Artículo de investigación

Los exosomas derivados de la placenta mitigan la apoptosis del trofoblasto inducida por hipoxia y la progresión inflamatoria a través de SASH1

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DOI:

10.3791/71083

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18 de agosto de 2026

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1Department of Obstetrics and Gynecology, The Fourth Hospital of Shijiazhuang

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se ha identificado a la proteína 1 que contiene dominios SAM y SH3 (SASH1) como un regulador clave de la apoptosis y la inflamación en los trofoblastos durante la preeclampsia (PE). Los exosomas derivados del tejido placentario (P-EXOS) alivian el daño inducido por hipoxia mediante la supresión de la expresión de SASH1. Estos hallazgos revelan un mecanismo novedoso subyacente a la patogénesis de la PE y sugieren que SASH1 podría ser un blanco terapéutico potencial.

Resumen

SASH1 es una proteína adaptadora de señales implicada en el crecimiento celular, la apoptosis y la regulación inmunitaria, y ha sido objeto de un número creciente de estudios en células tumorales e inmunitarias. Evidencias recientes sugieren que SASH1 desempeña un papel importante en las respuestas inflamatorias y en la homeostasis celular, procesos estrechamente asociados con el desarrollo de la preeclampsia (PE). Este estudio tuvo como objetivo determinar si SASH1 contribuye a la apoptosis de los trofoblastos y a las respuestas inflamatorias en la PE, y si los P-EXOS ejercen efectos protectores mediante la regulación de SASH1. En este trabajo, se analizaron tres conjuntos de datos transcriptómicos relacionados con la PE (GSE75010, GSE10588 y GSE60438) para identificar genes expresados diferencialmente (DEGs) comunes, seguido de análisis de enriquecimiento mediante Ontología Genética (GO) y el KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Además, se aplicaron algoritmos de aprendizaje automático para seleccionar genes candidatos clave, y se utilizaron datos de secuenciación de ARN a nivel de célula individual para caracterizar la heterogeneidad celular en el tejido placentario y determinar los patrones de expresión específicos de cada tipo celular. SASH1 se identificó como un gen candidato consenso y mostró una regulación significativamente positiva en células trofoblásticas procedentes de muestras de PE. In vitro, se estableció un modelo de células trofoblásticas HTR-8/SVneo tratadas con hipoxia, combinado con la inhibición de SASH1, la sobreexpresión de SASH1 y el cultivo conjunto con P-EXOS. Los experimentos funcionales mostraron que la inhibición de SASH1 suprimió significativamente la apoptosis inducida por hipoxia en los trofoblastos y redujo la secreción de citocinas proinflamatorias, incluyendo IL-6, IL-1β y TNF-α, mientras que la sobreexpresión de SASH1 promovió la apoptosis y las respuestas inflamatorias. Además, el tratamiento con P-EXOS redujo notablemente la expresión de SASH1 tanto a nivel de ARNm como de proteína, y atenuó la lesión trofoblástica inducida por hipoxia, mientras que la sobreexpresión de SASH1 anuló en gran medida estos efectos protectores. En conjunto, estos hallazgos indican que SASH1 desempeña un papel fundamental en la apoptosis de los trofoblastos y en las respuestas inflamatorias en la PE. Los P-EXOS podrían aliviar la lesión trofoblástica inducida por hipoxia mediante la supresión de la expresión de SASH1, aportando nuevas perspectivas sobre los mecanismos moleculares y posibles dianas terapéuticas para la PE.

Introducción

La PE es un trastorno multisistémico específico del embarazo que generalmente ocurre después de las 20 semanas de gestación y se caracteriza clínicamente por hipertensión, proteinuria y disfunción multiorgánica. Sigue siendo una causa principal de morbilidad y mortalidad materna y perinatal en todo el mundo1. A pesar de los continuos avances en el manejo clínico, el tratamiento definitivo para la PE sigue siendo la expulsión de la placenta, lo que subraya la comprensión incompleta de su patogénesis y la necesidad urgente de identificar nuevos mecanismos moleculares y celulares, así como posibles dianas terapéuticas2,3.

Una invasión adecuada del trofoblasto y la promoción del desarrollo placentario normal son mecanismos críticos subyacentes a la patogénesis de la PE4. Durante un embarazo normal, las células trofoblásticas invaden la decidua uterina y remodelan las arterias espirales para establecer una circulación de baja resistencia y alta capacidad. La invasión y migración deficientes de las células trofoblásticas conducen a una perfusión placentaria reducida, lo que resulta en un entorno persistente de hipoxia y estrés oxidativo. La hipoxia afecta directamente la apoptosis celular, y la liberación anómala de mediadores proinflamatorios altera la homeostasis en la interfaz materno-fetal, agravando aún más la disfunción placentaria5. La inflamación también es un impulsor importante de la PE. Se ha encontrado que las concentraciones de IL-17, IL-6 y TNF-α están marcadamente elevadas en la placenta y en la sangre periférica de pacientes con PE6. La hipoxia y la inflamación se refuerzan mutuamente, formando un círculo vicioso que amplifica la inflamación sistémica, causa daño endotelial y contribuye a las anomalías placentarias. Las redes moleculares subyacentes que regulan la apoptosis del trofoblasto y las respuestas inflamatorias permanecen en gran parte desconocidas.

SASH1 es un miembro de la familia de proteínas intracelulares de andamiaje SLy/SASH1 que funciona como adaptador de señalización7. SASH1 ha sido caracterizado principalmente como un supresor tumoral que inhibe la transición epitelial-mesénquima (EMT), la migración celular y la invasión mediante interacciones con socios de señalización como CRKL y la vía PI3K-Akt-mTOR8,9. Más allá de sus funciones supresoras de tumores, evidencia emergente sugiere que SASH1 participa en la señalización inflamatoria y la regulación inmunitaria7. Sin embargo, la expresión y función de SASH1 en la placenta, particularmente en el contexto de la biología de los trofoblastos y la PE, no han sido investigadas.

Los exosomas han surgido como mediadores celulares importantes y se están estudiando cada vez más en el contexto del embarazo10. Los exosomas transportan diversos cargos bioactivos, incluyendo proteínas, lípidos y ARN no codificantes, para modular la función de las células dianas. Evidencias crecientes sugieren que los P-EXOS desempeñan un papel crítico en la regulación inmunitaria durante el embarazo, y que su actividad y su contenido se alteran significativamente en la PE, lo que podría intensificar el estado inflamatorio11. También se ha implicado a los exosomas en la regulación del estrés oxidativo12 y la angiogénesis13, posiblemente ejerciendo efectos beneficiosos en las complicaciones relacionadas con el embarazo. Sin embargo, sus dianas moleculares y mecanismos de acción en la PE aún no se comprenden completamente.

Se planteó la hipótesis de que SASH1 está desregulado en la placenta de PE y actúa como un impulsor clave de la apoptosis de los trofoblastos y de las respuestas inflamatorias, y de que los P-EXOS podrían ejercer efectos protectores frente al daño en los trofoblastos mediante la modulación de la expresión de SASH1. Para comprobar esta hipótesis, se integraron múltiples conjuntos de datos transcriptómicos de PE y se utilizó secuenciación de ARN a nivel de célula individual junto con aprendizaje automático basado en múltiples algoritmos para identificar genes candidatos clave. Mediante un modelo celular de trofoblasto HTR-8/SVneo tratado con hipoxia y experimentos de intervención basados en exosomas, se investigó el papel funcional de SASH1 en la disfunción del trofoblasto y el potencial terapéutico de los P-EXOS en la PE.

Protocolo

Declaración de ética

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Cuarto de Shijiazhuang (número de aprobación: 20200031). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes de tejido placentario antes de la recolección de muestras. Todos los procedimientos que involucraron a participantes humanos se realizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se proporciona una lista completa de los reactivos, materiales de consumo, equipos y software utilizados en este protocolo en la Tabla de Materiales.

Recolección de datos

Los datos de RNA-seq se obtuvieron de la base de datos GEO. Los conjuntos de datos incluyeron GSE75010, que contiene datos de expresión génica de 157 placentas con PE y 173 placentas sin PE (N = 330). GSE10588 contiene datos de expresión génica de 26 placentas normales y 17 placentas con PE grave (N = 43). GSE60438 contiene datos de perfilado del transcriptoma de decidua basalis de pacientes con pre-eclampsia y embarazos normotensos (N = 125). Los datos de transcriptoma de célula individual se obtuvieron del conjunto de datos GEO GSE183338. Incluye muestras de núcleos individuales de vellosidades coriónicas/interfaz materno-fetal de embarazos con PE y embarazos sanos.

Análisis de DEGs

Primero, los DEG asociados con PE, los conjuntos de datos GSE75010, GSE10588 y GSE60438, fueron preprocesados y normalizados. Luego, se realizó un análisis diferencial utilizando el paquete de R «limma»14 basado en la información de agrupación de muestras. Se seleccionaron los genes con p < 0,05 y |log2FC| > 0,5. Los gráficos de volcanes de los DEG se generaron utilizando el paquete de R ggplot2. Los mapas de calor de los 20 principales DEG se elaboraron utilizando el paquete de R pheatmap. Posteriormente, se obtuvo la intersección de los DEG seleccionados de los tres conjuntos de datos, y se construyó una red de interacción proteína-proteína (PPI) para los genes candidatos utilizando la plataforma en línea STRING, con una puntuación de interacción ≥0,15. Los 20 principales genes centrales se identificaron posteriormente a partir de esta red PPI según su grado de conectividad, ordenados mediante el software Cytoscape. Los resultados de la red PPI se visualizaron utilizando el software Cytoscape o STRING.

Análisis de enriquecimiento

Se realizó un análisis de enriquecimiento génico utilizando los paquetes ClusterProfiler y DOSE en combinación con el sitio web Metascape. Las bases de datos se obtuvieron de GO y KEGG. El análisis de enriquecimiento se llevó a cabo mediante la función «EnrichGO». Se consideraron significativamente enriquecidas las vías con p < 0,05. Los resultados del enriquecimiento se visualizaron utilizando los paquetes «ggplot2» y «ggpubr».

Aprendizaje automático

Para identificar genes diferencialmente expresados (GDE) robustos y biológicamente significativos asociados con la preeclampsia, se realizó un análisis de selección de características mediante aprendizaje automático multimodelo basado en el conjunto de datos transcriptómicos públicamente disponible GSE60438 (plataforma: GPL6884). Este conjunto de datos contiene el perfil de expresión de muestras de decidua basal obtenidas de embarazos con preeclampsia y embarazos normotensos durante cesáreas. Los GDE prefiltrados se estandarizaron, y la matriz de expresión, junto con la información correspondiente de agrupación clínica, se utilizó como entrada para cuatro algoritmos distintos de aprendizaje automático con el fin de reducir el sesgo del modelo y mejorar la estabilidad de la selección de características.

Los cuatro algoritmos se aplicaron simultáneamente, sin un orden específico. LASSO se realizó utilizando el paquete «glmnet» para llevar a cabo análisis de regresión y seleccionar los genes característicos importantes. Se añadió un término de regularización L1 a la función de pérdida, que reduce los coeficientes de las características menos importantes a cero, logrando así la selección de características. SVM-RFE se implementó utilizando el paquete «e1071» para construir una máquina de vectores de soporte con eliminación recursiva de características. Primero se entrenó un clasificador mediante SVM, y luego se eliminaron iterativamente las características menos informativas según los pesos de las características, obteniéndose un subconjunto óptimo de características. XGBoost se aplicó utilizando el paquete «xgboost» para construir múltiples árboles de decisión. Cada árbol ajustó los residuos del árbol anterior, y las salidas ponderadas se acumularon para obtener la predicción final. Boruta se realizó utilizando el paquete «randomForest», generando características sombra que compitieron con las características reales durante el entrenamiento de un bosque aleatorio. Se conservaron aquellas características cuyos valores de importancia fueron significativamente superiores al ruido aleatorio.

Análisis de datos de transcriptómica de una sola célula

Los datos del transcriptoma de célula individual se obtuvieron de la base de datos GEO, y la matriz de conteo crudo se recuperó de GSE183338. La matriz de conteo se importó utilizando la función «Read10X» del paquete Seurat y se convirtió al formato dgCMatrix. Los objetos individuales se fusionaron en un único objeto agregado mediante la función «merge», y las etiquetas celulares se hicieron únicas usando «RenameCells». Las células de baja calidad se filtraron según los siguientes criterios: se eliminaron los genes expresados en menos de tres células, y se excluyeron las células que expresaban menos de 200 genes. Las células controladas por calidad se normalizaron y se identificaron los genes altamente variables. Se aplicó una normalización de escala global utilizando «LogNormalize» (factor de escala = 10.000), se seleccionaron los genes altamente variables (n = 2.000) mediante «FindVariableFeatures» y los datos se escalaron usando «ScaleData». Se realizó un análisis de componentes principales sobre las características altamente variables, y se conservaron las primeras 30 componentes principales. Los efectos de lote entre muestras se corrigieron utilizando el método Harmony. Las células se visualizaron y redujeron dimensionalmente mediante UMAP. Se construyeron grafos de vecinos más cercanos compartidos utilizando «FindNeighbors» y «FindClusters» basados en el algoritmo de Louvain. El parámetro de resolución en «FindClusters» se optimizó entre 0,1 y 1. El árbol de agrupamiento se visualizó utilizando la función «clustree», y se seleccionó una resolución de 0,9 para definir los grupos celulares. Los posibles dobletes se eliminaron utilizando el algoritmo Scrublet. Los grupos celulares se anotaron identificando genes marcadores expresados diferencialmente mediante la función «FindAllMarkers». Se aplicó la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de Bonferroni. Las identidades celulares se asignaron según marcadores de superficie, literatura relevante y la Base de Datos de Clasificación Celular15.

Cultivo celular

Las células de la línea celular de trofoblasto HTR-8/SVneo se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina/estreptomicina. Las condiciones hipóxicas se establecieron cultivando las células al 1% de O₂, 5% de CO₂ y 94% de N₂ durante 24 h; los controles normóxicos se mantuvieron al 20% de O₂ y 5% de CO₂16. Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse en una cabina de seguridad biológica de Clase II utilizando técnicas asépticas. Los medios de cultivo, los reactivos de transfección y los desechos celulares deben desecharse de acuerdo con las directrices institucionales de seguridad biológica.

Transfección celular

Se sintetizaron plásmidos que contenían sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 y OE-NC. Las células HTR-8/SVneo se sembraron a una densidad de 5 × 105 células por pocillo en placas de seis pocillos. Posteriormente, las células se transfectaron con 2 µg de plásmido sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 u OE-NC por pocillo utilizando un reactivo de transfección según las instrucciones del fabricante. En resumen, el ADN plasmídico y el reactivo P3000 se diluyeron en Opti-MEM, se mezclaron con Lipofectamina 3000 diluida por separado en Opti-MEM, se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente y se añadieron a las células con una confluencia del 70–80%. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, la expresión de SASH1 se evaluó mediante RT-qPCR y Western blot. Las secuencias diana de shRNA utilizadas para el silenciamiento de SASH1 se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.

PCR cuantitativa en tiempo real

Se extrajo ARN total de células HTR-8/SVneo y se transcribió inversamente a ADNc utilizando un kit de transcripción inversa a 42 °C durante 30 min, seguido de 85 °C durante 5 min. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando una mezcla maestra de SYBR Green con las siguientes condiciones de ciclado: 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min. La expresión relativa de ARNm se calculó mediante el método ΔΔCt, utilizando β-actina como referencia interna. Las secuencias de los cebadores utilizadas en este experimento se enumeran en la Tabla Suplementaria 2.

Ensayo de inmunotransferencia Western

Se extrajo la proteína total de células HTR-8/SVneo utilizando tampón de lisis. Los lisados celulares se recogieron, se incubaron en hielo y se centrifugaron a 12.000 × g durante 30 min a 4 °C para eliminar los restos insolubles. La concentración de proteína se determinó utilizando un espectrofotómetro. Se separaron cantidades iguales de proteína (50 µg) mediante electroforesis en SDS-PAGE y posteriormente se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % y se incubaron con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Después del lavado, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios correspondientes y las bandas proteicas se visualizaron mediante un sistema de detección de quimioluminiscencia mejorado.

Para la detección de proteínas, los anticuerpos primarios incluyeron anti-SASH1 y β-actina. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiados—anticuerpo secundario de cabra anti-conejo y anticuerpo secundario de cabra anti-ratón—. La β-actina se empleó como control interno de carga para asegurar una cantidad igual de proteína cargada. La intensidad de las bandas proteicas se midió y cuantificó mediante el software ImageJ.

Aislamiento de P-EXOS

Los P-EXOS se aislaron de tejido corial obtenido de vellosidades placentarias de placentas a término procedentes de mujeres sanas sometidas a cesárea electiva. El tejido corial se lavó exhaustivamente con PBS estéril y se picó en fragmentos de aproximadamente 1 mm3 fragmentos, y cultivados en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de SFB agotado de exosomas a 37 °C en 5% CO2 durante 48 h. El medio condicionado se sometió a centrifugación diferencial de la siguiente manera: 300 × g durante 10 min para eliminar células y restos de tejido; 2.000 × g durante 20 min para eliminar restos celulares; y 10.000 × g durante 30 min para eliminar microvesículas, todo a 4 °C. El sobrenadante resultante se ultracentrifugó a 120.000 × g durante 70 min a 4 °C para sedimentar las exosomas. El sedimento se lavó una vez con PBS y se sometió nuevamente a ultracentrifugación a 120.000 × g durante 70 min a 4 °C. El pellet final se resuspendió en PBS. Los exosomas aislados se caracterizaron mediante análisis por inmunotransferencia para detectar marcadores de exosomas (PLAP, CD63 y TSG101, con GM130 como control negativo) y se examinaron además mediante microscopía electrónica de transmisión para la observación morfológica.

Experimento de captación celular de P-EXOS

Para confirmar la internalización celular de P-EXOS, los exosomas se marcaron fluorescentemente con el colorante lipofílico de membrana PKH67 según el protocolo del fabricante. En resumen, los P-EXOS se incubaron con PKH67 (4 µM) en Diluyente C durante 5 min a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo con un volumen igual de albúmina de suero bovino (BSA) al 1%. Los exosomas marcados se reaislaron mediante ultracentrifugación (120.000 × g, 70 min, 4 °C) para eliminar el colorante no unido. Posteriormente, se añadieron P-EXOS marcados con PKH67 (50 µg/mL) a células HTR-8/SVneo y se co-incubaron durante 24 h en condiciones normóxicas o hipóxicas (1% O₂). Las células se lavaron posteriormente tres veces con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min y los núcleos se contratinjeron con DAPI (1 µg/mL). La internalización de los exosomas marcados con PKH67 se visualizó mediante microscopía confocal de barrido láser (CLSM; excitación 490 nm, emisión 502 nm). Para experimentos funcionales de co-cultivo, las células HTR-8/SVneo se trataron con P-EXOS a una concentración de 50 µg/mL (equivalente de proteína) en medio RPMI-1640 completo suplementado con 10% de SFB agotado de exosomas, bajo condiciones hipóxicas (1% O₂) durante 24 h.

Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)

Se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se midieron los niveles de IL-6, IL-1β y TNF-α mediante el kit de ELISA para IL-6, el kit de ELISA para IL-1β y el kit de ELISA para TNF-α, respectivamente, según las instrucciones del fabricante. Se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas, y las concentraciones reales se calcularon a partir de las curvas estándar.

Etiquetado de extremos rotos de dUTP mediado por TdT (TUNEL)

Las células apoptóticas se detectaron utilizando el kit de ensayo TUNEL según las instrucciones del fabricante. Breve­mente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 5 min en hielo, y se incubaron con la mezcla de reacción TUNEL durante 60 min a 37 °C en la oscuridad. Los núcleos se contratinjeron con DAPI, y las células TUNEL-positivas se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia y se cuantificaron contando el porcentaje de células TUNEL-positivas en al menos cinco campos seleccionados aleatoriamente por muestra.

Análisis estadístico

Todos los datos se analizaron utilizando R y GraphPad Prism. Las variables continuas se presentan como media ±DE. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron mediante la prueba t de Student, mientras que las comparaciones entre múltiples grupos se llevaron a cabo mediante ANOVA de un factor seguido de la prueba post hoc de Tukey. La significancia estadística para variables categóricas se evaluó mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. A menos que se indique lo contrario, las correlaciones entre moléculas se calcularon utilizando el análisis de correlación de Spearman. Los experimentos de caracterización de exosomas se realizaron utilizando P-EXOS aislados de tres donantes placentarios independientes. Los experimentos con células se realizaron en tres réplicas biológicas independientes, representando experimentos independientes realizados en ocasiones diferentes con células HTR-8/SVneo de diferentes pasajes, utilizando en cada réplica P-EXOS aislados de un donante placentario diferente. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.

Resultados

Análisis transcriptómico de pacientes sanos y con PE

Para analizar las diferencias de expresión génica entre el grupo normal (Normal) y los pacientes con PE, se examinó la expresión diferencial mediante el paquete R limma en los conjuntos de datos combinados. Se identificaron un total de 89 genes diferencialmente expresados (DEG) (p < 0,05 y |log2FC| > 0,5), de los cuales 69 fueron genes regulados hacia arriba y 20 regulados hacia abajo en GSE75010 (Figura 1A). Hubo 2.097 genes diferencialmente expresados, con 1.121 genes regulados hacia arriba y 976 regulados hacia abajo (Figura 1B). En el conjunto de datos GSE60438 se identificaron 7.633 DEG, con 3.371 genes regulados hacia arriba y 4.262 regulados hacia abajo (Figura 1C). Las diferencias sustanciales en el número de DEG entre los tres conjuntos de datos probablemente reflejan variaciones en el tamaño de la muestra, el origen del tejido (villi placentarios frente a decidua basal) y la clasificación de la gravedad de la PE, lo que resalta aún más la importancia de considerar la intersección entre los conjuntos de datos para identificar DEG comunes y robustos.

Análisis de enriquecimiento funcional de los genes diferencialmente expresados

Para la identificación sistemática de los principales DEG asociados con la PE, se realizó un análisis de Venn con los DEG de los conjuntos de datos de PE GSE75010, GSE10588 y GSE60438, identificándose finalmente 56 DEG comunes (Figura 2A). Se construyó una red PPI para estos 56 DEG comunes utilizando la plataforma en línea STRING (puntuación de interacción ≥0,15), y se identificaron además los 20 principales genes centrales según su grado de conectividad dentro de la red, clasificados mediante el software Cytoscape (Figura 2B). Con base en dichos genes, también se realizó un enriquecimiento GO para explorar funcionalidades potenciales en BP, CC y MF (Figura 2C). Es probable que los DEG se enriquezcan principalmente en la secreción hormonal y la regulación de la señalización del receptor transmembrana serina/treonina quinasa. En cuanto a las células, los genes se localizaron principalmente en adhesiones focales, uniones célula-sustrato y una variedad de genes relacionados con vesículas y lisosomas. En cuanto a funciones moleculares, los términos enriquecidos fueron actividad de prolil hidroxilasa, actividad hormonal y transporte transmembrana de moléculas relacionadas con lípidos. Estos resultados sugieren que los DEG podrían desempeñar funciones importantes en la señalización celular placentaria, la interacción célula-matriz y el mantenimiento de funciones relacionadas con el sistema endocrino. Al mismo tiempo, se encontró que el enriquecimiento de vías KEGG arrojó que los DEG probablemente se enriquecieran en la interacción citocina-receptor de citocina, la interacción de moléculas de adhesión celular y las vías de señalización TGF-β y HIF-1 (Figura 2D). El enriquecimiento de ciertos términos relacionados con virus (por ejemplo, virus de la hepatitis, Ebolavirus) probablemente refleja una superposición no específica con genes inmunorreguladores compartidos, más que una asociación biológica directa con la PE; por lo tanto, el enfoque interpretativo permanece en las vías relacionadas con inflamación, adhesión y hipoxia. Estas vías están relacionadas con la respuesta inflamatoria, la señalización mediada por adhesión celular y la hipoxia, y podrían influir en la progresión de la PE al modificar el estado inmuno-inflamatorio y la comunicación entre células en el microentorno placentario.

El aprendizaje automático identifica SASH1 como un gen clave en la PE

Para identificar genes pronósticos clave, se aplicaron cuatro métodos de aprendizaje automático para la selección de características. La regresión LASSO con validación cruzada mostró que el modelo alcanzó el error mínimo de validación cruzada cuando log(λ.min) = -3.8075. Los genes con coeficientes distintos de cero en este valor de λ se seleccionaron como características clave identificadas por LASSO (Figura 3A–B). El algoritmo Boruta evalúa la importancia de las características comparándolas con características sombra. Los genes con valores de importancia superiores a shadowMax se etiquetaron como Confirmados y se consideraron genes candidatos clave, mientras que aquellos con valores de importancia inferiores a shadowMin se etiquetaron como Rechazados y se consideraron sin contribución significativa. Los genes entre estos dos umbrales se etiquetaron como Tentativos, lo que indica una importancia potencial pero incierta (Figura 3C). El análisis SVM-RFE demostró que cuando se conservaron 40–50 características, la precisión de validación cruzada alcanzó el nivel más alto o cercano al más alto, lo que sugiere un rendimiento predictivo óptimo a esta escala de características (Figura 3D). La precisión moderada de validación cruzada (~0.6) indica que ningún algoritmo individual funcionó de forma óptima para este conjunto de datos; por lo tanto, se adoptó una estrategia de intersección multi-algoritmo para mejorar la solidez de la selección de características. XGBoost cuantificó la importancia relativa de los genes utilizando valores de Ganancia, identificando así las características con mayor contribución a la predicción del modelo (Figura 3E). El análisis de intersección de Venn de los resultados de los cuatro métodos identificó a SASH1 como el único gen común. Aunque SASH1 fue clasificado como Tentativo por el algoritmo Boruta, su selección consistente en los otros tres algoritmos respalda su designación como gen candidato por consenso (Figura 3F).

Análisis de una sola célula

Se investigó la heterogeneidad celular y los procesos moleculares en tejidos placentarios de PE. Las células se filtraron por calidad según el número de genes detectados, el número de conteos de ARN y el porcentaje de expresión de genes mitocondriales. Se eliminaron las células de baja calidad (menos de 200 genes detectados o con más del 20 % de contenido de genes mitocondriales) para obtener una muestra de célula única de alta calidad para el análisis posterior. Las métricas de control de calidad y la identificación de genes altamente variables se muestran en la Figura Suplementaria 1A–B. Tras normalizar e identificar los genes altamente variables, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) utilizando los 2.000 genes altamente variables principales y los componentes principales significativos mediante análisis JackStraw y análisis ElbowPlot (Figura Suplementaria 2A–B).

Con base en los componentes principales, se utilizó la aproximación y proyección uniforme de variedades (UMAP) para reducir la dimensionalidad y realizar agrupamiento no supervisado, en el que todas las células se clasificaron en 22 grupos, destacando la alta heterogeneidad celular en el tejido placentario (Figura 4A). Mediante el estudio de la expresión de genes marcadores específicos de cada grupo y la visualización de genes diferencialmente expresados (DEG) en un mapa térmico (Figura 4B), cada grupo se anotó según un marcador canónico y se proyectó nuevamente sobre la representación UMAP (Figura 4C). A partir de estos grupos principales, se identificaron las poblaciones celulares placentarias, incluyendo células B/células plasmáticas, células endoteliales, fibroblastos/células estromales, macrófagos/células dendríticas, células asesinas naturales, células T y células trofoblásticas. Las comparaciones entre los grupos control y PE revelan que varios tipos de células presentan una distribución relativa sustancial en placentas con PE, lo que sugiere una remodelación del microentorno placentario (Figura 4D).

El origen del tejido y el estado de la enfermedad se utilizaron para rastrear las células en el mismo agrupamiento UMAP según la fuente del tejido (decidua frente a vellosidades) y la agrupación por enfermedad (control frente a PE) (Figura 4E). La distribución del número de células se separó parcialmente según el origen del tejido, mientras que las células de diferentes grupos de enfermedad estaban altamente interconectadas. Esto sugiere que la PE no reorganiza sustancialmente toda la estructura transcriptómica, pero podría tener efectos sobre poblaciones celulares individuales o sobre características moleculares específicas. La expresión de SASH1 se proyectó sobre el UMAP para explorar su distribución entre las poblaciones celulares placentarias (Figura 4F–G). SASH1 muestra una expresión fuertemente específica de tipo celular, con diferencias notables entre las poblaciones celulares deciduales y vellosas. La comparación estadística de la expresión de SASH1 entre los grupos PE y control a través de los tipos celulares (prueba de suma de rangos de Wilcoxon) reveló diferencias significativas en múltiples poblaciones celulares placentarias, con el aumento más pronunciado observado en células trofoblásticas de muestras con PE (Figura 4H). Este hallazgo proporciona evidencia a nivel de célula individual de que la desregulación de SASH1 es particularmente marcada en el compartimento trofoblástico, lo que respalda el uso de la línea celular trofoblástica HTR-8/SVneo para experimentos funcionales posteriores.

La inhibición de SASH1 impide la apoptosis de los trofoblastos inducida por hipoxia y las respuestas inflamatorias

Para validar las predicciones bioinformáticas, se estableció un modelo celular de trofoblasto relacionado con la PE bajo condiciones hipóxicas (1 % O2). Se realizaron análisis de qPCR e inmunotransferencia para evaluar la expresión de SASH1 (Figura 5A–B). En comparación con las células HTR-8/SVneo normóxicas, las células tratadas con hipoxia mostraron niveles significativamente aumentados de expresión de ARNm y proteína SASH1, lo que proporciona una validación experimental preliminar de los resultados bioinformáticos. Para evaluar el efecto del silenciamiento de SASH1 sobre los procesos patológicos relacionados con la PE, se silenció SASH1 en células HTR-8/SVneo tratadas con hipoxia. Los análisis de PCR cuantitativa e inmunotransferencia (Figura 5C–D) mostraron que la expresión de SASH1 se redujo significativamente en todos los grupos sh-SASH1 en comparación con el grupo sh-NC. Entre ellos, sh-SASH1#3 presentó la mayor eficiencia de silenciamiento y, por lo tanto, se seleccionó para experimentos posteriores. Se realizaron tinción TUNEL y ELISA bajo tres condiciones: control normóxico (Normal), hipoxia con ARNip control negativo (Hipoxia + sh-NC) e hipoxia con silenciamiento de SASH1 (Hipoxia + sh-SASH1). En comparación con el grupo Normal, el grupo Hipoxia + sh-NC mostró un aumento significativo de apoptosis y una secreción elevada de citocinas proinflamatorias IL-1β, IL-6 y TNF-α, confirmando la lesión del trofoblasto inducida por hipoxia. El silenciamiento de SASH1 atenuó marcadamente estos efectos, reduciendo la apoptosis (Figura 5E) y los niveles de citocinas (Figura 5F) hasta niveles cercanos a los del grupo Normal, lo que sugiere que el silenciamiento de SASH1 puede revertir en gran medida la apoptosis del trofoblasto y las respuestas inflamatorias inducidas por hipoxia. Para establecer aún más el papel causal de SASH1, se realizaron experimentos de ganancia de función. La qPCR y la inmunotransferencia confirmaron una sobreexpresión exitosa de SASH1 en células HTR-8/SVneo (Figura 5G–H). Bajo condiciones normóxicas, la sobreexpresión de SASH1 (OE-SASH1) aumentó significativamente la apoptosis del trofoblasto y la secreción de citocinas proinflamatorias en comparación con el grupo OE-NC, reproduciendo el fenotipo inducido por hipoxia (Figura 5I–J). En conjunto, los datos de pérdida y ganancia de función establecen que SASH1 es tanto necesario como suficiente para inducir la apoptosis del trofoblasto y las respuestas inflamatorias, confirmando su papel causal en la patología relacionada con la PE.

Los P-EXOS suprimen la apoptosis de los trofoblastos inducida por hipoxia y las respuestas inflamatorias mediante la modulación de SASH1

Se considera que P-EXOS tiene un valor terapéutico potencial en la PE. En este estudio, el análisis bioinformático sugirió que SASH1 está asociado con vías de señalización relacionadas con los exosomas (como se indica en el enriquecimiento GO y KEGG, Figura 2C–D), lo que nos llevó a plantear la hipótesis de que P-EXOS podría ejercer un efecto protector en la PE mediante la regulación de SASH1. Antes de los estudios funcionales, se caracterizaron primero los P-EXOS aislados. El análisis mediante inmunotransferencia confirmó la presencia de proteínas marcadoras de exosomas PLAP, CD63 y TSG101, sin expresión detectable del marcador del aparato de Golgi GM130, lo que indica una alta pureza de las vesículas aisladas. La microscopía electrónica de transmisión reveló además estructuras vesiculares típicas con forma de taza (Figura 6A–B). Para verificar si P-EXOS podían internalizarse eficientemente por las células diana, se realizó tinción de inmunofluorescencia para evaluar la captación celular de P-EXOS. En comparación con el grupo control, las células HTR-8/SVneo tratadas con P-EXOS mostraron señales de co-localización prominentes en las imágenes fusionadas, lo que indica que P-EXOS fueron internalizados eficazmente por las células HTR-8/SVneo (Figura 6C).

Posteriormente, las células HTR-8/SVneo se co-cultivaron con P-EXOS en condiciones hipóxicas. Tanto los ensayos de PCR cuantitativa como de inmunotransferencia Western mostraron una reducción pronunciada en los niveles de ARNm y proteína de SASH1 en el grupo tratado con P-EXOS en comparación con los controles (Figura 6D–E), lo que proporciona evidencia inicial de una interacción reguladora entre P-EXOS y SASH1. En consonancia con estos cambios moleculares, la tinción TUNEL reveló una atenuación sustancial de la apoptosis inducida por hipoxia en las células HTR-8/SVneo tras el tratamiento con P-EXOS (Figura 6F). Al mismo tiempo, los ensayos de ELISA demostraron una disminución notable en la secreción de citocinas proinflamatorias, incluyendo IL-6, IL-1β y TNF-α (Figura 6G).

Para determinar si los efectos protectores de P-EXOS dependen mecanísticamente de la supresión de SASH1, se realizó un experimento de rescate bajo condiciones hipóxicas. Se compararon células que sobreexpresan SASH1 (OE-SASH1 + P-EXOS) con células de control negativo (OE-NC + P-EXOS). La sobreexpresión de SASH1 anuló significativamente los efectos protectores de P-EXOS, como lo demuestra el aumento de la apoptosis (Figura 6H) y la secreción elevada de citocinas proinflamatorias (Figura 6I) en comparación con el grupo OE-NC + P-EXOS. Estos resultados demuestran que el efecto protector de P-EXOS está mediado específicamente a través de la supresión de SASH1, y no mediante vías paralelas, destacando el potencial terapéutico de P-EXOS en la PE.

DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:

Los conjuntos de datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles públicamente y fueron obtenidos de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), con los números de acceso GSE75010, GSE10588, GSE60438 y GSE183338. La anotación de tipos celulares se realizó con referencia a la Base de Datos de Clasificación Celular (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/). Las imágenes originales de inmunotransferencias no recortadas y todos los demás datos experimentales brutos que respaldan los hallazgos de este estudio se proporcionan en la carpeta Datos Brutos Suplementarios .

Los diagramas de volcán y mapas de calor muestran los resultados del análisis de expresión génica en diferentes conjuntos de datos.
Figura 1: Identificación de genes diferencialmente expresados (DEG) en tejidos placentarios y deciduales de preeclampsia (PE) en tres conjuntos de datos independientes. (A) Gráfico de volcán de los DEG entre 157 muestras placentarias de PE y 173 muestras placentarias no PE del conjunto de datos combinado GSE75010. (B) Gráfico de volcán de los DEG entre muestras placentarias de PE grave (n = 17) y muestras placentarias normales (n = 26) del conjunto de datos GSE10588. (C) Gráfico de volcán de los DEG entre muestras deciduales de PE y muestras deciduales de control normotensas del conjunto de datos GSE60438. Los DEG se identificaron utilizando p < 0,05 y |log2FC| > 0,5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de Venn, gráfico de red, diagramas de acordes; análisis de expresión génica, mapeo de interacciones proteicas.
Figura 2: Análisis funcional de enriquecimiento y de interacciones proteína-proteína (PPI) de los DEG comunes asociados con la preeclampsia. (A) Diagrama de Venn de los DEG identificados a partir de los conjuntos de datos relacionados con la preeclampsia GSE75010, GSE10588 y GSE60438. (B) Red de interacciones proteína-proteína (PPI) de los 20 principales genes centrales seleccionados entre los 56 DEG comunes según su grado de conectividad, clasificados mediante el software Cytoscape (puntaje de interacción STRING ≥0.15). (C) Los análisis de enriquecimiento GO y KEGG de los DEG comunes se presentan como gráficos de barras. (D) Los análisis de enriquecimiento GO y KEGG de los DEG comunes, presentados como diagramas de acordes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Métodos de selección de genes; resultados de LASSO, XGBoost, SVM, Boruta; gráficos comparativos de análisis de datos.
Figura 3: Selección basada en aprendizaje automático de genes centrales candidatos asociados a la preeclampsia. (A) Análisis de regresión LASSO que muestra los perfiles de coeficientes de los genes candidatos. (B) Selección del parámetro de regularización óptimo (λ) mediante regresión LASSO utilizando validación cruzada. (C) Algoritmo Boruta. (D) Análisis SVM-RFE. (E) Algoritmo XGBoost. (F) Diagrama de Venn que muestra la intersección de los genes candidatos identificados por los algoritmos LASSO, Boruta, SVM-RFE y XGBoost. Abreviaturas: LASSO = operador de contracción y selección de mínima absoluta; SVM-RFE = eliminación recursiva de características mediante máquina de vectores de soporte. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Diagrama de agrupamiento UMAP y mapa de calor de expresión génica que muestra el análisis y distribución de datos de tipos celulares.
Figura 4: El análisis transcriptómico a nivel de célula individual revela patrones específicos de expresión de SASH1 según el tipo celular en la preeclampsia. (A) Agrupamiento UMAP del conjunto de datos de célula individual. (B) Análisis de las cinco principales anotaciones marcadoras del conjunto de datos transcriptómicos de célula individual de preeclampsia GSE183338. (C) Anotación de subpoblaciones celulares. (D) Gráfico de barras que muestra la distribución de las proporciones celulares en muestras de control y preeclampsia. (E) Gráfico UMAP coloreado según el origen tisular (decidua y vellosidades) y el estado de la enfermedad (control y preeclampsia). (F) Gráfico UMAP que muestra la expresión de SASH1 en poblaciones celulares placentarias agrupadas por origen tisular (decidua y vellosidades). (G) Gráfico UMAP que muestra la expresión de SASH1 en poblaciones celulares placentarias agrupadas por estado de la enfermedad (control y preeclampsia). (H) Gráfico de violín que muestra la distribución de expresión de SASH1 en diferentes tipos celulares placentarios. ns p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Abreviaturas: UMAP = aproximación y proyección uniforme de variedades; ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Expresión de SASH1 en hipoxia; análisis de proteínas mediante inmunotransferencia; gráficos de expresión génica/proteica.
Figura 5: SASH1 regula la apoptosis e inflamación trofoblástica inducida por hipoxia. (A) Análisis mediante qPCR de la expresión de ARNm de SASH1 y cuantificación densitométrica de los niveles proteicos de SASH1 en células HTR-8/SVneo bajo condiciones normales y hipóxicas. (B) Imágenes representativas de inmunotransferencia correspondientes a los datos densitométricos mostrados en (A). (C) Análisis mediante qPCR de la expresión de ARNm de SASH1 y cuantificación densitométrica de los niveles proteicos de SASH1 en células HTR-8/SVneo tratadas con hipoxia y transfectadas con constructos sh-NC o sh-SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 y sh-SASH1#3). (D) Imágenes representativas de inmunotransferencia correspondientes a los datos densitométricos mostrados en (C). (E) Tinción TUNEL de células HTR-8/SVneo en los grupos Normal, Hipoxia + sh-NC e Hipoxia + sh-SASH1(#3). Barra de escala = 20 µm. (F) Análisis mediante ELISA de citocinas inflamatorias (IL-1β, IL-6 y TNF-α) en los grupos Normal, Hipoxia + sh-NC e Hipoxia + sh-SASH1(#3). (G) Análisis mediante qPCR de la expresión de ARNm de SASH1 y cuantificación densitométrica de los niveles proteicos de SASH1 en células HTR-8/SVneo transfectadas con constructos OE-NC u OE-SASH1. (H) Imágenes representativas de inmunotransferencia correspondientes a los datos densitométricos mostrados en (G). (I) Tinción TUNEL de células HTR-8/SVneo en los grupos Normal + OE-NC y Normal + OE-SASH1. Barra de escala = 20 µm. (J) Análisis mediante ELISA de citocinas inflamatorias (IL-1β, IL-6 y TNF-α) en los grupos Normal + OE-NC y Normal + OE-SASH1. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Los datos se presentan como media ± DE de tres réplicas biológicas independientes (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El inmunotransferencia, la imagen de microscopía electrónica de transmisión y la microscopía de fluorescencia evalúan los efectos de los P-EXO sobre los niveles de proteínas y la apoptosis.
Figura 6: Los P-EXO alivian la lesión trofoblástica inducida por hipoxia mediante la supresión de SASH1. (A) Análisis por inmunotransferencia de las proteínas marcadoras de P-EXO: PLAP, CD63 y TSG101, con GM130 como control negativo. (B) Análisis de la morfología de los P-EXO mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Barra de escala = 1,0 µm. (C) Imágenes de microscopía láser confocal que muestran la incorporación de P-EXO marcados con PKH67 (verde) en células HTR-8/SVneo (rojo). Los núcleos fueron contrasteñados con DAPI (azul). Barra de escala = 20 µm. (D) Análisis por qPCR de la expresión de ARNm de SASH1 y cuantificación densitométrica de los niveles de la proteína SASH1 en células HTR-8/SVneo en los grupos Control y P-EXO. (E) Imágenes representativas de inmunotransferencia correspondientes a los datos densitométricos mostrados en (D). (F) Tinción TUNEL de células HTR-8/SVneo en los grupos Control y P-EXO. Barra de escala = 20 µm. (G) Análisis por ELISA de citocinas inflamatorias (IL-1β, IL-6 y TNF-α) en células HTR-8/SVneo tratadas con hipoxia en los grupos Control y P-EXO. (H) Tinción TUNEL de células HTR-8/SVneo en los grupos OE-NC + P-EXO y OE-SASH1 + P-EXO. Barra de escala = 20 µm. (I) Análisis por ELISA de citocinas inflamatorias (IL-1β, IL-6 y TNF-α) en células HTR-8/SVneo tratadas con hipoxia en los grupos OE-NC + P-EXO y OE-SASH1 + P-EXO. Abreviaturas: P-EXO = exosomas derivados de placenta; TEM = microscopía electrónica de transmisión; PLAP = fosfatasa alcalina placentaria; TSG101 = gen de susceptibilidad tumoral 101. *p < 0,05; **p < 0,01. Los datos se representan como media ± DE de tres réplicas biológicas independientes (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Control de calidad de los datos de secuenciación de ARN a nivel de célula individual. (A) Gráfico de violín de los niveles de expresión génica tras el control de calidad. (B) Gráfico de características variables que muestra los genes altamente variables identificados tras el control de calidad.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Determinación de componentes principales estadísticamente significativos para la agrupación de células individuales. (A) Gráfico de puntos JackStraw utilizado para identificar componentes principales estadísticamente significativos. (B) Gráfico de puntos de codo que muestra la varianza explicada por los componentes principales.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Secuencias diana de shRNA utilizadas para el silenciamiento de SASH1. Secuencias diana de shRNA (5′–3′) para el control negativo (sh-NC) y tres construcciones dirigidas a SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 y sh-SASH1#3) utilizadas para el silenciamiento génico.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Secuencias de cebadores utilizadas para PCR cuantitativa. Secuencias de cebadores directos e inversos (5′–3′) para SASH1 y β-actina (control interno de referencia) utilizadas en el análisis de qPCR.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este estudio, SASH1 fue identificado como un gen clave regulado de manera anormal en la PE mediante análisis transcriptómico integrado, secuenciación de célula individual y aprendizaje automático multi-algoritmo, un enfoque particularmente relevante dado que aún no existen terapias dirigidas para la PE17. Se demostró que SASH1 está significativamente sobreexpresado en células trofoblásticas hipóxicas y elevado específicamente en el compartimento trofoblástico de placentas con PE a resolución de célula individual. A través de experimentos de pérdida y ganancia de función, se estableció que SASH1 es necesario y suficiente para inducir la apoptosis trofoblástica y la secreción de citoquinas proinflamatorias. Además, el tratamiento con P-EXOS atenuó la lesión trofoblástica inducida por hipoxia, y este efecto protector se abolió mediante la sobreexpresión de SASH1, confirmando que la citoprotección mediada por P-EXOS depende mecanísticamente de la supresión de SASH1.

Además, se han observado alteraciones en las proporciones de múltiples tipos celulares placentarios en la PE, incluyendo células B/células plasmáticas, células endoteliales, fibroblastos/células estromales, macrófagos/células dendríticas, células NK, células T y células trofoblásticas. Estos hallazgos sugieren que el microambiente placentario experimenta una remodelación sustancial durante la PE. Dicho microambiente inflamatorio no solo agrava la disfunción trofoblástica, sino que también podría acelerar la progresión de la enfermedad mediante interacciones inmunes con la matriz extracelular18. Asimismo, recientemente se ha implicado a las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) en la exacerbación de la inflamación placentaria en la PE19. Se cree que SASH1 desempeña un papel importante en el desarrollo de la PE a través de su participación en la señalización inflamatoria, la adhesión celular y los procesos relacionados con la hipoxia. En este estudio, los perfiles de expresión génica se extrajeron de muestras placentarias de pacientes con PE y embarazos normotensos utilizando el paquete limma, y varios algoritmos de aprendizaje automático —regresión LASSO, SVM-RFE, XGBoost y Boruta— para la selección de características. En todos los algoritmos, SASH1 surgió consistentemente como un gen candidato consensuado. A nivel de célula individual, SASH1 mostró una expresión específica de tipo celular en diversas poblaciones celulares placentarias y mantuvo una expresión elevada en las muestras de PE, con la diferencia más pronunciada observada en las células trofoblásticas, lo que sugiere que podría ejercer efectos funcionales distintos en diferentes contextos celulares placentarios.

SASH1 es una proteína adaptadora de señalización que se ha descrito participando en diversos procesos biológicos, incluyendo la migración e invasión celular, la transición epitelial-mesenquimal y la regulación de la señalización en respuesta al estrés8,9. Para investigar el papel funcional de SASH1 en la patología relacionada con la preeclampsia (PE), se estableció un modelo de trofoblasto inducido por hipoxia utilizando células HTR-8/SVneo. Nuestros resultados demostraron que la exposición a hipoxia aumentó significativamente la expresión de SASH1, mientras que la inhibición de SASH1 atenuó marcadamente la apoptosis inducida por hipoxia y redujo la secreción de citocinas proinflamatorias, incluyendo IL-1β, IL-6 y TNF-α. Por el contrario, la sobreexpresión de SASH1 en condiciones normóxicas fue suficiente para reproducir el fenotipo inducido por hipoxia, estableciendo así el papel causal de SASH1 en la inducción del daño trofoblástico. Estos hallazgos sugieren que SASH1 podría regular negativamente el estado funcional del trofoblasto mediante la modulación de las respuestas inflamatorias. Dado que los trofoblastos representan una fuente importante de mediadores inflamatorios placentarios20, una expresión anómala de SASH1 podría constituir una base molecular clave para la amplificación de la inflamación en la preeclampsia. Cabe destacar que las funciones proapoptóticas y proinflamatorias de SASH1 observadas en células trofoblásticas contrastan con su papel canónico como supresor tumoral en células cancerosas, donde normalmente inhibe la EMT y la migración8,9. Esta dualidad funcional dependiente del contexto podría reflejar diferencias específicas del tipo celular en los socios de interacción de SASH1 y en las redes de señalización descendentes, y requiere una investigación adicional.

Se reconoce a los exosomas como mediadores importantes de la comunicación intercelular y se ha implicado su participación en la patogénesis de la PE21. En particular, los P-EXOS podrían desempeñar un papel importante en la regulación inmunitaria durante el embarazo normal, como mantener la tolerancia inmune materno-fetal, lo que podría conferir protección contra la PE22. En este estudio, el análisis bioinformático reveló una asociación entre SASH1 y vías de señalización relacionadas con exosomas, lo que motivó una investigación más profunda sobre el papel de los P-EXOS en la regulación de la función de los trofoblastos. Experimentos de co-cultivo demostraron que el tratamiento con P-EXOS redujo significativamente los niveles de ARNm y proteína de SASH1 en células de trofoblasto tratadas con hipoxia, y atenuó notablemente la apoptosis y las respuestas inflamatorias inducidas por la hipoxia. Es importante destacar que la sobreexpresión de SASH1 anuló estos efectos protectores, confirmando que la citoprotección mediada por P-EXOS depende mecanísticamente de la supresión de SASH1, y no actúa a través de vías paralelas.

Los mecanismos moleculares mediante los cuales los P-EXOS suprimen la expresión de SASH1 aún deben elucidarse. Se sabe que los P-EXOS transportan cargas bioactivas diversas, incluyendo microARNs, proteínas y lípidos, que pueden modular la expresión génica en células dianas10. Una posibilidad es que los P-EXOS entreguen ARNm específicos que dirijan directa o indirectamente a SASH1. Alternativamente, los P-EXOS podrían modular vías de señalización upstream, como NF-κB o PI3K-Akt, que convergen en la regulación transcripcional de SASH1. Dado que se ha implicado a SASH1 en la vía PI3K-Akt-mTOR en células cancerosas8, es plausible que la modulación mediada por exosomas de este eje pueda contribuir a la disminución de SASH1 en células trofoblásticas. Serán necesarios estudios futuros que empleen secuenciación del contenido exosómico e inhibidores específicos de vías para desentrañar la cascada molecular precisa mediante la cual los P-EXOS regulan la expresión de SASH1.

En este estudio, el perfilado transcriptómico se integró con la secuenciación de ARN a nivel de célula individual para investigar los cambios moleculares en el tejido placentario en la preeclampsia (PE). Se demostró que SASH1 desempeña un papel clave en la apoptosis de los trofoblastos inducida por hipoxia y en las respuestas inflamatorias, y que los P-EXOS pueden ejercer un efecto protector al suprimir la expresión de SASH1, lo que aporta nuevas perspectivas sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la PE y sugiere una estrategia terapéutica potencial. Sin embargo, este estudio presenta varias limitaciones. Primero, los hallazgos funcionales se obtuvieron principalmente a partir de la línea celular inmortalizada de trofoblastos HTR-8/SVneo; es necesario validarlos en células de trofoblasto primarias. Segundo, la expresión de la proteína SASH1 no se validó en tejidos placentarios clínicos de PE mediante inmunohistoquímica, lo que limita la interpretación traslacional de los hallazgos y debería abordarse en estudios futuros. Tercero, el clasificador SVM-RFE mostró una precisión moderada en la validación cruzada (~0,6), lo que refleja la heterogeneidad inherente del conjunto de datos; se requerirán cohortes independientes más grandes para desarrollar modelos diagnósticos más robustos. Cuarto, el mecanismo molecular exacto mediante el cual los P-EXOS suprimen la expresión de SASH1 permanece poco claro. Quinto, se observaron bandas de tinción inespecíficas en la detección de SASH1 mediante inmunotransferencia (Western blot), lo que podría deberse a una especificidad subóptima del anticuerpo. El anticuerpo utilizado en este experimento es un anticuerpo policlonal, que generalmente presenta una especificidad menor en la inmunodetección en comparación con los anticuerpos monoclonales. No obstante, estas bandas inespecíficas no afectan los hallazgos sobre la proteína SASH1 ni las conclusiones de este estudio. Se necesitan estudios futuros que incluyan experimentos in vivo, análisis de muestras clínicas y caracterización de la carga exosomal para elucidar más a fondo el papel funcional del eje P-EXOS-SASH1 en la PE y evaluar su potencial traslacional.

Divulgaciones

No existe conflicto de intereses en este estudio.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el Programa Clave de Investigación Científica en Medicina de la Comisión de Salud de la Provincia de Hebei, China (n.º 20210075).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio RPMI-1640Gibco11875085
Suero bovino fetal (FBS)Gibco16140071
FBS libre de exosomasSystem BiosciencesEXO-FBS-50A-1
Penicilina/estreptomicinaThermo Fisher Scientific, CN15140122
Reactivo de transfección Lipofectamina 3000 (con reactivo P3000)Thermo Fisher Scientific, CNL3000150
Medio Opti-MEM con suero reducidoThermo Fisher Scientific, CN31985070
Plásmido de ARNip para SASH1 (HuSH)origeneTL301836
Plásmido de expresión de ORF de SASH1origeneRC218866
Vector vacío controlorigenePS100001
Kit de transcripción inversaThermo Fisher Scientific, CN4368814
Mezcla maestra PowerUp SYBR GreenThermo Fisher Scientific, CNA46110
Primeros para SASH1Sangon BiotechSintetizados a medida
Primeros para β-actinaSangon BiotechSintetizados a medida
Tampón de lisis celularBeyotimeP0013B
Espectrofotómetro NanoDropThermo Fisher Scientific, CNNanoDrop Ultra
Membrana de PVDFThermo Fisher Scientific, CN88518
Anticuerpo anti-SASH1ABclonalA15248
Anticuerpo anti-β-actinaAbcamab6276
Anticuerpo secundario conjugado con HRP, anti-conejo/anti-ratón de cabraBeyotimeA0208
Software ImageJNIH (dominio público)ImageJ
Kit PKH67 Green Fluorescent Cell Linker (incluye Diluyente C)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CNMINI67
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN10711454001
DAPIBeyotimeC1002
Microscopio confocal de barrido láser (CLSM)LeicaLeica TCS SP8
Kit ELISA Quantikine para IL-6 humanaR&D SystemsD6050B
Kit ELISA DuoSet para IL-1β/IL-1F2 humanaR&D SystemsDY201
Kit ELISA Quantikine para TNF-α humanaR&D SystemsDTA00D
Lector de microplacasThermo ScientificMultiskan FC
Kit de detección de muerte celular in situ (Kit de ensayo TUNEL)Roche11684795910
Tritón X-100BeyotimeP0096
Paraformaldehído (4%)BeyotimeP0099
Microscopio de fluorescenciaOlympusBX53
Centrífuga refrigerada (capacidad de 12,000 × g)EppendorfEppendorf 5430 R
Ultracentrífuga (capacidad de 120,000 × g)Beckman CoulterOptima MAX-XP
Software RThe R Foundationv4.2.1
GraphPad PrismGraphPad Softwarev10.0
Seurat (paquete de R)Satija Lab (código abierto)v4.0.4
Harmony (paquete de R, corrección de lotes)Código abiertov1.2.0
Scrublet (paquete de Python, detección de dobletes)Código abiertov0.2.3
clustree (paquete de R)Código abiertov0.5.1
glmnet (paquete de R, LASSO)Código abiertov4.1.8
e1071 (paquete de R, SVM-RFE)Código abiertov1.7-14
xgboost (paquete de R)Código abiertov1.7.7.1
randomForest (paquete de R, Boruta)Código abiertov4.7-1.1
Base de datos Gene Expression Omnibus (GEO)NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Base de datos STRINGstring-db.orghttps://www.string-db.org/
Metascapemetascape.orghttps://metascape.org/
Software CytoscapeCytoscape Consortiumv3.10.4
ggplot2 (paquete de R)Código abiertov3.5.1
limma (paquete de R)Código abiertov3.58.1
pheatmap (paquete de R)Código abiertov1.0.12
ClusterProfiler (paquete de R)Código abiertov4.8.3
DOSE (paquete de R)Código abiertov3.28.2
ggpubr (paquete de R)Código abiertov0.6.0

Referencias

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