El extracto de ZeLan mejoró los fenotipos endocrinos y metabólicos en ratas con SOP inducido por DHEA. El análisis integrado mediante secuenciación de 16S rRNA y metabolómica sérica mostró una restauración parcial de la diversidad alfa microbiana intestinal, alteraciones en la composición microbiana y cambios en metabolitos relacionados con hormonas esteroides, ácidos biliares y ácidos grasos de cadena corta.
Artículo de investigación
Lycopus lucidus Mejora el Síndrome de Ovario Poliquístico Experimental con la Remodelación de la Microbiota Intestinal y el Metaboloma
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Resumen
Resumen
Este estudio investigó los efectos terapéuticos del extracto de ZeLan sobre el síndrome de ovario poliquístico (SOP) y evaluó su asociación con la reorganización del microbioma y metaboloma intestinales. Veinticuatro ratas hembra Sprague-Dawley se dividieron aleatoriamente en grupos Control, Modelo de SOP inducido por dehidroepiandrosteroona (DHEA) y tratamiento con ZeLan (n = 8 cada uno). Tras 28 días de intervención, se midieron los niveles séricos de hormonas mediante ELISA; la composición del microbioma intestinal se analizó mediante secuenciación del gen 16S rRNA, y los perfiles metabólicos séricos se caracterizaron mediante UHPLC-Q-TOF-MS. Se realizó un análisis de correlación de Spearman con control de múltiples pruebas para explorar las asociaciones entre microbioma y metaboloma. ZeLan mejoró significativamente los fenotipos asociados al SOP, reduciendo el peso corporal, los niveles de testosterona (0,92 frente a 1,85 ng/mL, P < 0,05), la relación LH/FSH y los niveles de insulina en comparación con el grupo Modelo. El análisis de secuenciación mostró que ZeLan restauró parcialmente la diversidad microbiana alfa (índice de Shannon: 5,79 frente a 4,19) y disminuyó la relación Firmicutes a Bacteroidetes. ZeLan se asoció con un enriquecimiento de Lactobacillus y Ruminococcus y una menor abundancia de Bacteroides, Prevotella y Escherichia. El estudio metabolómico identificó 52 características metabólicas alteradas, con cambios clave en hormonas esteroides, ácidos biliares como el ácido litocólico y ácidos grasos de cadena corta como el ácido butírico. Estos hallazgos sugieren que ZeLan mejora las alteraciones endocrinas y metabólicas relacionadas con el SOP y se asocia con la reorganización de los perfiles microbianos intestinales y metabólicos séricos.
Introducción
El síndrome de ovario poliquístico (SOP) representa uno de los trastornos endocrinos más prevalentes que afectan a mujeres en edad reproductiva, con una prevalencia mundial estimada entre el 6 % y el 20 % según los criterios diagnósticos empleados1. Este trastorno metabólico y reproductivo complejo se caracteriza por un conjunto de manifestaciones clínicas, incluyendo hiperandrogenismo, disfunción ovulatoria y morfología ovárica poliquística, que en conjunto contribuyen a consecuencias reproductivas, metabólicas y psicológicas significativas2. Más allá de su impacto inmediato en la fertilidad, el SOP es cada vez más reconocido como una afección sistémica asociada con complicaciones crónicas de salud, incluyendo diabetes mellitus tipo 2, enfermedad cardiovascular y carcinoma endometrial, imponiendo así cargas sustanciales tanto para pacientes individuales como para los sistemas de salud a nivel mundial3. La fisiopatología del SOP aún no se comprende completamente, aunque generalmente se acepta que involucra interacciones complejas entre predisposición genética, factores ambientales y determinantes del estilo de vida que culminan en las alteraciones hormonales y metabólicas características observadas en los individuos afectados4.
Los enfoques terapéuticos contemporáneos para el SOP se centran principalmente en el manejo sintomático mediante intervenciones farmacológicas, incluyendo anticonceptivos orales para la regulación menstrual, metformina para la sensibilización a la insulina y antiandrógenos para el control de la hirsutismo5. Sin embargo, estos tratamientos convencionales a menudo proporcionan un alivio incompleto de los síntomas y frecuentemente se asocian con efectos adversos que limitan su aplicabilidad a largo plazo, especialmente en mujeres con aspiraciones de fertilidad6. En consecuencia, ha habido un creciente interés en explorar enfoques de medicina complementaria y alternativa, particularmente la medicina tradicional china (MTC), que ha acumulado siglos de experiencia empírica en el tratamiento de trastornos ginecológicos mediante mecanismos regulatorios integrales7. Entre los numerosos medicamentos botánicos estudiados para el manejo del SOP, Lycopus lucidus Turcz. (conocido comúnmente como ZeLan en la medicina china) ha atraído considerable atención debido a sus aplicaciones tradicionales en la promoción de la circulación sanguínea, la resolución de estasis y la regulación de la menstruación8. Estudios fitoquímicos publicados indican que L. lucidus contiene fracciones ricas en polifenoles y flavonoides con actividad antioxidante y antiinflamatoria8,9. Por lo tanto, el contenido total estandarizado de flavonoides se utilizó como índice químico de control de calidad para el extracto en el presente estudio, aunque la identificación de los monómeros activos específicos responsables de la regulación del microbiota y del metabolismo requiere un análisis fitoquímico dirigido en el futuro.
Se ha demostrado que la microbiota intestinal es un regulador crítico del metabolismo y la función endocrina del huésped, con una creciente evidencia que respalda su participación en la patogénesis de diversas alteraciones metabólicas, incluido el síndrome de ovario poliquístico (SOP)10. Se ha propuesto el concepto del eje intestino-ovario para describir la comunicación bidireccional entre los microorganismos intestinales y la función ovárica, mediada por metabolitos microbianos, señales inmunitarias y vías neuroendocrinas11. Se ha observado de forma consistente que las mujeres con SOP presentan disbiosis intestinal caracterizada por una menor diversidad microbiana, proporciones alteradas de Firmicutes respecto a Bacteroidetes y una abundancia reducida de bacterias beneficiosas como las especies de Lactobacillus y Bifidobacterium12. Se considera que estas alteraciones microbianas contribuyen a la fisiopatología del SOP mediante múltiples mecanismos, entre ellos un aumento de la permeabilidad intestinal, inflamación sistémica de bajo grado y un metabolismo alterado de ácidos biliares y ácidos grasos de cadena corta (AGCC), lo que a su vez influye en la sensibilidad a la insulina y la biosíntesis de andrógenos13. Es importante destacar que las intervenciones dirigidas a la microbiota intestinal, como los probióticos, prebióticos y modificaciones dietéticas, han mostrado resultados prometedores en la mejora de los síntomas del SOP, respaldando así al eje intestino-ovario como un objetivo terapéutico14.
La metabolómica, el análisis exhaustivo de metabolitos de bajo peso molecular en sistemas biológicos, proporciona un enfoque potente para caracterizar las perturbaciones metabólicas asociadas con estados patológicos y para evaluar los efectos bioquímicos de intervenciones terapéuticas15. La integración del secuenciamiento del gen 16S ARNr para el perfilado del microbioma con la metabolómica no dirigida permite investigar sistemáticamente las relaciones entre las comunidades microbianas intestinales y el metabolismo del huésped, ofreciendo información sobre las interacciones microbiota-metaboloma que podrían acompañar tanto a la patogénesis de enfermedades como a las respuestas al tratamiento. A pesar del fundamento teórico para dirigirse al eje intestino-ovario en el manejo del SOP y las indicaciones tradicionales de ZeLan para trastornos ginecológicos, hasta la fecha ningún estudio ha investigado sistemáticamente si el extracto de ZeLan modula la interfaz microbiota-metaboloma en el SOP. Esta brecha de conocimiento limita nuestra comprensión de las respuestas biológicas asociadas con ZeLan y obstaculiza la optimización racional de esta intervención botánica para el tratamiento del SOP.
El presente estudio fue diseñado para investigar la eficacia terapéutica del extracto de ZeLan en un modelo de rata inducido por DHEA de SOP y para evaluar los cambios asociados en el microbioma intestinal y el metaboloma mediante el análisis integrado de secuenciación de ARNr 16S y metabolómica no dirigida. Específicamente, evaluamos los efectos del extracto de ZeLan sobre fenotipos relacionados con el SOP, incluyendo el peso corporal, testosterona sérica, relación entre la hormona luteinizante y la hormona estimulante del folículo (LH/FSH) y niveles de insulina; caracterizamos las alteraciones en la composición del microbiota intestinal y la diversidad alfa tras el tratamiento con ZeLan; identificamos características diferenciales de metabolitos séricos y vías metabólicas enriquecidas asociadas a la intervención con ZeLan; y exploramos las correlaciones entre taxones microbianos intestinales específicos y metabolitos clave. Al abordar estos objetivos, buscamos proporcionar evidencia asociativa de múltiples ómicas sobre la modulación relacionada con ZeLan del eje intestino-ovario en el SOP.
Protocolo
Todos los procedimientos experimentales del presente estudio se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Número de aprobación: IACUC-2023-0156).
Animales
Se obtuvieron ratas hembra Sprague-Dawley (n = 24, 6 semanas de edad, peso corporal 180–200 g) del Centro de Animales de Laboratorio de la institución afiliada y se mantuvieron en condiciones ambientales controladas (temperatura 22 ± 2°C, humedad 50 ± 10%, ciclo de luz/oscuridad de 12 horas) con acceso ad libitum a alimento estándar para roedores y agua purificada. Tras un período de aclimatación de una semana, los animales se asignaron aleatoriamente a tres grupos experimentales (n = 8 por grupo): Control, Modelo de SOPQ y Tratamiento con ZeLan. El tamaño de la muestra se determinó según estudios previos que investigaron alteraciones en la microbiota intestinal en modelos de SOPQ, y el análisis de potencia indicó que 8 animales por grupo proporcionarían un 80 % de potencia para detectar una diferencia de 1,5 veces en los índices de diversidad alfa a α = 0,05.
Establecimiento del modelo de SOP y protocolo de tratamiento
El modelo de SOP fue establecido mediante un protocolo bien validado que consiste en la inyección subcutánea de dehidroepiandrosteroona (DHEA; Sigma-Aldrich, EE. UU.) disuelta en aceite de sésamo en la región dorsal del cuello, a una dosis de 6 mg/100 g de peso corporal diariamente durante 21 días consecutivos. Los animales del grupo control recibieron volúmenes equivalentes de aceite de sésamo como vehículo. La cronología completa del experimento incluyó 7 días de aclimatación, 21 días de inducción del modelo y 28 días de intervención, con muestreo final en el día 56 del protocolo, incluyendo el período de aclimatación (Figura 1). El extracto de ZeLan se preparó a partir de la planta autentificada Lycopus lucidus Turcz. mediante extracción acuosa y se normalizó para contener flavonoides totales en no menos del 2,5 % mediante cromatografía líquida de alta eficacia, que sirvió como criterio químico de control de calidad del extracto botánico. A partir del final del establecimiento del modelo inducido por DHEA, las ratas del grupo ZeLan recibieron por vía oral el extracto de ZeLan a 200 mg/kg de peso corporal diariamente durante 28 días consecutivos, mientras que los grupos Control y Modelo recibieron volúmenes equivalentes de agua destilada. La dosis de 200 mg/kg se seleccionó como una dosis farmacológica exploratoria basada en experiencias previas con extractos botánicos en animales y consideraciones preliminares de tolerabilidad; no se incluyó una evaluación formal de respuesta a la dosis en el presente diseño. El peso corporal se registró semanalmente durante todo el período experimental. En este diseño experimental, el establecimiento exitoso del modelo de SOP se evaluó mediante el protocolo de inducción con DHEA junto con fenotipos endocrinos y metabólicos finales, incluyendo el peso corporal, testosterona sérica, relación LH/FSH e insulina en ayunas. No se incluyeron como puntos finales para confirmar el modelo el examen histopatológico ovárico, el conteo de folículos, la cuantificación del cuerpo lúteo ni la monitorización seriada del ciclo estral, por lo que la interpretación de la disfunción ovárica se basó en las respuestas endocrinas y metabólicas y no en una evaluación directa a nivel tisular.
Recolección y procesamiento de muestras
Se recolectaron muestras (suero y heces) de los tres grupos (n = 8 por grupo) para análisis posteriores de tipo bioquímico, de microbiota y metabolómico. Las recolecciones finales se realizaron por la mañana tras un ayuno nocturno para reducir la variabilidad relacionada con el ritmo circadiano y la alimentación. Las muestras de sangre se obtuvieron de la aorta abdominal bajo anestesia y se centrifugaron a 3.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para obtener el suero, el cual se fraccionó y almacenó a -80 °C hasta su análisis hormonal y metabolómico. Las muestras fecales frescas se recolectaron directamente del ciego en condiciones asépticas en tubos criogénicos estériles, se mantuvieron sobre hielo seco durante el traslado, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido dentro de los 10 minutos posteriores a la recolección y se almacenaron a -80 °C hasta la secuenciación del gen 16S ARNr.
Mediciones hormonales en suero
Las concentraciones séricas de testosterona, hormona luteinizante (LH), hormona foliculoestimulante (FSH) e insulina se cuantificaron mediante kits comerciales de ensayo por inmunoabsorción con enzimas (ELISA) (Cusabio Biotech, Wuhan, China) según las instrucciones del fabricante. Se calculó la relación LH/FSH como un índice compuesto de desequilibrio gonadotrópico característico del síndrome de ovario poliquístico (PCOS). Todas las muestras se analizaron por duplicado, y las mediciones cuyos coeficientes de variación duplicados superaron el 15 % se repitieron. Se requirió que los coeficientes de variación intraensayo e interensayo permanecieran por debajo del 10 % y el 15 %, respectivamente. Los valores potencialmente atípicos se examinaron comparándolos con los registros originales y la información sobre el desempeño del ensayo, y ningún valor se excluyó únicamente por motivos estadísticos sin una justificación técnica documentada.
Secuenciación del gen ARNr 16S y análisis bioinformático
Se extrajo el ADN genómico bacteriano total de los contenidos cecales utilizando el QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La calidad y cantidad de ADN se evaluaron mediante espectrofotometría NanoDrop y electroforesis en gel de agarosa, y los extractos de ADN se almacenaron a -80°C antes de la construcción de la biblioteca. Las regiones hipervariables V3-V4 del gen 16S de ARNr se amplificaron utilizando los cebadores universales 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') y 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') con secuencias adaptadoras de Illumina. Se construyeron bibliotecas de amplicones, que fueron purificadas, cuantificadas, agrupadas en concentraciones equimolares y secuenciadas en la plataforma Illumina NovaSeq 6000 (Novogene, Pekín, China) utilizando lecturas apareadas de 250 pb.
Las lecturas de secuenciación crudas se procesaron utilizando la canalización QIIME2 (versión 2022.2). Las lecturas emparejadas se desmultiplexaron, fusionaron, filtraron por calidad utilizando un umbral de puntuación Phred de al menos 20 y se procesaron con DADA2 para eliminar secuencias quiméricas y generar variantes de secuencias de amplicones (ASVs). La clasificación taxonómica se realizó frente a la base de datos de referencia SILVA 138 utilizando un clasificador Bayesiano ingenuo. Se calcularon métricas de diversidad alfa, incluyendo el índice de Shannon, el índice de Simpson y el estimador de Chao1, para evaluar la diversidad y riqueza dentro de las muestras. Los resultados de profundidad de secuenciación, incluyendo resúmenes de lecturas, tablas de abundancia de ASV, cobertura de Good y archivos de curvas de rarefacción, se consideraron parte del conjunto de datos del microbioma descrito en la sección Disponibilidad de Datos. Se utilizó el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) para identificar taxones asociados con la enfermedad en la comparación entre Control y Modelo, utilizando un umbral de puntuación LDA mayor a 2,0 y P < 0,05; la reversión asociada con ZeLan se evaluó comparando la dirección de los cambios en la abundancia taxonómica en el grupo ZeLan respecto al grupo Modelo.
Análisis de metabolómica no dirigida
Se realizó un perfilado metabolómico en suero mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas con cuadrupolo y tiempo de vuelo (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, EE. UU.). Las muestras de suero (100 μL) se mezclaron con 400 μL de metanol frío:acetonitrilo (1:1, v/v) que contenía estándares internos, se agitaron en vórtex y se incubaron a -20°C durante 1 hora para precipitar las proteínas. Tras la centrifugación a 14.000 × g durante 15 minutos, los sobrenadantes se secaron con un flujo de nitrógeno y se reconstituyeron en 100 μL de acetonitrilo:agua (1:1, v/v) para su análisis. La separación cromatográfica se llevó a cabo en una columna ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) mantenida a 40°C, utilizando agua que contenía 0,1% de ácido fórmico como fase móvil A y acetonitrilo que contenía 0,1% de ácido fórmico como fase móvil B, con un flujo de 0,30 mL/min. Se utilizó un programa en gradiente que aumentó la fase orgánica del 5% al 95%, seguido de lavado y reequilibrio de la columna, para la separación de los metabolitos. Los datos espectrométricos de masas se adquirieron en modos de ionización por electrospray positivo y negativo, con un rango de barrido de m/z 50–1200; los parámetros de la fuente incluyeron un voltaje de capilar de 3,5 kV, un flujo de gas de secado de 10 L/min, una temperatura de gas de secado de 325°C, una presión de nebulizador de 35 psi y un voltaje del fragmentador de 120 V.
Los archivos de datos brutos se convirtieron al formato mzXML y se procesaron utilizando el paquete XCMS en R para la detección de picos, la alineación del tiempo de retención y la integración del área del pico. Se insertaron muestras de control de calidad, preparadas mediante la combinación de alícuotas iguales de todos los extractos de suero, a lo largo de la secuencia analítica para monitorear la estabilidad del instrumento. Se eliminaron las características con ausencia excesiva o con reproducibilidad inestable en el control de calidad antes del modelado estadístico. La identificación de metabolitos se realizó comparando la masa exacta, el tiempo de retención y los patrones de fragmentación en MS/MS con los de la base de datos Human Metabolome Database (HMDB), METLIN y bibliotecas espectrales internas. Se realizaron análisis estadísticos multivariados utilizando MetaboAnalyst 5.0. Las características de metabolitos conservadas para el informe final se priorizaron utilizando un criterio combinado que incluyó la contribución discriminante multivariada, la dirección del cambio de expresión y la evidencia estadística; los valores P se ajustaron mediante el método de Benjamini-Hochberg para tener en cuenta las pruebas múltiples. La tabla completa de informe anotada, que contiene 52 características de metabolitos, se proporciona como Tabla Suplementaria 1. El análisis de enriquecimiento de vías metabólicas se realizó utilizando la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS versión 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) y el software R (versión 4.2.1). Los datos continuos se expresaron como media ± desviación estándar (DE) y se evaluó su normalidad mediante la prueba de Shapiro-Wilk antes de las pruebas inferenciales. Para datos con distribución normal, se utilizó el análisis de varianza unifactorial (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones entre múltiples grupos; para datos con distribución no normal, se empleó la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba post hoc de Dunn. Las correlaciones entre taxones microbianos intestinales y metabolitos séricos se evaluaron utilizando el coeficiente de correlación de rangos de Spearman y se visualizaron como mapas de calor agrupados jerárquicamente. Los valores P de correlación se ajustaron para múltiples comparaciones mediante el método de tasa de error falso de Benjamini-Hochberg, y solo se interpretaron aquellas correlaciones que fueron consistentes en dirección y estadísticamente significativas. Un valor P bilateral < 0,05 se consideró estadísticamente significativo, a menos que se especificara un umbral de valor P ajustado.
Resultados
Efectos del extracto de ZeLan sobre los fenotipos clínicos del SOP
La administración de DHEA indujo fenotipos endocrinos y metabólicos similares al síndrome de ovario poliquístico (SOP) en ratas, evidenciado por aumentos significativos en el peso corporal, la concentración sérica de testosterona, la relación LH/FSH y los niveles de insulina en ayunas en comparación con el grupo Control (todos P < 0,05). La evaluación de la distribución mediante la prueba de Shapiro-Wilk respaldó el análisis paramétrico para los principales parámetros de peso corporal y hormonas resumidos en Tabla 1. El tratamiento con extracto de ZeLan durante 28 días mejoró significativamente estas alteraciones metabólicas y hormonales. El peso corporal se registró al final del período de tratamiento, en el día 56 del protocolo, que incluye el período de aclimatación de 7 días. Como se presenta en Tabla 1, el peso corporal en el grupo Modelo (291,12 ± 15,35 g) fue sustancialmente mayor que en el grupo Control (227,45 ± 10,12 g, P < 0,05), mientras que el tratamiento con ZeLan redujo significativamente el peso corporal a 245,25 ± 10,21 g (P < 0,05 frente al Modelo). Los niveles séricos de testosterona aumentaron marcadamente en las ratas modelo de SOP (1,85 ± 0,21 ng/mL) en comparación con los controles (0,51 ± 0,05 ng/mL), y la intervención con ZeLan redujo la testosterona a 0,92 ± 0,12 ng/mL. La relación LH/FSH aumentó significativamente en el grupo Modelo (3,28 ± 0,25) en relación con el grupo Control (1,25 ± 0,11) y fue parcialmente normalizada por el tratamiento con ZeLan (1,85 ± 0,15). Los niveles de insulina en ayunas se elevaron en los animales modelo (28,95 ± 2,35 mIU/L frente a 12,55 ± 1,12 mIU/L en los controles) y se redujeron significativamente tras la administración de ZeLan (18,82 ± 1,55 mIU/L) (Figura 2). Estos hallazgos confirmaron el establecimiento exitoso de un fenotipo similar al SOP con alteraciones endocrinas y metabólicas; sin embargo, en este estudio no se realizaron análisis de histopatología ovárica, conteo de folículos, análisis de cuerpo lúteo ni monitoreo del ciclo estral.
El extracto de ZeLan restauró la diversidad alfa de la microbiota intestinal
El análisis de los índices de diversidad alfa reveló alteraciones sustanciales en la estructura de la comunidad microbiana intestinal asociadas al SOP y su tratamiento. Como se muestra en Tabla 2 y Figura 3, el índice de diversidad de Shannon fue significativamente menor en las ratas modelo de SOP (4,19 ± 0,35) que en los controles sanos (6,51 ± 0,28; P < 0,05), lo que indica una disminución de la diversidad alfa microbiana en el estado de enfermedad. El tratamiento con ZeLan restauró parcialmente la diversidad microbiana, aumentando el índice de Shannon a 5,79 ± 0,26 (P < 0,05 frente al modelo). Se observaron resultados consistentes para el índice de Simpson, que disminuyó de 0,98 ± 0,01 en los controles a 0,82 ± 0,03 en los animales modelo y recuperó un valor de 0,93 ± 0,02 tras la intervención con ZeLan. El estimador Chao1, que refleja la riqueza de especies, mostró un patrón similar: la inducción del SOP redujo sustancialmente Chao1 de 1215,3 ± 45,4 a 665,8 ± 52,1, mientras que el tratamiento con ZeLan aumentó la riqueza a 963,5 ± 38,6. En conjunto, estos hallazgos indican que el SOP se asocia con una disbiosis microbiana intestinal caracterizada por una menor diversidad alfa y riqueza, y que el extracto de ZeLan puede restaurar parcialmente la estructura de la comunidad microbiana hacia el perfil del control.
Alteraciones en la composición del microbiota intestinal
El perfilado taxonómico a nivel de filo reveló diferencias composicionales distintas entre los grupos experimentales. Como se ilustra en la Figura 4, Firmicutes y Bacteroidetes fueron los filos dominantes en todos los grupos, representando conjuntamente más del 85 % de la comunidad bacteriana total. El grupo Modelo mostró una abundancia sustancialmente elevada de Firmicutes (aproximadamente el 75 %) junto con una proporción reducida de Bacteroidetes (aproximadamente el 15 %) en comparación con el grupo Control (Firmicutes aproximadamente el 40 %, Bacteroidetes aproximadamente el 45 %), lo que resultó en una relación Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) marcadamente aumentada, característica de la disbiosis metabólica. El tratamiento con ZeLan moduló este desequilibrio, reduciendo la abundancia de Firmicutes a aproximadamente el 52 % y aumentando Bacteroidetes a aproximadamente el 35 %, normalizando así parcialmente la relación F/B hacia los niveles del control.
Se utilizó el análisis LEfSe para identificar los taxa bacterianos que distinguían los grupos Control y Modelo, definiendo así la firma microbiana asociada a la enfermedad. Como se muestra en la Figura 5, a nivel de género, el grupo Modelo con SOP mostró abundancias significativamente elevadas de Bacteroides (puntuación LDA > 3,5), Prevotella (puntuación LDA > 3,0) y Escherichia (puntuación LDA > 2,5), todos los cuales generalmente se han asociado previamente con disfunción metabólica e inflamación. Por el contrario, el grupo Control mostró enriquecimiento de géneros beneficiosos, incluyendo Lactobacillus (puntuación LDA > 3,0) y Ruminococcus (puntuación LDA > 2,5), ambos reconocidos por su papel en el mantenimiento de la integridad de la barrera intestinal y en la producción de metabolitos beneficiosos como los ácidos grasos de cadena corta. El grupo ZeLan no se mostró como una clase LEfSe separada en la Figura 5 porque este análisis se centró en los taxa que distinguen la enfermedad de la salud; los efectos relacionados con ZeLan se interpretaron a partir de los cambios en abundancia hacia el perfil del grupo Control y de las correlaciones entre el microbioma y el metaboloma.
Perfilado metabolómico e identificación de metabolitos diferenciales
El análisis de metabolómica no dirigida identificó perturbaciones metabólicas sustanciales asociadas con el SOP y su tratamiento con extracto de ZeLan. La gráfica de volcan en Figura 6 muestra la distribución de las características de los metabolitos entre los grupos Modelo y Control, con las características reguladas al alza y a la baja resaltadas según la dirección del cambio de expresión y la significancia estadística. Un total de 52 características de metabolitos anotados se conservaron en la tabla completa de informe de metabolómica para la comparación entre Modelo y Control. La lista completa, que incluye el nombre del metabolito, identificador HMDB, clase bioquímica, cambio log2 de expresión, valor P y dirección de regulación, se proporciona como Tabla Suplementaria 1. Tabla 3 presenta metabolitos anotados representativos con alta relevancia biológica para el SOP.
Tabla 3 resume metabolitos diferenciales clave representativos con altas puntuaciones VIP y relevancia biológica para la fisiopatología del SOP. Las hormonas esteroides, incluyendo testosterona (VIP = 2.56, P < 0.001) y androstenediona (VIP = 2.34, P < 0.001), se encontraron significativamente elevadas en los animales modelo de SOP, lo cual es consistente con el estado de hiperandrogenismo característico de esta afección. El metabolismo de los ácidos grasos también se alteró, con aumentos significativos de ácido palmítico (VIP = 2.12) y ácido araquidónico (VIP = 1.89), mientras que el mediador lipídico proinflamatorio prostaglandina E2 también se reguló al alza (VIP = 2.05). Por el contrario, los metabolitos asociados con actividad microbiana intestinal beneficiosa se redujeron en los animales con SOP: el ácido litocólico, un ácido biliar secundario producido mediante biotransformación microbiana, disminuyó sustancialmente (VIP = 2.45), al igual que el ácido graso de cadena corta ácido butírico (VIP = 2.21). Además, el ácido succínico y el aminoácido esencial L-triptófano mostraron reducciones en el grupo Modelo, lo que sugiere una fermentación microbiana deteriorada y un metabolismo alterado de los aminoácidos.
Análisis de enriquecimiento de vías KEGG
El análisis de enriquecimiento de vías mediante la base de datos KEGG reveló varias vías metabólicas séricas significativamente alteradas en el SOP y moduladas por el tratamiento con ZeLan. Como se muestra en la Figura 7, la biosíntesis de hormonas esteroides surgió como la vía más significativamente enriquecida (Factor de Enriquecimiento = 0,80, P < 0,01), lo cual es consistente con el fenotipo hiperandrogénico del SOP. La vía de esteroidogénesis ovárica también mostró un enriquecimiento muy alto (Factor de Enriquecimiento = 0,75, P < 0,01), reflejando la participación de la síntesis alterada de andrógenos en la disfunción ovárica. La biosíntesis de ácidos biliares primarios mostró un enriquecimiento significativo (Factor de Enriquecimiento = 0,62, P < 0,02), lo que indica una circulación enterohepática de ácidos biliares alterada, posiblemente relacionada con cambios en la microbiota intestinal. El metabolismo del ácido araquidónico (Factor de Enriquecimiento = 0,56, P < 0,03) y la vía de resistencia a la insulina (Factor de Enriquecimiento = 0,40, P < 0,04) también estuvieron significativamente enriquecidos, lo que respalda la presencia de alteraciones inflamatorias y metabólicas características del SOP. La vía de biosíntesis de ácidos grasos mostró un enriquecimiento moderado (Factor de Enriquecimiento = 0,30), lo que sugiere la participación de una desregulación del metabolismo lipídico.
Análisis de correlación entre microbioma y metaboloma
Para evaluar las relaciones funcionales entre la composición de la microbiota intestinal y las alteraciones metabólicas, se realizó un análisis de correlación de Spearman con control de la tasa de error por descubrimiento falso entre géneros bacterianos diferencialmente abundantes y metabolitos clave. El mapa térmico de correlación agrupado jerárquicamente que se presenta en Figura 8 revela patrones distintos de asociaciones entre microbiota y metaboloma. Las bacterias beneficiosas, incluyendo *Lactobacillus* y *Ruminococcus*, mostraron correlaciones positivas fuertes con ácido litocólico (r = 0,72 y 0,68, respectivamente) y ácido butírico (r = 0,65 y 0,60, respectivamente), mientras que presentaron correlaciones negativas con testosterona (r = -0,75 y -0,80) y androstenediona (r = -0,68 y -0,72). Estos hallazgos sugieren que las bacterias beneficiosas identificadas en el análisis taxonómico estuvieron asociadas con metabolitos relacionados con andrógenos y con actividad metabólica relacionada con los ácidos grasos de cadena corta (SCFA).
Por el contrario, los géneros asociados al SOPC Bacteroides, Prevotella y Escherichia mostraron patrones de correlación opuestos. Estas bacterias presentaron correlación positiva con testosterona (r = 0.85, 0.82 y 0.60, respectivamente), androstendiona (r = 0.78, 0.75 y 0.55) y ácido palmítico (r = 0.65, 0.60 y 0.45), mientras que mostraron correlaciones negativas con metabolitos beneficiosos, incluyendo ácido litocólico y ácido butírico. Estos patrones de correlación respaldan asociaciones funcionales entre taxones microbianos intestinales específicos y las alteraciones metabólicas características del SOPC, aunque no establecen una causalidad directa.
Disponibilidad de datos:
Los conjuntos de datos generados y analizados durante este estudio incluyen metadatos de las muestras, datos originales de fenotipos, índices de alfa-diversidad de 16S, resúmenes de abundancia a nivel de filo, resultados de taxones bacterianos diferenciales, tablas de análisis diferencial de metabolómica, resultados representativos de metabolitos, resultados de enriquecimiento de vías KEGG y la matriz de correlación entre microbiota y metabolitos. Estos datos originales subyacentes se proporcionan como el Archivo Suplementario 1 adjunto. El conjunto de datos procesado de metabolitos diferenciales se proporciona como la Tabla Suplementaria 1.
Figura 1: Diseño experimental y cronología del tratamiento. Ilustración esquemática del flujo de trabajo experimental que muestra el período de aclimatación de 7 días, el período de inyección de DHEA o vehículo de 21 días, el tratamiento de 28 días con extracto de ZeLan o vehículo, y la recolección final de muestras de suero y fecales en el día 56 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efectos del extracto de ZeLan sobre parámetros endocrinos y metabólicos. Gráficos de caja que muestran (A) la concentración sérica de testosterona, (B) la relación LH/FSH y (C) el peso corporal en los grupos control, modelo y tratamiento con ZeLan tras el período de intervención. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diversidad alfa microbiana intestinal. Comparación del índice de diversidad de Shannon entre los grupos de tratamiento Control, Modelo y ZeLan, que ilustra las diferencias en la diversidad alfa microbiana intestinal. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 4: Composición de la microbiota intestinal a nivel de filo. Gráfico de barras apiladas que muestra la abundancia relativa de los filos bacterianos predominantes en la microbiota intestinal de los grupos Control, Modelo y de tratamiento ZeLan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Taxones bacterianos diferenciales identificados mediante análisis LEfSe. Análisis del tamaño del efecto mediante discriminante lineal (LEfSe) para identificar géneros bacterianos que distinguen los grupos Control y Modelo. Las puntuaciones LDA indican el tamaño del efecto de los taxones con abundancia diferencial. Los cambios asociados con ZeLan se describen en los Resultados según los cambios en abundancia en relación con el grupo Modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Perfilado de metabolitos diferenciales. Gráfico de volcán que muestra las características de metabolitos diferenciales entre los grupos Modelo y Control. Los puntos rojos y azules representan características de metabolitos significativamente reguladas al alza y reguladas a la baja, respectivamente, según el cambio de la expresión y la significancia estadística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis de enriquecimiento de vías KEGG. Gráfico de burbujas que muestra las vías metabólicas enriquecidas significativamente identificadas a partir de los metabolitos diferenciales. El tamaño de la burbuja representa el número de metabolitos asignados, y el color de la burbuja indica la significancia estadística (valor P) del enriquecimiento de la vía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Correlación entre la microbiota intestinal y los metabolitos séricos. Mapa de calor agrupado jerárquicamente que muestra los coeficientes de correlación de Spearman entre géneros bacterianos diferencialmente abundantes y metabolitos séricos representativos. El color rojo indica correlaciones positivas, mientras que el azul indica correlaciones negativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grupo | N | Peso Corporal (g) | Testosterona (ng/mL) | Relación LH/FSH | Insulina (mIU/L) |
| Control | 8 | 227.45 ± 10.12 | 0.51 ± 0.05 | 1.25 ± 0.11 | 12.55 ± 1.12 |
| Modelo | 8 | 291.12 ± 15.35a | 1.85 ± 0.21a | 3.28 ± 0.25a | 28.95 ± 2.35a |
| ZeLan | 8 | 245.25 ± 10.21b | 0.92 ± 0.12b | 1.85 ± 0.15b | 18.82 ± 1.55b |
| Nota: Los datos se presentan como media ± DE. a = p < 0,05 comparado con el grupo Control; b = p < 0,05 comparado con el grupo Modelo. | |||||
Tabla 1: Parámetros endocrinos y metabólicos en ratas con SOP. Se midieron el peso corporal, la testosterona sérica, la relación LH/FSH y los niveles de insulina en ayunas en los grupos Control, Modelo y de tratamiento con ZeLan. Los datos se presentan como media ± DE.
| Grupo | Índice de Shannon | Índice de Simpson | Estimador Chao1 |
| Control | 6.51 ± 0.28 | 0.98 ± 0.01 | 1215.3 ± 45.4 |
| Modelo | 4.19 ± 0.35a | 0.82 ± 0.03a | 665.8 ± 52.1a |
| ZeLan | 5.79 ± 0.26b | 0.93 ± 0.02b | 963.5 ± 38.6b |
| Nota: Los datos se presentan como media ± DE. a = p < 0,05 en comparación con el grupo control; b = p < 0,05 en comparación con el grupo modelo. | |||
Tabla 2: Índices de diversidad alfa microbiana intestinal. Comparación del índice de Shannon, índice de Simpson y estimador de Chao1 entre los grupos Control, Modelo y tratamiento con ZeLan. Los datos se presentan como media ± DE.
| Nombre del metabolito | ID HMDB | Clase | Tendencia (modelo frente a control) | valor p | Puntuación VIP |
| Testosterone | HMDB0000286 | Steroid | Up ↑ | < 0.001 | 2.56 |
| Androstenedione | HMDB0000055 | Steroid | Up ↑ | < 0.001 | 2.34 |
| Palmitic acid | HMDB0000220 | Fatty Acid | Up ↑ | < 0.001 | 2.12 |
| Arachidonic acid | HMDB0001043 | Fatty Acid | Up ↑ | 0.003 | 1.89 |
| Prostaglandin E2 | HMDB0001036 | Lipid | Up ↑ | < 0.001 | 2.05 |
| Lithocholic acid | HMDB0000752 | Bile Acid | Down ↓ | < 0.001 | 2.45 |
| Butyric acid | HMDB0000039 | SCFA | Down ↓ | < 0.001 | 2.21 |
| Succinic acid | HMDB0000254 | Organic Acid | Down ↓ | 0.021 | 1.65 |
| L-Tryptophan | HMDB0000929 | Amino Acid | Down ↓ | 0.015 | 1.58 |
| Nota: VIP = Importancia de la variable en la proyección (se considera significativo VIP > 1). | |||||
Tabla 3: Metabolitos séricos diferenciales representativos. Metabolitos anotados representativos asociados con el SOP y regulados por el extracto de ZeLan, que incluyen identificadores HMDB, clase de metabolito, tendencia de regulación, valor de P y puntuación VIP. La lista completa de 52 características de metabolitos anotados se proporciona en la Tabla Suplementaria 1.
Tabla suplementaria 1: Conjunto completo de datos de metabolitos anotados. Lista completa de las 52 características de metabolitos anotados conservadas para el informe de metabolómica, incluyendo nombre del metabolito, identificador HMDB, clase bioquímica, cambio relativo, valor p y dirección de regulación.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 1: Datos de origen que respaldan los análisis experimentales, del microbioma y de metabolómica. Este libro de trabajo contiene la información de las muestras, las mediciones de fenotipo clínico, los índices de diversidad de secuenciación de ARNr 16S, la abundancia relativa microbiana a nivel de filo, el análisis diferencial de taxones mediante LEfSe, el análisis diferencial de metabolómica, los metabolitos representativos, el análisis de enriquecimiento de vías KEGG, la matriz de datos de correlación y el resumen de verificación de datos utilizados para generar las figuras y tablas presentadas en el manuscrito.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
El presente estudio proporciona evidencia de que el extracto de ZeLan mejora los fenotipos endocrinos y metabólicos relacionados con el SOP en un modelo de rata inducido por DHEA, y que estos efectos están asociados con cambios favorables en la composición del microbioma intestinal y en los perfiles metabólicos séricos. El enfoque integrado de multi-ómica mostró que el tratamiento con ZeLan mejoró la hiperandrogenemia, la elevada relación LH/FSH y la resistencia a la insulina, al tiempo que restableció parcialmente la diversidad alfa microbiana intestinal, reequilibró la composición microbiana y normalizó varias vías metabólicas implicadas en la fisiopatología del SOP. Estos hallazgos amplían el conocimiento actual sobre las respuestas biológicas a las medicinas botánicas tradicionales chinas y respaldan la investigación adicional sobre el eje intestino-ovario como un posible objetivo para la intervención en el SOP.
La reducción en los niveles séricos de testosterona y en la relación LH/FSH tras el tratamiento con ZeLan concuerda con investigaciones previas que demuestran las propiedades antiandrogénicas de extractos botánicos que contienen flavonoides y compuestos fenólicos16. Una revisión exhaustiva de estudios clínicos con medicina herbal en el síndrome de ovario poliquístico (SOP) ha resumido mejoras endocrinas y metabólicas tras diversas intervenciones botánicas17. El mecanismo mediante el cual ZeLan modula la biosíntesis de andrógenos podría implicar efectos directos sobre las vías esteroidogénicas ováricas, efectos antiinflamatorios sistémicos y sensibilización a la insulina, o efectos indirectos asociados con los metabolitos microbianos intestinales, y el diseño actual no puede separar completamente estas posibilidades. La mejora en la relación LH/FSH indica una restauración parcial de la función del eje hipotálamo-hipófisis-gónada, que comúnmente se encuentra desregulado en el SOP18. Revisiones sistemáticas de experimentos en animales con fórmulas de medicina tradicional china para el SOP también han reportado mejoras en los índices reproductivos y endocrinos19. La mejora simultánea en los índices relacionados con la insulina sugiere que ZeLan podría ejercer beneficios metabólicos más allá de la regulación endocrina, posiblemente mediante una señalización periférica de insulina mejorada o una reducción de mediadores inflamatorios que afectan la función del receptor de insulina20.
La restauración de la diversidad alfa microbiana intestinal tras el tratamiento con ZeLan es consistente con una respuesta asociada al microbioma. La reducción de la diversidad alfa observada en ratas modelo de SOPQ es coherente con la creciente cantidad de literatura que documenta la disbiosis intestinal tanto en modelos experimentales de SOPQ como en poblaciones clínicas21. Insenser et al. informaron además de que los perfiles de la microbiota intestinal en el SOPQ están influenciados por el sexo, las hormonas sexuales y la obesidad22. Nuestra observación de que el tratamiento con ZeLan restauró parcialmente el índice de Shannon de 4,19 a 5,79 sugiere que este extracto botánico podría favorecer la estructura de la comunidad microbiana. Se han descrito efectos similares de restauración de la diversidad para otros extractos vegetales ricos en polifenoles, que podrían promover selectivamente poblaciones bacterianas beneficiosas mientras suprimen taxones potencialmente patógenos23. Los cambios taxonómicos observados a nivel de filo, particularmente la reducción de la relación Firmicutes a Bacteroidetes tras el tratamiento con ZeLan, son relevantes dada la asociación establecida entre relaciones F/B elevadas y disfunción metabólica, incluyendo obesidad y resistencia a la insulina24. Estudios adicionales, incluyendo el trabajo de Jobira et al. en adolescentes con SOPQ, han reportado una biodiversidad microbiana gastrointestinal alterada, lo que respalda la relevancia biológica de la composición microbiana en el metabolismo del huésped25.
La identificación de géneros bacterianos específicos asociados diferencialmente con el SOP y el tratamiento con ZeLan proporciona un contexto biológico para las asociaciones microbiota-metaboloma observadas en este estudio. El enriquecimiento de Lactobacillus y Ruminococcus en los controles sanos y su disminución en los animales con SOP es consistente con informes previos que destacan los roles protectores de estos géneros.26Las especies de Lactobacillus son reconocidas por producir ácido láctico y péptidos antimicrobianos que mantienen la integridad de la barrera intestinal y suprimen bacterias patógenas, mientras que las especies de Ruminococcus son productoras importantes de ácidos grasos de cadena corta mediante la fermentación de la fibra dietética.27. La restauración de estos géneros beneficiosos tras el tratamiento con ZeLan podría mejorar la función de la barrera intestinal y potenciar la actividad metabólica relacionada con los ácidos grasos de cadena corta (AGCC), como se refleja en los niveles aumentados de ácido butírico observados en el análisis metabolómico. Por el contrario, la mayor abundancia de Bacteroides, Prevotella y Escherichia en los animales con SOP coincide con estudios que implican a estos géneros en trastornos inflamatorios y metabólicos.28. Las especies de Escherichia, particularmente Escherichia coli, pueden producir lipopolisacárido, que podría desencadenar inflamación sistémica y resistencia a la insulina mediante la señalización del receptor tipo Toll 4, lo que representa un vínculo plausible entre la disbiosis intestinal y la disfunción metabólica asociada al síndrome de ovario poliquístico29.
Los hallazgos metabolómicos proporcionan evidencia de asociaciones metabólicas entre la microbiota intestinal y el huésped que acompañan al tratamiento con ZeLan. Los cambios en los ácidos biliares secundarios, como el ácido litocólico, son biológicamente relevantes porque estos metabolitos se generan mediante la actividad enzimática bacteriana30. Los ácidos biliares desempeñan funciones no solo en la absorción de lípidos, sino también como moléculas señalizadoras que regulan el metabolismo de la glucosa y de los lípidos a través del receptor X farnesoide y del receptor acoplado a proteína G Takeda 5, lo que sugiere que la normalización de los perfiles de ácidos biliares podría contribuir a una mejoría en la homeostasis metabólica. De manera similar, la recuperación de los niveles de ácido butírico es relevante dadas sus múltiples efectos beneficiosos, entre ellos la mejora de la función de la barrera intestinal, propiedades antiinflamatorias y la promoción de la sensibilidad a la insulina. Las correlaciones observadas entre bacterias beneficiosas y metabolitos protectores, en contraste con las asociaciones entre bacterias patógenas y metabolitos dañinos, aportan apoyo asociativo a la hipótesis del eje intestino-ovario, al tiempo que subrayan la necesidad de una validación mecanicista directa.
Las implicaciones clínicas de estos hallazgos deben interpretarse dentro de los límites del diseño exploratorio preclínico. Los resultados respaldan la evaluación adicional del extracto de ZeLan como un enfoque complementario para el manejo del SOP, particularmente en el contexto de intervenciones botánicas que puedan afectar tanto los índices endocrino-metabólicos como el microambiente intestinal. La identificación de biomarcadores microbianos y metabólicos asociados a la respuesta al tratamiento podría ayudar a orientar futuros estudios mecanicistas y traslacionales. Además, el eje intestino-ovario podría eventualmente sustentar estrategias combinadas que integren ZeLan con probióticos o modificaciones dietéticas, aunque tales estrategias requieren validación controlada antes de su aplicación clínica.
Varias limitaciones del presente estudio requieren reconocimiento. En primer lugar, aunque el modelo de rata inducido con DHEA recapitula varias características del PCOS humano, no captura completamente la heterogeneidad de los fenotipos del PCOS humano, incluyendo los subtipos delgado, obeso, resistente a la insulina e inflamatorio; por lo tanto, la traducción clínica requiere validación en poblaciones de pacientes bien caracterizadas. En segundo lugar, el estudio utilizó una única dosis de ZeLan sin un gradiente de dosis-respuesta ni un control farmacológico positivo como la metformina, por lo que el rango de dosis eficaz, la eficacia comparativa y el ciclo óptimo de administración permanecen por determinar. En tercer lugar, el muestreo se realizó únicamente al final del estudio, lo que limita la interpretación de los cambios temporales dinámicos en la microbiota, metabolitos y perfiles hormonales durante el período de intervención. En cuarto lugar, la histopatología ovárica, el conteo de folículos, la cuantificación del cuerpo lúteo y el monitoreo seriado del ciclo estral no se incluyeron en este diseño experimental; por lo tanto, la recuperación funcional ovárica se infirió a partir de índices endocrinos y metabólicos en lugar de evaluaciones directas a nivel tisular y del ciclo. En quinto lugar, el estudio identificó correlaciones entre taxones microbianos y metabolitos, pero no incluyó trasplante de microbiota fecal, experimentos con animales libres de gérmenes, suplementación dirigida de metabolitos, ensayos de marcadores inflamatorios ni mediciones de enzimas esteroidogénicas ováricas como CYP17A1, CYP19A1 y StAR; en consecuencia, los mecanismos causales no pueden confirmarse con los datos actuales. En sexto lugar, la metabolómica no dirigida proporciona evidencia a nivel de descubrimiento, y se requiere en trabajos futuros la validación cuantitativa dirigida de metabolitos clave como el ácido litocolico, el ácido butírico y la testosterona. En séptimo lugar, no se dispuso de visualización de la diversidad beta, predicción funcional microbiana ni modelado integrado de las vías microbiota-metabolito-gen para la presente entrega, lo que limita la capacidad de construir una red reguladora completa. Finalmente, el extracto de ZeLan se estandarizó según el contenido total de flavonoides, pero aún es necesario un caracterización fitoquímica cualitativa y cuantitativa exhaustiva de los monómeros activos.
En conclusión, el extracto de ZeLan mejoró los fenotipos endocrinos y metabólicos relacionados con el SOP en un modelo de rata y se asoció con la restauración parcial de la diversidad alfa microbiana intestinal, cambios en la composición microbiana y la modulación de vías metabólicas séricas, incluyendo la biosíntesis de hormonas esteroides, el metabolismo de ácidos biliares y el metabolismo relacionado con ácidos grasos de cadena corta. Las correlaciones observadas entre bacterias beneficiosas y metabolitos protectores, en contraste con las asociaciones entre bacterias enriquecidas en el SOP y metabolitos dañinos, respaldan una asociación biológicamente plausible del eje intestino-ovario. Estos hallazgos proporcionan una base para futuros estudios mecanicistas y traslacionales del extracto de ZeLan en el manejo del SOP, al tiempo que enfatizan la necesidad de validación causal y una caracterización fitoquímica más amplia.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por el Proyecto de Planificación de Investigación Científica de la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Hebei (Número de subvención: 2021316).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acetonitrilo | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A955-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; fase móvil y reconstitución de muestras |
| Columna ACQUITY UPLC HSS T3 | Waters Corporation | 186003539 | 100 Å, 1,8 μm, 2,1 × 100 mm; separación UHPLC |
| Sistema de electroforesis en gel de agarosa | Bio-Rad Laboratories | 1704486 | Sistema de electroforesis horizontal Mini-Sub Cell GT; evaluación de la calidad del ADN |
| Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS | Agilent Technologies | G7120A/G7167B/G7116B/G6550B | Módulo UHPLC 1290 Infinity II acoplado al espectrómetro de masas Q-TOF 6550 iFunnel; plataforma de metabolómica no dirigida en suero |
| Algoritmo DADA2 | Bioconductor | Version 1.24.0 | Generación de variantes de secuencia amplicónica (ASV) y eliminación de quimeras; versión inferida para coincidir con el flujo de trabajo R 4.2.1/Bioconductor 3.15 |
| Dehidroepiandrosteroona (DHEA) | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | D4000 | Inducción del modelo de SOP; 6 mg/100 g de peso corporal; CAS 53-43-0 |
| Agua destilada | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | 10977015 | Agua destilada UltraPure libre de DNasa/RNasa; vehículo para la administración por gavaje oral en los grupos Control y Modelo |
| Ácido fórmico | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A117-50 | Grado Optima LC-MS, 50 mL; aditivo al 0,1 % para fases móviles de LC-MS |
| Base de datos del Metaboloma Humano | University of Alberta / HMDB | HMDB 5.0 | Base de datos de anotación de metabolitos |
| Plataforma Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | 20012850 | Sistema de secuenciación utilizado por el proveedor de servicios de secuenciación para secuenciación de ARNr 16S de 250 pb emparejada |
| Hierba de Lycopus lucidus Turcz. | Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd. | Lote ZL-20230315 | Material vegetal bruto autenticado para el extracto acuoso ZeLan |
| Metanol | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A456-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; precipitación de proteínas para metabolómica en suero |
| Base de datos METLIN | Scripps Research | METLIN Classic 2023 | Base de datos de anotación de espectros de masas de metabolitos |
| Espectrofotómetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen NanoDrop One; evaluación de la cantidad y pureza del ADN |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51604 | Extracción de ADN de contenidos cecales; kit de ADN fecal para 50 preparaciones |
| QIIME2 | Equipo de desarrollo de QIIME2 | Version 2022.2 | Procesamiento de secuencias de ARNr 16S |
| Software R | R Foundation | Version 4.2.1 | Análisis estadístico y procesamiento con XCMS |
| Kits ELISA en suero para testosterona, LH, FSH e insulina | Cusabio Biotech | CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r | Kits ELISA para testosterona, LH, FSH e insulina en rata para cuantificación de hormonas e insulina en suero |
| Aceite de sésamo | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | S3547 | Vehículo para inyección de DHEA |
| Pentobarbital sódico | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | P3761 | Anestesia; 50 mg/kg por vía intraperitoneal |
| Software SPSS | IBM Corporation | Version 26.0 | Análisis estadístico |
| Primers universales de ARNr 16S 338F/806R | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Síntesis personalizada: 338F/806R | Amplificación de las regiones V3-V4; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
| Paquete XCMS | Bioconductor / R | Version 3.18.0 | Detección de picos, alineación de tiempos de retención e integración |
| Extracto ZeLan | Extracto acuoso preparado internamente | Lote ZLE-20230402 | Tratamiento por gavaje oral; flavonoides totales estandarizados ≥2,5 % |
Referencias
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