Identificación de constituyentes anticerebrales de parálisis que dirigen a AChE en Coptis chinensis mediante ultrafiltración de afinidad y validación experimental

Resumen

El propósito de este estudio fue identificar los componentes activos clave de Coptis chinensis y dilucidar su acción en la intervención de la parálisis cerebral (PC) mediante la ultrafiltración de afinidad y la verificación experimental.

Resumen

El propósito de este estudio fue identificar los componentes activos clave de Coptis chinensis y dilucidar sus mecanismos de acción en la intervención de la parálisis cerebral (PC) mediante ultrafiltración por afinidad. Utilizando la acetilcolinesterasa (AChE) como objetivo, se filtró la coptisina del extracto de C. chinensis como el componente con mayor capacidad de unión, que mostró una tasa de unión del 21,9% y una actividad inhibitoria in vitro significativa (IC₅₀ = 3,24 μg/mL). Las simulaciones de acoplamiento molecular y dinámica molecular demostraron que la coptisina podía unirse de forma estable al bolsillo activo de AChE. Posteriormente, se realizaron experimentos de verificación en un modelo neonatal de rata de daño cerebral hipóxico-isquémico (HIBD). Los resultados mostraron que la intervención con coptisina (10 mg/kg) mejoró significativamente el aprendizaje espacial y los déficits de memoria en los animales modelo, aumentó el flujo sanguíneo cerebral en el hemisferio lesionado, alivió el daño patológico de los tejidos cerebrales e inhibió la activación anormal de la AChE en el cerebro. En resumen, este estudio combinó tecnología de ultrafiltración por afinidad y confirmó que la coptisina, identificada a partir del extracto de C. chinensis, puede inhibir la AChE y ejercer efectos neuroprotectores y efectos de mejora del flujo sanguíneo cerebral. Sirve como base material clave para C. chinensis para mitigar déficits neurológicos similares a la PC, proporcionando así moléculas candidatas y evidencia científica para el desarrollo de fármacos relacionados.

Introducción

La parálisis cerebral (PC) es un síndrome permanente causado por daño no progresivo en el cerebro en desarrollo de fetos o bebés, caracterizado principalmente por disfunción motora y anomalías posturales. Aunque actualmente existen múltiples enfoques clínicos para la PC, sigue existiendo una falta de fármacos ideales que puedan reparar fundamentalmente déficits neurológicos con efectos secundarios mínimos. A diferencia de los fármacos sintetizados químicamente, que suelen actuar sobre objetivos individuales y tienen un potencial de toxicidad relativamente alto, las medicinas tradicionales chinas (MTC), con sus ventajas de regulación multicomponente, multiobjetivo y holística, así como los perfiles de seguridad favorables demostrados en la práctica clínica a largo plazo, ofrecen nuevas perspectivas y un reservorio de candidatos a fármacos para el tratamiento de trastornos cerebrales^{complejos 1,} 2,3,4,5,6. Por lo tanto, explorar componentes químicos altamente eficaces y de baja toxicidad a partir de MTC tiene una importancia científica y un valor clínico^{significativos 7}.

Entre los complejos mecanismos patológicos de la parálisis cerebral, la disfunción del sistema nervioso colinérgico juega un papel fundamental ^8,9. La acetilcolinesterasa (AChE) es una enzima clave que hidroliza el neurotransmisor acetilcolina (ACh). Una actividad excesivamente alta de esta enzima provoca la disminución de ACh, dificulta la transmisión de la señal colinérgica y, en consecuencia, agrava el control motor y las disfunciones cognitivas. Por ello, la AChE se ha consolidado como un objetivo farmacológico importante y bien establecido para el desarrollo de agentes neuroprotectores. Inhibir la actividad de AChE para elevar los niveles de ACh en la hendidura sináptica es reconocido como una de las estrategias eficaces para mejorar los déficits neurológicos relacionados con la PC. En el contexto de la lesión cerebral hipóxico-isquémica, la interrupción de la neurotransmisión colinérgica puede agravar aún más la disfunción neuronal, contribuyendo así a deterioros motores y cognitivos relevantes para la PC. Por ello, en este estudio se seleccionó AChE no solo como un blanco neurofuncional clásico, sino también como un punto de entrada mecánicamente relevante para el cribado de compuestos bioactivos con posibles efectos anti-PC.

La investigación moderna ha demostrado que las plantas medicinales tienen una amplia gama de valores de actividad farmacológica. Como medicina tradicional china clásica para eliminar el calor y secar la humedad, Coptis chinensis constituye un sistema complejo abundante en varios alcaloides isoquinolinos. Además de la conocida berberina, también contiene una serie de componentes con estructuras similares y diversas actividades farmacológicas, como coptisina, epiberberina, palmatina y^{jatrorrrizina 10}. Estos alcaloides forman colectivamente la base material para los efectos farmacológicos de C. chinensis. Estudios previos han demostrado que C. chinensis y sus alcaloides poseen propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y potenciales propiedades neuroprotectoras. Sin embargo, dado un sistema de componentes tan complejo, los métodos tradicionales de investigación son difíciles de identificar rápida y con precisión los componentes activos clave que actúan directamente sobre la AChE, lo que limita en gran medida la elucidación profunda de los mecanismos subyacentes a los efectos de C. chinensis en la lesión^{cerebral 11}.

En comparación con el aislamiento guiado por actividad convencional, que normalmente requiere fraccionamientos, pruebas de bioactividad y purificación repetidas, y puede provocar la pérdida o el abandono de compuestos de baja abundancia pero alta afinidad, la ultrafiltración por afinidad permite un cribado rápido de ligandos que se unen al objetivo directamente a partir de mezclas complejas. Esta técnica permite una "pesca" eficiente y rápida de ligandos activos que se unen a objetivos específicos (por ejemplo, AChE) directamente a partir de los extractos de crudo multicomponente de los MTC. Es especialmente adecuado para sistemas con múltiples componentes alcaloides, como C. chinensis, lo que permite la identificación precisa de componentes efectivos que interactúan directamente con el objetivo a partir de la mezcla^{compleja 12}. Combinado con enfoques computacionales que incluyen acoplamiento molecular y simulaciones de dinámica molecular, puede predecir intuitivamente el modo de unión, los tipos de interacción y la estabilidad compleja entre componentes y proteínas objetivo a nivel atómico, proporcionando así evidencia teórica sólida y explicaciones mecanicistas para los resultados del cribado^{experimental 13}.

Basándose en el contexto anterior, este estudio propone la siguiente hipótesis científica: entre los diversos alcaloides presentes en C. chinensis, existen componentes activos que pueden inhibir específicamente la AChE, y estos componentes son la base material para sus posibles efectos anti-parálisis cerebral. Para verificar esta hipótesis, integramos técnicas modernas de cribado con métodos de validación farmacológica: primero, usando AChE como objetivo, se empleó tecnología de ultrafiltración por afinidad para detectar rápidamente posibles inhibidores del extracto multi-alcaloide de C. chinensis; Además, se utilizaron simulaciones de acoplamiento molecular y dinámica molecular para aclarar el mecanismo de unión a nivel atómico; finalmente, se realizaron experimentos in vivo con animales para verificar los efectos mejoradores de los componentes cribados sobre el comportamiento, la patología del tejido cerebral y la actividad de AChE en ratas con PC.

Protocolo

Todos los procedimientos de bienestar animal y experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en Bienestar Animal de Laboratorio del Primer Hospital Popular de Zunyi (Ética nº 2025-2-362). Durante el periodo de modelado y tratamiento, se registraron diariamente la condición corporal y la supervivencia animal.

Preparación del extracto de C. chinensis
En este estudio, se utilizó un extractor acelerado de disolventes para la extracción acelerada de la fracción de n-butanol de materiales medicinales de C. chinensis . Un total de 1 g de polvo seco de C. chinensis fue ponderado con precisión y colocado en celdas de extracción de 40 mL, respectivamente. Se colocaban juntas metálicas y membranas filtrantes de fibra de vidrio secuencialmente por encima y por debajo de la celda de extracción para filtrar la muestra, y la muestra se envolvía con arena de cuarzo. Durante el proceso de extracción, la temperatura y la presión se ajustaron a 90 °C y 100 bar, respectivamente. Se recogía el extracto acelerado y el disolvente de extracción se evaporaba hasta quedar seco usando un evaporador rotatorio para obtener extractos secos de diferentes fracciones polares. Se seleccionó metanol:agua (50:50, v/v) como disolvente de reconstitución. El extracto se filtró a través de una membrana microporosa de 0,45 μm y se almacenó a 4 °C. Antes de la detección de la muestra, se investigó la actividad inhibitoria del disolvente de reconstitución en blanco sobre AChE. Los resultados mostraron que su efecto inhibidor era insignificante, lo que indica que la selección del disolvente de reconstitución en este experimento no afectaría los resultados experimentales.

Ensayo de inhibición de la acetilcolinesterasa
El experimento se realizó en una placa de 96 pozos. Primero, se añadió PBS, seguido de muestras secuenciales de AChE (0,1 U/mL) y C. chinensis . Tras la incubación a 37 °C durante 10 minutos, se añadieron solución cromogénica de 5,5′-Dithiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) (2,5 mmol/mL) y sustrato ATChI (10 mmol/mL). La mezcla se incubó a 37 °C durante otros 10 minutos, y la reacción terminó añadiendo 60 μL de dodecilo sulfato de sodio al 1% (SDS). La absorbancia se midió en 405 nm. Cada muestra de C. chinensis se preparó con 4 grupos: grupo de control a: PBS (120 μL), solución AChE (20 μL), solución DTNB (40 μL), solución ATChI (40 μL) y solución SDS (60 μL) añadidas secuencialmente; Grupo de control en blanco b: PBS (120 μL), solución DTNB (40 μL), solución ATChI (40 μL) y solución SDS (80 μL); Grupo de muestra c: PBS (80 μL), extracto de C. chinensis (20 μL), solución de AChE (20 μL), solución DTNB (40 μL), solución de ATChI (40 μL) y solución SDS (60 μL); Grupo en blanco de muestra d: PBS (100 μL), extracto de C. chinensis (20 μL), solución DTNB (40 μL), solución ATChI (40 μL) y solución SDS (60 μL). Se utilizó Huperzina A como control positivo con una concentración inicial de aproximadamente 2,5 mg/mL. La concentración inicial del extracto de fracción de n-butanol fue de aproximadamente 1 mg/mL. Tanto huperzina A como las muestras se diluyeron con un gradiente del 60%. La tasa de inhibición se calculó usando la siguiente fórmula: Tasa de inhibición (%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100%, donde a, b, c y d representan respectivamente los valores de absorbancia del grupo de control a, el grupo de control en blanco b, el grupo de muestra c y el grupo en blanco d.

La tasa inhibitoria en cada concentración probada se calculó usando la fórmula descrita anteriormente. A continuación, se construyeron curvas concentración-inhibición representando la tasa inhibitoria en función del logaritmo de la concentración del compuesto. Los valores de IC20, IC50 e IC80 se calcularon mediante ajuste de regresión no lineal utilizando el software GraphPad Prism basado en las curvas de concentración-respuesta ajustadas, y se definieron como las concentraciones necesarias para producir una inhibición del 20%, 50% y 80% de la actividad AChE, respectivamente.

Ensayo de ultrafiltración de afinidad
Se realizó una ultrafiltración de afinidad para detectar compuestos que se unen a AChE del extracto de C. chinensis . En resumen, se utilizó la solución de AChE (0,1 U/mL en PBS, pH 7,4) como enzima activa. El control enzimático inactivado se preparó calentando la misma solución de AChE en un baño maria hirviendo durante 10 minutos. Para cada reacción, se mezclaron 200 μL de solución de extracto de C. chinensis con 200 μL de solución activa o inactivada de AChE e incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Tras la incubación, la mezcla se transfirió a un tubo de centrifugación de ultrafiltración de 30 kDa y centrifugada a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. El complejo enzima-ligando retenido se lavó tres veces con 200 μL de PBS bajo las mismas condiciones de centrifugación para eliminar los componentes no unidos. Posteriormente, se añadieron 200 μL de metanol al 90% para disociar y eluir los ligandos unidos a AChE, seguido de incubación durante 10 minutos y centrifugación a 12.000 × g durante 10 minutos. El eluato fue recogido, filtrado y analizado mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Se consideraron componentes potenciales de unión a la enzima 14 los compuestos enriquecidos en el grupo enzimático activo en relación con la enzima^{controlada inactivada}.

Análisis HPLC de los principales metabolitos alcaloides
El análisis cromatográfico se realizó utilizando un sistema HPLC equipado con bomba cuaternaria, un automuestreador, un horno de columna y un detector ultravioleta-visible (UV-Vis). La separación se logró sobre una columna cromatográfica C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) mantenida a 25 °C. La fase móvil consistía en acetonitrilo (A) y una solución de bicarbonato de amonio de 30 mmol/L que contenía 0,7% de amoníaco y 0,25% de trietilamina (B), administrada a un caudal de 1,0 mL/min. El programa de elución en gradiente fue el siguiente: 0–15 min, 90%–75% B; 15–25 min, 75%–70% B; 25–50 min, 70%–55% B. El volumen de inyección era de 5 μL, y la detección UV se realizaba a 270 nm.

Para el análisis cuantitativo de los principales alcaloides en C. chinensis, cada muestra (0,02 g) fue pesada con precisión y extraída ultrasónicamente con 10 mL de solución de ácido clorhídrico-metanol (1:100, v/v) durante 30 minutos. Tras la filtración, la pérdida de peso se compensó con el mismo disolvente de extracción que el peso original, y la solución final se filtró a través de una membrana de 0,45 μm antes del análisis HPLC. Ocho estándares de referencia auténticos, incluyendo magnoflorina, glaucina, jatrorrhizina, columbamina, epiberberina, coptisina, palmatina y berberina, se analizaron bajo las mismas condiciones cromatográficas. Se construyeron curvas de calibración para estos analitos utilizando soluciones de referencia. Debido a que los niveles de abundancia y las respuestas del detector de los ocho alcaloides diferían considerablemente, el rango de calibración para cada analito se optimizó individualmente en función de informes bibliográficos y experimentos preliminares, en lugar de aplicar un esquema idéntico de plegamiento y dilución a todos los compuestos. Por lo tanto, no se esperaba que las relaciones de concentración alta a baja de los rangos lineales fueran idénticas entre los ocho analitos. Los límites de detección (LOD) y los límites de cuantificación (LOQ) se estimaron en relaciones señal-ruido de aproximadamente 3 y 10, respectivamente.

Para el análisis de eluados de ultrafiltración de afinidad, los ligandos disociados de AChE tras la ultrafiltración se recogieron de experimentos repetidos y se concentraron antes del análisis HPLC para asegurar una intensidad de señal adecuada para la detección. Los eluados concentrados se analizaron entonces utilizando las mismas condiciones HPLC descritas anteriormente. Los picos cromatográficos en los eluados se asignaron mediante comparación dirigida con los ocho estándares de referencia auténticos y con el perfil cromatográfico del extracto de C. chinensis obtenido bajo condiciones analíticas idénticas. Por lo tanto, el presente análisis no estaba destinado a la elucidación estructural de novo de compuestos desconocidos, sino a la determinación dirigida de si los alcaloides principales conocidos en C. chinensis estaban enriquecidos en la enzima activa eluada en relación con la enzima inactivada control.

Ensayo de acoplamiento molecular
En el presente estudio, el análisis de acoplamiento se centró en la coptisina porque se identificó como el constituyente de unión a AChE mejor valorado por ultrafiltración de afinidad y también mostró la mayor actividad inhibitoria in vitro entre los principales alcaloides. Los cristales de proteínas se recuperaron del Banco de Datos de Proteínas (PDB). Se seleccionaron cristales proteicos con ligandos cocristalizados como receptores finales de acoplamiento, y todos los cristales de proteína objetivo se derivaron de humanos. El archivo receptor se abría usando el software PyMOL, y los archivos receptor y ligando se separaban y guardaban a continuación; el receptor se abría con el software MGLTools, seguido de la eliminación de moléculas de agua, la adición de átomos y cargas de hidrógeno, la fusión de átomos de hidrógeno no polares, el cálculo de cargas atómicas locales, etc., y luego se guardaba en formato pdbqt; el archivo de ligandos se abría con el software MGLTools, se añadían átomos y cargas de hidrógeno, y se guardaba como un archivo en formato pdbqt; Se abrió la caja de la cuadrícula, el espaciado se estableció en 1,000, se estableció el número de puntos de la cuadrícula, se seleccionaron las coordenadas centrales de la caja según el ligando cocristalizado y se guardaron como archivo^{GPF 15,16}.

Las estructuras de componentes químicos se recogieron primero de la base de datos SciFinder y se guardaron en formato cdx; cada estructura molecular tridimensional se mostró usando el módulo ChemBio3D Ultra, se optimizó la energía con el campo de fuerza MM2, se guardó en formato mol2 y se eliminaron los parámetros de carga. Usando AutoDock, el archivo en formato mol2 se abría con el software MGLTools, se añadían átomos y cargas de hidrógeno al ligando, se observaban enlaces químicos rotativos y se guardaban como un archivo en formato pdbqt. Se aplicó el modelo AutoDock Vina (versión 1.2.5) para realizar la evaluación de acoplamiento molecular.

Ensayo de simulación de dinámica molecular
Se utilizaron los softwares Gaussian 16 y GaussView 6 para la optimización de la estructura de ligandos. Tras importar el archivo mol2 de la estructura del ligando en GaussView 6, el tipo de tarea se configuró en Optimización, el estado de la molécula objetivo se seleccionó como Estado fundamental, el método de cálculo fue la teoría del funcional de densidad (DFT), la multiplicidad de espín se asignó por defecto a Espín por defecto, el funcional utilizado fue B3LYP, el modelo solvente fue IEFPCM, y el disolvente era agua. Tras completar la optimización de la estructura molecular, se utilizó la Gaussian 16 para convertir el archivo chk generado en un archivo fch, que luego se importaba al software Multiwfn para calcular la carga RESP del ligando.

Tras el cálculo de la carga del RESP, el archivo chg generado se importaba al software sobtop_1.0 (dev5) para generar el archivo de topología de ligandos necesario para la simulación de dinámica molecular. La simulación de dinámica molecular se realizó utilizando el software GROMACS 2019.6 con el campo de fuerza AMBER99. Los archivos estructurales de la molécula proteica y la pequeña molécula se importaron al software, se estableció una caja triclínica con un límite periódico de 1,0 nm y se utilizó el modelo de agua TIP3P para el relleno. Se empleó el método Particle Mesh Ewald (PME) para calcular interacciones electrostáticas a largo alcance, y el comando gmx geion se utilizó para introducir un número adecuado de iones de sodio e iones cloruro para neutralizar la carga de todo el sistema. La simulación se realizó a una temperatura constante de 298 K y una presión atmosférica estándar de 100 kPa. Para minimizar la energía, se implementó el método de descenso más pronunciado (empinado). Los comandos gmx grompp y mdrun gmx se utilizaron para realizar 10.000 pasos de equilibrio NVT (conjunto isotérmico-isocórico) y equilibrio NPT (conjunto isotérmico-isobárico), con la constante de acoplamiento de temperatura y la constante de acoplamiento de presión establecidas a 0,1 ps y 0,5 ps, respectivamente, y la duración de la simulación de equilibrio fue de 100 ps. Una vez que el sistema alcanzaba el equilibrio, el paso de tiempo se establecía en 2 fs, y se realizaba una simulación de dinámica molecular de 10 ns en el complejo, guardando los datos de trayectoria cada 2 ps. La producción de 10 ns fue seleccionada como una duración de simulación exploratoria para proporcionar una evaluación dinámica a corta escala temporal del complejo coptisina–AChE acoplado, en lugar de muestreo conformacional exhaustivo. Esta configuración se utilizó para evaluar si el complejo acoplado podía mantener un modo de enlace relativamente estable a lo largo del tiempo. Los comandos gmx rms, gmx rmsf, gmx girar y gmx hbonds se utilizaron además para calcular la desviación cuadrática media de la raíz (RMSD), la fluctuación cuadrática media de la raíz (RMSF), el radio de giro de la proteína, los enlaces de hidrógeno y la superficie accesible por disolvente. QTgrace se utilizó para la visualización de resultados.

Verificación de experimentos con animales
Se seleccionaron dieciocho crías sanas de rata neonatal Sprague-Dawley (SD) (7 días postnatales) de ambos sexos. Todos los animales experimentales fueron alojados en una instalación experimental específica libre de patógenos (SPF). Esta instalación estaba equipada con un estricto sistema de barrera, que podía prevenir eficazmente la invasión de microorganismos y parásitos. Los parámetros ambientales de la habitación de alojamiento se monitorizaban y regulaban automáticamente mediante un sistema de control central: temperatura 22 ± 2 °C, humedad relativa 55% ± 10%, y ciclo de luz de 12 horas y ciclo de luz de 12 horas. Se utilizó un modelo neonatal en rata de daño cerebral hipóxico-isquémico (HIBD) modificado por el método clásico de Rice-Vannucci para simular las características patológicas y conductuales de la PC.

Brevemente, a los cachorros de rata del día 7 postnatales se anestesiaron con un 2–3% de isoflurano para inducción y 1–2% para mantenimiento. Tras una anestesia adecuada, se realizó una incisión cervical en la línea media y se aisló cuidadosamente la arteria carótida común izquierda y se ligó de forma permanente. Luego se suturó la incisión y se permitió que los cachorros se recuperaran en una almohadilla durante 1 hora. Posteriormente, las crías del grupo modelo y coptisina estuvieron expuestas a hipoxia en una cámara que contenía un 8% de O₂ equilibrado con 92% de N₂ durante 2 horas a 37 °C para inducir lesión cerebral hipóxico-isquémica. Los animales operados simuladamente se sometieron a la misma anestesia y exposición quirúrgica sin ligadura carotídica ni tratamiento hipóxico. Tras la hipoxia, las crías fueron devueltas a sus madres y monitorizadas diariamente para detectar su estado general, supervivencia y comportamiento alimenticio durante todo el periodo experimental.

Las ratas experimentales se dividieron aleatoriamente en 3 grupos: Grupo simulado: solo se separó la arteria carótida común izquierda sin ligadura ni tratamiento para la hipoxia, y se administró un volumen igual de disolvente postoperatorio; Grupo modelo: se realizó una cirugía de modelización del daño cerebral hipóxico-isquémico y se administró un volumen igual de disolvente postoperatorio; Grupo coptisina: tras modelar, se administró coptisina (10 mg/kg) por gavage. La dosis de coptisina (10 mg/kg) se seleccionó como dosis in vivo basándose en estudios in vivo/farmacocinéticos previamente reportados de coptisina¹⁷. Los fármacos se administraron una vez al día a una hora fija durante 14 días consecutivos de intervención.

Detección de indicadores animales
El equipo de prueba del laberinto de agua Morris (MWM) consistía en una gran piscina circular (diámetro aproximado de 150 cm) con señales visuales evidentes en la pared de la piscina. El agua de la piscina se estratificó en un blanco opaco lechoso, y la temperatura del agua se controló a 23 ± 1 °C. Se colocó una plataforma transparente en el cuadrante objetivo, sumergida a 1–2 cm bajo la superficie del agua. El entrenamiento se realizaba cuatro veces al día: los animales se colocaban en el agua mirando hacia la pared de la piscina desde cuatro puntos de entrada diferentes, y se registraba el tiempo necesario para encontrar y escalar la plataforma oculta desde la entrada al agua, es decir, la "latencia de escape". Cada sesión de entrenamiento estaba limitada a 60 segundos. Si el animal encontraba la plataforma en menos de 60 s, se le permitía permanecer en ella durante 15 s para consolidar la memoria. Si no se encontraba, el animal era guiado suavemente hasta la plataforma y dejado permanecer durante 15 segundos. Tras 7 días de entrenamiento, la plataforma oculta fue retirada. Los animales se colocaban en el agua desde el punto de entrada opuesto a la plataforma original y se les permitía nadar libremente durante 60 segundos, y la trayectoria de nado de los animales se grababa mediante un sistema de vídeo. A través de la prueba MWM, se registraron indicadores como la latencia media de escape, el tiempo pasado en el cuadrante objetivo y el número de cruces sobre la posición original de la plataforma.

Para la detección por imagen láser de contraste de motas (LSCI): Tras la anestesia, las ratas fueron fijadas en un instrumento estereotáxico, y el cráneo quedó expuesto y se mantuvo húmedo. Se utilizó un sistema de imagen de flujo sanguíneo con speckles láser para recoger continuamente imágenes de speckles sin procesar durante 30 segundos directamente por encima del cráneo. Se utilizó software profesional para convertir el contraste de speckles que varía espaciotemporalmente en un mapa de distribución de la unidad de perfusión del flujo sanguíneo cerebral (PU). Para el análisis cuantitativo, se seleccionó un ROI cortical delimitado manualmente dentro del hemisferio ipsilateral expuesto en cada imagen según el área de perfusión cortical relevante para la lesión y los hitos anatómicos visibles, y se utilizó el valor medio de perfusión dentro de este ROI para la comparación entre grupos.

Se recogieron tejidos cerebrales y se añadió PBS preenfriado según la relación peso-volumen. Se realizó homogeneización mecánica sobre hielo, seguida de centrifugación a 8000 × g a 4 °C durante 10–15 minutos, y se recogió el sobrenadante para su prueba. Los tejidos cerebrales se colocaron rápidamente en paraformaldehído al 4% para fijarse durante más de 24 horas y mantener la morfología tisular. La tinción por hematoxilina-eosina (HE) se realizó mediante operaciones como deshidratación, limpieza e incrustación de parafina, y el grado de lesión cerebral se observó bajo un microscopio óptico.

Para la medición de la actividad de AChE, se recogió y homogeneizó la corteza cerebral del hemisferio lesionado (ipsilateral) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de tejido se homogeneizaron en un tampón de extracción y centrifugaron a 8000 × g durante 10 minutos a 4 °C, y se recogió el sobrenadante para su análisis. La actividad de AChE se determinó utilizando un kit comercial de ensayo de actividad de acetilcolinesterasa (método microplaca/colorimétrico). Este ensayo se basa en la hidrólisis de acetilcolina por AChE, seguida de una reacción con DTNB para generar un producto cromogénico, y la absorbancia se midió en 412 nm para el cálculo de la actividad enzimática. Dado que este kit es un ensayo colorimétrico basado en la actividad enzimática en lugar de un kit convencional de inmunosorción enzimática cuantificadora de antígenos (ELISA), el fabricante no proporcionó un rango estándar de detección ni sensibilidad analítica. En el presente estudio, los valores medidos de actividad AChE en el tejido cortical estuvieron aproximadamente dentro del rango de 25–80 nmol/min/mg de proteína.

Análisis estadístico
Todos los datos experimentales se expresaron como media ± desviación estándar (SD) y se analizaron utilizando el software GraphPad Prism. Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguidos de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Para la prueba del laberinto acuático de Morris, el resultado final del entrenamiento y los parámetros de la prueba de sonda se analizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05¹⁸. La correlación entre la perfusión del flujo sanguíneo cerebral en el ROI y la actividad de AChE en la corteza cerebral ipsilateral se analizó mediante análisis de correlación Pearson. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05.

Resultados

Análisis de componentes químicos en extracto de C. chinensis
Los alcaloides son los principales componentes acumulados y también los principales componentes activos de los materiales medicinales de C. chinensis . En este estudio, se utilizó tecnología cromatográfica para analizar los principales componentes químicos en C. chinensis (Figura 1A). Como se muestra en la Tabla 1, los ocho analitos mo...

Discusión

Actualmente, se han desarrollado diversos métodos y tecnologías para la prevención y el tratamiento de enfermedades^cerebrales 20,21,22. En este estudio, se adoptó una estrategia integrada de cribado in vitro, simulación computacional y verificación in vivo para clarificar sistemáticamente la base material y el mecanismo multi-objetivo de C. chinensis en la mejora de lo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)	CATO Research Chemicals Inc.	416046844	Ensayo de inhibición de acetilcolinesterasa
Acetilcolinesterasa (AChE)	Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd	C1682	Ensayo de inhibición de acetilcolinesterasa
Acetiltiocoline yodado (ATChI)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	1037408	Ensayo de inhibición de acetilcolinesterasa
Aetonitrile	Thermo Fisher Scientific Inc	1162577	Fase móvil de cromatografía líquida
AutoDock Vina	AutoDock	Versión 1.2.5
Berberina estándar	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	110713-201814	Análisis de composición química
Columbamina estándar	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180712	Análisis de composición química
Coptisina estándar	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	Análisis de composición química
Extractor de solvente acelerado E-916	Büchi Labortechnik AG, Suiza	E916-008	Extracción de la fracción de n-butanol
Epiberberina estándar	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	Análisis de composición química
Ácido fórmico	Thermo Fisher Scientific Inc	1270563	Fase móvil de cromatografía líquida
GaussView 6	Gaussian	https://gaussian.com/gaussview6/
Glaucina estándar	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180615	Análisis de composición química
Jatrorrizína estándar	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180607	Análisis de composición química
Magnoflorina estándar	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180205	Análisis de composición química
Metanol	Thermo Fisher Scientific Inc	1162578	Fase móvil de cromatografía líquida
Membrana microporosa	Millipore Filter Company	2139547	Filtración de extractos
Palmatina estándar	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180226	Análisis de composición química
Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
PyMOL	PyMOL	https://pymol.org/
Carbonato de sodio	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	15138805	Ensayo de inhibición de acetilcolinesterasa
Dodecilsulfato de sodio (SDS)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	11019349	Ensayo de inhibición de acetilcolinesterasa