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Artículo de investigación
El extracto de ZeLan mejoró los fenotipos endocrinos y metabólicos en ratas con SOP inducido por DHEA. El análisis integrado mediante secuenciación de 16S rRNA y metabolómica sérica mostró una restauración parcial de la diversidad alfa microbiana intestinal, alteraciones en la composición microbiana y cambios en metabolitos relacionados con hormonas esteroides, ácidos biliares y ácidos grasos de cadena corta.
Este estudio investigó los efectos terapéuticos del extracto de ZeLan sobre el síndrome de ovario poliquístico (SOP) y evaluó su asociación con la reorganización del microbioma y metaboloma intestinales. Veinticuatro ratas hembra Sprague-Dawley se dividieron aleatoriamente en grupos Control, Modelo de SOP inducido por dehidroepiandrosteroona (DHEA) y tratamiento con ZeLan (n = 8 cada uno). Tras 28 días de intervención, se midieron los niveles séricos de hormonas mediante ELISA; la composición del microbioma intestinal se analizó mediante secuenciación del gen 16S rRNA, y los perfiles metabólicos séricos se caracterizaron mediante UHPLC-Q-TOF-MS. Se realizó un análisis de correlación de Spearman con control de múltiples pruebas para explorar las asociaciones entre microbioma y metaboloma. ZeLan mejoró significativamente los fenotipos asociados al SOP, reduciendo el peso corporal, los niveles de testosterona (0,92 frente a 1,85 ng/mL, P < 0,05), la relación LH/FSH y los niveles de insulina en comparación con el grupo Modelo. El análisis de secuenciación mostró que ZeLan restauró parcialmente la diversidad microbiana alfa (índice de Shannon: 5,79 frente a 4,19) y disminuyó la relación Firmicutes a Bacteroidetes. ZeLan se asoció con un enriquecimiento de Lactobacillus y Ruminococcus y una menor abundancia de Bacteroides, Prevotella y Escherichia. El estudio metabolómico identificó 52 características metabólicas alteradas, con cambios clave en hormonas esteroides, ácidos biliares como el ácido litocólico y ácidos grasos de cadena corta como el ácido butírico. Estos hallazgos sugieren que ZeLan mejora las alteraciones endocrinas y metabólicas relacionadas con el SOP y se asocia con la reorganización de los perfiles microbianos intestinales y metabólicos séricos.
El síndrome de ovario poliquístico (SOP) representa uno de los trastornos endocrinos más prevalentes que afectan a mujeres en edad reproductiva, con una prevalencia mundial estimada entre el 6 % y el 20 % según los criterios diagnósticos empleados1. Este trastorno metabólico y reproductivo complejo se caracteriza por un conjunto de manifestaciones clínicas, incluyendo hiperandrogenismo, disfunción ovulatoria y morfología ovárica poliquística, que en conjunto contribuyen a consecuencias reproductivas, metabólicas y psicológicas significativas2. Más allá de su impacto inmediato en la fertilidad, el SOP es cada vez más reconocido como una afección sistémica asociada con complicaciones crónicas de salud, incluyendo diabetes mellitus tipo 2, enfermedad cardiovascular y carcinoma endometrial, imponiendo así cargas sustanciales tanto para pacientes individuales como para los sistemas de salud a nivel mundial3. La fisiopatología del SOP aún no se comprende completamente, aunque generalmente se acepta que involucra interacciones complejas entre predisposición genética, factores ambientales y determinantes del estilo de vida que culminan en las alteraciones hormonales y metabólicas características observadas en los individuos afectados4.
Los enfoques terapéuticos contemporáneos para el SOP se centran principalmente en el manejo sintomático mediante intervenciones farmacológicas, incluyendo anticonceptivos orales para la regulación menstrual, metformina para la sensibilización a la insulina y antiandrógenos para el control de la hirsutismo5. Sin embargo, estos tratamientos convencionales a menudo proporcionan un alivio incompleto de los síntomas y frecuentemente se asocian con efectos adversos que limitan su aplicabilidad a largo plazo, especialmente en mujeres con aspiraciones de fertilidad6. En consecuencia, ha habido un creciente interés en explorar enfoques de medicina complementaria y alternativa, particularmente la medicina tradicional china (MTC), que ha acumulado siglos de experiencia empírica en el tratamiento de trastornos ginecológicos mediante mecanismos regulatorios integrales7. Entre los numerosos medicamentos botánicos estudiados para el manejo del SOP, Lycopus lucidus Turcz. (conocido comúnmente como ZeLan en la medicina china) ha atraído considerable atención debido a sus aplicaciones tradicionales en la promoción de la circulación sanguínea, la resolución de estasis y la regulación de la menstruación8. Estudios fitoquímicos publicados indican que L. lucidus contiene fracciones ricas en polifenoles y flavonoides con actividad antioxidante y antiinflamatoria8,9. Por lo tanto, el contenido total estandarizado de flavonoides se utilizó como índice químico de control de calidad para el extracto en el presente estudio, aunque la identificación de los monómeros activos específicos responsables de la regulación del microbiota y del metabolismo requiere un análisis fitoquímico dirigido en el futuro.
Se ha demostrado que la microbiota intestinal es un regulador crítico del metabolismo y la función endocrina del huésped, con una creciente evidencia que respalda su participación en la patogénesis de diversas alteraciones metabólicas, incluido el síndrome de ovario poliquístico (SOP)10. Se ha propuesto el concepto del eje intestino-ovario para describir la comunicación bidireccional entre los microorganismos intestinales y la función ovárica, mediada por metabolitos microbianos, señales inmunitarias y vías neuroendocrinas11. Se ha observado de forma consistente que las mujeres con SOP presentan disbiosis intestinal caracterizada por una menor diversidad microbiana, proporciones alteradas de Firmicutes respecto a Bacteroidetes y una abundancia reducida de bacterias beneficiosas como las especies de Lactobacillus y Bifidobacterium12. Se considera que estas alteraciones microbianas contribuyen a la fisiopatología del SOP mediante múltiples mecanismos, entre ellos un aumento de la permeabilidad intestinal, inflamación sistémica de bajo grado y un metabolismo alterado de ácidos biliares y ácidos grasos de cadena corta (AGCC), lo que a su vez influye en la sensibilidad a la insulina y la biosíntesis de andrógenos13. Es importante destacar que las intervenciones dirigidas a la microbiota intestinal, como los probióticos, prebióticos y modificaciones dietéticas, han mostrado resultados prometedores en la mejora de los síntomas del SOP, respaldando así al eje intestino-ovario como un objetivo terapéutico14.
La metabolómica, el análisis exhaustivo de metabolitos de bajo peso molecular en sistemas biológicos, proporciona un enfoque potente para caracterizar las perturbaciones metabólicas asociadas con estados patológicos y para evaluar los efectos bioquímicos de intervenciones terapéuticas15. La integración del secuenciamiento del gen 16S ARNr para el perfilado del microbioma con la metabolómica no dirigida permite investigar sistemáticamente las relaciones entre las comunidades microbianas intestinales y el metabolismo del huésped, ofreciendo información sobre las interacciones microbiota-metaboloma que podrían acompañar tanto a la patogénesis de enfermedades como a las respuestas al tratamiento. A pesar del fundamento teórico para dirigirse al eje intestino-ovario en el manejo del SOP y las indicaciones tradicionales de ZeLan para trastornos ginecológicos, hasta la fecha ningún estudio ha investigado sistemáticamente si el extracto de ZeLan modula la interfaz microbiota-metaboloma en el SOP. Esta brecha de conocimiento limita nuestra comprensión de las respuestas biológicas asociadas con ZeLan y obstaculiza la optimización racional de esta intervención botánica para el tratamiento del SOP.
El presente estudio fue diseñado para investigar la eficacia terapéutica del extracto de ZeLan en un modelo de rata inducido por DHEA de SOP y para evaluar los cambios asociados en el microbioma intestinal y el metaboloma mediante el análisis integrado de secuenciación de ARNr 16S y metabolómica no dirigida. Específicamente, evaluamos los efectos del extracto de ZeLan sobre fenotipos relacionados con el SOP, incluyendo el peso corporal, testosterona sérica, relación entre la hormona luteinizante y la hormona estimulante del folículo (LH/FSH) y niveles de insulina; caracterizamos las alteraciones en la composición del microbiota intestinal y la diversidad alfa tras el tratamiento con ZeLan; identificamos características diferenciales de metabolitos séricos y vías metabólicas enriquecidas asociadas a la intervención con ZeLan; y exploramos las correlaciones entre taxones microbianos intestinales específicos y metabolitos clave. Al abordar estos objetivos, buscamos proporcionar evidencia asociativa de múltiples ómicas sobre la modulación relacionada con ZeLan del eje intestino-ovario en el SOP.
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Todos los procedimientos experimentales del presente estudio se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Número de aprobación: IACUC-2023-0156).
Animales
Se obtuvieron ratas hembra Sprague-Dawley (n = 24, 6 semanas de edad, peso corporal 180–200 g) del Centro de Animales de Laboratorio de la institución afiliada y se mantuvieron en condiciones ambientales controladas (temperatura 22 ± 2°C, humedad 50 ± 10%, ciclo de luz/oscuridad de 12 horas) con acceso ad libitum a alimento estándar para roedores y agua purificada. Tras un período de aclimatación de una semana, los animales se asignaron aleatoriamente a tres grupos experimentales (n = 8 por grupo): Control, Modelo de SOPQ y Tratamiento con ZeLan. El tamaño de la muestra se determinó según estudios previos que investigaron alteraciones en la microbiota intestinal en modelos de SOPQ, y el análisis de potencia indicó que 8 animales por grupo proporcionarían un 80 % de potencia para detectar una diferencia de 1,5 veces en los índices de diversidad alfa a α = 0,05.
Establecimiento del modelo de SOP y protocolo de tratamiento
El modelo de SOP fue establecido mediante un protocolo bien validado que consiste en la inyección subcutánea de dehidroepiandrosteroona (DHEA; Sigma-Aldrich, EE. UU.) disuelta en aceite de sésamo en la región dorsal del cuello, a una dosis de 6 mg/100 g de peso corporal diariamente durante 21 días consecutivos. Los animales del grupo control recibieron volúmenes equivalentes de aceite de sésamo como vehículo. La cronología completa del experimento incluyó 7 días de aclimatación, 21 días de inducción del modelo y 28 días de intervención, con muestreo final en el día 56 del protocolo, incluyendo el período de aclimatación (Figura 1). El extracto de ZeLan se preparó a partir de la planta autentificada Lycopus lucidus Turcz. mediante extracción acuosa y se normalizó para contener flavonoides totales en no menos del 2,5 % mediante cromatografía líquida de alta eficacia, que sirvió como criterio químico de control de calidad del extracto botánico. A partir del final del establecimiento del modelo inducido por DHEA, las ratas del grupo ZeLan recibieron por vía oral el extracto de ZeLan a 200 mg/kg de peso corporal diariamente durante 28 días consecutivos, mientras que los grupos Control y Modelo recibieron volúmenes equivalentes de agua destilada. La dosis de 200 mg/kg se seleccionó como una dosis farmacológica exploratoria basada en experiencias previas con extractos botánicos en animales y consideraciones preliminares de tolerabilidad; no se incluyó una evaluación formal de respuesta a la dosis en el presente diseño. El peso corporal se registró semanalmente durante todo el período experimental. En este diseño experimental, el establecimiento exitoso del modelo de SOP se evaluó mediante el protocolo de inducción con DHEA junto con fenotipos endocrinos y metabólicos finales, incluyendo el peso corporal, testosterona sérica, relación LH/FSH e insulina en ayunas. No se incluyeron como puntos finales para confirmar el modelo el examen histopatológico ovárico, el conteo de folículos, la cuantificación del cuerpo lúteo ni la monitorización seriada del ciclo estral, por lo que la interpretación de la disfunción ovárica se basó en las respuestas endocrinas y metabólicas y no en una evaluación directa a nivel tisular.
Recolección y procesamiento de muestras
Se recolectaron muestras (suero y heces) de los tres grupos (n = 8 por grupo) para análisis posteriores de tipo bioquímico, de microbiota y metabolómico. Las recolecciones finales se realizaron por la mañana tras un ayuno nocturno para reducir la variabilidad relacionada con el ritmo circadiano y la alimentación. Las muestras de sangre se obtuvieron de la aorta abdominal bajo anestesia y se centrifugaron a 3.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para obtener el suero, el cual se fraccionó y almacenó a -80 °C hasta su análisis hormonal y metabolómico. Las muestras fecales frescas se recolectaron directamente del ciego en condiciones asépticas en tubos criogénicos estériles, se mantuvieron sobre hielo seco durante el traslado, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido dentro de los 10 minutos posteriores a la recolección y se almacenaron a -80 °C hasta la secuenciación del gen 16S ARNr.
Mediciones hormonales en suero
Las concentraciones séricas de testosterona, hormona luteinizante (LH), hormona foliculoestimulante (FSH) e insulina se cuantificaron mediante kits comerciales de ensayo por inmunoabsorción con enzimas (ELISA) (Cusabio Biotech, Wuhan, China) según las instrucciones del fabricante. Se calculó la relación LH/FSH como un índice compuesto de desequilibrio gonadotrópico característico del síndrome de ovario poliquístico (PCOS). Todas las muestras se analizaron por duplicado, y las mediciones cuyos coeficientes de variación duplicados superaron el 15 % se repitieron. Se requirió que los coeficientes de variación intraensayo e interensayo permanecieran por debajo del 10 % y el 15 %, respectivamente. Los valores potencialmente atípicos se examinaron comparándolos con los registros originales y la información sobre el desempeño del ensayo, y ningún valor se excluyó únicamente por motivos estadísticos sin una justificación técnica documentada.
Secuenciación del gen ARNr 16S y análisis bioinformático
Se extrajo el ADN genómico bacteriano total de los contenidos cecales utilizando el QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La calidad y cantidad de ADN se evaluaron mediante espectrofotometría NanoDrop y electroforesis en gel de agarosa, y los extractos de ADN se almacenaron a -80°C antes de la construcción de la biblioteca. Las regiones hipervariables V3-V4 del gen 16S de ARNr se amplificaron utilizando los cebadores universales 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') y 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') con secuencias adaptadoras de Illumina. Se construyeron bibliotecas de amplicones, que fueron purificadas, cuantificadas, agrupadas en concentraciones equimolares y secuenciadas en la plataforma Illumina NovaSeq 6000 (Novogene, Pekín, China) utilizando lecturas apareadas de 250 pb.
Las lecturas de secuenciación crudas se procesaron utilizando la canalización QIIME2 (versión 2022.2). Las lecturas emparejadas se desmultiplexaron, fusionaron, filtraron por calidad utilizando un umbral de puntuación Phred de al menos 20 y se procesaron con DADA2 para eliminar secuencias quiméricas y generar variantes de secuencias de amplicones (ASVs). La clasificación taxonómica se realizó frente a la base de datos de referencia SILVA 138 utilizando un clasificador Bayesiano ingenuo. Se calcularon métricas de diversidad alfa, incluyendo el índice de Shannon, el índice de Simpson y el estimador de Chao1, para evaluar la diversidad y riqueza dentro de las muestras. Los resultados de profundidad de secuenciación, incluyendo resúmenes de lecturas, tablas de abundancia de ASV, cobertura de Good y archivos de curvas de rarefacción, se consideraron parte del conjunto de datos del microbioma descrito en la sección Disponibilidad de Datos. Se utilizó el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) para identificar taxones asociados con la enfermedad en la comparación entre Control y Modelo, utilizando un umbral de puntuación LDA mayor a 2,0 y P < 0,05; la reversión asociada con ZeLan se evaluó comparando la dirección de los cambios en la abundancia taxonómica en el grupo ZeLan respecto al grupo Modelo.
Análisis de metabolómica no dirigida
Se realizó un perfilado metabolómico en suero mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas con cuadrupolo y tiempo de vuelo (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, EE. UU.). Las muestras de suero (100 μL) se mezclaron con 400 μL de metanol frío:acetonitrilo (1:1, v/v) que contenía estándares internos, se agitaron en vórtex y se incubaron a -20°C durante 1 hora para precipitar las proteínas. Tras la centrifugación a 14.000 × g durante 15 minutos, los sobrenadantes se secaron con un flujo de nitrógeno y se reconstituyeron en 100 μL de acetonitrilo:agua (1:1, v/v) para su análisis. La separación cromatográfica se llevó a cabo en una columna ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) mantenida a 40°C, utilizando agua que contenía 0,1% de ácido fórmico como fase móvil A y acetonitrilo que contenía 0,1% de ácido fórmico como fase móvil B, con un flujo de 0,30 mL/min. Se utilizó un programa en gradiente que aumentó la fase orgánica del 5% al 95%, seguido de lavado y reequilibrio de la columna, para la separación de los metabolitos. Los datos espectrométricos de masas se adquirieron en modos de ionización por electrospray positivo y negativo, con un rango de barrido de m/z 50–1200; los parámetros de la fuente incluyeron un voltaje de capilar de 3,5 kV, un flujo de gas de secado de 10 L/min, una temperatura de gas de secado de 325°C, una presión de nebulizador de 35 psi y un voltaje del fragmentador de 120 V.
Los archivos de datos brutos se convirtieron al formato mzXML y se procesaron utilizando el paquete XCMS en R para la detección de picos, la alineación del tiempo de retención y la integración del área del pico. Se insertaron muestras de control de calidad, preparadas mediante la combinación de alícuotas iguales de todos los extractos de suero, a lo largo de la secuencia analítica para monitorear la estabilidad del instrumento. Se eliminaron las características con ausencia excesiva o con reproducibilidad inestable en el control de calidad antes del modelado estadístico. La identificación de metabolitos se realizó comparando la masa exacta, el tiempo de retención y los patrones de fragmentación en MS/MS con los de la base de datos Human Metabolome Database (HMDB), METLIN y bibliotecas espectrales internas. Se realizaron análisis estadísticos multivariados utilizando MetaboAnalyst 5.0. Las características de metabolitos conservadas para el informe final se priorizaron utilizando un criterio combinado que incluyó la contribución discriminante multivariada, la dirección del cambio de expresión y la evidencia estadística; los valores P se ajustaron mediante el método de Benjamini-Hochberg para tener en cuenta las pruebas múltiples. La tabla completa de informe anotada, que contiene 52 características de metabolitos, se proporciona como Tabla Suplementaria 1. El análisis de enriquecimiento de vías metabólicas se realizó utilizando la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS versión 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) y el software R (versión 4.2.1). Los datos continuos se expresaron como media ± desviación estándar (DE) y se evaluó su normalidad mediante la prueba de Shapiro-Wilk antes de las pruebas inferenciales. Para datos con distribución normal, se utilizó el análisis de varianza unifactorial (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones entre múltiples grupos; para datos con distribución no normal, se empleó la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba post hoc de Dunn. Las correlaciones entre taxones microbianos intestinales y metabolitos séricos se evaluaron utilizando el coeficiente de correlación de rangos de Spearman y se visualizaron como mapas de calor agrupados jerárquicamente. Los valores P de correlación se ajustaron para múltiples comparaciones mediante el método de tasa de error falso de Benjamini-Hochberg, y solo se interpretaron aquellas correlaciones que fueron consistentes en dirección y estadísticamente significativas. Un valor P bilateral < 0,05 se consideró estadísticamente significativo, a menos que se especificara un umbral de valor P ajustado.
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Efectos del extracto de ZeLan sobre los fenotipos clínicos del SOP
La administración de DHEA indujo fenotipos endocrinos y metabólicos similares al síndrome de ovario poliquístico (SOP) en ratas, evidenciado por aumentos significativos en el peso corporal, la concentración sérica de testosterona, la relación LH/FSH y los niveles de insulina en ayunas en comparación con el grupo Control (todos P < 0,05). La evaluación de la distribución mediante la prueba de Shapiro-Wilk res...
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El presente estudio proporciona evidencia de que el extracto de ZeLan mejora los fenotipos endocrinos y metabólicos relacionados con el SOP en un modelo de rata inducido por DHEA, y que estos efectos están asociados con cambios favorables en la composición del microbioma intestinal y en los perfiles metabólicos séricos. El enfoque integrado de multi-ómica mostró que el tratamiento con ZeLan mejoró la hiperandrogenemia, la elevada relación LH/FSH y la resistencia a la insulina, al tiempo que restableció parcialmente la di...
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Este estudio fue financiado por el Proyecto de Planificación de Investigación Científica de la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Hebei (Número de subvención: 2021316).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acetonitrilo | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A955-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; fase móvil y reconstitución de muestras |
| Columna ACQUITY UPLC HSS T3 | Waters Corporation | 186003539 | 100 Å, 1,8 μm, 2,1 × 100 mm; separación UHPLC |
| Sistema de electroforesis en gel de agarosa | Bio-Rad Laboratories | 1704486 | Sistema de electroforesis horizontal Mini-Sub Cell GT; evaluación de la calidad del ADN |
| Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS | Agilent Technologies | G7120A/G7167B/G7116B/G6550B | Módulo UHPLC 1290 Infinity II acoplado al espectrómetro de masas Q-TOF 6550 iFunnel; plataforma de metabolómica no dirigida en suero |
| Algoritmo DADA2 | Bioconductor | Version 1.24.0 | Generación de variantes de secuencia amplicónica (ASV) y eliminación de quimeras; versión inferida para coincidir con el flujo de trabajo R 4.2.1/Bioconductor 3.15 |
| Dehidroepiandrosteroona (DHEA) | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | D4000 | Inducción del modelo de SOP; 6 mg/100 g de peso corporal; CAS 53-43-0 |
| Agua destilada | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | 10977015 | Agua destilada UltraPure libre de DNasa/RNasa; vehículo para la administración por gavaje oral en los grupos Control y Modelo |
| Ácido fórmico | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A117-50 | Grado Optima LC-MS, 50 mL; aditivo al 0,1 % para fases móviles de LC-MS |
| Base de datos del Metaboloma Humano | University of Alberta / HMDB | HMDB 5.0 | Base de datos de anotación de metabolitos |
| Plataforma Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | 20012850 | Sistema de secuenciación utilizado por el proveedor de servicios de secuenciación para secuenciación de ARNr 16S de 250 pb emparejada |
| Hierba de Lycopus lucidus Turcz. | Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd. | Lote ZL-20230315 | Material vegetal bruto autenticado para el extracto acuoso ZeLan |
| Metanol | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A456-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; precipitación de proteínas para metabolómica en suero |
| Base de datos METLIN | Scripps Research | METLIN Classic 2023 | Base de datos de anotación de espectros de masas de metabolitos |
| Espectrofotómetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen NanoDrop One; evaluación de la cantidad y pureza del ADN |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51604 | Extracción de ADN de contenidos cecales; kit de ADN fecal para 50 preparaciones |
| QIIME2 | Equipo de desarrollo de QIIME2 | Version 2022.2 | Procesamiento de secuencias de ARNr 16S |
| Software R | R Foundation | Version 4.2.1 | Análisis estadístico y procesamiento con XCMS |
| Kits ELISA en suero para testosterona, LH, FSH e insulina | Cusabio Biotech | CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r | Kits ELISA para testosterona, LH, FSH e insulina en rata para cuantificación de hormonas e insulina en suero |
| Aceite de sésamo | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | S3547 | Vehículo para inyección de DHEA |
| Pentobarbital sódico | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | P3761 | Anestesia; 50 mg/kg por vía intraperitoneal |
| Software SPSS | IBM Corporation | Version 26.0 | Análisis estadístico |
| Primers universales de ARNr 16S 338F/806R | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Síntesis personalizada: 338F/806R | Amplificación de las regiones V3-V4; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
| Paquete XCMS | Bioconductor / R | Version 3.18.0 | Detección de picos, alineación de tiempos de retención e integración |
| Extracto ZeLan | Extracto acuoso preparado internamente | Lote ZLE-20230402 | Tratamiento por gavaje oral; flavonoides totales estandarizados ≥2,5 % |
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