NEAT1-Mediada Disfunción de la Barrera Intestinal Mediante la Unión a miR-29b-3p en Células Caco-2 Dañadas por Lipopolisacárido

Resumen

Este estudio evaluó NEAT1 como marcador diagnóstico y regulador de la disfunción de la barrera intestinal en el síndrome del intestino irritable con predominio de diarrea. NEAT1 se encontró elevado en el suero de los pacientes, se unió a miR-29b-3p y su silenciamiento mejoró los parámetros de barrera, apoptosis e inflamación en células Caco-2 dañadas por lipopolisacárido.

Resumen

La patogénesis del síndrome del intestino irritable con diarrea (SII-D) no está clara, y las terapias disponibles siguen siendo limitadas. Este estudio evaluó el valor diagnóstico de NEAT1 en el SII-D y exploró su posible mecanismo regulador. Se incluyeron un total de 116 pacientes con SII-D y 116 controles sanos. Los niveles séricos de NEAT1 y miR-29b-3p se detectaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa (RT-qPCR), y se utilizaron curvas de característica operativa del receptor (ROC) para evaluar el valor diagnóstico. Para los estudios mecanicistas, se estableció un modelo de células epiteliales intestinales Caco-2 tratadas con lipopolisacárido (LPS). La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo con el kit de recuento de células 8 (CCK-8), la apoptosis mediante citometría de flujo, la integridad de la barrera mediante la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y los niveles de ARNm de ZO-1, ocludina y claudina-2 mediante RT-qPCR. Los ensayos de luciferasa dual (DLR) y de inmunoprecipitación de ARN (RIP) se utilizaron para verificar la relación de unión entre NEAT1 y miR-29b-3p. NEAT1 se expresó altamente y miR-29b-3p se expresó débilmente en pacientes con SII-D, y sus niveles mostraron una fuerte correlación negativa. La inhibición de NEAT1 aumentó los niveles de miR-29b-3p, mejoró la viabilidad celular y la TEER, redujo la apoptosis, incrementó los niveles de ARNm de ZO-1 y ocludina, disminuyó los niveles de ARNm de claudina-2 y alivió los indicadores asociados a la lesión de la barrera en células Caco-2 tratadas con LPS. En conjunto, estos resultados indican que NEAT1 sérico es un biomarcador candidato para el SII-D y que el eje NEAT1/miR-29b-3p podría estar implicado en la disfunción de la barrera intestinal.

Introducción

El síndrome del intestino irritable con diarrea (IBS-D) es un trastorno gastrointestinal funcional común caracterizado por dolor abdominal, distensión abdominal y hábitos intestinales alterados¹. En la actualidad, el mecanismo fisiopatológico del IBS-D no se ha elucidado completamente². Los métodos de tratamiento consisten principalmente en alivio sintomático, con eficacia limitada y una alta tasa de recurrencia³. Se considera generalmente que el IBS-D implica la interacción de múltiples factores, como la desregulación del eje cerebro-intestino, la hipersensibilidad visceral, la inflamación intestinal de bajo grado y la disfunción de la barrera^4,5. Aunque estos criterios han estandarizado hasta cierto punto el diagnóstico, son subjetivos y pueden provocar retrasos en el diagnóstico o clasificaciones erróneas, especialmente cuando los síntomas del paciente se superponen con los de la enfermedad inflamatoria intestinal u otras enfermedades orgánicas. En la práctica clínica habitual, actualmente no existen biomarcadores objetivos validados para el IBS-D. Por lo tanto, explorar un nuevo objetivo molecular que pueda servir como herramienta diagnóstica y que tenga valor terapéutico potencial se ha convertido en una necesidad urgente en el campo actual de la investigación del IBS-D.

En los últimos años, los ARN no codificantes largos, como moléculas clave en la regulación epigenética, han demostrado un gran potencial como marcadores diagnósticos y objetivos terapéuticos en diversas enfermedades^6,7. La causa principal del SII-D es el deterioro de la función de la barrera intestinal⁸. La destrucción de las proteínas de las uniones estrechas conduce a "fuga intestinal", lo que a su vez activa la respuesta inmune de la mucosa^9,10. La activación del sistema inmunitario libera numerosos factores proinflamatorios que pueden causar disfunción intestinal al activar el sistema inmuno-nervioso intestinal. Estudios han indicado que algunos lncARN pueden regular la barrera epitelial intestinal^11,12. Se ha informado que NEAT1 está sobreexpresado en el tejido de la mucosa colónica de pacientes con colitis¹³. La inhibición del lncARN NEAT1 puede aliviar la disfunción en las células epiteliales intestinales (IEC) en la colitis ulcerosa¹⁴. Sin embargo, el perfil de expresión de NEAT1 en el SII-D y su valor diagnóstico aún no han sido investigados. Además, NEAT1 podría tener potencial como biomarcador diagnóstico¹⁵. Si NEAT1 se expresa anormalmente en el suero de pacientes con SII-D, esto podría complementar los actuales criterios Roma IV al proporcionar una herramienta diagnóstica molecular. Mientras tanto, el perfil de expresión de miARN también ha cambiado significativamente en pacientes con SII. Por ejemplo, se ha asociado la disminución de la expresión de miR-29b-3p con la patogénesis del SII¹⁶. Sin embargo, los mecanismos reguladores upstream que controlan la expresión de miR-29b-3p en el SII-D permanecen completamente inexplorados. En particular, el papel de NEAT1 como ARN endógeno competitivo (ceARN) de miR-29b-3p en el contexto del SII-D nunca ha sido investigado, aunque este mecanismo está bien establecido en otras enfermedades^17,18. Además, aunque estudios previos se han centrado principalmente en la expresión a nivel tisular, el potencial de NEAT1 circulante como biomarcador sérico no invasivo para el diagnóstico del SII-D sigue siendo completamente desconocido.

Planteamos la hipótesis de que el lncRNA-NEAT1 podría participar en la regulación de la función de la barrera intestinal en el SII-D al actuar como una ceRNA que atrapa al miR-29b-3p. Con base en el antecedente de investigación anterior, este estudio tiene como objetivos: (1) evaluar los niveles de NEAT1 y miR-29b-3p en el suero de pacientes con SII-D y su valor diagnóstico; (2) validar la interacción directa de unión entre NEAT1 y miR-29b-3p; y (3) esclarecer el papel funcional del eje NEAT1/miR-29b-3p en la regulación de la integridad de la barrera intestinal y la inflamación, mediante un modelo de células Caco-2 tratadas con LPS.

Protocolo

Inclusión de pacientes

Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito tras comprender completamente el contenido de la investigación. El Comité de Ética del Hospital Popular de la Nueva Área de Pudong, Shanghái, ha revisado y aprobado este protocolo de investigación (n.º 2024k007). El tamaño de la muestra se calculó mediante G*Power: la prueba seleccionada fue una prueba t, y el análisis estadístico se diseñó para detectar diferencias entre dos muestras independientes. Con un tamaño del efecto d = 0,5, α = 0,05 y una potencia = 0,9, el cálculo indicó que se debía incluir un mínimo de 86 sujetos en cada grupo. Para tener en cuenta posibles circunstancias imprevistas durante el ensayo, se incluyeron 116 pacientes en cada grupo. En este estudio se incluyó un total de 116 pacientes con SII-D que acudieron al Hospital Popular de la Nueva Área de Pudong, Shanghái, entre julio de 2024 y julio de 2025, formando el grupo experimental. Los criterios de inclusión fueron: (1) SII-D que cumplieran los criterios diagnósticos de Roma IV; (2) colonoscopia que indicara ausencia de lesiones orgánicas en la mucosa. Criterios de exclusión: (1) pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), cáncer colorrectal, etc.; (2) pacientes diabéticos; (3) pacientes con antecedentes recientes de cirugía abdominal; y (4) pacientes con insuficiencia grave cardíaca, hepática o renal. Mientras tanto, se reclutaron 116 voluntarios sanos que coincidían con las características demográficas de los pacientes, como edad y sexo, para formar el grupo control. Se confirmó que los controles sanos no tenían antecedentes de enfermedades gastrointestinales crónicas ni síntomas clínicos correspondientes. A todos los sujetos se les extrajeron cinco mililitros de sangre venosa periférica. Luego, el sobrenadante se transfirió a un congelador de ultra baja temperatura a -80 °C para su criopreservación antes de la posterior extracción de ARN.

Cada participante completó un cuestionario de 10 días para registrar las siguientes manifestaciones clínicas: (a) evaluación de la intensidad del dolor abdominal mediante una escala visual analógica de 10 puntos; (b) frecuencia del dolor abdominal durante el período de la encuesta (número de días con dolor); (c) frecuencia de movimientos intestinales (número máximo de movimientos intestinales por día); (d) escala de características fecales de Bristol para evaluar las características de las heces. El estado emocional de los sujetos se evaluó mediante la escala de ansiedad y depresión hospitalaria (HADS).

Cultivo celular y modelado

Las células Caco-2 se cultivaron rutinariamente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 1 % de penicilina-estreptomicina, en un incubador a 37 °C y 5 % de CO₂. La línea celular Caco-2 se diferencia espontáneamente en una monocapa polarizada de células con uniones estrechas y microvellosidades, mostrando características morfológicas y funcionales similares a las de las células epiteliales intestinales maduras. El LPS desencadena una respuesta inflamatoria y altera las uniones estrechas en el epitelio intestinal, aumentando la permeabilidad intestinal, un proceso muy similar a las características patológicas del SII-D. Además, dado que las células Caco-2 tratadas con LPS se han utilizado ampliamente en estudios previos^19,20,21 para modelar la disfunción de la barrera y la inflamación relacionadas con el SII, en este estudio se seleccionó el tratamiento con lipopolisacárido (LPS) de células Caco-2 para establecer un modelo in vitro de SII-D. Una vez que las células alcanzaron aproximadamente un 80 % de confluencia, el medio de cultivo se reemplazó por medio completo que contenía 5 µg/ml de LPS²², y las células se estimularon durante 24 h. Las células cultivadas convencionalmente sin LPS se utilizaron como grupo control.

Transfección celular

Para investigar los papeles de NEAT1 y miR-29b-3p en células Caco-2, se realizaron transfecciones en células Caco-2. Las células se dividieron en seis grupos de la siguiente manera: 1. grupo control (sin tratamiento); 2. grupo LPS; 3. grupo LPS + si-NC; 4. grupo LPS + si-NEAT1; 5. grupo LPS + si-NEAT1 + inhibidor NC; y 6. grupo LPS + si-NEAT1 + inhibidor de miR-29b-3p. Se diseñaron y sintetizaron dos ARN de interferencia pequeños (si-NEAT1) dirigidos contra NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) y si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Se utilizó un ARN de interferencia de secuencia aleatoria no dirigida (si-NC) como control negativo. Al mismo tiempo, también se sintetizaron el inhibidor de miR-29b-3p y su control negativo. Inhibidor de miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Control negativo: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Las células Caco-2 se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron una vez que los cultivos alcanzaron una confluencia del 60–70 %, siguiendo el protocolo del fabricante. Breve­mente, 1,25 µL de siRNA se diluyeron en 25 µL de medio con suero reducido para obtener una concentración final de siRNA de 50 nM. Para la inhibición de miARN, 2 µL del inhibidor de miR-29b-3p o su control negativo se diluyeron en 25 µL de medio con suero reducido hasta una concentración final de 100 nM. Por separado, 1,5 µL del reactivo de transfección se mezclaron con 25 µL de medio con suero reducido. La solución de siRNA diluido (o del inhibidor/control negativo) se mezcló entonces con el reactivo de transfección diluido para formar el complejo de transfección, el cual se añadió gota a gota a las células. Seis horas después de la transfección, la mezcla de transfección se sustituyó por medio completo fresco, y las células se mantuvieron durante otras 48 h antes de realizar los ensayos funcionales posteriores. La eficiencia de silenciamiento o inhibición se confirmó mediante RT-qPCR antes de experimentos adicionales.

PCR cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa (RT-qPCR)

Se aisló ARN total de muestras de suero y de células Caco-2 sometidas a los tratamientos indicados. Breve­mente, cada muestra se lisó con 1 mL de reactivo de extracción de ARN y se combinó con 200 µL de cloroformo. Tras la centrifugación a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C, la fase acuosa superior se transfirió a un tubo nuevo, se mezcló con 500 µL de isopropanol y se mantuvo a −20 °C durante 30 min. A continuación, las muestras se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. El pellet de ARN resultante se lavó dos veces con etanol al 75%, se secó al aire y se resuspendió en 20 µL de agua libre de ARNasas. El rendimiento y la pureza del ARN se midieron con un microespectrofotómetro, y solo se utilizaron muestras con A₂₆₀/A₂₈₀ valores de 1,8 a 2,0 se utilizaron. El ARN se transcribió inversamente a ADNc siguiendo el protocolo del fabricante. Para la detección de NEAT1, ZO-1, ocludina, claudina-2, y GAPDH, se utilizó 1 µg de ARN total para cada reacción de retrotranscripción de 20 µL, que contenía tampón RT 1×, dNTPs 0,5 mM, cebador oligo(dT) 0,5 µM, 200 U de retrotranscriptasa y agua libre de RNasas. La reacción se llevó a cabo a 37 °C durante 15 min, seguida de la inactivación enzimática a 85 °C durante 5 s.

Se realizó una PCR cuantitativa con ADNc como molde utilizando un sistema de PCR en tiempo real basado en SYBR Green. NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludina, y Los niveles de expresión de claudina-2 se midieron con cebadores específicos para el gen. U6 sirvió como gen de referencia para miR-29b-3p, mientras que GAPDH se utilizó para normalizar NEAT1 y genes relacionados con las uniones estrechas. La expresión relativa se calculó utilizando el método 2−ΔΔCt. Las secuencias de los cebadores se enumeran en Tabla 1.

Ensayo de viabilidad celular

Se sembraron células Caco-2 en fase logarítmica en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10⁴ células por pocillo. Se establecieron un grupo control en blanco (que contenía solo medio de cultivo), un grupo control (células no tratadas) y un grupo experimental (células Caco-2 bajo diferentes condiciones de tratamiento), con 5–6 pocillos duplicados en cada grupo. Las células se asignaron a cuatro puntos temporales: 0, 24, 48 y 72 h. Se preparó una placa de cultivo independiente para cada punto temporal con el fin de evitar abrir repetidamente el incubador durante las mediciones. Tras el período de cultivo, se añadieron 10 µL de solución CCK-8 a cada pocillo, evitando la formación de burbujas. Posteriormente, la placa de cultivo se devolvió a un incubador a 37 °C con 5 % de CO₂ y se incubó en la oscuridad durante 2 h. La absorbancia de cada pocillo se midió inmediatamente a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Finalmente, la viabilidad celular se expresó como un porcentaje.

Ensayo de apoptosis celular

La apoptosis se cuantificó mediante citometría de flujo tras la tinción con V-FITC de anexina/PI. Las células Caco-2 de cada grupo de tratamiento se recolectaron y se lavaron dos veces con PBS frío. La centrifugación se realizó a 300 × g durante 5 min a 4 °C. El sedimento celular se resuspendió entonces en 100 µL de tampón de enlace 1×, seguido de la adición secuencial de 5 µL de anexina V-FITC y 5 µL de PI. Tras una mezcla suave, las muestras se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, se añadieron 300 µL de tampón de enlace 1×, y la suspensión se mezcló cuidadosamente antes de transferirla a un tubo de citometría de flujo de 5 mL. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo dentro de la primera hora.

Resistencia eléctrica transepitelial (TEER)

La permeabilidad se evaluó midiendo los valores de resistencia transepitelial (TEER) de células Caco-2²³. Las células Caco-2 se inocularon en cámaras Transwell y se cultivaron durante 21 días para formar una monocapa densa. Se realizaron seis réplicas biológicas independientes para cada condición experimental, así como cinco réplicas técnicas en cada condición. Antes y después del tratamiento experimental, se midieron los valores de TEER de cada grupo mediante un medidor de resistencia transepitelial, utilizando electrodos esterilizados con etanol y equilibrados con PBS. En resumen, la varilla larga del electrodo se sumergió en el medio de cultivo basolateral y la varilla corta en el medio de cultivo apical, evitando el contacto con la membrana de filtro. Tras la estabilización, se registró el valor de resistencia (Ω), y las mediciones se repitieron hasta obtener tres lecturas consistentes. La resistencia de los filtros Transwell en blanco (sin células) se midió en las mismas condiciones, y este valor se restó de todas las lecturas experimentales. TEER (Ω·cm²) = (resistencia de la muestra – resistencia del blanco) × área efectiva de la membrana. Los datos se presentan como: (grupo experimental/grupo control) × 100 %.

Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)

Se recogieron los sobrenadantes de células Caco-2 de diferentes grupos de tratamiento tras 24 h de cultivo. Los niveles de citocinas proinflamatorias, incluyendo el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β), se midieron utilizando reactivos comerciales de ELISA según las instrucciones del fabricante. El ensayo se realizó estrictamente de acuerdo con las instrucciones. Las muestras y los patrones se añadieron a los pocillos previamente recubiertos con anticuerpos, luego se incubaron y se lavaron. A continuación, se añadió el anticuerpo de detección biotinilado. Tras otra incubación y lavado, se añadió la estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante. Finalmente, se añadió el sustrato TMB para el desarrollo del color, y la reacción se detuvo con la solución de parada. La absorbancia de cada pocillo se midió inmediatamente a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Transferencia Western

Las proteínas se aislaron de células Caco-2 tras los tratamientos indicados utilizando tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasas. Los niveles de proteína se midieron mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Para cada muestra, se cargaron 30 µg de proteína por pozo, se separaron en geles de SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % durante 1 h a temperatura ambiente y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos contra ZO-1 (1:1.000), ocludina (1:500), claudina-2 (1:1.000) y GAPDH (1:5.000). Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) y la intensidad de las bandas se analizó utilizando ImageJ. GAPDH sirvió como control de carga.

Ensayo de luciferasa dual (DLR)

Los sitios potenciales de unión de miR-29b-3p a la secuencia de NEAT1 se predijeron mediante la base de datos ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Posteriormente, fragmentos de NEAT1 que contenían sitios de unión tipo silvestre (WT) o mutantes (MUT) se clonaron en el vector reportero pmirGLO. El plásmido recombinante construido se transfirió por co-transfección a las células junto con análogos de miR-29b-3p (Sentido: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisentido: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) o inhibidores y sus respectivos controles negativos (mimic NC, Sentido: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisentido: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recolectaron las células y se determinaron las actividades de luciferasa de luciérnaga y luciferasa de renilla utilizando un reactivo de detección de doble luciferasa. La actividad de la luciferasa de renilla se utilizó como referencia interna para la normalización.

Ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP)

Para el ensayo de inmunoprecipitación de ribonucleoproteínas (RIP), se recolectaron células Caco-2, se lavaron con PBS e incubaron en hielo durante 15 min en 200 µL de tampón de lisis RIP suplementado con inhibidores de proteasas y RNasas. Los lisados celulares se centrifugaron a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C, y se reservaron 10 µL de cada sobrenadante como control de entrada. Para la inmunoprecipitación, se rotaron 40 µL de perlas magnéticas A/G-Proteína con 5 µg de anticuerpo anti-Ago2 o IgG normal en 200 µL de tampón de lavado RIP durante 30 min a temperatura ambiente. Tras tres lavados con 500 µL de tampón de lavado RIP, se combinaron 100 µL de la suspensión de perlas con 100 µL de lisado, se ajustó el volumen final a 1 mL con tampón de lavado RIP y se incubó durante la noche a 4 °C con rotación. Las perlas se lavaron luego cinco veces con 500 µL de tampón de lavado RIP y se resuspendieron en 150 µL del mismo tampón. La digestión proteica se realizó añadiendo 15 µL de proteinasa K (20 mg/mL) y 15 µL de SDS al 10%, seguido de incubación a 55 °C durante 30 min con agitación. Se recolectó el sobrenadante y el ARN se aisló con el reactivo de extracción y precipitó durante la noche. Posteriormente, se evaluó el enriquecimiento de NEAT1 y miR-29b-3p mediante RT-qPCR.

Análisis de localización subcelular

Las células Caco-2 se separaron en fracciones nucleares y citoplasmáticas utilizando el reactivo comercial disponible para separación núcleo-citoplasma citado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se extrajo ARN total de estos dos componentes, y se detectó la distribución de NEAT1 en el núcleo y el citoplasma mediante RT-qPCR. La calibración se realizó utilizando U6 (predominantemente nuclear) y el ARNm de GAPDH (predominantemente citoplasmático) como indicadores de la eficiencia de separación.

Análisis estadístico

Para muestras clínicas de suero, un análisis de potencia (t-prueba, d = 0,5, α = 0,05, potencia = 0,9) indicó que se requería un mínimo de 86 sujetos por grupo. Para tener en cuenta posibles circunstancias imprevistas durante el ensayo, se incluyeron 116 pacientes en cada grupo con el fin de detectar diferencias clínicamente significativas. La normalidad de los datos para las variables continuas se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Dado que todos los datos continuos presentaban distribución normal (P > 0,05), se aplicaron análisis paramétricos. Las variables categóricas se analizaron utilizando la prueba de chi-cuadrado. Los experimentos con células incluyeron seis réplicas biológicas independientes, con cinco réplicas técnicas para cada réplica biológica. Los datos se presentan como media ± DE. Las comparaciones entre dos grupos de variables continuas se realizaron mediante la prueba t de Student, mientras que las comparaciones entre múltiples grupos se analizaron mediante ANOVA de un factor seguido de la prueba post hoc de Tukey. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05.

Resultados

Expresión de NEAT1 y valor diagnóstico

En comparación con el grupo control sano (HC), los niveles de expresión de NEAT1 en pacientes con IBS-D fueron notablemente más altos (P < 0,0001; Figura 1A). El área bajo la curva (AUC) de NEAT1, según se muestra en la curva característica de operación del receptor (ROC), fue de 0,867 (IC del 95 %: 0,821–0,913). Su especificidad fue del 75,9 %, mientras que su sensibilidad fue del 84,5 % (Figura 1B). Esto sugiere que la expresión anormal de NEAT1 en el suero de pacientes con IBS-D podría servir como un nuevo biomarcador diagnóstico para esta afección.

Además, se compararon los datos clínicos de los pacientes en los grupos de control y de SII-D. Los resultados no mostraron diferencias significativas entre ambos grupos en cuanto a edad, sexo u otras características (P > 0,05). Sin embargo, hubo diferencias significativas en los puntajes del HADS, en la frecuencia de movimientos intestinales y en la forma de las heces (P < 0,0001, Tabla 2). En cuanto a la frecuencia del dolor abdominal, 69 pacientes presentaron síntomas durante ≥ 5 días, lo que representa el 59,48 % de los casos. Respecto a la intensidad del dolor abdominal, 72 pacientes tuvieron una puntuación ≥ 5, lo que representa el 62,07 % (Tabla 2). Esto indica que los pacientes con SII-D son claramente distinguibles del grupo control por sus síntomas. Dada la asociación clínica entre los niveles elevados de NEAT1 y los síntomas de SII-D, a continuación investigamos el impacto funcional de NEAT1 en la integridad de la barrera intestinal mediante un modelo celular de Caco-2 tratado con LPS.

Efectos de bajos niveles de NEAT1 en el daño de la barrera intestinal y las respuestas inflamatorias en células Caco-2 tratadas con LPS

Para modelar la disfunción de la barrera intestinal y la inflamación de bajo grado observadas en el SII-D, tratamos células Caco-2 con LPS. Cuando se añadió LPS a las células, NEAT1 los niveles se regulaban hacia arriba en comparación con el grupo control. Después de la transfección con si-NEAT1, el NEAT1 nivel se redujo notablemente en comparación con el grupo LPS + si-NC (P < 0.0001, Figura 2A). El tratamiento con LPS redujo la viabilidad celular y aumentó la apoptosis en comparación con el grupo control. Después de silenciar NEAT1, la viabilidad celular aumentó y la tasa de apoptosis disminuyó en comparación con el grupo LPS + si-NC (P < 0.001; Figura 2B, C). Después de silenciar NEAT1, el TEER reducido por LPS se restauró significativamente (P < 0.0001, Figura 2D). El LPS disminuyó la expresión de ARNm de ZO-1 y occludina, y expresión aumentada de claudina-2 en relación con los controles, mientras que NEAT1 la inhibición revirtió estos cambios (P < 0.001, Figura 2E-G). El tratamiento con LPS puede desencadenar una respuesta inflamatoria en las células. Los niveles de los factores proinflamatorios TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β en las células fue mayor que en el grupo control. Después del silenciamiento de NEAT1, el contenido de factores proinflamatorios en las células disminuyó significativamente en comparación con el grupo si-NC (P < 0.0001, Figura 3A-D). Esto sugiere que los niveles bajos de NEAT1 los niveles reducen la disfunción de la barrera intestinal inducida por LPS y las respuestas inflamatorias, y que NEAT1 puede contribuir a la progresión del SII-D.

Unión directa de NEAT1 y efectos sobre miR-29b-3p en células Caco-2

En células Caco-2, NEAT1 se encuentra principalmente en el citoplasma (Figura 4A). Los sitios de unión de NEAT1 y miR-29b-3p fueron predichos mediante la base de datos ENCORI. Con base en esto, diseñamos las secuencias WT-NEAT1 y MUT-NEAT1 (Figura 4B). Los resultados del experimento DLR indicaron que los análogos de miR-29b-3p redujeron la actividad enzimática de WT-NEAT1 en comparación con el control negativo (mimic NC), mientras que sus inhibidores la aumentaron en comparación con el control del inhibidor (inhibitor NC). Por el contrario, ninguno de los tratamientos tuvo influencia sobre MUT-NEAT1 (P < 0.0001, Figura 4C). El ensayo de inmunoprecipitación de ribonucleoproteínas (RIP) reveló que NEAT1 y miR-29b-3p estaban notablemente abundantes en la fracción anti-Ago2 en comparación con el grupo anti-IgG, lo que indica una interacción específica entre ambos (P < 0.0001, Figura 4D). Estos resultados indican que NEAT1 se une específicamente a miR-29b-3p. Mientras tanto, el nivel de miR-29b-3p se redujo notablemente en pacientes con IBS-D en comparación con el grupo HC (P < 0.0001, Figura 4E). El área bajo la curva (AUC) de su curva ROC fue de 0.856 (IC del 95 %: 0.808–0.905), con una sensibilidad del 89,7 % y una especificidad del 71,6 % (Figura 4F). El análisis de correlación de Pearson reveló una correlación inversa entre los niveles de NEAT1 y la expresión de miR-29b-3p (r = -0,744, P < 0.0001, Figura 4G).

Efectos de la baja expresión de NEAT1 en el daño de la barrera intestinal en células Caco-2 tratadas con LPS y en los niveles de miR-29b-3p

En células Caco-2 tratadas con LPS, la expresión de miR-29b-3p se redujo notablemente en comparación con el grupo control. La transfección con si-NEAT1 aumentó los niveles de miR-29b-3p, mientras que la transfección con el inhibidor de miR-29b-3p volvió a disminuir los niveles de miR-29b-3p (P < 0,0001, Figura 5A). La reducción de NEAT1 aumentó la viabilidad celular y disminuyó la apoptosis, y estos efectos fueron anulados por el inhibidor de miR-29b-3p (P < 0,01, Figura 5B,C). La reducción inducida por LPS en la resistencia transepitelial (TEER) fue restaurada mediante la inhibición de NEAT1, y esta recuperación volvió a prevenirse con el inhibidor de miR-29b-3p (P < 0,0001, Figura 5D). El tratamiento con LPS provocó una disminución en la expresión de ARNm de ZO-1 y de ocludina, y un aumento en la expresión de ARNm de claudina-2 en comparación con el grupo control. Tras la inhibición de NEAT1, los niveles de miR-29b-3p aumentaron, los niveles de ARNm de ZO-1 y de ocludina aumentaron, y los niveles de ARNm de claudina-2 disminuyeron en comparación con el grupo LPS + si-NC. Tras la inhibición de miR-29b-3p, los niveles de ARNm de ZO-1 y de ocludina disminuyeron, y los niveles de ARNm de claudina-2 aumentaron en comparación con el grupo LPS + si-NEAT1 + inhibidor NC (P < 0,001, Figura 5E-G). NEAT1 (principalmente el subtipo citoplasmático NEAT1_1) actúa como esponja para miR-29b-3p. La reducción de NEAT1 libera miR-29b-3p, lo que indirectamente provoca la sobreexpresión de ZO-1 y de ocludina y la subexpresión de claudina-2, lo cual alivia la alteración de la barrera inducida por LPS. Estos resultados sugieren que, en este modelo, miR-29b-3p regula positivamente la expresión de ZO-1 y de ocludina y negativamente la de claudina-2, y que los efectos de la inhibición de NEAT1 están mediados, al menos en parte, por miR-29b-3p.

Examinamos además los niveles de expresión de las proteínas de las uniones estrechas mediante análisis por inmunotransferencia. Como se muestra en la Figura 5H, la inhibición de NEAT1 aumentó la expresión reducida por LPS de ZO-1 y ocludina, y suprimió la expresión de claudina-2 en comparación con el grupo LPS + si-NC. Sin embargo, la co-transfección con un inhibidor de miR-29b-3p debilitó el efecto protector de la inhibición de NEAT1 en comparación con el grupo LPS + si-NEAT1 + inhibidor NC. Estos resultados respaldan la conclusión de que la inhibición de NEAT1 restaura la expresión de las proteínas de las uniones estrechas, al menos en parte mediante la regulación positiva de miR-29b-3p, mejorando así la función de la barrera intestinal.

Efectos de los niveles bajos de NEAT1 en la inflamación intestinal en células Caco-2 tratadas con LPS y en la expresión de miR-29b-3p

En células Caco-2 tratadas con LPS, el LPS indujo una respuesta inflamatoria. Los niveles de los factores proinflamatorios TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β fueron significativamente más altos que en el grupo control. Tras el silenciamiento de NEAT1, los niveles de miR-29b-3p aumentaron, mientras que los niveles de los factores proinflamatorios disminuyeron significativamente en comparación con si-NC. Tras la inhibición de miR-29b-3p, los niveles de los factores inflamatorios volvieron a aumentar (P < 0,0001, Figura 6A-D). Por lo tanto, el silenciamiento de NEAT1 suprime la liberación de citocinas inflamatorias, al menos en parte, mediante la regulación positiva de miR-29b-3p.

Estos resultados indican que los niveles de NEAT1 están anormalmente elevados en el suero de pacientes con IBS-D y que NEAT1 presenta un AUC alto para distinguir a los pacientes con IBS-D de los controles sanos. Mecánicamente, NEAT1 se une directamente y secuestra a miR-29b-3p en el citoplasma. En modelos celulares y experimentos de rescate funcional, la inhibición de NEAT1 aumentó la expresión de miR-29b-3p, mejoró la supervivencia celular y el TEER, redujo la apoptosis y atenuó la liberación de citocinas proinflamatorias. Estos hallazgos respaldan la hipótesis de que NEAT1 regula negativamente la integridad de la barrera intestinal al inhibir a miR-29b-3p y sugieren que el enfoque hacia NEAT1 podría proporcionar una estrategia diagnóstica y terapéutica potencial para el IBS-D.

Disponibilidad de datos:

Los datos brutos que sustentan las figuras y las tablas se proporcionan como Archivo Suplementario 1 (hoja de cálculo de datos brutos) y Archivo Suplementario 2 (imágenes no editadas de blot de Western).

Figura 1. Expresión y valor diagnóstico de NEAT1 en pacientes con IBS-D. (A) Niveles de expresión de NEAT1 en suero de controles sanos (HC, n = 116) y pacientes con IBS-D (n = 116) detectados mediante RT-qPCR; (B) Análisis de la curva ROC de NEAT1 para discriminar a los pacientes con IBS-D de los controles sanos. Los datos se presentan como media ± DE (n = 116 por grupo). **** P < 0,0001. Abreviaturas: IBS-D = síndrome del intestino irritable con diarrea; ROC = característica operativa del receptor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Efecto de NEAT1 en el daño de la barrera intestinal inducido por LPS en células Caco-2. (A) La transfección con si-NEAT1 reduce los niveles de NEAT1 inducidos por LPS; (B) Viabilidad celular medida mediante el ensayo CCK-8 a las 0, 24, 48 y 72 h. La inhibición de NEAT1 mejora la viabilidad celular; (C) Tasa de apoptosis determinada por citometría de flujo con tinción de Annexin V-FITC/PI. La silenciación de NEAT1 reduce las tasas de apoptosis; (D) Resistencia eléctrica transepitelial (TEER) medida en monocapas de Caco-2. La inhibición de NEAT1 aumenta el TEER celular; (E-G) Niveles de expresión de ARNm de (E) ZO-1, (F) ocludina y (G) claudina-2 medidos mediante RT-qPCR. La silenciación de NEAT1 eleva la expresión de ARNm de ZO-1 y ocludina, y disminuye los niveles de ARNm de claudina-2. Los datos se presentan como media ± DE de seis experimentos independientes (n = 6 por grupo). *** P < 0,001; **** P < 0,0001, LPS comparado con control, LPS + si-NEAT1 comparado con LPS + si-NC. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3. Efecto del silenciamiento de NEAT1 sobre la liberación de citocinas proinflamatorias inducida por LPS en células Caco-2. (A-D) Concentraciones de (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 y (D) IL-1β en los sobrenadantes del cultivo celular medidas mediante ELISA. El silenciamiento de NEAT1 reduce los niveles de TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β inducidos por LPS. Los datos se presentan como media ± DE de seis experimentos independientes (n = 6 por grupo). **** P < 0,0001, LPS frente a control, LPS + si-NEAT1 frente a LPS + si-NC. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4. Unión directa de NEAT1 y asociación con miR-29b-3p. (A) Localización subcelular de NEAT1 en células Caco-2 determinada mediante fraccionamiento nuclear-citoplasmático (U6: control nuclear, GAPDH: control citoplasmático). NEAT1 se localiza principalmente en el citoplasma; (B) Secuencias predichas de unión tipo silvestre (WT) y mutante (MUT) de NEAT1 para miR-29b-3p obtenidas de la base de datos ENCORI; (C) El ensayo DLR verificó la relación de unión entre NEAT1 y miR-29b-3p; (D) El ensayo RIP verificó la relación de unión entre NEAT1 y miR-29b-3p. Los datos en A, C y D corresponden a la media ± DE de seis experimentos independientes (n = 6 por grupo). (E) Niveles de expresión sérica de miR-29b-3p en controles sanos (HC, n = 116) y pacientes con IBS-D (n = 116); (F) Curva ROC de miR-29b-3p para diferenciar pacientes con IBS-D de controles sanos; (G) Análisis de correlación de Pearson entre los niveles de NEAT1 y miR-29b-3p en pacientes con IBS-D. NEAT1 mostró una correlación negativa con la expresión de miR-29b-3p (r = -0.744, P < 0.0001). Los datos en E corresponden a la media ± DE (n = 116 por grupo). **** P < 0.0001. Abreviaturas: WT = tipo silvestre; MUT = mutante; DLR = ensayo de luciferasa dual; RIP = inmunoprecipitación de ARN. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5. Efectos del silenciamiento de NEAT1 sobre la función de barrera intestinal en células Caco-2 tratadas con LPS y miR-29b-3p. (A) El silenciamiento de NEAT1 aumenta los niveles de miR-29b-3p, mientras que la transfección con inhibidores de miR-29b-3p reduce la expresión de miR-29b-3p. (B) Viabilidad celular medida mediante el ensayo CCK-8. Niveles bajos de NEAT1 mejoran la viabilidad celular al aumentar miR-29b-3p; (C) Tasa de apoptosis determinada por citometría de flujo. Niveles bajos de NEAT1 reducen la tasa de apoptosis al incrementar miR-29b-3p; (D) Niveles bajos de NEAT1 aumentan la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de las células al elevar el nivel de miR-29b-3p; (E-G) Expresión de ARNm de (E) ZO-1, (F) ocludina y (G) claudina-2. Niveles bajos de NEAT1 aumentan la expresión de ZO-1 y ocludina y reducen la expresión de ARNm de claudina-2 al potenciar miR-29b-3p. (H) Imágenes representativas de inmunotransferencia que muestran la expresión proteica de ZO-1, ocludina, claudina-2 y GAPDH bajo las condiciones de tratamiento indicadas. Los datos se presentan como media ± DE de seis experimentos independientes (n = 6 por grupo). ** P < 0,01; *** P < 0,001; **** P < 0,0001, LPS frente a control, LPS + si-NEAT1 frente a LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibidor frente a LPS + si-NEAT1 + inhibidor NC. Abreviatura: miR-inhibidor = inhibidor de miR-29b-3p; TEER = resistencia eléctrica transepitelial. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6. Efectos del silenciamiento de NEAT1 sobre la inflamación en células Caco-2 tratadas con LPS y miR-29b-3p. (A-D) Concentraciones de (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 e (D) IL-1β en los sobrenadantes celulares medidos mediante ELISA. Bajos niveles de NEAT1 reducen el contenido de TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β en el sobrenadante celular al aumentar miR-29b-3p. Los datos se presentan como media ± DE de seis experimentos independientes (n = 6 por grupo). **** P < 0,0001, LPS frente a control, LPS + si-NEAT1 frente a LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibidor frente a LPS + si-NEAT1 + inhibidor NC. Abreviatura: miR-inhibidor = inhibidor de miR-29b-3p. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gen	Secuencia de cebador
NEAT1 sentido	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 antisentido	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 sentido	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 antisentido	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin sentido	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludin antisentido	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 sentido	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 antisentido	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p sentido	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p antisentido	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH sentido	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH antisentido	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 sentido	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 antisentido	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

Tabla 1: Secuencias de cebadores.

Indicador	Grupo control (N=116)	Grupo IBS-D (N=116)	P
Edad, años
< 40	63	54	0.293
≥ 40	53	62
Sexo
Hombre	64	66	0.895
Mujer	52	50
Tabaquismo
NO	58	53	0.599
SÍ	58	63
Consumo de alcohol
NO	63	58	0.599
SÍ	53	58
HADS, puntuación
< 8	96	26	< 0.0001
≥ 8	20	90
Defecaciones, número/día
< 4	103	51	< 0.0001
≥ 4	13	65
Forma de las heces, puntuación de Bristol
< 5	87	25	< 0.0001
≥ 5	29	91
Frecuencia del dolor abdominal, número de días
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
Intensidad del dolor abdominal, puntuación
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

Tabla 2: Comparación de las características demográficas y clínicas entre controles sanos y pacientes con SII-D. Los valores se expresan como número de participantes en cada grupo (n = 116/grupo). Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante la prueba de chi-cuadrado. Abreviatura: HADS = Escala de Ansiedad y Depresión del Hospital; IBS-D = síndrome de intestino irritable con diarrea.

Archivo Suplementario 1: Datos brutos subyacentes a las figuras y tablas. Este archivo contiene los datos numéricos brutos utilizados para generar los resultados cuantitativos mostrados en Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, y Figura 6, y los datos demográficos/clínicos resumidos en Tabla 2.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Imágenes sin editar de los inmunotransferidos. Este archivo contiene las imágenes sin editar de los inmunotransferidos para ZO-1, occludina, claudina-2 y GAPDH correspondientes al panel representativo de inmunotransferido mostrado en Figura 5H.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El SII-D es un trastorno gastrointestinal funcional común. Su mecanismo patológico no se ha elucidado completamente. En los últimos años, los ARN largos no codificantes (lncRNA), como moléculas clave en la regulación epigenética, han mostrado un gran potencial en el campo del diagnóstico y tratamiento de enfermedades. El lncRNA NEAT1 ha sido estudiado en diversas enfermedades, como el cáncer colorrectal²⁴, el glioma²⁵ y el infarto de miocardio²⁶. Varios estudios han demostrado que NEAT1 participa en la regulación de las respuestas inflamatorias¹³, la proliferación celular²⁷ y la integridad de la barrera intestinal²⁸. Sin embargo, la expresión específica de NEAT1 en el SII-D, su valor clínico y los mecanismos reguladores subyacentes al SII-D aún no se han explorado exhaustivamente.

NEAT1 se encuentra sobreexpresado en diversas afecciones inflamatorias, como la neumonía²⁹, la osteoartritis³⁰, la rinitis³¹ y la sepsis³². Nuestros resultados coinciden con los informados en estos estudios: la expresión de NEAT1 está significativamente aumentada en pacientes con IBS-D. Esto sugiere que podría estar asociado con el inicio del IBS-D. Actualmente, el diagnóstico del IBS-D se basa principalmente en los criterios sintomáticos de Roma IV, y no existen biomarcadores de laboratorio objetivos disponibles. Aunque estos criterios han demostrado ser eficaces en la investigación y en muchos entornos clínicos, aún presentan limitaciones, como la subjetividad, la superposición de síntomas con otras enfermedades y los retrasos en el diagnóstico. Un análisis adicional mediante curvas ROC indica que NEAT1 posee un valor diagnóstico relativamente bueno en pacientes con IBS-D. Los niveles séricos de expresión de NEAT1 distinguen eficazmente a los pacientes con IBS-D de los controles sanos, con un AUC de 0,867 y alta sensibilidad y especificidad. Esto sugiere que NEAT1 tiene potencial como herramienta complementaria a los criterios de Roma IV para el diagnóstico o como un nuevo marcador diagnóstico para el IBS-D. Por ejemplo, en pacientes con dolor abdominal crónico y cambios en los hábitos intestinales que presentan niveles elevados de NEAT1, la evaluación puede realizarse con mayor confianza cuando los resultados del biomarcador se consideran junto con los criterios de Roma IV. Esto facilita el inicio temprano de un tratamiento dirigido a los síntomas y evita exámenes invasivos innecesarios. Por el contrario, en pacientes con resultados normales del biomarcador pero que cumplen los criterios de Roma IV, se requiere un seguimiento más estrecho para descartar otras enfermedades orgánicas. Por lo tanto, se espera que la integración de estos biomarcadores en la práctica clínica mejore la precisión y eficiencia del diagnóstico, aunque aún se requiere una validación prospectiva en entornos clínicos.

Los síntomas clínicos que experimentan los pacientes con SII-D podrían estar relacionados con una función de barrera intestinal deteriorada³³. Esta función está mediada principalmente por la estructura de las uniones estrechas (TJ) entre las células epiteliales intestinales, en la que las proteínas ZO-1 y ocludina desempeñan funciones importantes^34,35. ZO-1 participa en el mantenimiento de la barrera mecánica y la permeabilidad del epitelio mucoso³⁶. La ocludina es principalmente responsable de formar uniones estrechas entre las células, las cuales son cruciales para mantener su función de barrera³⁷. La proteína de unión estrecha claudina-2 desempeña un papel importante en la formación de canales porosos de derivación celular, entre otras funciones³⁸. En pacientes con SII-D, las proteínas ZO-1 y ocludina suelen estar reducidas, la claudina-2 aumentada, la barrera intestinal dañada y la permeabilidad incrementada. Este estudio encontró que la inhibición de NEAT1 aumentó el valor de TEER en el modelo celular in vitro, lo que respalda un efecto perjudicial de NEAT1 sobre la barrera intestinal en este modelo. A nivel molecular, la inhibición de la expresión de NEAT1 provocó un marcado aumento en los niveles de expresión de ARNm de las proteínas clave de las uniones estrechas ZO-1 y ocludina, mientras que la expresión de claudina-2 disminuyó. Esto sugiere que NEAT1 podría regular negativamente la expresión de las proteínas de las uniones estrechas, alterando la barrera física del epitelio intestinal y aumentando su permeabilidad. En última instancia, esto puede conducir al fenómeno conocido como «intestino permeable». Además, la inflamación de bajo grado ampliamente presente en el SII-D es un factor importante que agrava el daño de la barrera³⁹. Numerosos estudios han confirmado que los ARNl pueden actuar como nodos reguladores clave en las vías de señalización inflamatoria⁴⁰. Nuestra investigación es coherente con esto. La inhibición de NEAT1 reduce significativamente la liberación de las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β inducida por LPS. Esto es muy similar al papel de NEAT1 como ARNl proinflamatorio en otros modelos inflamatorios, lo que indica que en el SII-D podría existir un círculo vicioso de inflamación-deterioro de la barrera-inflamación, en el cual NEAT1 desempeña un papel importante.

Los microARN (miARN) son otra clase importante de factores implicados en la regulación de enfermedades. El miARN-29b-3p presenta baja expresión en diversas respuestas inflamatorias celulares inducidas por LPS.^41,42. En consonancia con la mayoría de los estudios, encontramos que los niveles de miR-29b-3p estaban notablemente regulados a la baja en el suero de pacientes con IBS-D y mostraron una fuerte correlación negativa con NEAT1 upregulación. Además, demostramos que NEAT1 se une directamente y actúa como esponja de miR-29b-3p en el citoplasma en este modelo. El experimento de rescate funcional mostró además que NEAT1 afecta la viabilidad y la apoptosis de las células Caco-2, así como los niveles de ZO-1, ocludina, y el ARN mensajero de claudina-2, al menos en parte a través de miR-29b-3p, e influye finalmente en la integridad de la barrera intestinal. Nótese que nuestros datos indican que, en el contexto del deterioro de la barrera intestinal asociado al SII, los niveles de miR-29b-3p se correlacionan positivamente con ZO-1 y los niveles de ocludina. Esta regulación positiva podría ser indirecta; por ejemplo, el miR-29b-3p podría suprimir la transcripción de proteínas de uniones estrechas al dirigirse a sus represores transcripcionales, aliviando así la represión y promoviendo la expresión de ZO-1 y ocludina. Esta hipótesis también es respaldada por estudios previos, que han reportado que el miR-29b-3p desempeña un papel protector en condiciones inflamatorias al dirigirse a reguladores negativos de la función de barrera⁴².

Sin embargo, los genes diana a través de los cuales miR-29b-3p regula la expresión del ARNm de ZO-1 y de la ocludina requieren una investigación adicional para completar la red ceRNA, lo cual constituye una limitación de nuestro estudio actual. Además, nuestro estudio presenta otras limitaciones: primero, se trató de un estudio unicéntrico con un tamaño de muestra relativamente pequeño (solo se incluyeron 116 pacientes con IBS-D). El valor diagnóstico clínico de NEAT1 aún necesita validación adicional mediante estudios de cohorte prospectivos a gran escala y multicéntricos. Segundo, este estudio se basa principalmente en análisis de asociación clínica y modelos celulares in vitro. En el futuro, se necesitarán modelos animales para verificar el papel de este eje in vivo. Tercero, la red específica de genes diana downstream de miR-29b-3p implicada en la patogénesis del IBS-D aún no se ha elucidado completamente. Los estudios futuros deberían centrarse en: (1) validar el valor diagnóstico de NEAT1 y miR-29b-3p en pacientes con IBS-C e IBS-M; (2) evaluar la eficacia terapéutica de intervenciones dirigidas a NEAT1 en modelos animales; y (3) elucidar el mecanismo molecular preciso mediante el cual miR-29b-3p regula las proteínas de las uniones estrechas. Tales esfuerzos facilitarán la traducción clínica de nuestros hallazgos.

En conclusión, NEAT1 se expresa altamente en pacientes con IBS-D y tiene un buen valor diagnóstico en este grupo. Niveles bajos de NEAT1 pueden promover la viabilidad celular, reducir la apoptosis, aliviar el daño en la barrera intestinal y suprimir las respuestas inflamatorias al aumentar los niveles de miR-29b-3p en células Caco-2 tratadas con LPS. El eje NEAT1/miR-29b-3p proporciona una nueva perspectiva sobre los complejos mecanismos fisiopatológicos del IBS-D. NEAT1 podría servir como un biomarcador diagnóstico potencial para el IBS-D, y el eje NEAT1/miR-29b-3p podría representar un objetivo terapéutico potencial para esta afección.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de 24 pocillos	Corning	CLS3524	Para sembrar células
Placas de 96 pocillos	Corning	CLS3599	Para sembrar células en ensayos CCK-8
Kit de apoptosis Annexina V-FITC/PI	Invitrogen	V13242	Para detectar tasas de apoptosis
Anticuerpo monoclonal anti-AGO2	Proteintech	67934-1-Ig	Para inmunoprecipitación de complejos de ARN unidos a Ago2
Anticuerpo anti-Claudina-2	Invitrogen	32-5600	Anticuerpo primario, dilución 1:1000
Anticuerpo anti-GAPDH	Cell Signaling Technology	5174	Anticuerpo primario, dilución 1:5000; control de carga
Anticuerpo anti-IgG humano	Proteintech	10284-1-AP	Utilizado como control negativo para el ensayo de RIP
Anticuerpo anti-Ocludina	Abcam	ab31721	Anticuerpo primario, dilución 1:500
Anticuerpo anti-ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Anticuerpo primario, dilución 1:1000
Células Caco-2	SUNNCELL	SNL-068	Para construir modelos de barrera epitelial intestinal
Kit CCK-8	Solarbio	CA1210	Kit de ensayo de proliferación celular
Cloroformo	Sigma-Aldrich	C2432	Para separación de fases en la extracción de ARN
Medio DMEM	Gibco	11965092	Para cultivo celular
Kit de ensayo de luciferasa dual	ThermoFisher	16186	Para detectar la actividad de luciferasa
Kit ELISA (para IL-1β)	R&D Systems	DY201	Para detectar proteínas diana en sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para IL-6)	R&D Systems	D6050B	Para detectar proteínas diana en sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para IL-8)	R&D Systems	NBP3-28022	Para detectar proteínas diana en sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para TNF-α)	R&D Systems	DTA00D	Para detectar proteínas diana en sobrenadantes de cultivo celular
Sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL)	Thermo Fisher	32106	Para visualizar bandas proteicas
Etileno (75%)	Sigma-Aldrich	459844	Para lavar el pellet de ARN
Suero bovino fetal (FBS)	Gibco	10099141	Para cultivo celular
Citómetro de flujo	Beckman Coulter	B53002	Para detectar tasas de apoptosis
Anticuerpos secundarios conjugados con HRP	Cell Signaling Technology	7074	Catalizan la generación de una señal quimioluminiscente a partir de sustratos ECL
Isopropanol	Sigma-Aldrich	1133502500	Para precipitación de ARN
Lipofectamina 3000	ThermoFisher	L3000015	Reactivo de transfección
Lipopolisacárido (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	Para inducir la construcción del modelo celular
Lector de microplacas	BioTek	Epoch 2	Para detectar la absorbancia de muestras en placas de 96 pocillos
Micropespectrofotómetro Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000C	Para determinar la concentración y pureza del ARN
Leche descremada en polvo	Coolaber	CN7861	Para bloquear membranas (solución al 5%)
Kit PARIS	Thermo Fisher	AM1921	Para fraccionamiento nuclear-citoplasmático
Penicilina–Estreptomicina	Gibco	15140122	Para resistencia al crecimiento celular frente a contaminación
Kit de ensayo de proteína BCA Pierce	Thermo Fisher	23225	Para determinar concentraciones de proteína
Vector pmirGLO de luciferasa dual	Promega	E1330	Vector de gen reportero de luciferasa dual
Kit de reactivos PrimeScript RT	Takara	RR047A	Para transcripción inversa de ARN a ADNc
Membrana PVDF	Millipore	IPVH00010	Para transferencia proteica tras SDS-PAGE
Instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real con fluorescencia	Applied Biosystems	4365464	Para detectar genes diana
Tampón de lisis RIPA (con inhibidores de proteasas)	Thermo Fisher	89901	Para extracción de proteína total de células
Kit de inmunoprecipitación de proteínas que se unen al ARN	Sigma-Aldrich	17-701	Ensayo de inmunoprecipitación de proteínas que se unen al ARN (RIP) utilizando perlas magnéticas A/G
Reactivos SDS-PAGE (gel al 10%)	TargetMol	C0189	Para separar proteínas según peso molecular
Mezcla maestra SYBR Green	Thermo Fisher	4309155	Para usar en pruebas de PCR
Medidor de TER (voltiohmetro)	Millipore	MERS00002	Medidor de resistencia transepitelial, para medir la integridad de monocapa
Cámaras Transwell	Corning Costar	CLS3413	Para cultivar monocapas celulares y medir el TER
Reactivo TRIzol	Invitrogen	15596026CN	Para extracción de ARN total