Flexiona cuidadosamente la silicona para liberar el micromolde de agarosa en la placa (Figura 4Ci).
      NOTA: Los micromoldes de agarosa sumergidos en PBS +1% PS en una placa de cultivo de tejidos de 24 pozos envuelta en parafilm pueden almacenarse a 4 °C hasta 1 mes antes de su uso (Figura 4Cii). Los micromoldes de agarosa deben prepararse al menos 16 horas antes de su uso, ya que los micropozos suelen contener burbujas de aire inmediatamente después del colado y la sumersión en PBS + 1% de PS (Figura 4Ciii). Sin embargo, estas burbujas de aire se disipan durante el almacenamiento (Figura 4Civ). Antes de su uso en cultivo de organoides, los insertos de micropozos de agarosa deben examinarse cuidadosamente al microscopio para confirmar que los micropozos no se fusionaron ni se interrumpieron durante la fundición (Figura 4Di–iv). No se recomienda micromoldes defectuosos para la generación y cultivo de organoides. Se recomienda preparar un exceso de micromoldes de agarosa para cubrir un ~25% que presentarán defectos
2. Preparación de medios organoides ováricos
   1. En un armario de bioseguridad, añadir suplementos de medio de crecimiento organoide (Mouse) 1 y 2 y 1% de PS al medio basal según las instrucciones del fabricante. Conserva el medio organoide ovárico preparado a 4 °C durante hasta 2 semanas antes de su uso.
      NOTA: Los suplementos 1 y 2 pueden ser alicitados y almacenados a -20 °C.

Figura 4: Preparación esquemática de micromoldes de agarosa. (A) Imágenes representativas de (i) preparación de agarosa al 1,5%, (ii) pipeteado en moldes de silicona, (iii) moldes de silicona correctamente rellenados y (iv) moldes de silicona sobrellenados. Las líneas discontinuas en Aiii y Aiv muestran fondos planos y convexos de micromoldes de agarosa, respectivamente. (B) Imágenes representativas de (i,ii) moldes de silicona llenos con burbujas en la agarosa, (iii) burbujas reventando con punta de pipeta antes de la solidificación de agarosa, y (iv) un micromolde de agarosa solidificado dentro del molde de silicona. (C) Imágenes representativas de (i) retirada de micromoldes de agarosa solidificados de moldes de silicona, (ii) almacenamiento de micromoldes de agarosa en placas de 24 pozos que contienen PBS + 1% PS, (iii) burbujas presentes en micropozos inmediatamente después de la fundición, y (iv) micromolde de agarosa sin burbujas y correctamente fundido tras 16 horas de almacenamiento. (D) Imágenes representativas de micromoldes con (i,ii) pozos combinados, (iii) pozos alterados o (iv) daños. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; PS = penicilina-estreptomicina. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Generación y cultura de organoides

NOTA: Tras el cultivo 2D durante la noche, las células somáticas ováricas primarias se extraen del cultivo 2D y se siembran en micromoldes de agarosa para generar organoides. Los siguientes pasos deben realizarse mediante técnica aséptica en un armario de seguridad biológica esterilizado de Clase II.

1. Calienta el PM y medios organoides a 37 °C en un baño maria y tienta tripsina al 0,05% a temperatura ambiente.
2. Utilizando pinzas Graefe, transfiere cuidadosamente los micromoldes a los pozos de una nueva placa de 24 pozos (Figura 5Ai).
3. Añadir 500 μL de medios organoides ováricos a cada pozo de la placa de 24 pozos que contiene un micromolde de agarosa (Figura 5Aii). Asegúrate de que los micromoldes estén completamente sumergidos en el medio y equilibra los micromoldes y el medio durante al menos 30 minutos en una incubadora (ambiente humidificado, 37 °C con 5% de_CO2).
4. Eliminar el PM de las células somáticas ováricas adherentes aspirando y lavar las células con PBS libre de Mg/Ca.
5. Añade 0,05% de tripsina (1–2 mL de tripsina para una placa de 6 pozos o plato de 60 mm) para extraer las células del cultivo 2D. Incubar las células con tripsina durante 2–3 minutos a 37 °C en una incubadora.
6. Confirma que las células se han desprendido bajo un microscopio e inactiva la tripsina añadiendo dos volúmenes de PM calentado por cada volumen de tripsina utilizado.
7. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mL y pelleta las celdas mediante centrifugación a 300 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
8. Resuspende las células en 1 mL de PM calentado, tiñe una alícuota de células con azul de tripán para evaluar la viabilidad celular y cuenta las células con un hemocitómetro.
   NOTA: Consulte la Tabla 1 para el número anticipado de células somáticas ováricas primarias, según la cepa y edad del ratón, tras el cultivo 2D durante la noche y la posterior tripsinización. La viabilidad de las células tripsinizadas suele ser superior al 90%.
9. Aplicar las células en pellet mediante centrifugación (300 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente) y volver a suspender el pellet celular en medio organoide ovárico hasta una densidad de 3,33 × 10⁶ células vivas por 1 mL de medio, es decir, 2,5 ×^{10 5} células vivas por 75 μL de medio.
   NOTA: Aquí, se siembran 2,5 × 10^{5 células} por cada micromolde de agarosa. Así, el número total de micromoldes que se pueden generar dependerá del recuento total de células. Los organoides pueden generarse con menos de 2,5 × 10 células^{de 5} células por micromolde de agarosa, pero el tamaño del organoide, la cinética de agregación, la composición celular relativa y las funciones, incluida la producción hormonal, pueden verse afectados.
10. Retirar los micromoldes de agarosa equilibrados de la incubadora, asegurarse de que los micromoldes estén orientados de modo que la cámara de siembra celular quede hacia arriba y retirar el medio organoide ovárico de las cámaras de siembra celular (Figura 5Aiii).
    1. Retira el medio de las cámaras de siembra celular de los micromoldes usando pinzas Graefe para levantar e inclinar los micromoldes o pipeteando. Para extraer el medio de las cámaras de siembra celular pipeteando, coloca suavemente la punta de la pipeta sobre la esquina de la cámara de siembra celular mientras extraes el medio. No hagas contacto directo con el micromolde de agarosa para evitar interrumpir los micropozos.
       NOTA: Las cámaras de siembra celular deben estar lo más secas posible, de modo que los micropozos sean visibles a simple vista, pero el exterior de los micromoldes debe estar rodeado de medios organoides ováricos (Figura 5Aiii).
11. Dispensar 75 μL de la suspensión de la célula (es decir, 2,5 × 10⁵ celdas) directamente a la cámara de siembra celular de cada micromolde de agarosa y evitar crear burbujas (Figura 5Bi). Devuelve la placa de 24 pozos a la incubadora.
12. Una o dos horas después de la siembra celular, se añaden 250 μL adicionales de medio organoide ovárico calentado alrededor del exterior de los micromoldes de agarosa, teniendo cuidado de no alterar las cámaras de siembra celular (Figura 5Bii).
    NOTA: Las células somáticas ováricas primarias deben comenzar a agregarse entre 1 y 24 horas tras la siembra en micromoldes de agarosa (Figura 5Biii).
13. Sustituye el medio que rodea los micromoldes de agarosa por 750 μL de medio organoide ovárico fresco al día siguiente de la siembra celular y, posteriormente, día sí y día sí en el cultivo.
    1. Para cambiar el medio, sujeta la placa en un ángulo leve para eliminar el medio gastado que rodea los micromoldes de agarosa. No retires el medio de las cámaras de siembra celular. Pipetea suavemente medios frescos hacia la pared del pozo para evitar alterar las cámaras de siembra celular.
       NOTA: Los medios condicionados derivados de cambios en el medio pueden guardarse y almacenarse a -80 °C para el análisis de factores secretados organoides. Una vez formados los organoides (1–3 días después de la siembra celular), los medios pueden sustituirse por medios que contengan proteínas recombinantes, inhibidores, etc., para examinar los efectos de diversos tratamientos sobre la función organoide o para el cribado de compuestos.

Figura 5: Esquema de la generación de organoides somáticos ováricos. (A) Imágenes representativas de (i) transferencia de micromoldes de agarosa a la placa de cultivo con pinzas de Graefe, (ii) equilibrio de micromoldes de agarosa en medios organoides ováricos, y (iii) retirada de medios de las cámaras de siembra celular. La flecha en Aiii indica cámara de siembra de celda vacía. (B) Imágenes representativas de (i,ii) la siembra de células en micromoldes de agarosa y (iii) un escaneo de luz transmitida de un micromolde de agarosa que contiene células somáticas ováricas agregadoras. Barra de escala (Biii): 2500 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

5. Utilización de organoides para aplicaciones posteriores

NOTA: Los organoides pueden utilizarse para una variedad de aplicaciones posteriores, incluyendo histologia, aplicaciones en biología molecular (por ejemplo, análisis de ARN/proteínas), análisis de medios condicionados y cocultivo.

1. Histología
   NOTA: Los organoides pueden procesarse para obtener puntos finales histológicos sin ser removidos de los micromoldes de agarosa. De hecho, los organoides dentro de los micromoldes de agarosa actúan de forma similar a los microarrays tisulares, permitiendo así una evaluación histológica de alto rendimiento de varios organoides espaciados de manera consistente al mismo tiempo.
   1. Disuelve un 1,5% (p/v) de agarosa estéril en PBS hirviéndola.
   2. Tras el cultivo de organoides somáticos ováricos, se mantiene la placa en ángulo y se retira el medio que rodea los micromoldes de agarosa.
   3. Bajo un microscopio disecador, retira el medio de las cámaras de siembra celular suspendiendo suavemente la punta de una pipeta sobre la esquina de cada cámara de siembra celular y extrayendo cuidadosamente el medio sin perturbar los organoides ni alterar el micromolde en sí.
   4. Con cuidado, se pipetean 100–125 μL de agarosa líquida al 1,5% enfriados hasta aproximadamente 50 °C en la esquina de cada cámara de siembra celular para llenar y sellar las cámaras, teniendo cuidado de no perturbar los organoides (Figura 6Ai).
   5. Deja que la agarosa se solidifique durante 2–3 minutos a temperatura ambiente.
   6. Añadir 750 μL de Davidson modificado o paraformaldehído al 4% a cada pozo y fijar los organoides dentro de los micromoldes de agarosa sellados durante la noche a 4 °C.
   7. Tras la fijación, retira el fijador y lava los micromoldes de agarosa con etanol al 70%.
      NOTA: Los micromoldes pueden almacenarse en un 70% de etanol a 4 °C hasta el procesamiento del tejido (deshidratación, limpieza e infiltración de cera). Durante el procesamiento de tejidos, haz un seguimiento de la orientación de los micromoldes de agarosa.
   8. Tras el procesamiento de tejidos, incrustar los micromoldes de agarosa en parafina de modo que los micromoldes queden planos dentro de los bloques de parafina y que la parte inferior de los micromoldes sea la primera en ser seccionada (Figura 6Aii).
   9. Seccionar bloqueos de parafina a 5 μm y colocar las secciones de tejido sobre portaobjetos cargados de microscopio.
      NOTA: La presencia de micropozos puede visualizarse a simple vista durante la sección tanto en secciones de tejido como en bloques de parafina (Figura 6Aiii,iv). La presencia de organoides dentro de las secciones del micromolde puede verificarse examinando las láminas seccionadas bajo un microscopio (Figura 6Av). En lugar de colocar 2–3 secciones consecutivas en la misma diapositiva, colocar 2–3 secciones separadas por 50 μm (es decir, cada décima^sección ) en una sola diapositiva aumenta la probabilidad de que la mayoría de los organoides estén representados en al menos una sección de cada diapositiva. Los organoides están espaciados de forma constante dentro de las secciones del tejido, lo que facilita la obtención de imágenes tras la tinción histológica (Figura 6Avi).
   10. Deja que las láminas se sequen en el horno a 37 °C durante la noche.
   11. Proceder con la tinción histológica o inmunohistoquímica o almacenar las láminas a temperatura^{ambiente 19}.
2. Obtención de organoides para aplicaciones moleculares
   NOTA: Tras el cultivo, los organoides pueden extraerse de los micromoldes de agarosa y procesarse para diversas aplicaciones posteriores de biología molecular, incluyendo la extracción de ARN o proteínas para evaluar la expresión génica o proteica.
   1. Sujeta la placa que contiene los micromoldes de agarosa en un ángulo ligero y retira el medio que rodea los micromoldes de agarosa pipeteando.
   2. Añade 750 μL de PBS a temperatura ambiente a los pozos que contienen los micromoldes de agarosa.
   3. Utiliza pinzas Graefe para invertir y agitar los micromoldes de agarosa y liberar los organoides en el PBS circundante. Confirma la liberación de los organoides de los micromoldes de agarosa bajo un microscopio.
   4. Retirar los micromoldes vacíos de agarosa usando pinzas Graefe y transferir el PBS que contiene los organoides a tubos de microcentrífuga mediante pipeteo.
   5. Pelletar los organoides mediante centrifugación a 10.000 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   6. Elimina el sobrenadante aspirándolo y procede a la extracción de ARN o proteínas. Alternativamente, congela rápidamente la cápsula y guárdala a -80 °^{C 19}.
3. Salvación de medios condicionados organoides para su análisis
   NOTA: Los medios condicionados de organoides pueden conservarse a lo largo del cultivo para el análisis de factores secretados por organoides, incluyendo hormonas, citocinas y factores de crecimiento. Los resultados representativos del análisis de citocinas en medios acondicionados por organoides se muestran en la Figura 7A.
   1. Sujeta la placa que contiene los micromoldes de agarosa en un ángulo leve y elimina el medio acondicionado que rodea los micromoldes pipeteando. No retires el medio de las cámaras de siembra celular para evitar molestar a los organoides.
   2. Transfiere el medio acondicionado a tubos microcentrífugas y procede al análisis del medio o congelación rápida y almacena a -80 °^{C 19,22}.
      NOTA: Opcionalmente, centrifuga el medio acondicionado a 10.000 × g durante 5 minutos para pelletar cualquier célula muerta o residuo. Transfiere el sobrenadante a nuevos tubos microcentrífugas antes del análisis o almacenamiento del medio.
4. Cocultura de organoides
   NOTA: Los organoides somáticos ováricos pueden ser co-cultivados con otras células y tejidos por varios métodos. Se muestran resultados representativos del cocultivo de organoides con células y folículos del cáncer de ovario, mediante los métodos descritos en los pasos 5.4.1 y 5.4.3, respectivamente, en Figura 7B,C.
   1. Para generar organoides utilizando una combinación de células somáticas ováricas primarias de ratón y otros tipos celulares para investigar los efectos de las interacciones celulares directas, sigue los pasos 5.4.1.1–5.4.1.4.
      1. Sigue los pasos 4.1–4.9 para lavar las células somáticas ováricas primarias tras el cultivo 2D durante la noche, extraer las células del cultivo 2D usando tripsina al 0,05%, pellet, conteo y resuspender las células en medio organoide ovárico a una densidad de 2,5 ×^{10 5} células vivas por 75 μL de medio.
      2. Si el otro tipo celular de interés es adherente, extrae las células de un cultivo 2D. Contar las células, aplicar pellets mediante centrifugación y resuspender en medios organoides ováricos a una densidad de 2,5 × 10,5 células vivas por 75 μL de medio.
      3. Combinar la suspensión de las células somáticas ováricas primarias con la suspensión del otro tipo celular de interés en una proporción conocida.
      4. Seguir los pasos 4.10–4.13 para sembrar la suspensión celular resultante en micromoldes de agarosa y cultivar organoides.
   2. Para transferir micromoldes de agarosa que contienen organoides formados a placas de 24 pozos que contienen otras células u organoides, sigue los pasos 5.4.2.1–5.4.2.2.4.
      NOTA: Para evaluar los efectos de los factores secretados derivados de organoides sobre otros tipos celulares y viceversa, los organoides formados pueden permanecer dentro de los micromoldes de agarosa, y micromoldes completos de agarosa pueden transferirse a una placa de 24 pozos que contenga otras células u organoides. Estos métodos de cocultivo pueden utilizarse cuando se pueden emplear medios organoides ováricos para cultivar ambos tipos celulares o tisulares.
      1. Medio organoide ovárico caliente a 37 °C en un baño marea.
      2. Sujeta la placa que contiene los micromoldes de agarosa en ángulo y retira el medio que rodea los micromoldes de agarosa pipeteando.
      3. Utilizando pinzas Graefe, transfiere cuidadosamente los micromoldes a placas de 24 pocillos que contienen otras células u organoides.
      4. Añade 750 μL de medio organoide ovárico fresco para rodear los micromoldes de agarosa.
   3. Para extraer organoides formados de los micromoldes de agarosa y transferirlos a nuevos micromoldes de agarosa, sigue los pasos 5.4.3.1–5.4.3.3.13.
      NOTA: Si los medios organoides ováricos no son los deseados para experimentos de co-cultivo, el paradigma descrito en el paso 5.4.2 plantea el desafío de una transferencia significativa de medios, dado que los micromoldes de agarosa están saturados con medios organoides ováricos. Los organoides formados (1-3 días después de la siembra inicial de las células) pueden moverse de sus micromoldes de agarosa y transferirse a nuevos micromoldes de agarosa para cultivo adicional o cocultivo con el fin de evitar el traslado del medio.
      1. Calienta el medio deseado para la co-cultura a 37 °C en un baño marea.
         NOTA: Los medios basados en DMEM, αMEM y F12 se han utilizado con éxito en experimentos de cocultivo con organoides somáticos ováricos.
      2. Utilizando pinzas Graefe, transfiere cuidadosamente los nuevos micromoldes de agarosa de PBS +1% PS a pozos de una placa de 24 pozos que contiene otras células u organoides para cocultivo.
      3. Asegúrate de que los micromoldes estén completamente sumergidos en el medio, añade el medio adicional deseado para la co-cultura según sea necesario y equilibra los micromoldes y el medio durante al menos 30 minutos en una incubadora (ambiente humidificado, 37 °C con 5% de_CO2).
      4. Sujeta la placa que contiene los micromoldes de agarosa con organoides formados en un ángulo ligero y elimina el medio que rodea los micromoldes de agarosa pipeteando.
      5. Añade el medio deseado para la co-cultura que rodea los micromoldes de agarosa con los organoides formados.
      6. Utiliza pinzas Graefe para invertir y agitar los micromoldes de agarosa y liberar los organoides en el medio circundante. Confirma la liberación de organoides de los micromoldes de agarosa bajo un microscopio.
         NOTA: Si las células somáticas ováricas primarias no se han agregado adecuadamente, los organoides pueden no permanecer intactos al extraerse de los micromoldes de agarosa. El ensamblaje de organoides puede tardar entre 1 y 3 días, dependiendo de la cepa y edad de los ratones de los que se aislaron las células somáticas ováricas.
      7. Retirar los micromoldes vacíos de agarosa usando pinzas Graefe y transferir el medio que contiene los organoides a tubos de microcentrífuga mediante pipeteo.
      8. Centrifuga los organoides a 300 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      9. Bajo un microscopio disecante, se elimina el sobrenadante pipeteando, dejando entre 50 y 75 μL de medios que contienen los organoides.
      10. Retira los micromoldes equilibrados de la incubadora y asegúrate de que estén orientados de forma que la cámara de siembra de células quede hacia arriba.
      11. Retira el medio de las cámaras de siembra celular usando pinzas Graefe o pipeteando.
          NOTA: Los pozos no deben contener más de 500 μL de medios para que las cámaras de siembra celular de los micromoldes puedan vaciarse.
      12. Transfiere los organoides directamente a la cámara de siembra celular de cada nuevo micromolde de agarosa mediante pipeteo. Devuelve la placa de 24 pozos a la incubadora.
      13. Después de 1–2 horas, añade 250 μL adicionales del medio deseado alrededor del exterior de los micromoldes de agarosa, teniendo cuidado de no perturbar las cámaras de siembra celular.

Figura 6: Los principales tipos celulares ováricos se conservan en organoides somáticos ováricos. (A) Imágenes representativas de (i) sellar un micromolde con agarosa al final del cultivo, (ii) un micromolde sin cortar y (iii) un micromolde seccionado incrustado en un bloque de parafina. Los micropozos pueden visualizarse en secciones montadas (iv), y la presencia de organoides dentro de micromoldes seccionados puede (v) confirmarse bajo un microscopio antes de la tinción histológica (vi). (B) Imágenes representativas de secciones de tejido ovárico de ratón y secciones organoides somáticas ováricas tras tinción inmunohistoquímica usando anticuerpos contra Vimentina, F4/80, Foxl2 y 3β-HSD. Barras de escama = 20 μm. Abreviaturas: H&E = hematoxilina y eosina. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Dipali et ^al.19. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Co-cultivo de organoides somáticos ováricos con folículos y células de cáncer de ovario. (A) La secreción de citocinas organoides se midió por micromolde de agarosa al día 5 de cultivo y se normalizó a medios condicionados de micromoldes de agarosa sin organoides. N = 4 micromoldes de agarosa. (B) Imágenes representativas de luz transmitida de folículos ováricos en los días 0, 4 y 8 de cultivo con o sin organoides (control) y (i) un esquema del paradigma de co-cultivo. Barras de escala = 400 μm. Cuantificación de (ii) supervivencia folicular y (iii) crecimiento durante 8 días de cultivo con o sin organoides (control). Los datos se muestran como media ± SD. Algunas barras de error son demasiado pequeñas para visualizarse. N = 56 folículos por grupo. **P < 0,01. (C) Imágenes representativas de luz transmitida (arriba) y fluorescentes (abajo) de células somáticas ováricas primarias cultivadas en una proporción 10:1 con células de cáncer de ovario marcadas con proteínas fluorescentes rojas (OVCAR8-RFP) en organoides a los días 1, 3 y 5 de cultivo. Barras de escala = 400 μm. Abreviatura: RFP = proteína fluorescente roja. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

6. Consejos para solucionar problemas

1. Problema 1: El número de células somáticas ovárricas primarias aisladas es menor de lo previsto.
   NOTA: Si los fragmentos de tejido ovárico son consistentemente menores de 1 mm o no son visibles a simple vista tras la digestión enzimática, el número de células aisladas puede ser bajo debido a la disminución de la viabilidad por exceso de digestión. Si los fragmentos de tejido ovárico superan 1 mm tras la digestión enzimática, el número de células aisladas puede ser bajo debido a una digestión insuficiente del tejido ovárico.
   1. Si los fragmentos de tejido ovárico son mayores de 1 mm tras la digestión enzimática, sigue los pasos 6.1.1.1–6.1.1.2.
      1. Confirma que la colagenasa IV y la DNasa I están dentro de su vida útil recomendada y que no han perdido actividad enzimática debido a un almacenamiento inadecuado o, en el caso de la DNasa I, ciclos repetidos de congelación-descongelación.
      2. Aumentar la cantidad de pipeteo repetido del tejido ovárico, disminuir el tamaño del orificio de la punta p1000 si fue cortada para ensanchar la abertura y/o aumentar el tiempo de incubación en EM.
   2. Si los fragmentos de tejido ovárico son consistentemente mucho más pequeños que 1 mm tras la digestión enzimática, disminuye la cantidad de pipeteo repetido del tejido ovárico, aumenta el tamaño del orificio de la punta p1000 cortando para ensanchar la abertura y/o disminuye la incubación total en EM.
2. Problema 2: Más del ~25% de los micromoldes de agarosa fundidos tienen defectos
   1. Confirma que el molde de silicona está libre de agarosa residual ni restos. Si es necesario, lava los moldes de silicona en PBS y vuelve a esterilizar mediante autoclav. Si es necesario, recalienta la agarosa al 1% usada para la fundición, ya que la agarosa que se solidifica puede no llenar uniformemente la fundición de silicona y/o resultar en burbujas.
   2. Una vez pipeteada en el molde de silicona, dejar que la agarosa solidifique completamente, ya que la retirada prematura del micromolde de agarosa puede provocar micropozos alterados.
   3. Confirma que los moldes de silicona no estén insuficientes, ya que esto puede reducir la integridad estructural del micromolde de agarosa, lo que puede causar daños cuando la silicona se flexiona para eliminar el micromolde de agarosa.
   4. Además, el fabricante de los moldes de silicona recomienda que se autoclave no más de 12 veces. Si el molde de silicona ha sufrido una esterilización excesiva, cámbiala.
3. Problema 3: Los organoides no se forman en más del 10% de los micropozos
   1. Confirma que los moldes de silicona no están sobrellenos al fundir los micromoldes de agarosa, ya que esto puede provocar una distribución irregular de las células en los micropozos, favoreciendo los micropozos centrales del micromolde de agarosa frente a los micropozos exteriores.
   2. Evita crear burbujas al dispensar la suspensión celular en la cámara de siembra celular de los micromoldes de agarosa, ya que las burbujas pueden alterar la distribución de las células en los micropozos.
   3. Si es necesario, comienza con una suspensión de celda superior a 75 μL (a una densidad de 3,33 × 10⁶ celdas vivas por 1 mL) por micromolde para asegurarse de que no se generen burbujas debido a volumen insuficiente en la punta de la pipeta.
   4. Aumentar el intervalo entre la siembra celular y la adición de medio organoide ovárico en el exterior del micromolde de agarosa para asegurar tiempo suficiente para que las células se asienten en los micropozos.

Resultados

Para determinar la composición celular de los organoides somáticos ováricos, realizamos inmunohistoquímica de secciones de tejido organoide tras 6 días de cultivo utilizando anticuerpos contra los principales tipos de células ováricas. Los organoides contenían fibroblastos vimentin-positivos, macrófagos F4/80-positivos, así como poblaciones celulares esteroidogénicas (Figura 6B)¹⁹. Utilizamos un anticuerpo contra Foxl2 para marcar las...

Discusión

Este artículo describe métodos para aislar células somáticas ováricas primarias de ratón a partir de una fracción del ovario enriquecida con estroma, de manera que mantenga la heterogeneidad del compartimento somático ovárico. Las células somáticas ováricas primarias de ratón pueden cultivarse en una monocapa 2D o pueden utilizarse para generar organoides somáticos ováricos utilizando micromoldes de agarosa libres de andamio. Los micromoldes de agarosa contienen 96 micropozos para la for...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.2 μm, Polyethersulfone syringe filter	Corning	431229
1.5 mL microcentrifuge tubes	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL glass beaker	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petri dishes	Corning	351029
15 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	339651
24-well plates (TC-treated)	Corning	353047
28-gauge insulin needles	Exel International	26027
35 mm Petri dishes	Corning	351008
3β-HSD antibody	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm cell strainer	Corning	431750
45 mm watch glass	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL concial tubes	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile syringe	Air-Tite	ML60
60 mm TC-treated plates	Corning	353037
6-well plates (TC-treated)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
Autoclave sterilization pouch	Fisherbrand	01-812-55
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Bluing reagent	Fisherbrand	23-245681
Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Class II biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Collagenase, Type IV, powder	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissecting microscissors	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissecting scissors	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissection microscope	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 antibody	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fine-tipped dissecting forceps	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 antibody	Abcam	ab246511	1:200
Graefe Forceps	Fine Science Tools	1105010
Hematoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocytometer	MedOne	DHCN015
Imaging System	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
Laminar flow hood	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Microscope slides	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
Modified Davidson's Fixative	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP cells			Gift from Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Red staining solution	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tabletop centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin antibody	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides	Gibco, Fisher Scientific	32561102