Perfilado multiómico integrado de célula única y resuelto espacialmente del transcriptoma y objetivos epigenómicos en secciones de tejido congelado

Summary

Este estudio presenta un protocolo multioma espacial Trekker–CUT&Tag que combina codificación de barras espacial directa de una sección tisular con análisis multioma de célula única. Este enfoque permite simultáneamente un perfilado espacial de expresión génica en células individuales y la modificación de la histona H3K27ac, ofreciendo conocimientos mecanicistas sobre la regulación génica en el contexto de la microanatomía tisular.

Abstract

Las tecnologías multiómicas espaciales combinadas con el perfilado de células individuales ofrecen oportunidades sin precedentes para esclarecer la arquitectura molecular y celular de tejidos complejos. Combinar la codificación de barras espacial de núcleos dentro de criosecciones individuales preparadas a partir de bloques de tejido incrustados en un medio de congelación a temperatura óptima de corte (OCT) con ensayos multiómicos de célula única en un flujo de trabajo sencillo y eficiente puede facilitar la anotación y el análisis molecular resuelto espacialmente de células en tipos de tejido. Este estudio informa sobre un enfoque multioma de clivaje espacial bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag) que simultáneamente perfila la modificación de la histona H3K27ac y la expresión génica en una única sección cerebral congelada. Tras el código de barras espacial, los núcleos individuales se aíslan y se someten a CUT&Tag, captura combinada de ADN, ARN y códigos de barras espaciales etiquetados, preparación de bibliotecas y secuenciación. El flujo de trabajo genera perfiles epigenómicos y transcriptómicos anotados espacialmente a partir de los mismos núcleos, permitiendo asignar la información multiómica a coordenadas anatómicas. Integrar información epigenómica con datos transcriptómicos espaciales aumenta la fidelidad de la identificación de tipos celulares y revela programas reguladores espacialmente organizados e interacciones célula-célula dentro de tejidos intactos.

Introduction

La biología espacial es un campo en rápido avance que mapea la ubicación, organización e interacciones de moléculas, células y tejidos dentro de sus entornos^{nativos 1,2,3}. A diferencia de los métodos monocelulares o convencionales que requieren disociación tisular y provocan pérdida de información posicional, los enfoques espaciales preservan las coordenadas físicas de analitos o células/núcleos, permitiendo una investigación directa de cómo la arquitectura tisular influye en la identidad celular, la comunicación intercelular y la función^biológica 4,5,6,7 . Aunque la transcriptómica espacial y la proteómica espacial son actualmente las modalidades más adoptadas, el campo se está expandiendo rápidamente hacia el perfilado multiómico^{espacial 3,8,9}. La co-perfilación de la expresión génica y los estados epigenómicos dentro del mismo tejido es especialmente potente, ya que vincula directamente la salida transcripcional con mecanismos reguladores —como la accesibilidad a la cromatina y las modificaciones de histonas— que regulan la actividad génica y que se sabe que varían entre dominios espaciales 10,11,12. Por tanto, el análisis integrado del epigenoma espacial y el transcriptoma proporcionará información clave sobre cómo los programas regulatorios moldean la identidad celular y la organización de los tejidos.

Se han desarrollado varias estrategias multiómicas espaciales para permitir un perfilado epigenómico y transcriptómico simultáneos. El código de barras determinista en secuenciación de tejidos (DBiT-seq) emplea canales microfluídicos para entregar códigos de barras espaciales directa o indirectamente, mediante estampado con placas de gel, a secciones de tejido, permitiendo la anotación espacial de analitos. Este enfoque facilita el coperfilado espacialmente resuelto de características epigenómicas y^{transcriptómicas} 12,13,14,15. El método Slide-tag, comercializado como plataforma Takara Trekker, introduce directamente códigos de barras espaciales en el tejido intacto antes de la disociación, permitiendo procesar núcleos indexados espacialmente mediante flujos de trabajo estándar de célula única y proyectarse computacionalmente de vuelta a sus coordenadas originales^{del tejido 16}. En contraste, el ensayo espacial para cromatina accesible, linajes celulares y expresión génica con secuenciación (SPACE-seq) emplea una estrategia de apuntamiento en la que se capturan dianas epigenéticas y ARNm con cola poli(A) en una secuencia de captura poli-dT en las losetas¹⁷ de transcriptómica espacial.

Cliavage under targets & tagmentation (CUT&Tag) es una herramienta poderosa para mapear interacciones entre ADN y proteínas de histonas o no histonas a partir de muestras de entrada extremadamente^{bajas 18}. CUT&Tag se basa en la fragmentación mediada por la cromatina por transposasa Tn5 y en el marcaje de ADN (etiquetado), empleando Tn5 conjugado con proteína A guiado por anticuerpos para la escisión específica del locus y el marcaje molecular. Mientras que el ensayo convencional CUT&Tag implica múltiples pasos de incubación y lavado, se utilizó un flujo de trabajo simplificado y simplificado de CUT&Tag para mejorar la eficiencia de CUT&Tag en aplicaciones multioma monocélula aguas^{abajo 19}.

Figura 1: Resumen del flujo de trabajo y control de calidad del ensayo espacial Trekker–CUT&Tag multiome. (A) Diagrama esquemático del flujo de trabajo espacial multioma Trekker–CUT&Tag. Una sección coronal de tejido cerebral de ratón recién congelado se monta sobre una baldosa espacial de Trekker y se somete a códigos de barras espaciales. Tras la lisis tisular, los núcleos se aíslan y evalúan en cuanto a rendimiento y calidad. Se utilizan aproximadamente 50.000 núcleos para H3K27ac CUT&Tag, y los núcleos etiquetados se someten a codificación de barras de célula única mediante el uso de 10 perlas de gel Genomics Chromium Multiome tras el contar. El ADN unicelular con código de barras se preamplifica y se divide en dos fracciones. La biblioteca indexada CUT&Tag se genera directamente por PCR de índice. Para la expresión génica y las bibliotecas de códigos de barras espaciales, el ADN preamplificado se amplifica y selecciona por tamaño. Se utilizan fragmentos que corresponden a tamaños típicos de ADNc para la preparación de la biblioteca de expresión génica, mientras que los fragmentos de ADN más cortos se emplean para generar la biblioteca de códigos de barras espaciales. Las bibliotecas se secuencian y mapean siguiendo 10x directrices de Genómica y Curiosidad de Trekker. La línea temporal experimental esperada se indica a la izquierda. (B) Puntos clave de control de calidad (QC) y consideraciones críticas a lo largo del flujo de trabajo. La QC de núcleos incluye la evaluación del rendimiento, la integridad, la agregación y el contenido de residuos. La QC previa a la secuenciación incluye la evaluación de distribuciones de tamaño del ADN y contaminación por dímeros cebadores para todas las bibliotecas. La especificidad de la biblioteca CUT&Tag se evalúa mediante PCR cuantitativa (qPCR), que mide el enriquecimiento de regiones genómicas objetivo sobre el fondo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Este estudio presenta un ensayo multioma espacial Trekker CUT&Tag que perfila simultáneamente la modificación de histonas H3K27ac asociada a elementos cis-reguladores activos y la expresión génica en secciones de tejido fresco congelado. Este protocolo proporciona procedimientos paso a paso para el código de barras espacial Takara Trekker, disociación tisular y aislamiento de núcleos, recuento y control de calidad de núcleos, perfilado CUT&Tag de baja entrada de la modificación H3K27ac, captura de objetivos moleculares en 10x perlas de gel multicelular Genomics y preparación de bibliotecas. El flujo de trabajo se demostró utilizando una sección coronal de tejido cerebral de ratón. A diferencia del flujo de trabajo estándar 10x Genomics Multiome, en el que la accesibilidad a la cromatina se mide mediante un ensayo para cromatina accesible por transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq), este protocolo sustituye fragmentos de ADN derivados de CUT&Tag por fragmentos ATAC, permitiendo la interrogación directa de paisajes de modificación de histonas a resolución de célula única. Para vincular los códigos espaciales de Trekker con códigos de barras unicelulares de 10x Genomics, los códigos espaciales de poli(A) y los transcritos de ARNm son capturados por las secuencias poli-dT de las perlas de gel Multiome, mientras que los fragmentos de ADN CUT&Tag son capturados por las secuencias espaciadoras. Esta estrategia de doble captura permite la recuperación simultánea de información epigenómica, transcriptómica y espacial de los mismos núcleos individuales. Hasta donde sabemos, este es el primer flujo de trabajo multiómico espacial que integra directamente la anotación espacial Trekker con código de barras con un ensayo multioma de célula única para co-perfilar la distribución genómica de una marca de histona y el transcriptoma. Los paisajes multiomáticos espacialmente resueltos resultantes, que integran la ocupación de H3K27ac y datos de expresión génica, permiten proyección de perfiles unicelulares de vuelta a sus coordenadas tisulares originales y proporcionan un vínculo directo entre los mecanismos reguladores epigenómicos y los programas transcripcionales en relación con la arquitectura del tejido intacto.

Protocol

Los ratones adultos fueron eutanasiados por inhalación de CO₂ (IACUC #: A48315-15-R24) antes de la extracción de tejido. Se extrajeron cerebros en su totalidad tras una craneotomía sagital y la extirpación de la calvaria dividida por la mitad. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Montar una sección de tejido sobre la losa del código de barras Trekker para codificación espacial

1. Prepara lo siguiente antes de empezar.
   1. Equilibrar el bloque tisular embebido a temperatura óptima de corte (OCT) en un criostato antes de seccionar. Prepara los buffers para la cindidura UV, disociación tisular y aislamiento de núcleos.
      NOTA: La temperatura óptima para la sección puede variar según el tipo de tejido.
   2. Para aislar núcleos, preenfría la centrífuga con cubos oscilantes para tubos de 1,5 mL a 4 °C. Preenfría una placa de 12 pozos con un anillo tórico Trekker sobre hielo.
   3. Ajusta el medidor UV al límite máximo de corriente (1,2 A) y potencia máxima.
2. Registra el ID de la casilla de código de barras espacial (por ejemplo, U0001_001) de la casilla de Trekker que se va a utilizar.
   NOTA: Cada casilla de Trekker contiene coordenadas únicas de código de barras. El ID de la casilla es necesario para recuperar el archivo correcto para el mapeo espacial de códigos de barras de los datos de secuenciación.
3. Seccionar el pañuelo. Se realizó una sección coronal de 25 μm de espesor en la posición aproximada de bregma -1 mm a −18 °C (Figura 1A).
   NOTA: El grosor puede aumentarse hasta 30 μm cuando se trabaja con tejidos de baja celularidad.
4. Coloca la sección (o la región de interés) sobre el azulejo espacial y funde suavemente un dedo en la parte inferior del vidrio deslizante.
   PRECAUCIÓN: Si es necesario, revisa los procedimientos mediante las mediciones de control de calidad de núcleos usando la casilla de entrenamiento de Trekker.
5. Utiliza pinzas para quitar las baldosas del adhesivo transparente y colócalas en un pozo de una placa de cultivo de tejido de 12 pozos sobre hielo encima del O-Ring de Trekker. Inmediatamente se pipetean 30 μL de buffer de corte UV Trekker sobre la baldosa, asegurándose de que todo el tejido esté cubierto con buffer.
6. Coloca la lámpara UV (ajuste de 1,2 A) en la placa justo encima del pozo. Ilumina durante 1 minuto para liberar los códigos de barras mientras mantienes todo en hielo.
   PRECAUCIÓN: Usa gafas UV protectoras al trabajar con la lámpara UV.
7. Apaga la lámpara UV e incuba la baldosa sobre hielo durante 7,5 minutos. Durante la incubación, saca una cámara de lavado Trekker de 10 x 10 y llena las cámaras 1 y 2 con 400 μL de tampón de lavado de núcleos fríos de Trekker para una muestra sobre hielo.
8. Recoge cuidadosamente las baldosas con pinzas sin tocar las cuentas y lava las baldosas en la cámara 1 durante 5 s. Lava las baldosas en la cámara 2 durante 5 segundos. Coloca cuidadosamente la baldosa en un pozo en la placa de 12 pozos sobre hielo. La sección de tejido debe estar teñida de azul y ser fácilmente visible.

2. Disociación tisular y aislamiento de núcleos

1. Dispensa 175 μL de buffer Invent Minute A apuntando al tejido. Repite 3 veces más para obtener un total de 700 μL. Con cada dispensación, apunta a diferentes partes de la baldosa para desprender todo el tejido de la baldosa.
   NOTA: Evita la contaminación de cuentas por rayar las baldosas o por la caída de cuentas.
2. Sigue disociando el tejido del azulejo aspirando el tampón desde el lateral del pozo y dispensándolo sobre las zonas del azulejo cubiertas por el tejido, manteniendo la placa sobre hielo tanto como sea posible. Repite hasta que no quede ningún papel en la baldosa. Una vez que todo el tejido ha sido retirado de la baldosa, utiliza cuidadosamente unas pinzas para transferir la baldosa a un pozo vacío.
3. Utiliza una pipeta P1000 para disociar mecánicamente núcleos con trituraciones repetidas en el mismo pozo. Repite hasta que no queden trozos de tejido visibles.
4. Transfiere cuidadosamente la suspensión de núcleos a un cartucho filtrante con un tubo de recogida del kit de aislamiento de núcleo único Invent Minute para tejidos/células neuronales. Incuba el tubo con la tapa abierta a –20 °C durante 10 minutos. Tapa el cartucho del filtro y centrifuga inmediatamente a 13.000 x g durante 30 segundos en una microcentrífuga refrigerada.
5. Desecha el cartucho filtrante y vuelve a suspender el pellet pipeteando suavemente entre 10 y 20 veces. Gira el tubo en la centrifugadora prefría con cubos oscilantes a 600 x g durante 5 minutos. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el perdigón en 200 μL del buffer Trekker C.
6. Añade 1 mL de buffer Minute B en frío Invent a un tubo Eppendorf de 1,5 mL de baja unión y superpone cuidadosamente 200 μL de suspensión de núcleos sobre el buffer Minute B expulsando lentamente contra la pared del tubo para evitar la mezcla de las capas. Haz girar el tubo en la centrífuga preenfriada con cubos oscilantes a 500 x g durante 10 minutos. Retira cuidadosamente la capa lechosa y el sobrenadante.
7. Suspende suavemente los núcleos con 24 μL de buffer Trekker C y procede a mediciones de control de calidad de núcleos aislados.

Figura 2: Evaluación del control de calidad de núcleos aislados. Imágenes representativas en campo claro de núcleos aislados de tejido cerebral de ratón. Los núcleos fueron teñidos con azul de tripán al 0,4% y se realizaron imágenes a un aumento de 40x para evaluar la integridad nuclear y la presencia de residuos. La preparación de núcleos mostrada a la izquierda muestra núcleos de alta calidad e intactos adecuados para ensayos posteriores, mientras que la preparación mostrada a la derecha ilustra núcleos de baja calidad con agregados tisulares parcialmente lisados. Los núcleos dañados o rotos se indican con puntas de flecha llenas. La barra de escala es de 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Conteo y mediciones de control de calidad de núcleos aislados

1. Para contar núcleos, toma 2 μL de la suspensión de núcleos en 8 μL de tampón Trekker C. Mezcla 10 μL de la suspensión de núcleos diluidos con 10 μL de solución de tinción AO/PI. Cuenta los núcleos según las instrucciones del fabricante.
2. Para evaluar la calidad de los núcleos aislados, se diluyen 2 μL de la suspensión de núcleos en 8 μL de solución de tripán azul al 4%. Examinar los núcleos bajo el microscopio de fluorescencia a un aumento de 40X, comprobando la morfología intacta de la membrana nuclear y el contenido de residuos no nucleares (Figura 2).
3. Proceder inmediatamente al ensayo multioma CUT&Tag de núcleo único (CUT&Tag en H3K27ac + expresión génica).
   PRECAUCIÓN: Proceda a los siguientes pasos si se recuperan al menos 30.000 núcleos de alta calidad.

4. Etiquetado CUT&Tag en núcleos aislados

1. Prepara el buffer de incubación CUT&Tag I. Colócalo sobre hielo.
2. Preparar anticuerpos primarios y transposasa activada por el conjugado enzimático guía (TAG).
   1. Añadir 46,23 μL de buffer de incubación CUT&Tag I y 1,33 μL de la enzima TAG a un tubo PCR sobre hielo. Añade una cantidad optimizada de anticuerpo primario a la trompa. Mezcla lentamente pipeteando 10 veces.
      NOTA: Se añadieron 2,43 μL de anticuerpo anti-H3K27ac a la reacción. El lote de anticuerpos fue validado para ensayos CUT&Tag in situ e en gran cantidad. Optimiza la cantidad de anticuerpos para la conjugación de enzimas TAG mediante un ensayo masivo. El anticuerpo óptimo se definió como la concentración más baja que alcanzó la máxima relación señal-ruido, determinada por qPCR en loci objetivo positivo y negativo.
   2. Gira brevemente y coloca el tubo sobre un rotador de 18 rpm. Incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla resultante puede prepararse y colocarse sobre hielo hasta 5 horas.
      NOTA: La incubación de anticuerpo-TAG puede realizarse simultáneamente o antes del aislamiento de núcleos.
3. Incubación de núcleos aislados con conjugado enzimático anticuerpo-TAG.
   1. Gira el tubo (Paso 2.7) de núcleos aislados en la centrífuga preenfriada con cubos de movimiento a 500 x g durante 10 minutos. Retirar el sobrenadante sin alterar el pellet y dejar ~5 μL de sobrenadante.
   2. Añade 25 μL de buffer de incubación CUT&Tag I (Paso 4.1) y resuspende pipeteando suavemente 10 veces. Transfiere los núcleos al tubo (Paso 4.2.2) que contiene conjugado anticuerpo-TAG usando la misma punta de la pipeta. Mezcla suavemente pipeteando 10 veces y coloca el tubo sobre un rotador suave.
   3. Incubar durante la noche a 4 °C.
4. Al día siguiente (Día 2), preparar 1X CUT&Tag núcleo buffer y colocarlo en hielo.
5. Etiquetado CUT&Tag
   1. Recupera el tubo de reacción (Paso 4.3.3) del rotador. Añade 5 μL de activador CUT&Tag y transfiere la mezcla a un nuevo tubo de 1,5 mL. Incuba durante 1 hora a 37 °C en el ThermoMixer a 550 rpm.
   2. Saca el tubo, añade 20 μL de tampón de temple CUT&Tag y mezcla suavemente la reacción pipeteando 10 veces. Centrifuga el tubo en la centrífuga preenfriada con cubos oscilantes a 500 x g durante 10 minutos. Retirar el sobrenadante sin alterar el pellet de núcleos, dejando ~5 μL de sobrenadante en el fondo del tubo.
   3. Añade 100 μL de buffer de núcleos 1X CUT&Tag y resuspende los núcleos pipeteando suavemente 10 veces. Haz girar el tubo en la centrífuga preenfriada con cubos oscilantes a 500 x g durante 10 minutos. Retirar 85 μL del sobrenadante, dejando ~15 μL. Resuspender los núcleos pipeteando suavemente y lentamente 10 veces.
6. Conteo de núcleos etiquetados y determinación del número de dirección
   1. Añadir 1 μL de la suspensión de núcleos etiquetados a 9 μL de solución salina tamponada con fosfato y mezclar con 10 μL de solución de tinción AO/PI. Contar los núcleos etiquetados como se describe en el Paso 3.1.
   2. Utiliza 1,6 veces el número objetivo de núcleos para la generación de GEM en una sola célula para obtener el número deseado de núcleos capturados.
   3. Gira el tubo en la centrífuga preenfriada con cubos oscilantes a 500 x g durante 10 minutos y retira cuidadosamente el sobrenadante, dejando un volumen final de 8 μL.

5. Codificación de barras de célula única de núcleos etiquetados y preamplificación de ADN con código de barras

1. Añade 7 μL de búfer ATAC B a 8 μL de los núcleos etiquetados con el número esperado de núcleos de dirección para tu experimento.
   NOTA: Consulte más detalles sobre los ajustes de reacción y el funcionamiento del instrumento Chromium X en el protocolo "GEM Generation & Barcoding" de la Guía de Usuario Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
2. Generación de GEM y código de barras usando el instrumento Chromium X.
   1. Añadir 60 μL de mezcla maestra GEM al tubo que contiene núcleos etiquetados. Mezcla suavemente pipeteando y carga en la fila 1 del chip Chromium Next GEM.
   2. Prepara las perlas de gel multioma monocelular y carga 50 μL de perlas de gel en la fila 2. Dispensar 45 μL de aceite de partición en los pozos de la fila 3.
   3. Coloca el chip J ensamblado con la junta en la bandeja del instrumento Chromium X y ejecuta el instrumento.
   4. Aspirar lentamente 100 μL de GEM desde los puntos más bajos de los pozos de recuperación en la fila superior 3. Dispensar lentamente los GEMs en el nuevo tubo de PCR sobre hielo con las puntas de la pipeta contra las paredes laterales de los pozos.
   5. Incubar las GEMs recogidas en un termociclador (temperatura de tapa a 50 °C) siguiendo el siguiente protocolo: un ciclo de 37 °C durante 45 minutos, un ciclo de 25 °C durante 30 minutos y 4 °C para la retención.
   6. Añade 5 μL de agente templante y mezcla lentamente pipeteando 10 veces.
3. Limpieza de la incubación post-GEM y purificación del ADN
   NOTA: Consulta más detalles en el protocolo "Post GEM Incubation Cleanup" de la Guía de Usuario de Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
   1. Añade 125 μL de agente recuperador de color rosa al tubo a temperatura ambiente y invierte suavemente el tubo 10 veces. Centrifugar brevemente. Retira y descarta lentamente 125 μL de agente de recuperación o aceite de partición (rosa) del fondo del tubo.
   2. Añade 200 μL de mezcla de limpieza Dynabeads al tubo y mezcla pipeteando 10 veces. Incuba 10 minutos a temperatura ambiente. Coloca el tubo sobre el soporte magnético hasta que la solución se disipe. Quita el sobrenadante.
   3. Añade 300 μL de etanol al 80% recién preparado al pellet. Incuba 30 segundos y elimina el sobrenadante. Añade 200 μL de etanol al 80% al pellet, incuba 30 segundos y retira el sobrenadante. Gira el tubo brevemente y colócalo sobre el imán. Quita el sobrenadante restante.
   4. Quita el tubo del imán. Inmediatamente añade 50,5 μL de solución de elución I. Mezcle pipeteando e incube durante 1 minuto a temperatura ambiente. Gira brevemente y coloca el tubo sobre el imán hasta que la solución se disipe. Transfiere 50 μL de solución despejada a un tubo nuevo.
   5. Purificación del ADN mediante perlas paramagnéticas
      1. Añade 90 μL de perlas paramagnéticas (1,8X) a cada muestra y mezcla pipeteando bien. Incuba 5 minutos a temperatura ambiente. Gira brevemente y coloca el tubo sobre el imán hasta que la solución se disipe. Quita el sobrenadante.
      2. Añade 200 μL de etanol al 80% al pellet. Incuba durante 30 segundos. Quita el etanol. Repite esto una vez más.
      3. Gira brevemente y coloca el tubo sobre el imán. Quita el sobrenadante restante.
      4. Quita el tubo del imán. Añade 46,5 μL de EB del tampón y mezcla pipeteando. Incuba 2 minutos a temperatura ambiente. Haz girar y colócalo sobre el imán hasta que la solución se disipe.
      5. Transfiere 46 μL de ADN purificado a un nuevo tubo.
4. Preamplificación de ADN con código de barras.
   1. Añade 54 μL de mezcla de preamplificación a cada muestra. Mezcla de pipetas y centrifuga brevemente.
   2. Incubar en un ciclador térmico (temperatura de tapa a 105 °C) con el siguiente protocolo: un ciclo de 72 °C durante 5 minutos; un ciclo de 98 °C durante 3 minutos; un total de 7 ciclos de 98 °C durante 20 s, 63 °C durante 30 s, 72 °C durante 1 minuto; un ciclo de 72 °C durante 1 minuto; y una retención a 4 °C. Guárdalos a 4 °C durante la noche.
   3. Al día siguiente (Día 3), purificar ADN preamplificado con perlas paramagnéticas (1,6X) como se describe en el Paso 5.3.5. Añade 80,5 μL de EB del tampón al tubo y mezcla pipeteando. Incubar 2 minutos a 22 °C (temperatura ambiente). Gira brevemente y coloca el tubo sobre el imán hasta que la solución se disipe.
   4. Transfiere 80 μL de ADN preamplificado a un tubo nuevo. Usa 40 μL para generar la biblioteca CUT&Tag. Almacena el ADN preamplificado restante a 4 °C.
      NOTA: 40 μL del ADN preamplificado restante se utilizarán más adelante para la expresión génica y bibliotecas de códigos de barras espaciales.

6. Preparación de bibliotecas para CUT&Tag, expresión génica y códigos de barras espaciales

1. Preparación de la biblioteca scCUT&Tag
   1. Transfiere 40 μL de ADN preamplificado a un nuevo tubo y añade 60 μL de mezcla PCR con índice de muestra. Mezcla pipeteando y centrifugando brevemente.
   2. Incubar en un termociclador (temperatura de tapa a 105 °C) con el siguiente protocolo: un ciclo de 98 °C durante 45 s; un total de 12 ciclos de 98 °C durante 20 s, 67 °C durante 30 s, 72 °C durante 20 s; un ciclo de 72 °C durante 1 minuto; 4 °C para retención).
      NOTA: El número óptimo de ciclo depende del número inicial de núcleos y de la marca de histona que se perfila. Se utilizaron doce ciclos de amplificación para la marca H3K27ac en el experimento.
   3. Selección doble de tamaño y purificación del ADN mediante perlas paramagnéticas (0,6X, 1,55X)
      1. Añadir 60 μL de perlas paramagnéticas (0,6X) a cada muestra y mezclar pipeteando cuidadosamente. Incuba 5 minutos a temperatura ambiente. Gira brevemente y coloca el tubo sobre el imán hasta que la solución se disipe.
      2. Transfiere 150 μL de sobrenadante a un tubo nuevo. Añade 95 μL de perlas paramagnéticas (1,55X) a cada muestra (sobrenadante) y mezcla pipeteando. Incuba 5 minutos a temperatura ambiente. Coloca el tubo sobre el imán hasta que la solución se disipe. Quita el sobrenadante.
      3. Añade 300 μL de etanol al 80% al pellet. Espera 30 segundos. Quita el etanol. Repítelo una vez más. Gira brevemente y coloca el tubo sobre el imán. Quita el sobrenadante restante.
      4. Quita el tubo del imán. Añade 20,5 μL de EB del tampón al tubo y mezcla pipeteando. Incuba 2 minutos a temperatura ambiente. Haz girar y colócalo sobre el imán hasta que la solución se disipe.
      5. Transfiere 20 μL de bibliotecas CUT&Tag purificadas e indexadas a nuevos tubos.
2. Comprobación de control de calidad para la biblioteca CUT&Tag
   1. Análisis de la distribución del tamaño del ADN en la biblioteca
      1. Mezcla 1 μL de ADN de biblioteca purificado con 1 μL de tampón de bajo TE.
      2. Mezcle el ADN diluido con un tampón de trabajo del analizador de fragmentos y ejecute el instrumento con el kit de fragmentos HS NGS de alta sensibilidad (1-6000 bp) (Figura 3A).
   2. Evalúa el enriquecimiento de un locus genómico positivo para H3K27ac antes de secuenciar y mapear.
      1. Mezcla 1 μL de ADN de biblioteca purificado con 4 μL de agua libre de nucleasa. Utiliza 1 μL de ADN de biblioteca diluido para mediciones qPCR en tres loci genómicos.
         NOTA: Para H3K27ac CUT&Tag, el cebador positivo fue diseñado a partir del locus Actb-TSS, mientras que los cebadores dirigidos al T1-TSS y un locus intergénico sirvieron como controles^{negativos 20} (Tabla 1). Se utilizó ADN genómico de ratón como control de entrada para normalizar la eficiencia de la PCR (Figura 3B).
      2. Prepara un total de 20 μL de la mezcla de reacción de la siguiente manera: 1 μL de ADN de biblioteca diluido, 2 μL de mezcla cebadora de 10 μM, 10 μL de 2X SYBR Green Master Mix y 7 μL de agua libre de nucleasa.
      3. Ejecuta la placa qPCR preparada en el sistema CFX Opus Real-Time PCR usando el programa de ciclo adecuado para la detección de SYBR Green.
3. Amplificación de ADNc y ADN de códigos de barras espaciales.
   1. Transfiere 35 μL de ADN preamplificado (Paso 5.4.4) a un tubo nuevo y añade 65 μL de mezcla de reacción de amplificación de ADNc. Mezcla pipeteando y centrifugando brevemente. El cebador utilizado para la amplificación de ADN de ADN por código de barras espacial es los Cebadores de ADNc de Características 2.
   2. Incubar en un termociclador (temperatura de tapa a 105 °C) con el siguiente protocolo: un ciclo de 98 °C durante 45 s; un total de 8 ciclos de 98 °C durante 20 s, 63 °C durante 30 s, 72 °C durante 1 minuto; un ciclo de 72 °C durante 1 minuto; 4 °C para retención.
      NOTA: El número óptimo de ciclo debe determinarse en función del tipo celular, el contenido de ARN y el número inicial de núcleos. En este experimento se realizaron 8 ciclos de amplificación.
   3. Purificación de ADNc amplificados
      1. Doble selección de tamaño y purificación del ADN mediante perlas paramagnéticas (0,6X, 2,0X) como se describe en el Paso 6.1.3. Añade 60 μL de perlas paramagnéticas (0,6X) a cada muestra y mezcla pipeteando. Incuba 5 minutos a temperatura ambiente. Coloca el imán sobre la solución hasta que se disipe.
      2. Transfiere y guarda 75 μL de sobrenadante en un tubo nuevo sin alterar el pellet. Mantenlo a temperatura ambiente.
         PRECAUCIÓN: No descartes el sobrenadante, ya que contiene ADN enriquecido para fragmentos más cortos que se usarán para generar la biblioteca de códigos de barras espaciales.
      3. Retira el sobrenadante restante del pellet. Lava con etanol al 80% dos veces, como se describe en el Paso 6.1.3.
      4. Añade 40,5 μL de EB de tampón al tubo y mezcla pipeteando. Incuba 2 minutos a temperatura ambiente. Gira brevemente y colócala sobre el imán hasta que la solución se elimine.
      5. Transfiere 40 μL de ADNc amplificados a un nuevo tubo. Guárdalo en hielo para preparar una biblioteca de expresión génica indexada.
         NOTA: Esta fracción enriquece los ADN para el tamaño típico de los cDNA.
   4. Purificación de ADN amplificados de códigos de barras espaciales
      1. Añadir 70 μL de perlas paramagnéticas (2,0X) a 75 μL del sobrenadante previamente guardado (Paso 6.3.3.2). Mezcla pipeteando y centrifugando brevemente. Incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. Coloca el tubo sobre el imán hasta que la solución se disipe. Quita el sobrenadante.
      2. Lava con etanol al 80% dos veces, como se describe en el Paso 6.1.3.
      3. Añade 40,5 μL de EB de tampón al tubo y mezcla pipeteando. Incuba 2 minutos a temperatura ambiente. Gira brevemente y colócala sobre el imán hasta que la solución se elimine.
      4. Transfiere 40 μL de ADN de código de barras espacial amplificado y purificado a un nuevo tubo. Almacene a −20 °C para la posterior generación de la biblioteca de códigos de barras espaciales indexados.
   5. Análisis de tamaños de ADNc por el Analizador de Fragmentos. Mezcla 1 μL de ADNc amplificado con 1 μL de tampón de bajo TE. Procesa los ADN diluidos con el analizador de fragmentos como se describe en el paso 6.2.1.
   6. Preparación de una biblioteca de expresión génica indexada
      1. Transfiere 10 μL de ADNc amplificados (Paso 6.3.3.5) a un nuevo tubo. Añade 25 μL de EB de tampón y 15 μL de mezcla de fragmentación. Mezcla pipeteando sobre hielo. Gira brevemente y transfiere el tubo al ciclador térmico preenfriado a 4 °C.
      2. Incubar en un ciclador térmico (temperatura de la tapa a 65 °C) iniciando el siguiente protocolo: un ciclo de 32 °C durante 5 minutos; un ciclo de 65 °C durante 30 minutos; 4 °C para retención.
      3. Selección doble de tamaño y purificación del ADN mediante perlas paramagnéticas (0,6X, 0,8X) como se describe en el Paso 6.1.3. Añade 50,5 μL de EB de tampón y mezcla pipeteando. Incuba 2 minutos a temperatura ambiente. Gira brevemente y colócala sobre el imán hasta que la solución se elimine.
      4. Transfiere 50 μL de muestra a un tubo nuevo. Añade 50 μL de mezcla de ligación adaptadora y mezcla pipeteando. Gira brevemente. Incubar en un ciclador térmico (temperatura de tapa a 30 °C) siguiendo el siguiente protocolo: un ciclo de 20 °C durante 15 minutos y 4 °C para la retención.
      5. Purificación del ADN mediante perlas paramagnéticas (0,8X) como se describe en el Paso 5.3.5. Añade 30,5 μL de EB del tampón y mezcla pipeteando. Incuba 2 minutos a temperatura ambiente. Gira brevemente y colócala sobre el imán hasta que la solución se elimine. Transfiere 30 μL de la muestra a un tubo nuevo.
      6. PCR índice de la biblioteca de expresión génica. Añade 50 μL de mezcla de amperios y 20 μL de un conjunto individual de TT de doble índice a cada muestra.
      7. Incubar en un termociclador (temperatura de tapa a 105 °C) con el siguiente protocolo: un ciclo de 98 °C durante 45 s; un total de 11 ciclos de 98 °C durante 20 s, 54 °C durante 30 s, 72 °C durante 20 s; un ciclo de 72 °C durante 1 minuto; 4 °C para retención.
         NOTA: El número óptimo de ciclo debe determinarse en función del tipo de célula, el contenido de ARN y el número inicial de núcleos. En este experimento se utilizaron un total de 11 ciclos de amplificación.
      8. Selección doble de tamaño y purificación del ADN mediante perlas paramagnéticas (0,6X, 0,8X) como se describe en el Paso 6.1.3. Añade 35,5 μL de EB del tampón al tubo y mezcla pipeteando. Incuba 2 minutos a temperatura ambiente. Gira brevemente y colócala sobre el imán hasta que la solución se elimine.
      9. Transfiere 35 μL de biblioteca de expresión génica purificada e indexada a un nuevo tubo.
4. Análisis de la distribución del tamaño del ADN en la biblioteca de expresión génica. Mezcla 1 μL de ADN de biblioteca con 1 μL de tampón de bajo TE. Analizar los ADN diluidos como se describe en el Paso 6.2.1. (Figura 3A).
5. Preparación de una biblioteca de códigos de barras espaciales indexados
   1. Preparar un total de 100 μL de la mezcla PCR de índice de muestra de la siguiente manera: 50 μL de mezcla de amperes (del Kit de Código de Barras Característico GEM-X Single-Cell 3'), 25 μL de Buffer EB, 20 μL de cebador del Conjunto TT A de Placa Dual Index, y 1 μL de ADN de código de barras espacial purificado (Paso 6.3.4.4) diluidos en 4 μL de buffer EB.
   2. Incubar en un termociclador (temperatura de tapa a 105 °C) con el siguiente protocolo: un ciclo de 98 °C durante 45 s; un total de 7 ciclos de 98 °C durante 20 s, 54 °C durante 30 s, 72 °C durante 20 s; 72 °C durante 1 minuto; 4 °C para retención.
   3. Purificación del ADN mediante perlas paramagnéticas (1,2X) como se describe en el Paso 5.3.5. Añade 35,5 μL de buffer EB al tubo y mezcla pipeteando. Incuba 2 minutos a temperatura ambiente. Coloca el tubo sobre el imán hasta que la solución esté clara.
   4. Transfiere 35 μL de ADN de biblioteca de códigos de barras espaciales purificados e indexados a un tubo nuevo. Guarda a 4 °C hasta 72 horas o a −20 °C para almacenamiento a largo plazo.
6. Comprobar la distribución de tamaños de ADN en la biblioteca de códigos de barras espaciales indexada. Mezcla 1 μL de ADN de biblioteca purificado con 1 μL de tampón de bajo TE. Analizar los ADN diluidos con el analizador de fragmentos tal y como se describe en el paso 6.2.1 (Figura 3A).

Figura 3: Evaluaciones de control de calidad de bibliotecas indexadas. (A) Perfiles de tamaño en ADN amplificado y bibliotecas indexadas. El ADN es analizado por un analizador de fragmentos para evaluar la calidad y la distribución del tamaño del ADN. Se muestran perfiles representativos para la biblioteca indexada CUT&Tag, ADN amplificado utilizado para la preparación de la expresión génica y la biblioteca de códigos de barras espaciales, biblioteca de expresión génica indexada y biblioteca de códigos de barras espaciales indexados. (B) La biblioteca CUT&Tag se analiza mediante qPCR para evaluar el enriquecimiento de una región genómica positiva a H3K27ac (es decir, ACTB) sobre la señal de fondo negativa a H3K27ac (es decir, T1 y un locus intergénico). La diferencia de pliegue entre regiones positiva/negativa se calcula como^{enriquecimiento 21}. Un enriquecimiento de pliegues superior a 10 se considera ideal en este ensayo²⁰. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

7. Secuenciación de las bibliotecas

1. Secuenciar la biblioteca de códigos de barras espaciales del Trekker a una profundidad de 5.000 pares de lectura por núcleo capturado.
2. Secuenciar la biblioteca CUT&Tag de H3K27ac a una profundidad de 25.000 pares de lectura por núcleo capturado.
3. Secuenciar la biblioteca de expresión génica a una profundidad de al menos 20.000 pares de lectura por núcleo capturado.

8. Bioinformática y análisis de datos

1. Procesar la expresión génica y las lecturas CUT&Tag usando Cell Ranger ARC v2.0.2 con --min-atac-count=100 y --min-gex-count=1000. Integra las salidas ARC de Cell Ranger con la información del código de barras de Trekker usando la pipeline Trekker v1.3.0 con parámetros por defecto para asignar posiciones espaciales.
2. Realiza el control de calidad usando Signac. Las células que cumplían cualquiera de los siguientes criterios se eliminaron del análisis posterior: para CUT&Tag, el recuento total de fragmentos ≥ 1.000.000 o ≤ 100, y el enriquecimiento TSS ≤ 2; para la expresión génica, el recuento total de UMI ≥ 100.000 o ≤ 1.000, y el número total de genes detectados ≥ 10.284 o ≤ 200.
3. Elimina los dobletes usando scDblFinder para la expresión génica y AMULET para CUT&Tag. Las células que cumplían con cualquiera de los siguientes criterios se clasificaban como dobletes: (1) puntuación scDblFinder ≥ 0,6; (2) puntuación scDblFinder ≥ 0,3 y AMULET ≤ 0,01; y (3) en grupos con un alto porcentaje de dobletes.
4. Normalizar los datos de expresión génica usando datos LogNormalize y CUT&Tag usando TF-IDF. Calcular las incrustaciones de ARN PCA y CUT&Tag, utilizando las dimensiones LSI 2–50 para la modalidad de cromatina. Construye un grafo de vecino más cercano ponderado usando FindMultiModalNeighbors y genera incrustaciones UMAP basadas en el grafo de vecinos multimodales.
5. Anota datos post-QC de Trekker usando transferencia de etiquetas Seurat basada en FindTransferAnchors y una estrategia de mapeo de proyección PCA con parámetros por defecto. Los datos scRNA-seq del ABC Atlas (versión 20230630) se utilizaron como referencia. Durante la curación manual se eliminaron las predicciones de tipo celular inconsistentes con la anatomía tisular conocida.
   NOTA: Los scripts para análisis bioinformático están disponibles en GitHub: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

Utilizando una sección coronal (25 μm de espesor, aproximadamente 70% de cobertura de una baldosa espacial de 10 × 10 mm) de tejido cerebral recién congelado de ratón, el flujo de trabajo descrito aquí proporcionó consistentemente 50.100 núcleos de alta calidad (DE = 12.200, n = 8), suficientes para un perfil multiómico monocelular posterior (Figura 1). Tras el código de barras espacial Trekker de la sección tisular, los núcleos se aislaron mediante disociación de tejido suave y se purificaron posteriormente con el kit de aislamiento de núcleo único de Invent. Este procedimiento resultó en un mínimo de residuos y bajos niveles de agregación nuclear, produciendo preparaciones de núcleos adecuadas para ensayos unicelulares. Imágenes representativas de los núcleos aislados se muestran en la Figura 2.

Para ensayos posteriores de núcleo único, incluyendo el perfilado multiomático CUT&Tag (CUT&Tag + expresión génica), aquí se procesaban típicamente aproximadamente 50.000 núcleos. Para maximizar la recuperación nuclear, se implementó un protocolo simplificado y simplificado de baja entrada CUT&Tag mediante el uso directo de dirigimiento y etiquetado de anticuerpos–pA/Tn5, minimizando así los tiempos de incubación y los pasos^{de lavado 19}. Con este enfoque, se recuperaron aproximadamente 25.000 núcleos etiquetados, lo que corresponde a un rendimiento medio del 48,3% (DE = 6,1, n = 3). Estos núcleos se utilizaron posteriormente para codificación de barras de célula única con las 10x perlas de gel Genomics Chromium Multiome. Para la generación de GEM, se seleccionaron aproximadamente 15.000 núcleos con la expectativa de recuperar ~10.000 núcleos indexados espacialmente tras filtrado de calidad. Según la decodificación de códigos de barras espaciales de Trekker, el 81,3% de los núcleos (SD = 9, n = 3) del conjunto de datos de una sola célula pudieron asignarse con confianza a posiciones espaciales dentro del mosaico.

El flujo de trabajo multioma espacial Trekker–CUT&Tag genera tres bibliotecas indexadas: CUT&Tag, librerías de expresión génica y de códigos de barras espaciales. El ADN preamplificado con código de barras se dividía en dos fracciones, cada una utilizada para la preparación de la biblioteca según la química de captura de los objetivos en las perlas de gel. Las bibliotecas CUT&Tag se amplificaron directamente a partir de ADN preamplificado y mostraron distribuciones de tamaño de fragmento características de la etiquetación CUT&Tag, correspondientes a ADN sin nucleosomas y nucleosómicos (Figura 3A). La biblioteca mostró un buen enriquecimiento del locus Actb positivo para H3K27ac sobre los loci genómicos negativos para H3K27ac^20,21 (es decir, una diferencia de 68 veces, superando el límite de 10 veces establecido previamente para el análisis de inmunoprecipitación por inmunoprecipitación y secuenciación de cromatina de H3K27ac²⁰) (Figura 3B). Para la expresión génica y las bibliotecas de códigos de barras espaciales, el ADN preamplificado se amplificaba primero siguiendo el protocolo de amplificación de cDNA de 10x Genomics y luego se separaba en dos fracciones basadas en el tamaño del fragmento mediante purificación con perlas paramagnéticas. La biblioteca de códigos de barras espaciales indexados se preparó a partir de la fracción enriquecida para fragmentos más cortos y mostró un pico pronunciado en el tamaño esperado del fragmento. Las bibliotecas de expresión génica mostraron una distribución característica de tamaño centrada en fragmentos de ADNc amplificados (Figura 3A).

Figura 4: Representación unicelular y espacial del ensayo espacial multioma Trekker–CUT&Tag en tejido cerebral de ratón. (A) Identificación de tipos celulares mediante análisis de célula única. Los gráficos de aproximación y proyección de variedades uniformes (UMAP) muestran poblaciones celulares anotadas derivadas únicamente de H3K27ac CUT&Tag, expresión génica y el conjunto de datos integrado multioma (CUT&Tag + expresión génica). (B) Representación espacial de datos espaciales de multioma Trekker–CUT&Tag. Los núcleos del conjunto de datos multiomático integrado se asignan a coordenadas espaciales usando códigos de barras de Trekker, revelando distribuciones anatómicamente organizadas de tipos celulares a lo largo de la sección de tejido cerebral del ratón. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La secuenciación y mapeo de las bibliotecas CUT&Tag y de expresión génica se realizaron utilizando Cell Ranger ARC v2.0.2 siguiendo 10x directrices de Genómica, mientras que las bibliotecas de códigos de barras espaciales se procesaron usando Trekker v1.3.0 según las recomendaciones de Takara Trekker. Las opciones sugeridas de mapeo ATAC-seq de una sola celda se aplicaron a las bibliotecas CUT&Tag. Se generaron conjuntos de datos de núcleo único solo para CUT&Tag, expresión génica por sí sola y el multioma combinado (CUT&Tag + expresión génica). Las células con UMIs totales para CUT&Tag (≥ 1.000.000 o ≤ 100) o expresión génica (≥ 100.000 o ≤ 1000) fueron filtradas usando Signac²². La predicción de dobles se realizó utilizando una combinación de scDblFinder²³ para la expresión génica y AMULET²⁴ para CUT&Tag. Se eliminaron las celdas que cumplían uno de los siguientes criterios: 1) scDblFinder.score > 0,6; 2) scDblFinder.score entre 0,3 y 0,6, y amulet.score < 0,01. La anotación de tipo celular se realizó utilizando FindTransferAnchors²⁵ de Seurat, basada en los datos de^{referencia 26} del Allen Brain Cell Atlas. En la biblioteca de expresión génica de este estudio, el recuento medio de UMI por célula fue de 15.378, y el número medio de genes por célula fue de 4.378. Para la biblioteca CUT&Tag, se detectaron 11.860 celdas, con una mediana de 6.631 fragmentos de alta calidad por celda y una puntuación de enriquecimiento TSS de 7,66. Para la biblioteca de códigos de barras espaciales de Trekker, el 92,43% de los núcleos recibieron posiciones espaciales asignadas y el 51,54% de los núcleos a una única ubicación espacial. Los datos de secuenciación en bruto y los datos procesados de análisis secundarios están disponibles a través de GEO bajo el número de acceso GSE327406. El último objeto Seurat anotado post-QC está disponible en Zenodo bajo el número de acceso 19475899. Las incrustaciones representativas de UMAP con anotaciones de tipo de celda se muestran en la Figura 4A. Al vincular códigos de barras de célula única con códigos espaciales, los núcleos individuales se asignaron de nuevo a sus ubicaciones espaciales dentro del tejido para generar un mapa espacial (Figura 4B). Este mapa coincide estrechamente con las características anatómicas observadas en secciones adyacentes y se alinea con una sección coronal del cerebro en el Allen Brain^{Atlas 27}, una referencia estándar para la anatomía cerebral de ratón. El análisis conjunto de la expresión génica espacial y los perfiles H3K27ac a resolución unicelular permitió identificar los principales tipos de células cerebrales y reveló patrones anatómicamente organizados de distribución celular a lo largo de la sección tisular.

Discussion

Este protocolo describe un flujo de trabajo espacial multioma Trekker–CUT&Tag que integra código de barras espacial, perfilado CUT&Tag de baja entrada de H3K27ac, captura simultánea de múltiples objetivos moleculares en las 10x perlas de gel multiomático unicelular de Genómica y preparación de bibliotecas posteriores para la secuenciación Illumina. Al acoplar la indexación espacial con lecturas epigenómicas y transcriptómicas de células individuales, este enfoque aborda una limitación fundamental de los ensayos multiomáticos convencionales de célula única, que carecen de contexto tisular nativo. Este estudio demuestra con éxito la viabilidad del perfilado multioma espacial CUT&Tag (H3K27ac CUT&Tag + expresión génica) y establece una base para el co-perfilado espacial de la expresión génica y objetivos reguladores como las marcas de histonas y proteínas asociadas a la cromatina.

Un riguroso control de calidad en múltiples etapas del flujo de trabajo es esencial para la implementación exitosa de este flujo de trabajo (Figura 1). Aunque el procedimiento descrito aquí comienza con los pasos posteriores a la sección, la calidad de la sección tisular en sí es fundamental para obtener resultados óptimos. El grosor de la sección debe ajustarse según el tipo de tejido y la celularidad esperada. Durante la disociación tisular y el aislamiento de núcleos, maximizar el rendimiento de núcleos mientras se preserva la integridad nuclear es fundamental para el rendimiento global de los ensayos multiomáticos de célula única basados en Trekker. Un bajo rendimiento de núcleos puede deberse a una disociación tisular subóptima, aislamiento ineficiente de núcleos o un grosor de sección insuficiente. La mala integridad nuclear puede deberse a una interrupción mecánica excesiva, tiempos de procesamiento prolongados o sobrelisis. El aislamiento de núcleos representa un punto clave para la resolución de problemas para la implementación exitosa del flujo de trabajo multioma de célula única basado en Trekker. Por ello, se recomienda encarecidamente optimizar específicamente el tejido del protocolo de aislamiento de núcleos antes de iniciar el ensayo multioma de célula única basado en Trekker. Los núcleos aislados deben evaluarse cuantitativa y cualitativamente. El conteo de núcleos con colorantes nucleares proporciona una estimación del rendimiento, mientras que el examen microscópico permite evaluar la integridad de la membrana nuclear, la agregación y la presencia de residuos no nucleares. Tras la preparación de la biblioteca, todas las bibliotecas deben evaluarse para determinar la distribución del tamaño de los fragmentos y la ausencia de dímeros adaptadores. Para las bibliotecas CUT&Tag, el enriquecimiento de las regiones genómicas objetivo sobre el fondo debe evaluarse mediante PCR cuantitativa, proporcionando una indicación temprana de la especificidad del ensayo y la calidad general de la biblioteca antes de la secuenciación. El control de calidad postsecuenciación es igualmente importante para una interpretación precisa de los datos multioma espacial. Métricas como las tasas de mapeo, el recuento de fragmentos por núcleo, el enriquecimiento del sitio de inicio de la transcripción, las puntuaciones fragmento en pico para CUT&Tag, la complejidad génica y la profundidad de lectura por célula deben evaluarse siguiendo las directrices recomendadas por 10x Genomics y Takara Trekker. La evaluación conjunta de estas métricas tanto en modalidades epigenómica como transcriptómica permite identificar artefactos técnicos y garantiza una integración fiable de información espacial, epigenómica y transcripcional.

Aunque en este estudio se demuestra la viabilidad del enfoque de entrada con código de barras basado en Trekker combinado con un ensayo multioma CUT&Tag de célula única, el enfoque descrito también presenta limitaciones. Por ejemplo, el método está actualmente restringido a tejido fresco congelado, y su viabilidad solo se ha demostrado para el perfilado de una única modificación de histonas (H3K27ac) en un solo tipo de tejido (cerebro de ratón) sin réplicas biológicas. Además, el enfoque depende de dos plataformas comerciales propietarias (Takara Trekker y 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). Será necesaria una evaluación adicional entre diversos tipos de tejido y marcas epigenéticas adicionales para valorar la aplicabilidad, rendimiento, generalización y reproducibilidad más amplia de esta tecnología.

En resumen, el protocolo multioma espacial Trekker–CUT&Tag presentado aquí demuestra la capacidad para el co-perfilado espacialmente resuelto de células individuales de características epigenómicas y transcriptómicas. Al combinar el código de barras espacial con la química multioma de células únicas ya establecida, permite la investigación mecanicista de la regulación génica dentro de la arquitectura tisular intacta y ofrece una plataforma poderosa para futuras aplicaciones de biología espacial. Entre los usos potenciales destacados se encuentra la evaluación del impacto de diversos estímulos experimentales y ambientales en el control epigenético de la expresión génica en tipos celulares específicos; por ejemplo, los efectos de las estimulaciones nerviosas podrían analizarse en tipos específicos de neuronas en los sistemas nervioso central y periférico, o el impacto en las células cercanas de las células inmunitarias infiltradas pro- y antiinflamatorias podría revelarse en enfermedades inflamatorias y cánceres.