Un protocolo de montaje en cinta para la imagen de alta resolución en pila en Z de ojos compuestos de Drosophila

Summary

El objetivo principal de este protocolo es permitir la obtención de imágenes no destructivas y el análisis cuantitativo de los ojos compuestos de Drosophila. Combina una estrategia de montaje en cinta con la adquisición estereomicroscópica de la pila Z y la reconstrucción de profundidad de enfoque extendida para producir imágenes de alta resolución y libres de artefactos.

Abstract

Aquí presentamos un protocolo de montaje e imagen no destructivo para el análisis fenotípico de alta resolución del ojo compuesto de Drosophila. La fenotipización precisa del ojo compuesto de Drosophila suele estar limitada por su geometría convexa y fragilidad mecánica durante el manejo. Para abordar esto, detallamos un flujo de trabajo de imagen versátil y no invasivo que permite la visualización de alta resolución desde múltiples perspectivas. El protocolo utiliza una estrategia de montaje adhesivo personalizada sobre una plataforma de cinta invertida, asegurando las moscas por el cuerpo y las alas mientras deja la cabeza completamente intacta. De manera crucial, esta configuración flexible soporta orientaciones de montaje distintas: una posición lateral para captar la convexidad completa de los ojos individuales y una posición frontal para evaluar la simetría de toda la cabeza. Este método también facilita la disposición de matrices de alta densidad, permitiendo el procesamiento rápido de 20–30 muestras por sesión. Al integrar la estereomicroscopía de luz reflejada con la adquisición por pila Z y la reconstrucción de profundidad de enfoque extendida (EDF), el flujo de trabajo genera imágenes compuestas cuasi-3D uniformemente nítidas. Este enfoque preserva la pigmentación natural y produce imágenes de alta fidelidad y con mucho contraste, adecuadas para el análisis fenotípico cuantitativo a escala de órganos.

Introduction

El ojo compuesto de Drosophila melanogaster es un modelo clásico y potente para estudiar el crecimiento, el patrón y la robustez de órganos durante el desarrollo. Compuesto por aproximadamente 800 ommatidios altamente ordenados, el ojo de mosca proporciona una lectura sensible y cuantificable de las perturbaciones genéticas que afectan a la proliferación, diferenciación y organización^{tisular 1,2,3}. La manipulación genética del desarrollo ocular ha proporcionado históricamente conocimientos fundamentales sobre las vías de señalización....

Protocol

1. Recogida y sincronización de muestras

NOTA: Para garantizar la comparabilidad experimental, se requiere un control estricto del momento de la eclosión. Bajo condiciones estándar de cultivo a 25 °C, la eclosión suele ocurrir entre 10 y 12 días después de la puesta de huevos. Las pupas deben ser monitorizadas de cerca durante esta ventana, ya que el oscurecimiento de la casquilla pupal indica una eclosión inminente.

1. Método de tapping directo (método estándar)
   1. Golpea suavemente el frasco estándar de cultivo de Drosophila de plástico 24 x 95 mm (sellado con un ....

Results

La trayectoria experimental completa, desde la recogida de muestras hasta la adquisición de imágenes, se resume en la Figura 1. La eficiencia del protocolo modificado se demuestra mediante la creación de matrices de muestras de alta densidad. Como se muestra en la Figura 2A, entre 20 y 30 moscas anestesiadas pueden organizarse en un patrón de cuadrícula sobre una única plataforma de cinta invertida. Los marcadores de orientación.......

Discussion

El ojo compuesto de Drosophila sirve como una potente lectura fenotípica para el cribado genético, donde los cambios observables en el tamaño del ojo, rugosidad o^{pigmentación 2,3,8} suelen indicar perturbaciones en vías fundamentales de señalización como Hippo ^5,6 o ^{Hedgehog 7}. Sin embargo, la eficiencia d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cilindro de gas de dióxido de carbono (CO2)	Proveedor local	N/A
Cerbatana anestesia COsub2<>	T& L	DG-08
Cámara de microscopio digital	Leica	DMC6200
Pinzas finas	VETUS	MOS-167B
Tapones de espuma	Dongpeng	N/A
Software de adquisición de imágenes (LAS X)	Leica	3.7.1
Software de procesamiento de imágenes (FIJI/ImageJ)	NIH	Código abierto
Iluminador LED para cúpula	Leica	LED5000 IDH
Iluminador LED de cuello de ganso	Cossim	LG-10
Estereomicroscopio motorizado	Leica	M205 FCA
Lente objetivo	Leica	PlanApo NA0.2 1.0x
Válvula de pedal neumática	DELIXI	FV-320
Viales estándar de cultivo de Drosophila	LAIBOER	2424951
Medio alimenticio estándar de Drosophila	N/A	Harina de maíz-agar-melaza
Portaobjetos estándar de microscopio de vidrio	Citotest	10127101P-G
Estereomicroscopio estándar	Nikon	SMZ745
Cinta de enmascarar de papel blanca	UBWIN	25 mm de ancho