Un protocolo de montaje en cinta para la imagen de alta resolución en pila en Z de ojos compuestos de Drosophila

Summary

El objetivo principal de este protocolo es permitir la obtención de imágenes no destructivas y el análisis cuantitativo de los ojos compuestos de Drosophila. Combina una estrategia de montaje en cinta con la adquisición estereomicroscópica de la pila Z y la reconstrucción de profundidad de enfoque extendida para producir imágenes de alta resolución y libres de artefactos.

Abstract

Aquí presentamos un protocolo de montaje e imagen no destructivo para el análisis fenotípico de alta resolución del ojo compuesto de Drosophila. La fenotipización precisa del ojo compuesto de Drosophila suele estar limitada por su geometría convexa y fragilidad mecánica durante el manejo. Para abordar esto, detallamos un flujo de trabajo de imagen versátil y no invasivo que permite la visualización de alta resolución desde múltiples perspectivas. El protocolo utiliza una estrategia de montaje adhesivo personalizada sobre una plataforma de cinta invertida, asegurando las moscas por el cuerpo y las alas mientras deja la cabeza completamente intacta. De manera crucial, esta configuración flexible soporta orientaciones de montaje distintas: una posición lateral para captar la convexidad completa de los ojos individuales y una posición frontal para evaluar la simetría de toda la cabeza. Este método también facilita la disposición de matrices de alta densidad, permitiendo el procesamiento rápido de 20–30 muestras por sesión. Al integrar la estereomicroscopía de luz reflejada con la adquisición por pila Z y la reconstrucción de profundidad de enfoque extendida (EDF), el flujo de trabajo genera imágenes compuestas cuasi-3D uniformemente nítidas. Este enfoque preserva la pigmentación natural y produce imágenes de alta fidelidad y con mucho contraste, adecuadas para el análisis fenotípico cuantitativo a escala de órganos.

Introduction

El ojo compuesto de Drosophila melanogaster es un modelo clásico y potente para estudiar el crecimiento, el patrón y la robustez de órganos durante el desarrollo. Compuesto por aproximadamente 800 ommatidios altamente ordenados, el ojo de mosca proporciona una lectura sensible y cuantificable de las perturbaciones genéticas que afectan a la proliferación, diferenciación y organización^{tisular 1,2,3}. La manipulación genética del desarrollo ocular ha proporcionado históricamente conocimientos fundamentales sobre las vías de señalización conservadas. Estudios fundamentales demostraron que la expresión ectópica del factor de transcripción eyeless es suficiente para inducir la formación ocular en tejidos no retinianos, estableciendo el ojo como paradigma para la especificación y plasticidad^{de órganos 4}. Trabajos posteriores identificaron la vía de señalización del hipopótamo de D. melanogaster como un regulador central del tamaño ocular y el número celular mediante el control coordinado de la proliferación y la apoptosis ^5,6. Paralelamente, se demostró que la señalización de Hedgehog y BMP regula la progresión morfogenética, la precisión del crecimiento y el patrón espacial dentro de la retina en^{desarrollo 7,8}.

Sin embargo, capturar imágenes de alta fidelidad del ojo compuesto adulto presenta desafíos ópticos significativos debido a su geometría convexa y hemisférica. La microscopía estándar de campo brillante está limitada por una profundidad de campo poco profunda, lo que hace imposible enfocar simultáneamente el punto dorsal (polo) y los bordes marginales (ecuador) del ojo en una sola^{exposición 9}. Esta limitación suele dar lugar a imágenes donde partes significativas de la superficie retiniana están borrosas, dificultando la aplicación de análisis de imágenes de alta resolución y herramientas de aprendizaje automático diseñadas para cuantificar fenotipos variegados. Para caracterizar completamente la superficie retiniana, es necesario visualizar toda la curvatura sin artefactos ópticos. Por lo tanto, se requiere un método de imagen que preserve la morfología ocular nativa y que permita la visualización de alta resolución de toda la superficie curva de la retina.

Además, los métodos tradicionales de preparación de muestras para microscopía a menudo comprometen la integridad estructural de la cabeza de la mosca. Las técnicas de montaje convencionales suelen depender de adhesivos que pueden ocultar detalles superficiales o implican manipulación física con pinzas que ejercen presión sobre la cápsula cefálica. Como se observa en estudios sobre morfogénesis retiniana, la integridad estructural del ojo es fundamental. La presión directa o la perforación provocan fugas de hemolinfa, lo que provoca pérdida de presión interna y el posterior colapso o "abolladura" de la superficie ocular. Estos artefactos mecánicos pueden imitar fenotipos neurodegenerativos o defectos genéticos, lo que puede dar lugar a resultados falsos positivos en cribados a gran escala. El objetivo de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo de montaje e imagen no destructivo para la visualización de alta resolución de ojos compuestos intactos de Drosophila.

Aquí presentamos un flujo de trabajo de imagen rápido y reproducible que permite la visualización de alta resolución de los ojos compuestos intactos de Drosophila y la morfología de toda la cabeza sin contacto directo con la cabeza. En este método, las moscas adultas se inmovilizan mediante una estrategia de montaje adhesivo flexible que asegura el cuerpo y las alas, permitiendo una posición estable tanto en orientación lateral —para capturar la curvatura completa de un solo ojo— como en orientación frontal — para evaluar la simetría de toda la cabeza y las características interoculares. Esta versátil estrategia de montaje minimiza los daños mecánicos y preserva la geometría ocular natural en tres dimensiones. Cuando se combina con estereomicroscopía de luz reflejada, adquisición por pila Z y reconstrucción de profundidad de enfoque^extendida, este enfoque genera imágenes uniformemente nítidas y de alta calidad desde múltiples perspectivas, adecuadas tanto para la inspección cualitativa como para el análisis fenotípico cuantitativo. Este método es especialmente adecuado para estudios de perturbaciones genéticas, fenotipos del desarrollo y cribado de alto rendimiento de la morfología ocular en Drosophila.

Protocol

1. Recogida y sincronización de muestras

NOTA: Para garantizar la comparabilidad experimental, se requiere un control estricto del momento de la eclosión. Bajo condiciones estándar de cultivo a 25 °C, la eclosión suele ocurrir entre 10 y 12 días después de la puesta de huevos. Las pupas deben ser monitorizadas de cerca durante esta ventana, ya que el oscurecimiento de la casquilla pupal indica una eclosión inminente.

1. Método de tapping directo (método estándar)
   1. Golpea suavemente el frasco estándar de cultivo de Drosophila de plástico 24 x 95 mm (sellado con un tapón de espuma) contra una almohadilla blanda para desalojar las moscas adultas hasta el fondo.
   2. Retira rápidamente el tapón y alinea la boca de un vial de recogida fresca con el vial de cultivo.
   3. Invierte la configuración para que el vial de cultivo quede encima. Golpea suavemente las paredes para transferir las moscas al frasco de recogida.
      NOTA: Este método no se recomienda si el medio estándar de harina de maíz y agar es húmedo, ya que las moscas recién cerradas se atrapan y matan fácilmente. Para minimizar la mortalidad, primero se recogen moscas en un vial vacío de 24 x 95 mm. Tras la anestesia (Paso 3), transfiere las moscas a la pared interna de un vial de 24 x 95 mm que contiene un medio alimenticio fresco.
2. Método de transferencia de geotaxia negativa (método antiadherencia)
   1. Retira el tapón de un vial de recogida nuevo y invierte la puerta sobre la mesa para evitar que entren moscas callejeras.
   2. Sujeta el vial de cultivo con la abertura hacia abajo. Las moscas subirán hacia el lado de la comida, alejándose de la abertura.
   3. Una vez que la abertura esté libre de moscas, destapa rápidamente el vial de cultivo y alinearlo con el frasco de recogida invertido y vacío de 24 x 95 mm sobre el banco.
   4. Golpea suavemente el punto de conexión contra la superficie de la mesa para dejar caer las moscas en el frasco de recogida.
      NOTA: Este método reduce significativamente la mortalidad causada por la adhesión alimentaria, pero es más laborioso que el pinchado directo.
3. Método de anestesia por CO₂ (método de alta eficiencia)
   1. Invierte el vial de cultivo para que el tapón quede hacia abajo.
   2. Inserta cuidadosamente la aguja de la pistola de anestesia CO₂ entre el tapón y la pared del vial.
   3. Activa suavemente el pedal y la válvula de mano para liberar el 100% de CO₂ a un caudal bajo y suave.
   4. Una vez que las moscas estén anestesiadas y hayan caído sobre el tapón, coloca el vial de cultivo horizontalmente. Retira el tapón, alínea con un vial de recogida vacío y golpea suavemente el vial de cultivo para transferir las moscas anestesiadas al vial de recogida.
      NOTA: Un flujo excesivo de aire puede soplar moscas sobre la superficie del alimento, causando adhesión y muerte; mantener estrictamente un flujo suave de_CO2 suficiente para anestesiar a las moscas sin desplazarlas físicamente. El monitor vuela muy cerca en busca de señales tempranas de recuperación, como pequeños espasmos o movimientos de las alas y las patas.
4. Etiquetado y mantenimiento
   1. Etiqueta el frasco de la colección con el sexo, fecha de la recogida, fecha de eclosión, genotipo y condiciones del cultivo.
   2. Separación sexual: Si las imágenes de moscas tienen más de 10 días, separa machos y hembras en diferentes viales de cultivo que contienen alimento para evitar el apareamiento y la aparición de una generación F2, lo que podría interferir con el entorno experimental.
      NOTA: Las moscas pueden mantenerse en estos viales que contienen alimento bajo condiciones de cultivo previo (por ejemplo, 25 °C) hasta alcanzar la edad deseada para la imagen.

2. Preparación de la placa de montaje

1. Consigue una lámina de microscopio de vidrio estándar limpia.
2. Corta una tira de cinta de cinta blanca de papel aproximadamente 2 cm más larga que la lámina.
3. Coloca la cinta en el corredor con el lado adhesivo hacia arriba (lado no adhesivo contra el cristal). Asegúrate de que la cinta sobresalga aproximadamente 1 cm sobre la corredera en ambos extremos.
4. Asegura los extremos salientes envolviendo dos tiras adicionales de cinta adhesiva de ~5 mm firmemente alrededor de la parte trasera del deslizador.
5. Asegúrate de que la superficie adhesiva esté plana, tensa y libre de arrugas.
6. Etiquetado: Marca indicadores de orientación (por ejemplo, "Arriba/Arriba" y "Abajo/Abajo") o identificadores de muestra en los extremos no adhesivos de la cinta para facilitar la orientación y el seguimiento de la muestra bajo el microscopio.
   NOTA: Al seleccionar moscas para la imagen, evite elegir individuos con diferencias significativas en el tamaño corporal. Incluso con la misma aumentación, las variaciones en el tamaño corporal pueden dar lugar a superficies oculares compuestas no comparables.

3. Eutanasia y montada

1. Eutanasia
   1. Transfiere las moscas a un frasco de recogida sellado y vacío.
   2. Coloca el frasco sellado en un congelador a -80 °C durante 15–20 minutos.
      PRECAUCIÓN: Nunca pinches ni aprietes la bragueta con las puntas afiladas de unas pinzas finas. Incluso una fuga menor de hemolinfa provoca una rápida pérdida de presión hidrostática interna, lo que provoca abolladuras inmediatas y un colapso irreversible del ojo compuesto, lo que destruye la calidad de la imagen.
2. Montaje para vista lateral (ojo compuesto simple)
   1. Posicionamiento: Bajo un estereomicroscopio estándar (por ejemplo, Nikon SMZ745), se utilizan pinzas de punta fina para orientar la mosca eutanasiada en una posición lateral (de lado).
   2. Transferencia: Usando pinzas de punta fina, agarra suavemente la bragueta por el ala (manteniendo la postura lateral) y transfírala a la placa de montaje adhesiva preparada.
   3. Fijación: Pega un lado del cuerpo de la mosca a la cinta adhesiva. Abre las alas y pégalas planas contra la cinta para aumentar la estabilidad.
   4. Manejo del apéndice: Durante el montaje, asegúrate de que las patas no obstruyan el ojo compuesto. Si las patas delanteras bloquean el campo visual, usa pinzas para alejarlas cuidadosamente del ojo y adherirlas firmemente a la cinta (por ejemplo, extendiéndolas hacia abajo o metiéndolas bajo el tórax).
   5. Fijación: Inclina las pinzas y usa el lateral de la punta (no la punta afilada) para presionar suavemente el cuerpo contra la cinta y asegurar una unión segura.
   6. Ajuste fino: Comprueba que la cabeza esté horizontal. Si el ojo no está en un plano focal único, usa pinzas para microajustar el ángulo del cuerpo.
3. Montaje para vista frontal (cabeza completa)
   1. Posición: En la almohadilla anestésica, orienta la mosca en posición ventral-boca abajo (prona).
   2. Transferencia: Usa pinzas para agarrar un ala y levantar la bragueta. Transfiere a la placa de montaje adhesiva.
   3. Fijación inicial: Extiende suavemente ambas alas hacia afuera (izquierda y derecha) y presiónalas firmemente sobre la superficie adhesiva para anclar la mosca.
   4. Estabilización corporal: Presiona suavemente el tórax para asegurar el contacto total con la placa adhesiva. Utiliza pinzas para sujetar suavemente la parte posterior del abdomen (cola) y tira suavemente para enderezar el eje del cuerpo antes de adherir el abdomen a la cinta.
   5. Orientación de la cabeza: Ajusta el ángulo de la cabeza usando pinzas finas para asegurar que el plano frontal (cara) sea paralelo a la superficie adhesiva. Ambos ojos compuestos deben estar nivelados y visibles en el mismo plano focal.
4. Disposición
   1. Monta varias moscas en filas paralelas o en una matriz en forma de rejilla sobre la superficie adhesiva. Asegúrate de que las moscas individuales no se solapen para evitar interferencias en la pila Z, aunque se permite un empaquetado cercano para maximizar el rendimiento (por ejemplo, 20–30 moscas por portaobjetos). Alinea todas las moscas con la cabeza orientada en la misma dirección (como indican las etiquetas en el paso 2.6) para facilitar una imagen sistemática.
   2. Preparar matrices de muestras separadas para imágenes laterales y frontales utilizando diferentes grupos de moscas eutanasiadas de la misma cohorte. Una vez que una mosca está adherida a la cinta, no puede retirarse ni reposicionarse de forma segura sin causar graves daños mecánicos a la muestra; por lo tanto, no se pueden imaginar secuencialmente múltiples vistas desde la misma persona.
      NOTA: Se recomienda encarecidamente obtener imágenes de las muestras inmediatamente después de la eutanasia y el montaje para evitar la desecación tisular.

4. Adquisición de imágenes

1. Inicio e inicialización del sistema de imagen estereomicroscopio motorizado
   1. Enciende el PC, el monitor y la unidad de microscopio en secuencia.
   2. Lanza el software LAS X.
   3. Cuando aparezca el mensaje "Inicializar/Auto-prueba", asegúrate de que el espacio bajo el objetivo esté libre de obstáculos y haz clic en Confirmar. Permite que el microscopio complete todo el movimiento de calibración del eje Z.
      NOTA: Los siguientes pasos están optimizados para un estereomicroscopio con el sistema de software LAS X.
2. Colocación de muestras e iluminación
   1. Transfiere la placa de montaje preparada a la plataforma base del estereomicroscopio motorizado, posicionándola manualmente para centrar la primera muestra en la matriz bajo el objetivo de la cámara digital.
   2. Enciende las fuentes de Luz Transmitida (base) y Luz Incidente (arriba). Para la imagen ocular compuesta utiliza principalmente luz reflejada. Ajusta la apertura para asegurar una iluminación uniforme.
3. Configuración de software
   1. Configura el modo de adquisición en Z-stack. En la configuración del proyecto, establece la prioridad de movimiento multidimensional en 'Z-primero' para asegurar un funcionamiento continuo y estable del motor.
   2. Pon el modo de imagen en Luz Reflejada.
   3. Habilitar la Profundidad de Enfoque Extendida (EDF) para permitir la síntesis de una imagen completamente enfocada.
   4. En la sección de Ajustes Avanzados de Imagen, activa el Rango Dinámico Alto (HDR). Esto se recomienda encarecidamente para mitigar los reflejos especulares y la sobreexposición que suelen causar la superficie altamente reflectante y quitinosa del ojo compuesto.
4. Posicionamiento y balance de blancos
   1. Ajusta el mando de aumento al nivel adecuado (por ejemplo, un factor de zoom de 16x para la vista lateral de un solo ojo y 12,5x para la vista frontal de toda la cabeza), asegurando que la región específica de interés ocupe entre la mitad y dos tercios del campo de visión.
   2. Coloca manualmente la placa de montaje para que el tórax de la mosca se coloque en el centro del campo de visión.
   3. Realiza calibración de balance de blancos usando el tórax para corregir la temperatura de color.
5. Parámetros de exposición e imagen (valores de referencia)
   Exposición: 60–80 ms.
   Ganancia: 0–5 (Mantente bajo para minimizar el ruido).
   Intensidad: 60%–80%.
   Tamaño del paso de la pila Z: Estándar: 8–12 μm.
   NOTA: Para ojos compuestos lisos y sanos (por ejemplo, w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4), tamaños de escalón de hasta 15 μm pueden ser suficientes, ya que la curvatura continua y regular requiere menos secciones ópticas. Sin embargo, para fenotipos oculares ásperos o desiguales caracterizados por cambios topológicos abruptos, se requieren pasos más pequeños (tan bajos como 5 μm) para capturar detalles estructurales finos y mejorar significativamente la precisión de la reconstrucción EDF.
6. Definición y captura de la pila Z
   1. Para la vista lateral: Establece el rango de la pila Z desde el borde orbital (Inicio) hasta el ommatidia central (Fin) usando un tamaño de paso de 8–12 μm.
   2. Para la vista frontal: Ajusta el botón de enfoque hasta que el contorno exterior de los ojos compuestos esté justo enfocado (Inicio). Ajusta el enfoque en la dirección opuesta hasta que los ocelos centrales (ojos simples amarillos) en la parte superior de la cabeza estén justo enfocados (Extremo). Haz clic en Finalizar.
   3. Haz clic en Detener la Transmisión Activa para congelar la vista previa.
   4. Haz clic en Iniciar adquisición. El sistema capturará automáticamente los planos focales definidos y sintetizará una imagen de alta resolución y totalmente enfocada.
7. Guardado de archivos:
   1. Al completar la reconstrucción del EDF, haz clic en el icono de guardar en la interfaz del software (o navega a Archivo > Guardar como).
   2. Selecciona el directorio de destino, introduce el nombre del archivo designado y haz clic en Guardar.
   3. Obsérvese que cada adquisición genera tres archivos de imagen distintos: a. Imagen en bruto/canal (escala de grises); b. Imagen de vista previa en color; c. Imagen compuesta EDF (con el sufijo "_Composite")
      NOTA: Tanto la imagen raw/canal como la imagen compuesta EDF deben conservarse para análisis y documentación

Results

La trayectoria experimental completa, desde la recogida de muestras hasta la adquisición de imágenes, se resume en la Figura 1. La eficiencia del protocolo modificado se demuestra mediante la creación de matrices de muestras de alta densidad. Como se muestra en la Figura 2A, entre 20 y 30 moscas anestesiadas pueden organizarse en un patrón de cuadrícula sobre una única plataforma de cinta invertida. Los marcadores de orientación...

Discussion

El ojo compuesto de Drosophila sirve como una potente lectura fenotípica para el cribado genético, donde los cambios observables en el tamaño del ojo, rugosidad o^{pigmentación 2,3,8} suelen indicar perturbaciones en vías fundamentales de señalización como Hippo ^5,6 o ^{Hedgehog 7}. Sin embargo, la eficiencia d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cilindro de gas de dióxido de carbono (CO2)	Proveedor local	N/A
Cerbatana anestesia COsub2<>	T& L	DG-08
Cámara de microscopio digital	Leica	DMC6200
Pinzas finas	VETUS	MOS-167B
Tapones de espuma	Dongpeng	N/A
Software de adquisición de imágenes (LAS X)	Leica	3.7.1
Software de procesamiento de imágenes (FIJI/ImageJ)	NIH	Código abierto
Iluminador LED para cúpula	Leica	LED5000 IDH
Iluminador LED de cuello de ganso	Cossim	LG-10
Estereomicroscopio motorizado	Leica	M205 FCA
Lente objetivo	Leica	PlanApo NA0.2 1.0x
Válvula de pedal neumática	DELIXI	FV-320
Viales estándar de cultivo de Drosophila	LAIBOER	2424951
Medio alimenticio estándar de Drosophila	N/A	Harina de maíz-agar-melaza
Portaobjetos estándar de microscopio de vidrio	Citotest	10127101P-G
Estereomicroscopio estándar	Nikon	SMZ745
Cinta de enmascarar de papel blanca	UBWIN	25 mm de ancho