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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
Se ha identificado a la proteína 1 que contiene dominios SAM y SH3 (SASH1) como un regulador clave de la apoptosis y la inflamación en los trofoblastos durante la preeclampsia (PE). Los exosomas derivados del tejido placentario (P-EXOS) alivian el daño inducido por hipoxia mediante la supresión de la expresión de SASH1. Estos hallazgos revelan un mecanismo novedoso subyacente a la patogénesis de la PE y sugieren que SASH1 podría ser un blanco terapéutico potencial.
SASH1 es una proteína adaptadora de señales implicada en el crecimiento celular, la apoptosis y la regulación inmunitaria, y ha sido objeto de un número creciente de estudios en células tumorales e inmunitarias. Evidencias recientes sugieren que SASH1 desempeña un papel importante en las respuestas inflamatorias y en la homeostasis celular, procesos estrechamente asociados con el desarrollo de la preeclampsia (PE). Este estudio tuvo como objetivo determinar si SASH1 contribuye a la apoptosis de los trofoblastos y a las respuestas inflamatorias en la PE, y si los P-EXOS ejercen efectos protectores mediante la regulación de SASH1. En este trabajo, se analizaron tres conjuntos de datos transcriptómicos relacionados con la PE (GSE75010, GSE10588 y GSE60438) para identificar genes expresados diferencialmente (DEGs) comunes, seguido de análisis de enriquecimiento mediante Ontología Genética (GO) y el KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Además, se aplicaron algoritmos de aprendizaje automático para seleccionar genes candidatos clave, y se utilizaron datos de secuenciación de ARN a nivel de célula individual para caracterizar la heterogeneidad celular en el tejido placentario y determinar los patrones de expresión específicos de cada tipo celular. SASH1 se identificó como un gen candidato consenso y mostró una regulación significativamente positiva en células trofoblásticas procedentes de muestras de PE. In vitro, se estableció un modelo de células trofoblásticas HTR-8/SVneo tratadas con hipoxia, combinado con la inhibición de SASH1, la sobreexpresión de SASH1 y el cultivo conjunto con P-EXOS. Los experimentos funcionales mostraron que la inhibición de SASH1 suprimió significativamente la apoptosis inducida por hipoxia en los trofoblastos y redujo la secreción de citocinas proinflamatorias, incluyendo IL-6, IL-1β y TNF-α, mientras que la sobreexpresión de SASH1 promovió la apoptosis y las respuestas inflamatorias. Además, el tratamiento con P-EXOS redujo notablemente la expresión de SASH1 tanto a nivel de ARNm como de proteína, y atenuó la lesión trofoblástica inducida por hipoxia, mientras que la sobreexpresión de SASH1 anuló en gran medida estos efectos protectores. En conjunto, estos hallazgos indican que SASH1 desempeña un papel fundamental en la apoptosis de los trofoblastos y en las respuestas inflamatorias en la PE. Los P-EXOS podrían aliviar la lesión trofoblástica inducida por hipoxia mediante la supresión de la expresión de SASH1, aportando nuevas perspectivas sobre los mecanismos moleculares y posibles dianas terapéuticas para la PE.
La PE es un trastorno multisistémico específico del embarazo que generalmente ocurre después de las 20 semanas de gestación y se caracteriza clínicamente por hipertensión, proteinuria y disfunción multiorgánica. Sigue siendo una causa principal de morbilidad y mortalidad materna y perinatal en todo el mundo1. A pesar de los continuos avances en el manejo clínico, el tratamiento definitivo para la PE sigue siendo la expulsión de la placenta, lo que subraya la comprensión incompleta de su patogénesis y la necesidad urgente de identificar nuevos mecanismos moleculares y celulares, así como posibles dianas terapéuticas2,3.
Una invasión adecuada del trofoblasto y la promoción del desarrollo placentario normal son mecanismos críticos subyacentes a la patogénesis de la PE4. Durante un embarazo normal, las células trofoblásticas invaden la decidua uterina y remodelan las arterias espirales para establecer una circulación de baja resistencia y alta capacidad. La invasión y migración deficientes de las células trofoblásticas conducen a una perfusión placentaria reducida, lo que resulta en un entorno persistente de hipoxia y estrés oxidativo. La hipoxia afecta directamente la apoptosis celular, y la liberación anómala de mediadores proinflamatorios altera la homeostasis en la interfaz materno-fetal, agravando aún más la disfunción placentaria5. La inflamación también es un impulsor importante de la PE. Se ha encontrado que las concentraciones de IL-17, IL-6 y TNF-α están marcadamente elevadas en la placenta y en la sangre periférica de pacientes con PE6. La hipoxia y la inflamación se refuerzan mutuamente, formando un círculo vicioso que amplifica la inflamación sistémica, causa daño endotelial y contribuye a las anomalías placentarias. Las redes moleculares subyacentes que regulan la apoptosis del trofoblasto y las respuestas inflamatorias permanecen en gran parte desconocidas.
SASH1 es un miembro de la familia de proteínas intracelulares de andamiaje SLy/SASH1 que funciona como adaptador de señalización7. SASH1 ha sido caracterizado principalmente como un supresor tumoral que inhibe la transición epitelial-mesénquima (EMT), la migración celular y la invasión mediante interacciones con socios de señalización como CRKL y la vía PI3K-Akt-mTOR8,9. Más allá de sus funciones supresoras de tumores, evidencia emergente sugiere que SASH1 participa en la señalización inflamatoria y la regulación inmunitaria7. Sin embargo, la expresión y función de SASH1 en la placenta, particularmente en el contexto de la biología de los trofoblastos y la PE, no han sido investigadas.
Los exosomas han surgido como mediadores celulares importantes y se están estudiando cada vez más en el contexto del embarazo10. Los exosomas transportan diversos cargos bioactivos, incluyendo proteínas, lípidos y ARN no codificantes, para modular la función de las células dianas. Evidencias crecientes sugieren que los P-EXOS desempeñan un papel crítico en la regulación inmunitaria durante el embarazo, y que su actividad y su contenido se alteran significativamente en la PE, lo que podría intensificar el estado inflamatorio11. También se ha implicado a los exosomas en la regulación del estrés oxidativo12 y la angiogénesis13, posiblemente ejerciendo efectos beneficiosos en las complicaciones relacionadas con el embarazo. Sin embargo, sus dianas moleculares y mecanismos de acción en la PE aún no se comprenden completamente.
Se planteó la hipótesis de que SASH1 está desregulado en la placenta de PE y actúa como un impulsor clave de la apoptosis de los trofoblastos y de las respuestas inflamatorias, y de que los P-EXOS podrían ejercer efectos protectores frente al daño en los trofoblastos mediante la modulación de la expresión de SASH1. Para comprobar esta hipótesis, se integraron múltiples conjuntos de datos transcriptómicos de PE y se utilizó secuenciación de ARN a nivel de célula individual junto con aprendizaje automático basado en múltiples algoritmos para identificar genes candidatos clave. Mediante un modelo celular de trofoblasto HTR-8/SVneo tratado con hipoxia y experimentos de intervención basados en exosomas, se investigó el papel funcional de SASH1 en la disfunción del trofoblasto y el potencial terapéutico de los P-EXOS en la PE.
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Declaración de ética
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Cuarto de Shijiazhuang (número de aprobación: 20200031). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes de tejido placentario antes de la recolección de muestras. Todos los procedimientos que involucraron a participantes humanos se realizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se proporciona una lista completa de los reactivos, materiales de consumo, equipos y software utilizados en este protocolo en la Tabla de Materiales.
Recolección de datos
Los datos de RNA-seq se obtuvieron de la base de datos GEO. Los conjuntos de datos incluyeron GSE75010, que contiene datos de expresión génica de 157 placentas con PE y 173 placentas sin PE (N = 330). GSE10588 contiene datos de expresión génica de 26 placentas normales y 17 placentas con PE grave (N = 43). GSE60438 contiene datos de perfilado del transcriptoma de decidua basalis de pacientes con pre-eclampsia y embarazos normotensos (N = 125). Los datos de transcriptoma de célula individual se obtuvieron del conjunto de datos GEO GSE183338. Incluye muestras de núcleos individuales de vellosidades coriónicas/interfaz materno-fetal de embarazos con PE y embarazos sanos.
Análisis de DEGs
Primero, los DEG asociados con PE, los conjuntos de datos GSE75010, GSE10588 y GSE60438, fueron preprocesados y normalizados. Luego, se realizó un análisis diferencial utilizando el paquete de R «limma»14 basado en la información de agrupación de muestras. Se seleccionaron los genes con p < 0,05 y |log2FC| > 0,5. Los gráficos de volcanes de los DEG se generaron utilizando el paquete de R ggplot2. Los mapas de calor de los 20 principales DEG se elaboraron utilizando el paquete de R pheatmap. Posteriormente, se obtuvo la intersección de los DEG seleccionados de los tres conjuntos de datos, y se construyó una red de interacción proteína-proteína (PPI) para los genes candidatos utilizando la plataforma en línea STRING, con una puntuación de interacción ≥0,15. Los 20 principales genes centrales se identificaron posteriormente a partir de esta red PPI según su grado de conectividad, ordenados mediante el software Cytoscape. Los resultados de la red PPI se visualizaron utilizando el software Cytoscape o STRING.
Análisis de enriquecimiento
Se realizó un análisis de enriquecimiento génico utilizando los paquetes ClusterProfiler y DOSE en combinación con el sitio web Metascape. Las bases de datos se obtuvieron de GO y KEGG. El análisis de enriquecimiento se llevó a cabo mediante la función «EnrichGO». Se consideraron significativamente enriquecidas las vías con p < 0,05. Los resultados del enriquecimiento se visualizaron utilizando los paquetes «ggplot2» y «ggpubr».
Aprendizaje automático
Para identificar genes diferencialmente expresados (GDE) robustos y biológicamente significativos asociados con la preeclampsia, se realizó un análisis de selección de características mediante aprendizaje automático multimodelo basado en el conjunto de datos transcriptómicos públicamente disponible GSE60438 (plataforma: GPL6884). Este conjunto de datos contiene el perfil de expresión de muestras de decidua basal obtenidas de embarazos con preeclampsia y embarazos normotensos durante cesáreas. Los GDE prefiltrados se estandarizaron, y la matriz de expresión, junto con la información correspondiente de agrupación clínica, se utilizó como entrada para cuatro algoritmos distintos de aprendizaje automático con el fin de reducir el sesgo del modelo y mejorar la estabilidad de la selección de características.
Los cuatro algoritmos se aplicaron simultáneamente, sin un orden específico. LASSO se realizó utilizando el paquete «glmnet» para llevar a cabo análisis de regresión y seleccionar los genes característicos importantes. Se añadió un término de regularización L1 a la función de pérdida, que reduce los coeficientes de las características menos importantes a cero, logrando así la selección de características. SVM-RFE se implementó utilizando el paquete «e1071» para construir una máquina de vectores de soporte con eliminación recursiva de características. Primero se entrenó un clasificador mediante SVM, y luego se eliminaron iterativamente las características menos informativas según los pesos de las características, obteniéndose un subconjunto óptimo de características. XGBoost se aplicó utilizando el paquete «xgboost» para construir múltiples árboles de decisión. Cada árbol ajustó los residuos del árbol anterior, y las salidas ponderadas se acumularon para obtener la predicción final. Boruta se realizó utilizando el paquete «randomForest», generando características sombra que compitieron con las características reales durante el entrenamiento de un bosque aleatorio. Se conservaron aquellas características cuyos valores de importancia fueron significativamente superiores al ruido aleatorio.
Análisis de datos de transcriptómica de una sola célula
Los datos del transcriptoma de célula individual se obtuvieron de la base de datos GEO, y la matriz de conteo crudo se recuperó de GSE183338. La matriz de conteo se importó utilizando la función «Read10X» del paquete Seurat y se convirtió al formato dgCMatrix. Los objetos individuales se fusionaron en un único objeto agregado mediante la función «merge», y las etiquetas celulares se hicieron únicas usando «RenameCells». Las células de baja calidad se filtraron según los siguientes criterios: se eliminaron los genes expresados en menos de tres células, y se excluyeron las células que expresaban menos de 200 genes. Las células controladas por calidad se normalizaron y se identificaron los genes altamente variables. Se aplicó una normalización de escala global utilizando «LogNormalize» (factor de escala = 10.000), se seleccionaron los genes altamente variables (n = 2.000) mediante «FindVariableFeatures» y los datos se escalaron usando «ScaleData». Se realizó un análisis de componentes principales sobre las características altamente variables, y se conservaron las primeras 30 componentes principales. Los efectos de lote entre muestras se corrigieron utilizando el método Harmony. Las células se visualizaron y redujeron dimensionalmente mediante UMAP. Se construyeron grafos de vecinos más cercanos compartidos utilizando «FindNeighbors» y «FindClusters» basados en el algoritmo de Louvain. El parámetro de resolución en «FindClusters» se optimizó entre 0,1 y 1. El árbol de agrupamiento se visualizó utilizando la función «clustree», y se seleccionó una resolución de 0,9 para definir los grupos celulares. Los posibles dobletes se eliminaron utilizando el algoritmo Scrublet. Los grupos celulares se anotaron identificando genes marcadores expresados diferencialmente mediante la función «FindAllMarkers». Se aplicó la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de Bonferroni. Las identidades celulares se asignaron según marcadores de superficie, literatura relevante y la Base de Datos de Clasificación Celular15.
Cultivo celular
Las células de la línea celular de trofoblasto HTR-8/SVneo se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina/estreptomicina. Las condiciones hipóxicas se establecieron cultivando las células al 1% de O₂, 5% de CO₂ y 94% de N₂ durante 24 h; los controles normóxicos se mantuvieron al 20% de O₂ y 5% de CO₂16. Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse en una cabina de seguridad biológica de Clase II utilizando técnicas asépticas. Los medios de cultivo, los reactivos de transfección y los desechos celulares deben desecharse de acuerdo con las directrices institucionales de seguridad biológica.
Transfección celular
Se sintetizaron plásmidos que contenían sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 y OE-NC. Las células HTR-8/SVneo se sembraron a una densidad de 5 × 105 células por pocillo en placas de seis pocillos. Posteriormente, las células se transfectaron con 2 µg de plásmido sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 u OE-NC por pocillo utilizando un reactivo de transfección según las instrucciones del fabricante. En resumen, el ADN plasmídico y el reactivo P3000 se diluyeron en Opti-MEM, se mezclaron con Lipofectamina 3000 diluida por separado en Opti-MEM, se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente y se añadieron a las células con una confluencia del 70–80%. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, la expresión de SASH1 se evaluó mediante RT-qPCR y Western blot. Las secuencias diana de shRNA utilizadas para el silenciamiento de SASH1 se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.
PCR cuantitativa en tiempo real
Se extrajo ARN total de células HTR-8/SVneo y se transcribió inversamente a ADNc utilizando un kit de transcripción inversa a 42 °C durante 30 min, seguido de 85 °C durante 5 min. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando una mezcla maestra de SYBR Green con las siguientes condiciones de ciclado: 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min. La expresión relativa de ARNm se calculó mediante el método ΔΔCt, utilizando β-actina como referencia interna. Las secuencias de los cebadores utilizadas en este experimento se enumeran en la Tabla Suplementaria 2.
Ensayo de inmunotransferencia Western
Se extrajo la proteína total de células HTR-8/SVneo utilizando tampón de lisis. Los lisados celulares se recogieron, se incubaron en hielo y se centrifugaron a 12.000 × g durante 30 min a 4 °C para eliminar los restos insolubles. La concentración de proteína se determinó utilizando un espectrofotómetro. Se separaron cantidades iguales de proteína (50 µg) mediante electroforesis en SDS-PAGE y posteriormente se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % y se incubaron con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Después del lavado, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios correspondientes y las bandas proteicas se visualizaron mediante un sistema de detección de quimioluminiscencia mejorado.
Para la detección de proteínas, los anticuerpos primarios incluyeron anti-SASH1 y β-actina. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiados—anticuerpo secundario de cabra anti-conejo y anticuerpo secundario de cabra anti-ratón—. La β-actina se empleó como control interno de carga para asegurar una cantidad igual de proteína cargada. La intensidad de las bandas proteicas se midió y cuantificó mediante el software ImageJ.
Aislamiento de P-EXOS
Los P-EXOS se aislaron de tejido corial obtenido de vellosidades placentarias de placentas a término procedentes de mujeres sanas sometidas a cesárea electiva. El tejido corial se lavó exhaustivamente con PBS estéril y se picó en fragmentos de aproximadamente 1 mm3 fragmentos, y cultivados en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de SFB agotado de exosomas a 37 °C en 5% CO2 durante 48 h. El medio condicionado se sometió a centrifugación diferencial de la siguiente manera: 300 × g durante 10 min para eliminar células y restos de tejido; 2.000 × g durante 20 min para eliminar restos celulares; y 10.000 × g durante 30 min para eliminar microvesículas, todo a 4 °C. El sobrenadante resultante se ultracentrifugó a 120.000 × g durante 70 min a 4 °C para sedimentar las exosomas. El sedimento se lavó una vez con PBS y se sometió nuevamente a ultracentrifugación a 120.000 × g durante 70 min a 4 °C. El pellet final se resuspendió en PBS. Los exosomas aislados se caracterizaron mediante análisis por inmunotransferencia para detectar marcadores de exosomas (PLAP, CD63 y TSG101, con GM130 como control negativo) y se examinaron además mediante microscopía electrónica de transmisión para la observación morfológica.
Experimento de captación celular de P-EXOS
Para confirmar la internalización celular de P-EXOS, los exosomas se marcaron fluorescentemente con el colorante lipofílico de membrana PKH67 según el protocolo del fabricante. En resumen, los P-EXOS se incubaron con PKH67 (4 µM) en Diluyente C durante 5 min a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo con un volumen igual de albúmina de suero bovino (BSA) al 1%. Los exosomas marcados se reaislaron mediante ultracentrifugación (120.000 × g, 70 min, 4 °C) para eliminar el colorante no unido. Posteriormente, se añadieron P-EXOS marcados con PKH67 (50 µg/mL) a células HTR-8/SVneo y se co-incubaron durante 24 h en condiciones normóxicas o hipóxicas (1% O₂). Las células se lavaron posteriormente tres veces con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min y los núcleos se contratinjeron con DAPI (1 µg/mL). La internalización de los exosomas marcados con PKH67 se visualizó mediante microscopía confocal de barrido láser (CLSM; excitación 490 nm, emisión 502 nm). Para experimentos funcionales de co-cultivo, las células HTR-8/SVneo se trataron con P-EXOS a una concentración de 50 µg/mL (equivalente de proteína) en medio RPMI-1640 completo suplementado con 10% de SFB agotado de exosomas, bajo condiciones hipóxicas (1% O₂) durante 24 h.
Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se midieron los niveles de IL-6, IL-1β y TNF-α mediante el kit de ELISA para IL-6, el kit de ELISA para IL-1β y el kit de ELISA para TNF-α, respectivamente, según las instrucciones del fabricante. Se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas, y las concentraciones reales se calcularon a partir de las curvas estándar.
Etiquetado de extremos rotos de dUTP mediado por TdT (TUNEL)
Las células apoptóticas se detectaron utilizando el kit de ensayo TUNEL según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 5 min en hielo, y se incubaron con la mezcla de reacción TUNEL durante 60 min a 37 °C en la oscuridad. Los núcleos se contratinjeron con DAPI, y las células TUNEL-positivas se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia y se cuantificaron contando el porcentaje de células TUNEL-positivas en al menos cinco campos seleccionados aleatoriamente por muestra.
Análisis estadístico
Todos los datos se analizaron utilizando R y GraphPad Prism. Las variables continuas se presentan como media ±DE. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron mediante la prueba t de Student, mientras que las comparaciones entre múltiples grupos se llevaron a cabo mediante ANOVA de un factor seguido de la prueba post hoc de Tukey. La significancia estadística para variables categóricas se evaluó mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. A menos que se indique lo contrario, las correlaciones entre moléculas se calcularon utilizando el análisis de correlación de Spearman. Los experimentos de caracterización de exosomas se realizaron utilizando P-EXOS aislados de tres donantes placentarios independientes. Los experimentos con células se realizaron en tres réplicas biológicas independientes, representando experimentos independientes realizados en ocasiones diferentes con células HTR-8/SVneo de diferentes pasajes, utilizando en cada réplica P-EXOS aislados de un donante placentario diferente. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
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Análisis transcriptómico de pacientes sanos y con PE
Para analizar las diferencias de expresión génica entre el grupo normal (Normal) y los pacientes con PE, se examinó la expresión diferencial mediante el paquete R limma en los conjuntos de datos combinados. Se identificaron un total de 89 genes diferencialmente expresados (DEG) (p < 0,05 y |log2FC| > 0,5), de los cuales 69 fueron genes regulados hacia arriba y 20 regulados hacia abajo en GSE75010 (<...
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En este estudio, SASH1 fue identificado como un gen clave regulado de manera anormal en la PE mediante análisis transcriptómico integrado, secuenciación de célula individual y aprendizaje automático multi-algoritmo, un enfoque particularmente relevante dado que aún no existen terapias dirigidas para la PE17. Se demostró que SASH1 está significativamente sobreexpresado en células trofoblásticas hipóxicas y elevado específicamente en el compartimento trofoblástico de placentas con PE a resolución de...
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No existe conflicto de intereses en este estudio.
Este estudio fue financiado por el Programa Clave de Investigación Científica en Medicina de la Comisión de Salud de la Provincia de Hebei, China (n.º 20210075).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio RPMI-1640 | Gibco | 11875085 | |
| Suero bovino fetal (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| FBS libre de exosomas | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Penicilina/estreptomicina | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Reactivo de transfección Lipofectamina 3000 (con reactivo P3000) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Medio Opti-MEM con suero reducido | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| Plásmido de ARNip para SASH1 (HuSH) | origene | TL301836 | |
| Plásmido de expresión de ORF de SASH1 | origene | RC218866 | |
| Vector vacío control | origene | PS100001 | |
| Kit de transcripción inversa | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| Mezcla maestra PowerUp SYBR Green | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| Primeros para SASH1 | Sangon Biotech | Sintetizados a medida | |
| Primeros para β-actina | Sangon Biotech | Sintetizados a medida | |
| Tampón de lisis celular | Beyotime | P0013B | |
| Espectrofotómetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| Membrana de PVDF | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Anticuerpo anti-SASH1 | ABclonal | A15248 | |
| Anticuerpo anti-β-actina | Abcam | ab6276 | |
| Anticuerpo secundario conjugado con HRP, anti-conejo/anti-ratón de cabra | Beyotime | A0208 | |
| Software ImageJ | NIH (dominio público) | ImageJ | |
| Kit PKH67 Green Fluorescent Cell Linker (incluye Diluyente C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Microscopio confocal de barrido láser (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Kit ELISA Quantikine para IL-6 humana | R&D Systems | D6050B | |
| Kit ELISA DuoSet para IL-1β/IL-1F2 humana | R&D Systems | DY201 | |
| Kit ELISA Quantikine para TNF-α humana | R&D Systems | DTA00D | |
| Lector de microplacas | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| Kit de detección de muerte celular in situ (Kit de ensayo TUNEL) | Roche | 11684795910 | |
| Tritón X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldehído (4%) | Beyotime | P0099 | |
| Microscopio de fluorescencia | Olympus | BX53 | |
| Centrífuga refrigerada (capacidad de 12,000 × g) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultracentrífuga (capacidad de 120,000 × g) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Software R | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (paquete de R) | Satija Lab (código abierto) | v4.0.4 | |
| Harmony (paquete de R, corrección de lotes) | Código abierto | v1.2.0 | |
| Scrublet (paquete de Python, detección de dobletes) | Código abierto | v0.2.3 | |
| clustree (paquete de R) | Código abierto | v0.5.1 | |
| glmnet (paquete de R, LASSO) | Código abierto | v4.1.8 | |
| e1071 (paquete de R, SVM-RFE) | Código abierto | v1.7-14 | |
| xgboost (paquete de R) | Código abierto | v1.7.7.1 | |
| randomForest (paquete de R, Boruta) | Código abierto | v4.7-1.1 | |
| Base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| Base de datos STRING | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Software Cytoscape | Cytoscape Consortium | v3.10.4 | |
| ggplot2 (paquete de R) | Código abierto | v3.5.1 | |
| limma (paquete de R) | Código abierto | v3.58.1 | |
| pheatmap (paquete de R) | Código abierto | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (paquete de R) | Código abierto | v4.8.3 | |
| DOSE (paquete de R) | Código abierto | v3.28.2 | |
| ggpubr (paquete de R) | Código abierto | v0.6.0 |
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