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Artículo de investigación

NEAT1-Mediada Disfunción de la Barrera Intestinal Mediante la Unión a miR-29b-3p en Células Caco-2 Dañadas por Lipopolisacárido

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DOI:

10.3791/71021

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14 de agosto de 2026

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1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio evaluó NEAT1 como marcador diagnóstico y regulador de la disfunción de la barrera intestinal en el síndrome del intestino irritable con predominio de diarrea. NEAT1 se encontró elevado en el suero de los pacientes, se unió a miR-29b-3p y su silenciamiento mejoró los parámetros de barrera, apoptosis e inflamación en células Caco-2 dañadas por lipopolisacárido.

Resumen

La patogénesis del síndrome del intestino irritable con diarrea (SII-D) no está clara, y las terapias disponibles siguen siendo limitadas. Este estudio evaluó el valor diagnóstico de NEAT1 en el SII-D y exploró su posible mecanismo regulador. Se incluyeron un total de 116 pacientes con SII-D y 116 controles sanos. Los niveles séricos de NEAT1 y miR-29b-3p se detectaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa (RT-qPCR), y se utilizaron curvas de característica operativa del receptor (ROC) para evaluar el valor diagnóstico. Para los estudios mecanicistas, se estableció un modelo de células epiteliales intestinales Caco-2 tratadas con lipopolisacárido (LPS). La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo con el kit de recuento de células 8 (CCK-8), la apoptosis mediante citometría de flujo, la integridad de la barrera mediante la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y los niveles de ARNm de ZO-1, ocludina y claudina-2 mediante RT-qPCR. Los ensayos de luciferasa dual (DLR) y de inmunoprecipitación de ARN (RIP) se utilizaron para verificar la relación de unión entre NEAT1 y miR-29b-3p. NEAT1 se expresó altamente y miR-29b-3p se expresó débilmente en pacientes con SII-D, y sus niveles mostraron una fuerte correlación negativa. La inhibición de NEAT1 aumentó los niveles de miR-29b-3p, mejoró la viabilidad celular y la TEER, redujo la apoptosis, incrementó los niveles de ARNm de ZO-1 y ocludina, disminuyó los niveles de ARNm de claudina-2 y alivió los indicadores asociados a la lesión de la barrera en células Caco-2 tratadas con LPS. En conjunto, estos resultados indican que NEAT1 sérico es un biomarcador candidato para el SII-D y que el eje NEAT1/miR-29b-3p podría estar implicado en la disfunción de la barrera intestinal.

Introducción

El síndrome del intestino irritable con diarrea (IBS-D) es un trastorno gastrointestinal funcional común caracterizado por dolor abdominal, distensión abdominal y hábitos intestinales alterados1. En la actualidad, el mecanismo fisiopatológico del IBS-D no se ha elucidado completamente2. Los métodos de tratamiento consisten principalmente en alivio sintomático, con eficacia limitada y una alta tasa de recurrencia3. Se considera generalmente que el IBS-D implica la interacción de múltiples factores, como la desregulación del eje cerebro-intestino, la hipersensibilidad visceral, la inflamación intestinal de bajo grado y la disfunción de la barrera4,5. Aunque estos criterios han estandarizado hasta cierto punto el diagnóstico, son subjetivos y pueden provocar retrasos en el diagnóstico o clasificaciones erróneas, especialmente cuando los síntomas del paciente se superponen con los de la enfermedad inflamatoria intestinal u otras enfermedades orgánicas. En la práctica clínica habitual, actualmente no existen biomarcadores objetivos validados para el IBS-D. Por lo tanto, explorar un nuevo objetivo molecular que pueda servir como herramienta diagnóstica y que tenga valor terapéutico potencial se ha convertido en una necesidad urgente en el campo actual de la investigación del IBS-D.

En los últimos años, los ARN no codificantes largos, como moléculas clave en la regulación epigenética, han demostrado un gran potencial como marcadores diagnósticos y objetivos terapéuticos en diversas enfermedades6,7. La causa principal del SII-D es el deterioro de la función de la barrera intestinal8. La destrucción de las proteínas de las uniones estrechas conduce a "fuga intestinal", lo que a su vez activa la respuesta inmune de la mucosa9,10. La activación del sistema inmunitario libera numerosos factores proinflamatorios que pueden causar disfunción intestinal al activar el sistema inmuno-nervioso intestinal. Estudios han indicado que algunos lncARN pueden regular la barrera epitelial intestinal11,12. Se ha informado que NEAT1 está sobreexpresado en el tejido de la mucosa colónica de pacientes con colitis13. La inhibición del lncARN NEAT1 puede aliviar la disfunción en las células epiteliales intestinales (IEC) en la colitis ulcerosa14. Sin embargo, el perfil de expresión de NEAT1 en el SII-D y su valor diagnóstico aún no han sido investigados. Además, NEAT1 podría tener potencial como biomarcador diagnóstico15. Si NEAT1 se expresa anormalmente en el suero de pacientes con SII-D, esto podría complementar los actuales criterios Roma IV al proporcionar una herramienta diagnóstica molecular. Mientras tanto, el perfil de expresión de miARN también ha cambiado significativamente en pacientes con SII. Por ejemplo, se ha asociado la disminución de la expresión de miR-29b-3p con la patogénesis del SII16. Sin embargo, los mecanismos reguladores upstream que controlan la expresión de miR-29b-3p en el SII-D permanecen completamente inexplorados. En particular, el papel de NEAT1 como ARN endógeno competitivo (ceARN) de miR-29b-3p en el contexto del SII-D nunca ha sido investigado, aunque este mecanismo está bien establecido en otras enfermedades17,18. Además, aunque estudios previos se han centrado principalmente en la expresión a nivel tisular, el potencial de NEAT1 circulante como biomarcador sérico no invasivo para el diagnóstico del SII-D sigue siendo completamente desconocido.

Planteamos la hipótesis de que el lncRNA-NEAT1 podría participar en la regulación de la función de la barrera intestinal en el SII-D al actuar como una ceRNA que atrapa al miR-29b-3p. Con base en el antecedente de investigación anterior, este estudio tiene como objetivos: (1) evaluar los niveles de NEAT1 y miR-29b-3p en el suero de pacientes con SII-D y su valor diagnóstico; (2) validar la interacción directa de unión entre NEAT1 y miR-29b-3p; y (3) esclarecer el papel funcional del eje NEAT1/miR-29b-3p en la regulación de la integridad de la barrera intestinal y la inflamación, mediante un modelo de células Caco-2 tratadas con LPS.

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Protocolo

Inclusión de pacientes

Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito tras comprender completamente el contenido de la investigación. El Comité de Ética del Hospital Popular de la Nueva Área de Pudong, Shanghái, ha revisado y aprobado este protocolo de investigación (n.º 2024k007). El tamaño de la muestra se calculó mediante G*Power: la prueba seleccionada fue una prueba t, y el análisis estadístico se diseñó para detectar diferencias entre dos muestras independientes. Con un tamaño del efecto d = 0,5, α = 0,05 y una potencia = 0,9, el cálculo indicó que se debía incluir un mínimo de 86 sujetos en cada grupo. Para tener en cuenta posibles circunstancias imprevistas durante el ensayo, se incluyeron 116 pacientes en cada grupo. En este estudio se incluyó un total de 116 pacientes con SII-D que acudieron al Hospital Popular de la Nueva Área de Pudong, Shanghái, entre julio de 2024 y julio de 2025, formando el grupo experimental. Los criterios de inclusión fueron: (1) SII-D que cumplieran los criterios diagnósticos de Roma IV; (2) colonoscopia que indicara ausencia de lesiones orgánicas en la mucosa. Criterios de exclusión: (1) pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), cáncer colorrectal, etc.; (2) pacientes diabéticos; (3) pacientes con antecedentes recientes de cirugía abdominal; y (4) pacientes con insuficiencia grave cardíaca, hepática o renal. Mientras tanto, se reclutaron 116 voluntarios sanos que coincidían con las características demográficas de los pacientes, como edad y sexo, para formar el grupo control. Se confirmó que los controles sanos no tenían antecedentes de enfermedades gastrointestinales crónicas ni síntomas clínicos correspondientes. A todos los sujetos se les extrajeron cinco mililitros de sangre venosa periférica. Luego, el sobrenadante se transfirió a un congelador de ultra baja temperatura a -80 °C para su criopreservación antes de la posterior extracción de ARN.

Cada participante completó un cuestionario de 10 días para registrar las siguientes manifestaciones clínicas: (a) evaluación de la intensidad del dolor abdominal mediante una escala visual analógica de 10 puntos; (b) frecuencia del dolor abdominal durante el período de la encuesta (número de días con dolor); (c) frecuencia de movimientos intestinales (número máximo de movimientos intestinales por día); (d) escala de características fecales de Bristol para evaluar las características de las heces. El estado emocional de los sujetos se evaluó mediante la escala de ansiedad y depresión hospitalaria (HADS).

Cultivo celular y modelado

Las células Caco-2 se cultivaron rutinariamente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 1 % de penicilina-estreptomicina, en un incubador a 37 °C y 5 % de CO₂. La línea celular Caco-2 se diferencia espontáneamente en una monocapa polarizada de células con uniones estrechas y microvellosidades, mostrando características morfológicas y funcionales similares a las de las células epiteliales intestinales maduras. El LPS desencadena una respuesta inflamatoria y altera las uniones estrechas en el epitelio intestinal, aumentando la permeabilidad intestinal, un proceso muy similar a las características patológicas del SII-D. Además, dado que las células Caco-2 tratadas con LPS se han utilizado ampliamente en estudios previos19,20,21 para modelar la disfunción de la barrera y la inflamación relacionadas con el SII, en este estudio se seleccionó el tratamiento con lipopolisacárido (LPS) de células Caco-2 para establecer un modelo in vitro de SII-D. Una vez que las células alcanzaron aproximadamente un 80 % de confluencia, el medio de cultivo se reemplazó por medio completo que contenía 5 µg/ml de LPS22, y las células se estimularon durante 24 h. Las células cultivadas convencionalmente sin LPS se utilizaron como grupo control.

Transfección celular

Para investigar los papeles de NEAT1 y miR-29b-3p en células Caco-2, se realizaron transfecciones en células Caco-2. Las células se dividieron en seis grupos de la siguiente manera: 1. grupo control (sin tratamiento); 2. grupo LPS; 3. grupo LPS + si-NC; 4. grupo LPS + si-NEAT1; 5. grupo LPS + si-NEAT1 + inhibidor NC; y 6. grupo LPS + si-NEAT1 + inhibidor de miR-29b-3p. Se diseñaron y sintetizaron dos ARN de interferencia pequeños (si-NEAT1) dirigidos contra NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) y si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Se utilizó un ARN de interferencia de secuencia aleatoria no dirigida (si-NC) como control negativo. Al mismo tiempo, también se sintetizaron el inhibidor de miR-29b-3p y su control negativo. Inhibidor de miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Control negativo: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Las células Caco-2 se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron una vez que los cultivos alcanzaron una confluencia del 60–70 %, siguiendo el protocolo del fabricante. Breve­mente, 1,25 µL de siRNA se diluyeron en 25 µL de medio con suero reducido para obtener una concentración final de siRNA de 50 nM. Para la inhibición de miARN, 2 µL del inhibidor de miR-29b-3p o su control negativo se diluyeron en 25 µL de medio con suero reducido hasta una concentración final de 100 nM. Por separado, 1,5 µL del reactivo de transfección se mezclaron con 25 µL de medio con suero reducido. La solución de siRNA diluido (o del inhibidor/control negativo) se mezcló entonces con el reactivo de transfección diluido para formar el complejo de transfección, el cual se añadió gota a gota a las células. Seis horas después de la transfección, la mezcla de transfección se sustituyó por medio completo fresco, y las células se mantuvieron durante otras 48 h antes de realizar los ensayos funcionales posteriores. La eficiencia de silenciamiento o inhibición se confirmó mediante RT-qPCR antes de experimentos adicionales.

PCR cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa (RT-qPCR)

Se aisló ARN total de muestras de suero y de células Caco-2 sometidas a los tratamientos indicados. Breve­mente, cada muestra se lisó con 1 mL de reactivo de extracción de ARN y se combinó con 200 µL de cloroformo. Tras la centrifugación a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C, la fase acuosa superior se transfirió a un tubo nuevo, se mezcló con 500 µL de isopropanol y se mantuvo a −20 °C durante 30 min. A continuación, las muestras se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. El pellet de ARN resultante se lavó dos veces con etanol al 75%, se secó al aire y se resuspendió en 20 µL de agua libre de ARNasas. El rendimiento y la pureza del ARN se midieron con un microespectrofotómetro, y solo se utilizaron muestras con A260/A280 valores de 1,8 a 2,0 se utilizaron. El ARN se transcribió inversamente a ADNc siguiendo el protocolo del fabricante. Para la detección de NEAT1, ZO-1, ocludina, claudina-2, y GAPDH, se utilizó 1 µg de ARN total para cada reacción de retrotranscripción de 20 µL, que contenía tampón RT 1×, dNTPs 0,5 mM, cebador oligo(dT) 0,5 µM, 200 U de retrotranscriptasa y agua libre de RNasas. La reacción se llevó a cabo a 37 °C durante 15 min, seguida de la inactivación enzimática a 85 °C durante 5 s.

Se realizó una PCR cuantitativa con ADNc como molde utilizando un sistema de PCR en tiempo real basado en SYBR Green. NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludina, y Los niveles de expresión de claudina-2 se midieron con cebadores específicos para el gen. U6 sirvió como gen de referencia para miR-29b-3p, mientras que GAPDH se utilizó para normalizar NEAT1 y genes relacionados con las uniones estrechas. La expresión relativa se calculó utilizando el método 2−ΔΔCt. Las secuencias de los cebadores se enumeran en Tabla 1.

Ensayo de viabilidad celular

Se sembraron células Caco-2 en fase logarítmica en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 104 células por pocillo. Se establecieron un grupo control en blanco (que contenía solo medio de cultivo), un grupo control (células no tratadas) y un grupo experimental (células Caco-2 bajo diferentes condiciones de tratamiento), con 5–6 pocillos duplicados en cada grupo. Las células se asignaron a cuatro puntos temporales: 0, 24, 48 y 72 h. Se preparó una placa de cultivo independiente para cada punto temporal con el fin de evitar abrir repetidamente el incubador durante las mediciones. Tras el período de cultivo, se añadieron 10 µL de solución CCK-8 a cada pocillo, evitando la formación de burbujas. Posteriormente, la placa de cultivo se devolvió a un incubador a 37 °C con 5 % de CO₂ y se incubó en la oscuridad durante 2 h. La absorbancia de cada pocillo se midió inmediatamente a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Finalmente, la viabilidad celular se expresó como un porcentaje.

Ensayo de apoptosis celular

La apoptosis se cuantificó mediante citometría de flujo tras la tinción con V-FITC de anexina/PI. Las células Caco-2 de cada grupo de tratamiento se recolectaron y se lavaron dos veces con PBS frío. La centrifugación se realizó a 300 × g durante 5 min a 4 °C. El sedimento celular se resuspendió entonces en 100 µL de tampón de enlace 1×, seguido de la adición secuencial de 5 µL de anexina V-FITC y 5 µL de PI. Tras una mezcla suave, las muestras se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, se añadieron 300 µL de tampón de enlace 1×, y la suspensión se mezcló cuidadosamente antes de transferirla a un tubo de citometría de flujo de 5 mL. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo dentro de la primera hora.

Resistencia eléctrica transepitelial (TEER)

La permeabilidad se evaluó midiendo los valores de resistencia transepitelial (TEER) de células Caco-223. Las células Caco-2 se inocularon en cámaras Transwell y se cultivaron durante 21 días para formar una monocapa densa. Se realizaron seis réplicas biológicas independientes para cada condición experimental, así como cinco réplicas técnicas en cada condición. Antes y después del tratamiento experimental, se midieron los valores de TEER de cada grupo mediante un medidor de resistencia transepitelial, utilizando electrodos esterilizados con etanol y equilibrados con PBS. En resumen, la varilla larga del electrodo se sumergió en el medio de cultivo basolateral y la varilla corta en el medio de cultivo apical, evitando el contacto con la membrana de filtro. Tras la estabilización, se registró el valor de resistencia (Ω), y las mediciones se repitieron hasta obtener tres lecturas consistentes. La resistencia de los filtros Transwell en blanco (sin células) se midió en las mismas condiciones, y este valor se restó de todas las lecturas experimentales. TEER (Ω·cm2) = (resistencia de la muestra – resistencia del blanco) × área efectiva de la membrana. Los datos se presentan como: (grupo experimental/grupo control) × 100 %.

Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)

Se recogieron los sobrenadantes de células Caco-2 de diferentes grupos de tratamiento tras 24 h de cultivo. Los niveles de citocinas proinflamatorias, incluyendo el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β), se midieron utilizando reactivos comerciales de ELISA según las instrucciones del fabricante. El ensayo se realizó estrictamente de acuerdo con las instrucciones. Las muestras y los patrones se añadieron a los pocillos previamente recubiertos con anticuerpos, luego se incubaron y se lavaron. A continuación, se añadió el anticuerpo de detección biotinilado. Tras otra incubación y lavado, se añadió la estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante. Finalmente, se añadió el sustrato TMB para el desarrollo del color, y la reacción se detuvo con la solución de parada. La absorbancia de cada pocillo se midió inmediatamente a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Transferencia Western

Las proteínas se aislaron de células Caco-2 tras los tratamientos indicados utilizando tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasas. Los niveles de proteína se midieron mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Para cada muestra, se cargaron 30 µg de proteína por pozo, se separaron en geles de SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % durante 1 h a temperatura ambiente y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos contra ZO-1 (1:1.000), ocludina (1:500), claudina-2 (1:1.000) y GAPDH (1:5.000). Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) y la intensidad de las bandas se analizó utilizando ImageJ. GAPDH sirvió como control de carga.

Ensayo de luciferasa dual (DLR)

Los sitios potenciales de unión de miR-29b-3p a la secuencia de NEAT1 se predijeron mediante la base de datos ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Posteriormente, fragmentos de NEAT1 que contenían sitios de unión tipo silvestre (WT) o mutantes (MUT) se clonaron en el vector reportero pmirGLO. El plásmido recombinante construido se transfirió por co-transfección a las células junto con análogos de miR-29b-3p (Sentido: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisentido: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) o inhibidores y sus respectivos controles negativos (mimic NC, Sentido: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisentido: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recolectaron las células y se determinaron las actividades de luciferasa de luciérnaga y luciferasa de renilla utilizando un reactivo de detección de doble luciferasa. La actividad de la luciferasa de renilla se utilizó como referencia interna para la normalización.

Ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP)

Para el ensayo de inmunoprecipitación de ribonucleoproteínas (RIP), se recolectaron células Caco-2, se lavaron con PBS e incubaron en hielo durante 15 min en 200 µL de tampón de lisis RIP suplementado con inhibidores de proteasas y RNasas. Los lisados celulares se centrifugaron a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C, y se reservaron 10 µL de cada sobrenadante como control de entrada. Para la inmunoprecipitación, se rotaron 40 µL de perlas magnéticas A/G-Proteína con 5 µg de anticuerpo anti-Ago2 o IgG normal en 200 µL de tampón de lavado RIP durante 30 min a temperatura ambiente. Tras tres lavados con 500 µL de tampón de lavado RIP, se combinaron 100 µL de la suspensión de perlas con 100 µL de lisado, se ajustó el volumen final a 1 mL con tampón de lavado RIP y se incubó durante la noche a 4 °C con rotación. Las perlas se lavaron luego cinco veces con 500 µL de tampón de lavado RIP y se resuspendieron en 150 µL del mismo tampón. La digestión proteica se realizó añadiendo 15 µL de proteinasa K (20 mg/mL) y 15 µL de SDS al 10%, seguido de incubación a 55 °C durante 30 min con agitación. Se recolectó el sobrenadante y el ARN se aisló con el reactivo de extracción y precipitó durante la noche. Posteriormente, se evaluó el enriquecimiento de NEAT1 y miR-29b-3p mediante RT-qPCR.

Análisis de localización subcelular

Las células Caco-2 se separaron en fracciones nucleares y citoplasmáticas utilizando el reactivo comercial disponible para separación núcleo-citoplasma citado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se extrajo ARN total de estos dos componentes, y se detectó la distribución de NEAT1 en el núcleo y el citoplasma mediante RT-qPCR. La calibración se realizó utilizando U6 (predominantemente nuclear) y el ARNm de GAPDH (predominantemente citoplasmático) como indicadores de la eficiencia de separación.

Análisis estadístico

Para muestras clínicas de suero, un análisis de potencia (t-prueba, d = 0,5, α = 0,05, potencia = 0,9) indicó que se requería un mínimo de 86 sujetos por grupo. Para tener en cuenta posibles circunstancias imprevistas durante el ensayo, se incluyeron 116 pacientes en cada grupo con el fin de detectar diferencias clínicamente significativas. La normalidad de los datos para las variables continuas se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Dado que todos los datos continuos presentaban distribución normal (P > 0,05), se aplicaron análisis paramétricos. Las variables categóricas se analizaron utilizando la prueba de chi-cuadrado. Los experimentos con células incluyeron seis réplicas biológicas independientes, con cinco réplicas técnicas para cada réplica biológica. Los datos se presentan como media ± DE. Las comparaciones entre dos grupos de variables continuas se realizaron mediante la prueba t de Student, mientras que las comparaciones entre múltiples grupos se analizaron mediante ANOVA de un factor seguido de la prueba post hoc de Tukey. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05.

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Resultados

Expresión de NEAT1 y valor diagnóstico

En comparación con el grupo de control sano (HC), los niveles de expresión de NEAT1 en pacientes con IBS-D fueron significativamente más altos (P < 0,0001; Figura 1A). El área bajo la curva (AUC) de NEAT1, según se muestra en la curva de característica operativa del receptor (ROC), fue de 0,867 (IC del 95 %: 0,821–0,913). Su especificidad fue del 75,9 %, mientras que su ...

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Discusión

El SII-D es un trastorno gastrointestinal funcional común. Su mecanismo patológico no se ha elucidado completamente. En los últimos años, los ARN largos no codificantes (lncRNA), como moléculas clave en la regulación epigenética, han mostrado un gran potencial en el campo del diagnóstico y tratamiento de enfermedades. El lncRNA NEAT1 ha sido estudiado en diversas enfermedades, como el cáncer colorrectal24, el glioma25 y el infarto de miocardio26

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de 24 pocillosCorningCLS3524Para sembrar células
Placas de 96 pocillosCorningCLS3599Para sembrar células en ensayos CCK-8
Kit de apoptosis Annexina V-FITC/PIInvitrogenV13242Para detectar tasas de apoptosis
Anticuerpo monoclonal anti-AGO2Proteintech67934-1-IgPara inmunoprecipitación de complejos de ARN unidos a Ago2
Anticuerpo anti-Claudina-2Invitrogen32-5600Anticuerpo primario, dilución 1:1000
Anticuerpo anti-GAPDHCell Signaling Technology5174Anticuerpo primario, dilución 1:5000; control de carga
Anticuerpo anti-IgG humanoProteintech10284-1-APUtilizado como control negativo para el ensayo de RIP
Anticuerpo anti-OcludinaAbcamab31721Anticuerpo primario, dilución 1:500
Anticuerpo anti-ZO-1Proteintech21773-1-APAnticuerpo primario, dilución 1:1000
Células Caco-2SUNNCELLSNL-068Para construir modelos de barrera epitelial intestinal
Kit CCK-8SolarbioCA1210Kit de ensayo de proliferación celular
CloroformoSigma-AldrichC2432Para separación de fases en la extracción de ARN
Medio DMEMGibco11965092Para cultivo celular
Kit de ensayo de luciferasa dualThermoFisher16186Para detectar la actividad de luciferasa
Kit ELISA (para IL-1β)R&D SystemsDY201Para detectar proteínas diana en sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para IL-6)R&D SystemsD6050BPara detectar proteínas diana en sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para IL-8)R&D SystemsNBP3-28022Para detectar proteínas diana en sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para TNF-α)R&D SystemsDTA00DPara detectar proteínas diana en sobrenadantes de cultivo celular
Sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL)Thermo Fisher32106Para visualizar bandas proteicas
Etileno (75%)Sigma-Aldrich459844Para lavar el pellet de ARN
Suero bovino fetal (FBS)Gibco10099141Para cultivo celular
Citómetro de flujoBeckman CoulterB53002Para detectar tasas de apoptosis
Anticuerpos secundarios conjugados con HRPCell Signaling Technology7074Catalizan la generación de una señal quimioluminiscente a partir de sustratos ECL
IsopropanolSigma-Aldrich1133502500Para precipitación de ARN
Lipofectamina 3000ThermoFisherL3000015Reactivo de transfección
Lipopolisacárido (LPS)Sigma-AldrichL2880Para inducir la construcción del modelo celular
Lector de microplacasBioTekEpoch 2Para detectar la absorbancia de muestras en placas de 96 pocillos
Micropespectrofotómetro NanodropThermo ScientificND-2000CPara determinar la concentración y pureza del ARN
Leche descremada en polvoCoolaberCN7861Para bloquear membranas (solución al 5%)
Kit PARISThermo FisherAM1921Para fraccionamiento nuclear-citoplasmático
Penicilina–EstreptomicinaGibco15140122Para resistencia al crecimiento celular frente a contaminación
Kit de ensayo de proteína BCA PierceThermo Fisher23225Para determinar concentraciones de proteína
Vector pmirGLO de luciferasa dualPromegaE1330Vector de gen reportero de luciferasa dual
Kit de reactivos PrimeScript RTTakaraRR047APara transcripción inversa de ARN a ADNc
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Para transferencia proteica tras SDS-PAGE
Instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real con fluorescenciaApplied Biosystems4365464Para detectar genes diana
Tampón de lisis RIPA (con inhibidores de proteasas)Thermo Fisher89901Para extracción de proteína total de células
Kit de inmunoprecipitación de proteínas que se unen al ARNSigma-Aldrich17-701Ensayo de inmunoprecipitación de proteínas que se unen al ARN (RIP) utilizando perlas magnéticas A/G
Reactivos SDS-PAGE (gel al 10%)TargetMolC0189Para separar proteínas según peso molecular
Mezcla maestra SYBR GreenThermo Fisher4309155Para usar en pruebas de PCR
Medidor de TER (voltiohmetro)MilliporeMERS00002Medidor de resistencia transepitelial, para medir la integridad de monocapa
Cámaras TranswellCorning CostarCLS3413Para cultivar monocapas celulares y medir el TER
Reactivo TRIzolInvitrogen15596026CNPara extracción de ARN total

Referencias

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