Avances en la investigación sobre estrategias de evaluación de la eficiencia de la reparación de daños por ADN

Xiao Liu; Yiwei Zhu; Ling Li; Siyu Hang; Sipei Wu; Song-Bai Liu

doi:10.3791/71031

Artículo de revisión

Avances en la investigación sobre estrategias de evaluación de la eficiencia de la reparación de daños por ADN

DOI:

10.3791/71031

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23 de junio de 2026

Xiao Liu^*¹^,² , Yiwei Zhu^*³ , Ling Li¹^,² , Siyu Hang¹ , Sipei Wu⁴ , Song-Bai Liu¹^,²

¹Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, ²School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, ³Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, ⁴Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Los ensayos de eficiencia en la reparación de daños por ADN pueden clasificarse en tres grupos: ensayos funcionales basados en células, ensayos bioquímicos in vitro y ensayos con marcadores moleculares. Estos enfoques permiten una evaluación cualitativa o cuantitativa de la eficiencia de la reparación a través de múltiples vías de reparación de daños en el ADN.

Resumen

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El ADN genómico celular está continuamente expuesto a factores endógenos y exógenos que inducen diversas formas de daño en el ADN. En las células de mamíferos, la carga diaria de daño en el ADN puede alcanzar 10⁴–^{10 5} lesiones por célula. El daño en el ADN que persiste en la fase S puede provocar mutaciones. Cuando estas mutaciones ocurren en oncogenes, genes supresores tumorales o genes implicados en la proliferación celular, pueden promover la transformación celular y la carcinogénesis. Por lo tanto, la reparación del daño en el ADN desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la estabilidad genómica y en la prevención del desarrollo de cáncer. La evaluación de la capacidad de reparación del ADN se logra mejor midiendo la actividad funcional de los sistemas de reparación del ADN. Las vías de reparación de daños en el ADN y sus eficiencias reparativas son muy relevantes para el desarrollo de fármacos quimioterapéuticos, la validación de la función génica y la terapia contra el cáncer. Por tanto, la investigación de la eficiencia de reparación de las vías individuales de reparación de daño al ADN tiene una importante importancia teórica y práctica. Esta revisión resume las principales vías de reparación de daños por ADN, los métodos utilizados para evaluar la eficiencia de la reparación y las ventajas y limitaciones de estos enfoques.

Introducción

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El sistema de reparación de daños por ADN es un mecanismo de defensa celular crítico que mantiene la estabilidad genómica reduciendo la frecuencia de mutaciones y suprimiendo la^{carcinogénesis 1}. Diferentes tipos de daño en el ADN se reparan mediante vías de reparación distintas pero^{interconectadas 2}. Por ejemplo, las desadaptaciones de bases generadas durante la replicación del ADN se corrigen mediante la reparación de desajustes (MMR), mientras que las bases químicamente modificadas, como las bases alquiladas, se reparan principalmente mediante la reparación por escisión de bases (BER⁾³. Los 6-4 fotoproductos inducidos por el ultravioleta (UV) y los voluminosos aductos nucleotídicos generados por ciertos agentes químicos se eliminan mediante la reparación por escisión de nucleótidos (NER). El daño por la entrecadena intercadena (ICL) se repara mediante actividades coordinadas de proteínas asociadas a la^{vía 4} de la anemia de Fanconi. Las rupturas de cadena simple (SSB) se reparan a través de la vía de reparación de rotura de cadena simple (SSBR), mientras que las rupturas de doble cadena (DSB) se reparan principalmente mediante unión de extremos no homólogas (NHEJ) o recombinación homóloga (HR). En la mayoría de los casos, las lesiones complejas del ADN se resuelven mediante interacciones coordinadas entre múltiples vías de reparación del^{ADN 5}.

La evaluación del daño al ADN y la eficiencia de reparación en células suele basarse en una combinación de enfoques experimentales, incluyendo el ensayo de cometa, inmunofluorescencia (FI), Western blot (WB), reactivación de células hospedadoras (HCR) y ensayos de reparación basados en plásmidos. Estos métodos evalúan el daño y la reparación del ADN detectando rupturas de cadenas de ADN, marcadores de daño al ADN y la expresión o localización de proteínas asociadas a^{la reparación 6}. Sin embargo, la cuantificación precisa de la eficiencia de reparación celular generalmente requiere ensayos dinámicos basados en desafíos. En estos enfoques, se inducen lesiones específicas de ADN experimentalmente y se muestrean células en puntos temporales secuenciales para monitorizar la formación y eliminación de señales de daño. La comparación de los niveles de daño residual a lo largo del tiempo en relación con la carga inicial del daño permite una evaluación cuantitativa de la cinética de reparación y la funcionalidad de las vías.

Para comparar sistemáticamente las características y aplicaciones de los ensayos de eficiencia de reparación de daños por ADN actualmente disponibles, esta revisión resume los principales métodos de detección según cinco parámetros: especificidad de lesión/sustrato, resolución analítica, sensibilidad, capacidad cuantitativa y requisitos de instrumentación (Tabla 1). Esta revisión tiene como objetivo proporcionar una guía metodológica práctica para seleccionar enfoques adecuados para investigar las vías de reparación de daños en el ADN en investigación básica, traslacional y clínica.

Método de detección	Especificidad de lesión/sustrato	Resolución analítica	Umbral de sensibilidad/detección	Producción cuantitativa vs. cualitativa	Requisitos de instrumentación
Western blot	CPDs, 6-4PPs, proteínas de reparación (por ejemplo, MGMT, RAD51)	Población	Moderado	Semicuantitativo	Electroforesis de proteínas, transferencia de membrana, sistema de imagen por quimioluminiscencia
Inmunofluorescencia	CPDs, focos DSB (por ejemplo, γ-H2AX, RAD51)	Célula única	Moderado	Semicuantitativo	Microscopio de fluorescencia
HPLC-MS/MS	DPC, 6-4PPs, daño en bases oxidativas y alquilativas	Población/In vitro	Extremadamente alto	Cuantitativa	HPLC-MS/MS
Ensayo de actividad enzimática MGMT	Daño por alquilación O⁶-meG	Población/In vitro	Alto	Cuantitativa	Lector de microplacas
Ensayo del cometa	SSBs, DSBs, bases oxidadas (con pretratamiento FPG/OGG)	Célula única	Alto	Cuantitativa	Sistema de microscopio de fluorescencia/electroforesis
Ensayo de incisión	Sitios AP, incisiones NER, incisiones BER	Población/In vitro	Alto	Cuantitativa	Imagen en gel, radiomarcaje/detección de fluorescencia
Sistema de reparación reconstituido	Daño base específico del sitio, sitios de AP, roturas de hilo	In vitro	Alto	Cuantitativa	Electroforesis en gel, detección de fluorescencia/EM
Ensayo de reparación basado en plásmidos	Daños específicos del lugar	Población	Moderado	Cuantitativa	Lector de microplacas, citómetro de flujo, conteo de colonias
Ensayo del reportero	daños específicos del lugar; BER, NER, HR, NHEJ, MMR	Población	Alto	Cuantitativa	Lector de microplacas, citómetro de flujo, microscopio de fluorescencia
HCR/FM-HCR	Daños UV, enlaces de platino, daños específicos del sitio	Población	Alto	Cuantitativa	Citómetro de flujo, detector de fluorescencia/quimioluminiscencia
RADD	Daño en el ADN de amplio espectro	Célula única	Extremadamente alto	Cuantitativa	Microscopio de fluorescencia de molécula única
qPCR	Daño por los rayos UV, lesiones que bloquean la cadena	Población	Moderado	Cuantitativa	Instrumento qPCR en tiempo real
Detección MSI	Inestabilidad de microsatélites asociada a deficiencias de MMR	Población	Moderado	Cualitativo	Instrumento PCR/electroforesis capilar
DR-GFP/EJ5-GFP	Reparación DSB mediada por HR y NHEJ	Población	Alto	Cuantitativa	Citómetro de flujo/microscopio de fluorescencia
BENDICIÓN/DICHA	Mapeo de DSB a nivel genómico	Célula única	Extremadamente alto	Cuantitativa	Secuenciador de alto rendimiento
iPOND	Proteínas DDR en reparación asociada a forks de replicación/TLS	Bifurcación/proteoma de replicación	Alto	Semicuantitativo	Plataforma de espectrometría/secuenciación de masas

Tabla 1: Comparación sistemática de métodos para detectar la eficiencia de reparación de daños en el ADN. Comparación de métodos comúnmente utilizados para evaluar la eficiencia de reparación de daños por ADN a través de múltiples vías de reparación. La tabla resume la especificidad de lesiones o sustratos, resolución analítica, sensibilidad, capacidad cuantitativa y requisitos de instrumentación para cada ensayo, incluyendo enfoques bioquímicos, moleculares y basados en células.

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Revisión y perspectiva

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1. Reparación directa (DR)

La reparación directa (DR) es la forma más sencilla de reparación del ADN y se refiere a la restauración directa del ADN dañado sin la eliminación de bases o^{nucleótidos 7}. La RD se encarga principalmente de reparar dos tipos principales de lesiones en el ADN. La primera es el daño por ciclobutano y pirimidina (DPC) causado por la radiación ultravioleta (UV). En muchos organismos, la fotoliasa reconoce y se une a los dímeros pirimidinos. Al exponerse a la luz visible, la fotoliasa se activa, revierte directamente el daño al ADN y luego se disocia de la molécula de ADN. Este mecanismo de fotoreactivación es especialmente importante en plantas y organismos inferiores. Sin embargo, los mamíferos placentarios, incluidos los humanos, carecen de fotoliasa funcional y, por tanto, no pueden realizar la fotoreactivación. En consecuencia, el daño por DPC inducido por UV en células humanas se repara principalmente mediante la reparación por escisión de nucleótidos (NER⁾⁸.

El segundo tipo importante de daño reparado mediante DR es el daño base inducido por alquilación. La reparación está mediada por la alquiltransferasa O 6-alquilguanina-ADN (AGT), también conocida como O^{6-metilguanina-ADN} metiltransferasa (MGMT). Esta enzima transfiere grupos alquilo desde la posición^O6 de los residuos de guanina a sí misma, restaurando así directamente la base dañada del ADN.

Métodos para detectar la eficiencia de la DR

Detección de la eficiencia de reparación para daños en DPC inducidos por radiación ultravioleta (UV)
1. Ensayo Western blot (WB) para detectar cambios en el contenido de CPD
  Utilizando anticuerpos específicos para DPC, los investigadores pueden detectar cambios en la abundancia de DPC en diferentes momentos tras la irradiación UV e inferir la eficiencia de reparación a partir del nivel de daño residual. Una mayor eficiencia en la reparación corresponde a una eliminación más rápida de la DPC. La detección de DPC basada en BE es un enfoque clásico y eficaz para evaluar la actividad de reparación del ADN; sin embargo, existen varias limitaciones. En primer lugar, el ensayo mide los niveles medios de daño entre poblaciones celulares y, por tanto, carece de resolución en una sola célula. Segundo, y más importante, el ensayo no puede distinguir entre las vías de reparación. Dado que las DPC en células humanas se reparan principalmente mediante NER, el análisis de BB por sí solo no puede diferenciar si la actividad de reparación observada refleja la reparación mediada por fotoliasa o la actividad NER sin contexto experimental adicional.
2. Posicionamiento de inmunofluorescencia (FI) Cambios dinámicos de enfoque en la DPC
  Las células sometidas a irradiación UV y tratamiento de fotorreparación pueden ser teñidas usando anticuerpos específicos para CPD, y los cambios en los focos nucleares de CPD pueden visualizarse mediante microscopía de fluorescencia. El análisis cuantitativo de la formación y eliminación de focos de DPC permite evaluar la capacidad de reparación del ADN tanto a nivel poblacional como unicelular. La tasa de desaparición de focos de CPD refleja directamente la eficiencia de la reparación. El FI proporciona visualización espacial y temporal de la dinámica de reparación dentro de células individuales y permite la detección de la heterogeneidad célula a célula. Sin embargo, las señales de fluorescencia son susceptibles a la apagada, y el análisis cuantitativo suele depender del conteo manual, lo que introduce subjetividad. En células de mamíferos que carecen de actividad fotoreactivadora, este método refleja principalmente la eficiencia de reparación mediada por el NER.
3. Cromatografía líquida-espectrometría de masas de alto rendimiento (HPLC-MS/MS) para análisis cuantitativo de DPC
  El ADN extraído se digiere enzimáticamente en nucleósidos, tras lo cual las DPC se separan de los nucleósidos normales mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). Posteriormente, el análisis cuantitativo se realiza mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS). La eficiencia de la reparación se determina comparando la abundancia de CPD antes y después de la^{reparación 9}. HPLC-MS/MS proporciona una especificidad extremadamente alta y sensibilidad a nivel picomolar; sin embargo, el método requiere instrumentación costosa, preparación compleja de la muestra y no refleja el estado de reparación in situ de las células intactas. En muestras de células humanas, el resultado medido de reparación refleja predominantemente la actividad del NER.
Eficacia de la reparación de daños en la base del ADN inducida por agentes alquilantes
1. Ensayo de actividad enzimática MGMT
  La eficiencia de reparación del daño al ADN inducido por agentes alquilantes se evalúa comúnmente midiendo la actividad^{MGMT 10}. Se utilizan sustratos de ADN metilado marcado radiactivamente para monitorizar la transferencia de grupos metilo desde el ADN dañado hasta la proteína MGMT, permitiendo así una evaluación cuantitativa de la eficiencia de reparación.
2. Reporte de ensayo génico para detectar la eficiencia de reparación de^{OO 6-meG}
  Se pueden construir plásmidos reporteros que contienen lesiones de O6-metilguanina (O^6-meG) para evaluar la eficiencia de reparación. La lesión introducida suprime la expresión génica del reportero hasta que la reparación mediada por MGMT restaura la actividad del reportero. La eficiencia de reparación se cuantifica posteriormente midiendo los niveles de expresión génica reportera. Los ensayos génicos de reporteros proporcionan una evaluación intuitiva y cuantitativa de la actividad de reparación en células^{vivas 11}. Sin embargo, estos ensayos requieren la construcción de vectores específicos de la lesión e implican ciclos experimentales relativamente^{largos 12}.
Eficiencia en la reparación de daños tras la detección de rotura de cadena
1. Ensayo del cometa
  El ensayo cometa, también conocido como electroforesis en gel unicelular (SCGE), es un método sensible para detectar rupturas de hebras de ADN a nivel de célula única. Los fragmentos de ADN dañados migran desde el núcleo durante la electroforesis, formando colas similares a las de cometas, mientras que el ADN intacto permanece concentrado en la región nuclear. Parámetros como la longitud de la cola del cometa, el contenido de ADN y el momento de la cola pueden cuantificarse mediante microscopía de fluorescencia y software de análisis de imágenes. Estas métricas permiten una evaluación cuantitativa de la gravedad de la rotura de la cadena de ADN. Comparando los perfiles de cometas inmediatamente después de la inducción del daño en el ADN con los obtenidos tras la reparación, se puede estimar la eficiencia de^{reparación en 13}.
  El ensayo cometa ofrece varias ventajas, incluyendo operación sencilla, coste relativamente bajo, alta sensibilidad y resolución de célula única. El perfeccionamiento adicional de este método ha llevado al desarrollo de variantes modificadas con enzimas y ensayos de reparación de ADN in vitro basados en cometas, que pueden utilizarse para evaluar las actividades de BER y NER.

2. Reparación por escisión de bases (BER)

La reparación por escisión de bases (BER) es una vía de reparación del ADN altamente conservada que elimina principalmente pequeñas lesiones de base generadas por oxidación, alquilación y^{desaminación 14}. El BER comparte una importante superposición mecanicista con la reparación de rotura de una sola cadena (SSBR), y ciertos eventos SSBR se consideran extensiones del BER. Según la longitud del parche de reparación, el BER se clasifica en BER de parche corto (SP-BER) y BER de parche largo (LP-BER).

La BER se inicia mediante glicosilasas de ADN que reconocen y extirpan las bases dañadas al separar el enlace N-glicosídico entre la base y la desoxirribosa, generando así sitios apurínicos/apirimidínicos^{(AP) 15}. La endonucleasa AP 1 (APE1) posteriormente divide la columna vertebral del ADN en el lado 5′ del sitio AP, produciendo los terminales de fosfato 3′-OH y 5′-desoxirribosa (dRP). Durante SP-BER, se elimina el grupo dRP, la ADN polimerasa β (Polβ) llena la brecha de un solo nucleótido y la ligasa de ADN III (LigIII) completa la ligación.

La reparación de rupturas de cadena simple inducidas por alquilación que contienen terminaciones bloqueadas en 3′ sigue un mecanismo similar, pero requiere procesamiento adicional de extremos. La polinucleótida quinasa 3′-fosfatasa (PNKP) primero elimina terminales anormales de 3′ para generar un grupo 3′-OH adecuado. Posteriormente, Polβ rellena el nucleótido ausente y LigIII sella la mella para completar la reparación.

Métodos para detectar la eficiencia del BER

Ensayo de cometa modificado con enzimas
El ensayo Comet modificado por enzimas amplía el ensayo estándar de Comet incorporando enzimas reparadoras específicas de la lesión. Estas enzimas reconocen y cortan las bases dañadas, convirtiendo lesiones que de otro modo serían indetectables en fracturas de hebra detectables. La intensidad resultante de la cola del cometa refleja el nivel de daño en^{el ADN 16}˒¹⁷.
Para evaluar la eficiencia del BER, se utiliza formamidopirimidina ADN glicosilasa (FPG) o su homólogo mamífero, la 8-oxoxanina ADN glicosilasa (OGG1), para convertir lesiones de bases oxidadas en rupturas de cadena simple, que posteriormente se analizan mediante el ensayo^{Cometa 18}.
Ensayo de incisión
El ensayo de incisión es un enfoque fundamental in vitro para evaluar la actividad del BER. Los sustratos de ADN que contienen sitios AP se incuban con enzimas purificadas o extractos celulares, y se cuantifica la proporción de sustratos de ADN escindidos. Este ensayo refleja directamente la actividad incisional mediada por APE1 y proporciona alta especificidad y sensibilidad, minimizando la interferencia del entorno intracelular¹⁹.
Sin embargo, el ensayo de incisión no recapitula completamente la actividad de la BER en células vivas porque no puede evaluar la regulación dinámica del proceso completo de reparación, incluyendo el reconocimiento de lesiones, la excisión de bases, la cliveja del sitio AP, la síntesis de ADN y la^{ligadura 20}.
Sistema de reparación reconstituido
El sistema de reparación reconstituido es una plataforma experimental in vitro que reconstruye las vías de reparación del ADN utilizando proteínas purificadas de reparación. Este sistema permite un análisis detallado de las funciones moleculares e interacciones de proteínas de reparación individuales y es ampliamente utilizado para estudios mecanicistas y cribado de fármacos.
Para evaluar la eficiencia del BER, se incuban secuencialmente glicosilasas purificadas, endonucleasas AP, ADN polimerasas y ligases con sustratos de ADN dañados para reconstituir el reconocimiento, estiración, síntesis y ligadura de lesiones. Los productos de reparación se analizan mediante electroforesis en gel, marcaje de fluorescencia o espectrometría^{de masas 21}. Aunque este enfoque permite estudios mecanicistas altamente controlados, no tiene en cuenta la estructura de la cromatina ni la regulación celular global de la actividad de^{reparación 22}.
Ensayo de reparación basado en plásmidos
Los ensayos de reparación basados en plásmidos implican la introducción de plásmidos que contienen lesiones de ADN definidas en las células hospedadoras o la incubación con extractos celulares que contienen enzimas de reparación, seguida de una evaluación de la eficiencia de reparación mediante ensayos reporteros, citometría de flujo o análisis de formación^{de colonias 23}.
Para evaluar la eficiencia del BER, los plásmidos que contienen daño oxidativo en el ADN se incuban con extractos celulares y posteriormente se transforman en cepas bacterianas deficientes en reparación, como Escherichia coli. La eficiencia de la reparación se estima a partir de las tasas de formación de colonias.
Ensayo genético del reportero
Los ensayos de genes reporteros evalúan indirectamente la eficiencia de reparación del ADN o la actividad reguladora del gen midiendo la restauración de la expresión génica^{reportera 24}. En estos ensayos, se incorporan lesiones de ADN o elementos reguladores en los constructos del reportero, y la eficiencia de la reparación se cuantifica mediante cambios en la actividad del reportero tras la reparación.
Para el análisis BER, se puede insertar una lesión 8-oxoG en la región codificante de un gen reportero luciferasa. Si la lesión permanece sin reparar, la traslación se ve interrumpida; La reparación exitosa restaura la expresión de proteína reportera de longitud completa. Los plásmidos no dañados, como los vectores luciferasa de Renilla pRL-TK, se utilizan comúnmente como controles internos.
Reactivación de células hospedadoras (HCR)
La reactivación de células hospedadoras (HCR) es un ensayo clásico que evalúa indirectamente la eficiencia de la reparación del ADN midiendo la capacidad de las células hospedadoras para restaurar la expresión de plásmidos reporteros^{dañados 25}. Los plásmidos que portan lesiones definidas, como los dímeros de pirimidina inducidos por UV o los entrecruzamentos inducidos químicamente, se transfectan en las células hospedadoras. La eficiencia de reparación se cuantifica posteriormente midiendo la expresión génica del reportero.
Los ensayos HCR proporcionan una alta sensibilidad y permiten evaluar la actividad reparadora hacia tipos específicos de lesión. Sin embargo, se requiere una transfección eficiente y la preparación de plásmidos dañados de alta calidad. Una limitación importante de la HCR convencional es que el tratamiento de plásmidos con agentes dañinos del ADN suele generar poblaciones de lesiones heterogéneas a lo largo del plásmido, lo que complica la interpretación^{mecanicista 26}.
Para abordar estas limitaciones, se han desarrollado ensayos de reactivación de células hospedadoras basadas en citometría de flujo (FM-HCR) utilizando plásmidos específicos de lesión individual. FM-HCR permite un análisis cuantitativo rápido de la actividad de reparación en células vivas, aunque el ensayo requiere instrumentación especializada y tiene limitaciones para el análisis mecanicista simultáneo de múltiples vías^{BER 27}.
También se han desarrollado ensayos de reactivación de células hospedadoras de placas (PL-HCR) basados en sustratos específicos de la lesión para BER para investigar los mecanismos de la BER en células vivas (Figura 1)²⁸. En este enfoque, se introducen plásmidos que contienen una única lesión de^1,N 6-etenodenina (εA) en las células de los mamíferos. Tras la reparación, se recupera ADN plasmídico, se digiera con enzimas de restricción, se transforma en E. coli y se cuantifica mediante análisis de formación de placas. Los plásmidos completamente reparados se linearizan tras la digestión por restricción y no generan placas, mientras que los plásmidos no reparados o incompletamente reparados permanecen circulares y forman placas. Por tanto, la eficiencia del BER se determina mediante la cuantificación de placas.
Detección de daños asistida por reparación
La detección asistida por reparación de daños (TAD) es un método de molécula única para detectar y cuantificar daños en el^{ADN 29}. En este enfoque, las enzimas reparadoras específicas de la lesión reconocen y extirpan las bases dañadas, tras lo cual las ADN polimerasas incorporan nucleótidos marcados con fluorescencia en los huecos resultantes. Las moléculas de ADN se visualizan posteriormente mediante microscopía de fluorescencia, lo que permite la detección y cuantificación directa de lesiones de ADN (Figura 2)³⁰.
RADD proporciona un análisis cualitativo y cuantitativo altamente sensible del daño al ADN a nivel de molécula única. Sin embargo, el método mide principalmente la carga de daño al ADN en lugar de evaluar directamente la cinética de reparación o la eficiencia general de reparación en poblaciones celulares.

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Figura 1: Reactivación de la célula huésped en placa (PL-HCR). El ADN circular de cadena simple M13mp18 que contiene una lesión definida se transfecta en células competentes. Tras la transfección, las células se cultivan en placas de agar para permitir la formación de placas. El ADN replicativo de M13 se aísla posteriormente de placas, se digiera con enzimas de restricción y se analiza mediante electroforesis en gel para distinguir productos mutantes y salvajes y determinar si se ha producido reparación de la lesión. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Detección asistida de daños por reparación (RADD). Los huecos de cadena simple generados durante la reparación del ADN se llenan con nucleótidos marcados con biotina. A continuación, se utiliza avidina o estreptavidina marcada con fluorescencia para detectar nucleótidos incorporados, lo que permite una evaluación cuantitativa de los niveles de daño en el ADN mediante análisis de fluorescencia. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Reparación por escisión de nucleótidos (NER)

La reparación por escisión de nucleótidos (NER) es una vía principal de reparación del ADN responsable de eliminar lesiones voluminosas que distorsionan la doble hélice³¹ del ADN. Los sustratos de NER incluyen dímeros de ciclobutano pirimidina inducidos por UV (CPD), fotoproductos de 6-4 pirimidina (6-4PPs), lesiones oxidativas de purinas, aductos químicos voluminosos y enlaces intrahebrales inducidos por^{cisplatino 32}. Los defectos en la NER están asociados a trastornos como la xerodermia pigmentosa, que se caracteriza por una sensibilidad extrema a los rayos UV y una mayor susceptibilidad al cáncer.

NER consta de dos principales subvías: el genoma global NER (GG-NER⁾³³ y el NER acoplado a transcripción (TC-NER34). GG-NER examina todo el genoma en busca de lesiones que distorsionan la hélice, suprimiendo así la mutagénesis y la carcinogénesis. En cambio, TC-NER elimina selectivamente lesiones bloqueadoras de transcripción de genes transcritos activamente y es esencial para mantener la integridad transcripcional. Los defectos en el TC-NER contribuyen a trastornos como el síndrome de Cockayne y el síndrome sensible a los rayos UV³⁵.

Métodos para detectar la eficiencia del NER

Ensayo de incisión
El ensayo de incisión evalúa la eficiencia del NER detectando incisiones en cadenas introducidas en los sitios de daño del ADN por proteínas de reparación. En este ensayo, se incuban sustratos de ADN dañados, como el ADN irradiado UV que contienen DPC, con proteínas de reparación o extractos celulares, y posteriormente se detectan^{productos de incisión 36}.
El marcaje por radiodifusión o fluorescencia puede utilizarse para mejorar la sensibilidad y permitir un seguimiento preciso de la actividad^{incisiva 37}. El ensayo mide directamente la actividad de las proteínas clave de NER responsables del reconocimiento y escisión. Sin embargo, la implementación exitosa requiere la preparación de sustratos dañados de alta calidad y extractos de proteínas activas.
Ensayo de reparación enzimática de cometas
La eficiencia del NER también puede evaluarse mediante ensayos Comet modificados por enzimas. En este enfoque, la endonucleasa T4 V se incuba con células dañadas para convertir los dímeros pirimidinos en rupturas detectables de cadena simple, que posteriormente se analizan mediante el ensayo^{Comet 38}.
PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real (qPCR)
La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) evalúa indirectamente la eficiencia de reparación del ADN midiendo los efectos inhibitorios de las lesiones en el ADN en la amplificación por^{PCR 39}. Durante el análisis NER, la irradiación UV se utiliza primero para inducir dímeros de pirimidina. Estas lesiones dificultan la progresión de la ADN polimerasa y reducen la eficiencia de amplificación, lo que resulta en un aumento de los valores del umbral de ciclo (Ct). Tras la reparación por la vía NER, se restaura la integridad del ADN y la eficiencia de amplificación mejora, lo que conduce a valores de Ct más bajos. Por tanto, la eficiencia de la reparación puede cuantificarse comparando la amplificación antes y después de la reparación respecto a una región de control^{interna 40} intacta.
Además, la qPCR puede utilizarse para evaluar los niveles de expresión de genes implicados en las vías de señalización y reparación del daño al ADN, incluyendo ATM, ATR, BRCA1, CDKN1A y XPC, reflejando indirectamente la capacidad de reparación^{del ADN 41}.
Reactivación de células huésped basada en citometría de flujo (FM-HCR)
Los ensayos FM-HCR utilizan plásmidos específicos de lugar que contienen lesiones transfectados en las células hospedadoras y cuantifican la eficiencia de reparación mediante análisis citométrico de flujo de intensidad de fluorescencia y proporción de células fluorescentes (Figura 3)⁴²˒⁴³. El aumento de la intensidad de fluorescencia generalmente refleja una mayor capacidad de reparación^{del ADN 44}˒⁴⁵.
Secuenciación de reparación por escisión (XR-seq)
La secuenciación por reparación por escisión (XR-seq) es una técnica genómica para mapear la actividad del NER a resolución de nucleótido único. Este método enriquece y secuencia selectivamente los oligonucleótidos que contienen daño y eliminados durante el NER, generando así mapas de alta resolución de la actividad de reparación en todo el genoma. XR-seq permite un análisis cuantitativo de la eficiencia de reparación y los patrones de distribución asociados tanto con las vías GG-NER como TC-NER, y representa un avance tecnológico importante en la investigación de NER.
Dado que la NER consta de dos subvías mecánicamente distintas e involucra numerosas proteínas de reparación, se requieren múltiples métodos complementarios para una evaluación integral de la actividad de^{reparación 46}˒⁴⁷. Además de los métodos descritos anteriormente, la eficiencia del NER también puede evaluarse utilizando Western bloting, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de reparación basados en plásmidos y ensayos de genes reporteros.

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Figura 3: Principio de detección de la reactivación de células huésped basada en citometría de flujo (FM-HCR). Los plásmidos que contienen cuatro tipos distintos de daño en el ADN se co-transfectan en células de mamíferos cultivadas. La capacidad de reparación del ADN (DRC) se cuantifica posteriormente mediante citometría de flujo basada en la intensidad de fluorescencia del reportero. DRC, capacidad de reparación de ADN. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Reparación de desajustes (MMR)

La reparación de desajustes (MMR) es una vía postreplicativa de corrección de errores responsable de reparar desajustes de base, como los desparejamientos G-T y A-C, así como pequeños bucles de inserción-deleción generados durante la replicación^{del ADN 48}. La MMR se inicia cuando MutS reconoce bases desajustadas, tras lo cual MutL recluta factores de reparación aguas abajo y exonucleasas para activar el proceso^{de reparación 49}. Un paso fundamental en la MMR es la discriminación entre las cadenas de ADN parentales y las nuevas hebras^{de ADN sintetizadas 50}.

En los procariotas, la discriminación de hebras se logra mediante la metilación del ADN, que marca la cadena parental. En los eucariotas, la identidad de la cadena se determina mediante cortones transitorios en el ADN recién sintetizado e interacciones con el antígeno nuclear celular proliferante (PCNA). La MMR mejora sustancialmente la fidelidad de la replicación y desempeña un papel esencial en el mantenimiento de la estabilidad^{genómica 51}. Los defectos en la MMR están fuertemente asociados con múltiples tipos de cáncer, incluido el síndrome de Lynch.

Métodos para evaluar la eficiencia de la MMR

Pruebas de inestabilidad de microsatélites
Un MMR defectuoso provoca la incapacidad de corregir los errores de deslizamiento de replicación en loci de microsatélites, lo que conduce a la inestabilidad de microsatélites (MSI). Las pruebas MSI implican amplificación por PCR de marcadores microsatélites representativos seguida de un análisis de fragmentos basado en electroforesis capilar. La inestabilidad en múltiples loci indica una actividad MMR deteriorada, mientras que los perfiles estables de microsatélites indican una función MMR intacta. La prueba MSI proporciona alta sensibilidad y especificidad para identificar deficiencias de MMR; sin embargo, sigue siendo una medida indirecta de la función de la MMR y no evalúa cuantitativamente la eficiencia de la reparación.
Los plásmidos reporteros que contienen desajustes definidos o bucles de inserción-deleción también pueden utilizarse para evaluar la eficiencia de la MMR mediante ensayos de genes reporteros. Además, los ensayos Western blot e inmunofluorescencia dirigidos a proteínas asociadas a la vírica vírica viral pueden proporcionar una evaluación indirecta de la actividad de las vías.

5. Reparación de doble hilo (DSB)

Las rupturas de doble cadena (DSB) están entre las formas más citotóxicas de daño al ADN. El fallo en reparar correctamente los DSB puede resultar en mutaciones, deleciones cromosómicas, translocaciones, inestabilidad genómica y tumorigénesis. La reparación del DSB ocurre principalmente mediante recombinación homóloga (HR) y unión no homóloga de extremos (NHEJ), que operan preferentemente durante diferentes fases del ciclo celular⁵².

Métodos para evaluar la eficiencia de la reparación de DSB

Ensayo de focos gamma-H2AX
El ensayo de focos γ-H2AX es uno de los métodos más utilizados para detectar indirectamente los DSB. Tras la formación de DSB, la histona H2AX se fosforila rápidamente en Ser139 para generar focos γ-H2AX. El número de focos γ-H2AX se correlaciona con el grado de formación de DSB, y la eficiencia de reparación puede inferirse monitorizando la tasa de desaparición de focos a lo largo del tiempo mediante microscopía de inmunofluorescencia.
Este ensayo ofrece varias ventajas, incluyendo alta sensibilidad, resolución de células individuales y protocolos experimentales establecidos, lo que lo convierte en un método central en la investigación sobre la respuesta al daño al ADN (DDR).
BENDICIÓN y DICHA
BLESS (Breaks Labeling, Enrichment on Streptavidin, and Sequencing) y BLISS (Breaks Labeling In Situ and Sequencing) son métodos de mapeo DSB a nivel genómico basados en marcaje in situ y secuenciación de alto rendimiento (in situ). Ambos enfoques identifican sitios de DSB mediante la ligación directa de adaptadores de secuenciación a extremos de ADN rotos, permitiendo una localización y cuantificación precisa a nivel genómico de los DSB. Estos métodos también pueden utilizarse para evaluar la cinética global de reparación del DSB.
Además, los ensayos genéticos reporteros específicos de DSB pueden evaluar cuantitativamente la eficiencia de reparación de DSB y distinguir la reparación mediada por la HR de la reparación mediada por NHEJ (Figura 4). Sin embargo, aunque los ensayos γ-H2AX, BLESS y BLISS miden eficazmente la carga global de DSB y la cinética de reparación, no pueden determinar si la reparación ocurrió específicamente a través de las vías HR o NHEJ.

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Figura 4: Ensayo genético reportero para la reparación de ruptura de doble cadena (DSB). Los plásmidos reporteros de DSB se introducen en las células objetivo. Tras un periodo de reparación adecuado tras la transfección, se monitoriza la fluorescencia del gen reportero mediante microscopía de fluorescencia para evaluar la eficiencia de reparación del DSB. DSB, ruptura de doble hebra. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

6. Reparación por recombinación homóloga (HR)

La recombinación homóloga (HR) es una vía de reparación del ADN de alta fidelidad que funciona principalmente durante las fases S y G2 del ciclo celular, cuando una cromátida hermana intacta está disponible como plantilla^{de reparación 53}. Tras la formación del DSB, el complejo MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) reconoce los extremos del ADN e inicia la resección de los extremos del ADN en cooperación con CtIP⁵⁴. Este proceso genera sobresalientes de ADN monocatenario (ssDNA) de 3′.

El ADN ssDNA resultante está inicialmente recubierto por la proteína replicadora A (RPA), que protege el ADN de la degradación de la nucleasa y previene la formación de estructuras^{secundarias 55}. Posteriormente, BRCA2 media la sustitución de RPA por la recombinasa RAD51, dando lugar a la formación de un filamento de nucleoproteína^{RAD51 56}. Este filamento busca secuencias de ADN homólogas en la cromátida hermana y promueve la invasión de hebras en la plantilla de ADN dúplex homólogo, generando una estructura de bucle de desplazamiento (D-loop)⁵⁷˒⁵⁸. La síntesis de ADN y el intercambio de cadenas proceden luego a la reparación completa.

La eficiencia de la HR puede evaluarse cuantitativamente utilizando sistemas reporteros DR-GFP en ensayos de genes reporteros. Alternativamente, se puede realizar una evaluación indirecta utilizando ensayos de Western blot o inmunofluorescencia dirigidos a proteínas asociadas a HR.

7. Unión no homóloga de extremos del ADN (NHEJ)

La unión de extremos no homóloga (NHEJ) repara los DSB sin requerir una extensa homología de secuencias entre los extremos⁵⁹ del ADN. En su lugar, los extremos de ADN rotos se procesan y ligan directamente, lo que convierte a la NHEJ en una vía de reparación inherentemente propensa a errores. Dado que los extremos del ADN pueden sufrir degradación antes de la ligación y los extremos de DSB no relacionados pueden unirse, el NHEJ puede provocar mutaciones, deleciones y reordenamientos^{cromosómicos 60}.

Se reconocen tres formas principales de reparación no homóloga: NHEJ clásica, recocido de cadena simple (SSA) y unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ).

NHEJ Clásico
El NHEJ clásico opera durante todo el ciclo celular. El heterodímero Ku70/Ku80 primero reconoce y se une a los extremos^{DSB 61}. Este complejo recluta la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN (ADN-PKcs), lo que conduce a la activación de la señalización quinasa e inicio de la NHEJ. Las enzimas de procesamiento final, incluidas nucleasas y fosfatasas, procesan posteriormente los extremos dañados del ADN antes de que el complejo ligasa IV XRCC4-ADN media la ligación del ADN^{en los extremos 62}. Debido a que el procesamiento terminal suele provocar pérdida de nucleótidos o reincorporaciones inexactas, el NHEJ se considera una vía de reparación^{mutagénica 63}˒⁶⁴.
Recocido de una sola hilo (SSA)
El recocido de cadena simple (SSA) repara los DSB que ocurren entre secuencias homólogas repetidas. Tras la formación de DSB, las nucleasas resecan los extremos del ADN 5′, generando sobresalientes extendidos de ADN s 3′. RAD52 media el recocido entre repeticiones homólogas^{complementarias 65}. Posteriormente, el complejo endonucleasa XPF-ERCC1 elimina colgajos de ADN no apareados, y el complejo SLX1-SLX4 también puede participar en el procesamiento final. La ligasa de ADN sella entonces los huecos restantes. Debido a que las secuencias localizadas entre repeticiones homólogas se eliminan durante la reparación, la SSA se considera un mecanismo de reparación rápido pero inherentemente^{mutagénico 66}.
Unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ)
La unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ), también conocida como NHEJ alternativo (Alt-NHEJ), es otra vía de reparación de DSB propensa a^{errores 67}. En el MMEJ, se utilizan secuencias microhomólogas cortas situadas cerca de los extremos de ruptura del ADN para alinear los extremos rotos del ADN antes de la reparación. Tras el reconocimiento de estas regiones microhomólogas, los extremos del ADN se unen mediante un proceso similar a^{la recombinación 68}. Debido a que la MMEJ se basa en secuencias homólogas muy cortas, las deleciones y los reordenamientos genómicos suelen ocurrir durante la reparación.
La eficiencia de NHEJ puede evaluarse cuantitativamente utilizando sistemas reporteros EJ5-GFP en ensayos de genes reporteros. Alternativamente, la actividad de reparación puede evaluarse indirectamente mediante Western blot y análisis de inmunofluorescencia de proteínas asociadas a NHEJ.

8. Reparación de enlaces cruzados entre los trenes (ICL)

Los enlaces cruzados entre cadenas (ICL) son lesiones de ADN altamente tóxicas que unen covalentemente las dos cadenas de la doble hélice del ADN, bloqueando así la replicación y transcripción del ADN. La reparación de ICL es mecánicamente compleja y consiste principalmente en la vía de anemia de Fanconi (FA) y la vía^{NEIL3 69}.

En la vía FA, FANCM reconoce lesiones ICL y promueve la monoubiquitinación del complejo FANCI-FANCD2, activando así las proteínas de reparación^{aguas abajo 70}. Las nucleasas específicas de la estructura incisionan posteriormente el ADN cerca de la entrecruzada para separar las dos cadenas de ADN, y las DSB resultantes se reparan mediante vías de HR o NHEJ.

En la vía NEIL3, la ADN glucosilasa NEIL3 divide enlaces glucosídicos asociados con la lesión ICL, generando sitios AP que posteriormente son evitados por las polimerasas 71 de síntesis de translesión (TLS^). Dado que las ICLs impiden la separación de hebras necesaria para la replicación y la transcripción, estas lesiones son altamente citotóxicas y contribuyen al envejecimiento, la neurodegeneración y el cáncer⁷²˒⁷³.

La eficiencia de reparación de ICL puede evaluarse mediante ensayos de reparación basados en plásmidos, ensayos de genes reporteros, ensayos de reactivación de células hospedadoras y sistemas de reparación reconstituidos in vitro .

9. Síntesis de translesiones (TLS)

La síntesis de translesiones (TLS) es un mecanismo de tolerancia al daño en el ADN que permite que la replicación continúe a través de lesiones de ADN^{no reparadas 74}. La TLS involucra principalmente ADN polimerasas especializadas, incluyendo las polimerasas κ, η, ι y ζ. Cuando la replicación del ADN se detiene en los sitios dañados, las polimerasas TLS evitan la lesión y permiten que la replicación continúe, manteniendo así la estabilidad del^{genoma 75}.

A diferencia de BER, NER, MMR, HR y NHEJ, que eliminan o reparan directamente las lesiones del ADN, el TLS no elimina el daño en el ADN. En cambio, evita lesiones no reparadas durante la replicación del ADN y, por tanto, se clasifica como un mecanismo de tolerancia al daño en lugar de una vía^{canónica de reparación del ADN 76}.

TLS puede dividirse en rutas de bypass sin errores y propensas a errores. El TLS sin errores inserta el nucleótido correcto frente a la lesión, mientras que el TLS, propenso a errores, introduce frecuentemente nucleótidos incorrectos y contribuye a la mutagénesis. La TLS, propensa a errores, se considera un mecanismo principal por el cual los carcinógenos ambientales inducen mutaciones genómicas. En consecuencia, la modulación de las vías TLS propensas a errores puede representar una estrategia potencial para la prevención y tratamiento del cáncer⁷⁷.

Métodos para evaluar la eficiencia de TLS

Aislamiento de proteínas en ADN incipiente (iPOND)
El aislamiento de proteínas en ADN naciente (iPOND) es una técnica utilizada para analizar proteínas asociadas con ADN recién sintetizado en horquillas de replicación estancadas. Dado que la actividad de TLS ocurre frecuentemente en forks estancados, iPOND permite el análisis dinámico del reclutamiento y ensamblaje de polimerasas TLS y proteínas de respuesta al daño al ADN (DDR) durante el estrés de replicación. Por tanto, este método puede utilizarse para evaluar la actividad de TLS y los procesos de reparación acoplada por replicación.
La eficiencia del TLS también puede evaluarse utilizando plásmidos reporteros que contienen lesiones de ADN específicas de TLS en ensayos génicos reporteros. Además, los ensayos de Western blot e inmunofluorescencia dirigidos a proteínas asociadas a TLS pueden proporcionar una evaluación indirecta de la actividad de las vías.

10. Consideraciones de control de calidad y reproducibilidad en el diseño experimental

Replicación biológica y replicación técnica
Es esencial distinguir claramente entre réplicas biológicas y réplicas técnicas para garantizar la fiabilidad y reproducibilidad en los estudios de reparación del ADN. En general, se deben incluir al menos tres réplicas biológicas independientes para cada experimento, mientras que el número de réplicas técnicas debe determinarse según la variabilidad de la plataforma de detección.
Para ensayos de célula única, como el ensayo cometa y el análisis de focos basados en inmunofluorescencia, se deben analizar al menos entre 50 y 100 células por réplica biológica para minimizar el sesgo de muestreo. En ensayos reporteros basados en citometría de flujo, incluidos los ensayos DR-GFP y FM-HCR, se deben recoger al menos 10.000 eventos de células vivas por muestra para garantizar la robustez estadística.
Estrategia de estandarización
La comparación cuantitativa precisa de la eficiencia de reparación entre diferentes muestras o lotes experimentales requiere rigurosos procedimientos de normalización para minimizar la variación sistemática derivada de diferencias en eficiencia de transfección, viabilidad celular, carga de muestras y rendimiento del instrumento. Las estrategias de normalización más comunes incluyen las siguientes:
1. Co-transfección de plásmidos de normalización
  En ensayos HCR, ensayos de reparación basados en reporteros y ensayos de reparación basados en plásmidos, se recomienda la co-transfección con un plásmido de normalización no afectado por daño en el ADN. Los controles comúnmente utilizados incluyen pRL-TK, plásmidos de luciferasa Renilla o vectores GFP expresados constitutivamente. La eficiencia de reparación se normaliza calculando la relación entre la señal experimental del reportero y la señal del reportero de control.
2. Normalización mediante proteínas de mantenimiento o tinción total de proteínas
  En análisis Western blot que evalúan la expresión proteica de reparación o los niveles residuales de CPD, la normalización debe realizarse utilizando proteínas de mantenimiento, como GAPDH, β-actina o histona H3, o mediante métodos de tinción total de proteínas, incluyendo la tinción Ponceau S o REVERT.
3. Controles sin daños
  En ensayos de reparación basados en qPCR, las regiones genómicas no dañadas deben amplificarse como controles internos y los niveles relativos de daño deben calcularse mediante el método ΔCt. De manera similar, los ensayos HCR deben incluir controles de plásmidos sin daños que representen la máxima expresión del reportero, permitiendo expresar la eficiencia de reparación relativa a los plásmidos de referencia no dañados.
4. Normalización de número de celda
  En ensayos basados en citometría de flujo, incluidos los ensayos FM-HCR y DR-GFP, se deben analizar un número igual de células viables entre muestras. La eficiencia de reparación debe informarse posteriormente como el porcentaje de células positivas o cambios relativos en la intensidad de fluorescencia.
Dimensión cinética de la medición de la eficiencia de reparación
La reparación del ADN es un proceso dinámico, y las mediciones obtenidas en un único punto temporal pueden no distinguir entre reparación retardada y deficiencia completa de la vía. Por lo tanto, se recomiendan encarecidamente los diseños experimentales por curso temporal.
Tras la inducción del daño por ADN, las muestras deben recogerse en múltiples momentos secuenciales, como 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 y 24 horas, para monitorizar la acumulación y eliminación de marcadores de daño o productos de reparación. La cinética de la desaparición de señales proporciona información importante sobre la tasa de reparación, la integridad de las vías y la eficiencia general de la reparación.
Corrección de múltiples hipótesis:
Los enfoques de alto rendimiento y multiplexados suelen implicar análisis simultáneos de múltiples vías de reparación o condiciones experimentales, aumentando así el riesgo de resultados falsos positivos debido a múltiples comparaciones estadísticas. Ejemplos incluyen la evaluación simultánea de las actividades BER, NER, RH y NHEJ utilizando ensayos FM-HCR; análisis de DSB a nivel genómico usando BLESS o BLISS; y análisis basado en matrices qPCR de la expresión génica de reparación del ADN.
Por lo tanto, los métodos de corrección estadística para la prueba de hipótesis múltiples deben estar predefinidos durante el diseño experimental. Los métodos de corrección seleccionados y los umbrales ajustados de significación deben informarse claramente en las secciones de Materiales y Métodos y análisis estadístico.

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Conclusiones

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La detección precisa y el análisis cuantitativo de los procesos de reparación del daño en el ADN son esenciales para comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la reparación del ADN, evaluar los efectos biológicos de las exposiciones ambientales y evaluar las respuestas terapéuticas⁷⁸. Por lo tanto, la investigación en profundidad de las vías de reparación de daños por ADN y la eficiencia de la reparación tiene una importancia considerable tanto en la inv...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia ni relaciones personales que pudieran haber influido en el trabajo reportado en este estudio.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Centro de Investigación de Ingeniería de la Provincia de Jiangsu para el Desarrollo y Traducción de Tecnologías Clave para la Prevención y Control de Enfermedades Crónicas; el Equipo de Investigación Innovadora en Ciencia y Tecnología de la Institución de Educación Superior de Jiangsu (2021); el Programa del Centro de Investigación en Tecnología de Ingeniería del Colegio Vocacional de Jiangsu (2023); la Fundación Clave de Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu de China (Subvención nº 24KJA310008); el Programa Clave del Colegio de Salud Vocacional de Suzhou (Grant No. szwzy202406); y el Laboratorio Clave Estatal de Medicina y Protección Radioterápica de la Universidad Soochow (Grant No. GZK1202506).

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V as de reparaci n del ADN estabilidad gen mica terapia contra el c ncer desarrollo de f rmacos quimioterap uticos evaluaci n de la actividad funcional validaci n de la funci n g nica capacidad de reparaci n del ADN transformaci n celular

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