Análisis cuantitativo 3D no destructivo del ligamento periodontal residual en premolares humanos extraídos mediante escaneo intraoral

Resumen

Este protocolo detalla un método digital 3D cuantitativo y no destructivo para evaluar el ligamento periodontal residual en dientes extraídos. Utilizando escaneo intraoral y software de ingeniería inversa, establecimos un flujo de trabajo ex vivo para la evaluación periodontal, proporcionando una base metodológica para comparar técnicas de extracción en la investigación preclínica.

Resumen

La replantación intencionada de dientes es un tratamiento valioso para preservar los dientes naturales con lesiones endodónticas. Su éxito depende críticamente de la viabilidad e integridad estructural del ligamento periodontal residual (PDL). Los métodos tradicionales de evaluación, como la sección histológica o la fotografía bidimensional, son destructivos o están limitados por errores de proyección. Para abordar estas limitaciones, este protocolo presenta un método cuantitativo no destructivo para evaluar PDL residual utilizando escaneo intraoral de alta precisión. Se teñieron dientes extraídos para visualizar el tejido PDL y se escanearon tridimensionalmente para generar modelos digitales de alta fidelidad. Los datos se analizaron mediante software de ingeniería inversa, donde se definía una región de interés y la cobertura residual de PDL se cuantificaba mediante umbral de color. Este enfoque calculó la verdadera área de cobertura 3D del PDL sin comprometer la muestra biológica. Para evaluar la sensibilidad y utilidad de este protocolo, se aplicó para comparar extracciones mínimamente invasivas (MI) utilizando periotomas frente a extracciones convencionales con pinzas. El análisis digital reveló que el método MI preservaba significativamente más tejido PDL (61,99%) que el método convencional (50,46%). Además, un ensayo de viabilidad celular posterior corroboró los hallazgos digitales, demostrando una actividad metabólica significativamente mayor en el grupo de MI. En última instancia, este trabajo establece un flujo de trabajo de prueba de concepto para la evaluación cuantitativa de PDL ex vivo , proporcionando una base metodológica sólida para comparar técnicas de extracción en investigación preclínica.

Introducción

La replantación dental intencionada se reconoce cada vez más como una modalidad viable de tratamiento de último recurso para preservar dientes naturales que de otro modo serían considerados desesperanzados. Está indicado para el manejo de lesiones periapicales persistentes, perforaciones inaccesibles del canal o lesiones resorptivas extensas que no pueden gestionarse de forma no^{quirúrgica 1,2}. El procedimiento estándar implica la extracción intencionada del diente afectado, seguida de una inspección visual extraoral, intervención terapéutica (incluyendo resección de extremos de raíz, preparación y empaste de extremidad de raíz) y posterior replantación en el alveolo^{original 1,2}.

La presencia e integridad de tejido viable del ligamento periodontal residual (PDL) en la superficie radicular son los factores pronósticos más críticos que determinan el patrón de cicatrización tras la replantación dental ^3,4. Una barrera de PDL sana e intacta es esencial para restablecer la movilidad fisiológica y prevenir complicaciones como la reabsorción de reemplazo (anquilosis) o la reabsorción inflamatoria de raíces. Sin embargo, la avulsión de un diente desde el alveolo alveolar, ya sea traumática o intencionada, interrumpe inherentemente la unión de la fibra PDL y corta el suministro^{neurovascular 5}. En consecuencia, la reconstrucción biológica de la PDL es crucial para la cicatrización periodontal de los dientes^{replantados 3}. Investigaciones extensas han demostrado que maximizar la vitalidad y el volumen del tejido residual de PDL durante procedimientos clínicos extraorales constituye un factor pronóstico crítico, y su importancia para la supervivencia funcional a largo plazo de los dientes replantados está bien documentada en la literatura ^6,7.

Dado que la extracción interrumpe inherentemente la unión de la PDL, la elección de la técnica de extracción influye directamente en el volumen y la viabilidad del tejido residual de PDL que queda en la superficie radicular. La extracción convencional con pinzas aplica fuerzas rotacionales y de tracción que pueden aplastar la PDL contra el hueso alveolar o desgastarla por fricción. Para minimizar este trauma, se han desarrollado métodos de extracción mínimamente invasivos (IM). Estudios previos han informado que los métodos de MI pueden reducir significativamente el trauma quirúrgico en el periodonto de los dientes^afectados. Se han desarrollado técnicas que utilizan periotomas para romper la unión del PDL, o sistemas de extracción vertical que evitan fuerzas de palanca, para preservar el PDL residual en la superficie radicular. Por ejemplo, los informes de casos han documentado mejoras en los resultados clínicos en la replantación intencionada de dientes y la extrusión quirúrgica cuando se emplearon sistemas de IM ^9,10. Estos hallazgos sugieren que minimizar los traumatismos de extracción puede mejorar la retención del tejido residual de PDL en la superficie radicular.

Sin embargo, a pesar del consenso clínico sobre los beneficios de la extracción no traumática, existe poca evidencia directa que cuantifique la extensión del tejido residual de PDL preservado al utilizar métodos de MI en comparación con las técnicas convencionales. Esta brecha de conocimiento proviene en gran medida de las limitaciones de las metodologías de evaluación disponibles. La investigación existente emplea predominantemente métodos de evaluación subjetiva o destructiva para evaluar el PDL residual en la superficie radicular. La sección histológica sigue siendo el estándar para el análisis^{celular 11}, pero es inherentemente destructiva, haciendo que la muestra no sea utilizable para estudios posteriores. Alternativamente, se ha utilizado tinción combinada con fotografía bidimensional (2D) para caracterizar el PDL¹² residual. Sin embargo, estos métodos son insuficientes para cuantificar el tejido residual de PDL de toda la superficie radicular. Una fotografía 2D no puede mapear con precisión el área superficial de una raíz tridimensional compleja y curva; inevitablemente introduce errores de proyección y distorsión, lo que conduce a cuantificaciones inexactas.

En los últimos años, la tecnología de escaneo digital intraoral ha avanzado significativamente, ofreciendo alta precisión y adquisición rápida de datos. El método digital se ha empleado en estudios previos para medir impresiones y cambios en tejidos blandos, o para evaluar el desgaste dental en jóvenes¹³ años. Las aplicaciones incluso se han ampliado a análisis volumétricos complejos, como la evaluación de la inflamación facial en cirugía^{oral 14}. Estas tecnologías permiten la creación de modelos tridimensionales (3D) de alta fidelidad que pueden manipularse y medirse en software de ingeniería inversa, ofreciendo una posible solución para un análisis cuantitativo no destructivo. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha explorado la posible aplicación de la exploración intraoral para evaluar el PDL residual de dientes extraídos.

El objetivo general de este protocolo es establecer un flujo de trabajo estandarizado y no destructivo que combine la tinción biológica con escaneo intraoral de alta precisión y ingeniería inversa 3D. Al crear modelos digitales de alta fidelidad con mapas superficiales texturizados por color, este método permite una medición más objetiva y reproducible del PDL residual a lo largo de toda la superficie de la raíz. Este estudio aplica el flujo de trabajo propuesto para comparar la cobertura residual de PDL de dos técnicas de extracción, la extracción de MI asistida por periotoma frente a la extracción convencional con pinzas, en premolares humanos. Se plantea la hipótesis de que el método MI preserva una mayor proporción de cobertura residual de PDL que el método convencional.

Es importante destacar que este protocolo está diseñado estrictamente como una herramienta de investigación ex vivo para entornos de laboratorio o preclínicos. El procedimiento implica tinción, secado al aire, escaneo digital y segmentación basada en software, con un tiempo total de análisis incompatible con el uso intraoperatorio durante la replantación intencionada, donde debe minimizarse el tiempo extraoral. En consecuencia, este método es adecuado para (i) comparar la eficacia de preservación de PDL de diferentes técnicas de extracción bajo condiciones controladas; (ii) formación y calibración en entornos educativos; y (iii) estudios de validación que vinculen métricas de cobertura de PDL digitales con resultados biológicos. Su aplicabilidad a dientes con múltiples raíces y anatomías complejas requiere una investigación adicional.

Protocolo

El protocolo de investigación se realizó cumpliendo con las directrices del Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de la Universidad de Pekín (PKUSSIRB-202054022).

1. Selección de pacientes y asignación de grupos

1. Seleccionar pacientes que requieren extracción de premolares con fines ortodóncicos. Asegúrate de que los premolares cumplan los criterios de inclusión sin caries ni enfermedad periodontal.
2. Excluyan a los pacientes con hipertensión, diabetes, antecedentes de tabaquismo o aquellos menores de 16 años o mayores de 45 años.
3. Asignar aleatoriamente los premolares en dos grupos experimentales: el Grupo Control (extracción convencional) y el Grupo Mínimamente Invasivo (MI) (extracción asistida por periotoma).
4. Asignar aleatoriamente los dientes de cada grupo a la vía de análisis de escaneo 3D o a la vía de validación biológica (CCK-8), asegurando que se utilicen muestras independientes para cada método de evaluación.

2. Procedimientos de extracción dental

1. Realizar todas las extracciones bajo anestesia local estándar.
2. Método A: Extracción convencional (grupo de control)
   1. Realiza la separación gingival alrededor del cuello del diente.
   2. Coloca las pinzas dentales en la zona cervical de la corona dental.
   3. Aplica fuerzas de rotación hasta que el diente se afloje. Extrae el diente del alveolis usando las pinzas.
3. Método B: Extracción mínimamente invasiva (grupo MI)
   1. Realizar separación gingival.
      PRECAUCIÓN: Manipula el periotoma con cuidado para evitar lesiones en tejidos blandos o roturas de instrumentos.
   2. Inserta un periotoma en el espacio PDL lo más profundo posible, alcanzando al menos dos tercios de la longitud de la raíz.
   3. Secciona circunferencialmente las fibras PDL alrededor de la raíz usando el periotoma. Afloja el diente.
   4. Saca verticalmente el diente de la alveola usando pinzas dentales.

3. Preparación y tinción de muestras

1. Inmediatamente después de la extracción, enjuaga los dientes con solución salina estéril durante 10 minutos para eliminar sangre y restos.
   PRECAUCIÓN: El azul de toluidina es un químico peligroso. Lleva el equipo de protección personal adecuado (guantes, gafas) al manipularlo.
2. Tingue la superficie radicular sumergiendo el diente en una solución azul de toluidina al 0,1% (preparada en solución salina tamponada con fosfato, PBS) durante 40 minutos para visualizar el tejido PDL.
3. Enjuaga con suero fisiológico durante 10 minutos para eliminar la solución del tinte y seca suavemente la superficie con una jeringuilla de tres vías para eliminar el exceso de humedad.
   NOTA: Se espera que la superficie radicular muestre una coloración uniforme azul-púrpura, mientras que el cemento expuesto debe permanecer sin manchas, mostrando un beige claro.

4. 3D Escaneo digital

1. Calibra el escáner digital intraoral según las instrucciones del fabricante para asegurar una precisión de 0,02 mm.
2. Asegura la corona dental usando pinzas hemostáticas para evitar obstruir la vista de la superficie de la raíz.
3. Escanea toda la superficie radicular bajo condiciones estándar de escaneo. Realiza un escaneo complementario de la corona para completar el modelo 3D.
4. Utilizar el software propietario del escáner para exportar los datos de escaneo digital como un archivo de objeto 3D (OBJ) de alta resolución y paquete de datos asociado; la imagen de la textura se guarda en formato JPG.
   NOTA: La vista previa del escaneo en vivo debe mostrar una malla continua y de alta densidad, sin agujeros ni artefactos en la superficie de la raíz. La imagen de la textura debe distinguir claramente las zonas teñidas de azul de la superficie de la raíz sin teñir.

5. 3D reconstrucción de modelos y análisis cuantitativo

1. Preprocesamiento de imágenes
   1. Calibración de umbral
      1. Importa el mapa de texturas JPG en un software de edición de imágenes. Convierte la imagen a escala de grises de 8 bits.
      2. Abre la herramienta Umbral (Imagen > Ajustar > Umbral) e inspecciona el histograma para registrar el valor mínimo en escala de grises que capture todos los píxeles PDL teñidos de azul. Determinar el umbral mínimo en escala de grises usando tres observadores independientes.
   2. Importa el mapa de texturas JPG original en un software de edición de imágenes. Navega para seleccionar > rango de colores. Elige el modo Sombras y pon Rango en 65 y Tolerancia en 20% (calibrado a partir de los datos umbral 5.1.1).
      NOTA: Verifique que todas las regiones de PDL teñidas de azul estén completamente seleccionadas y que no haya ninguna superficie radicular sin teñir.
   3. Copia las regiones seleccionadas teñidas de azul y pégalas sobre una nueva capa blanca para generar una máscara binaria (azul para PDL, blanco para raíz desnuda). Guarda la imagen de textura procesada para sobreescribir el archivo JPG original.
2. Medición cuantitativa
   1. Importa el modelo 3D procesado en un software de ingeniería inversa.
   2. Utiliza Polígonos > Recorte para definir la Región de Interés (ROI) y así excluir tejidos gingivales y periapicales. Fija el límite superior del ROI a 2 mm por debajo de la unión cementoesmalte (CEJ). Excluye el apical de 3 mm del análisis.
   3. Selecciona las "regiones azules mejoradas" dentro del ROI. Tras la selección, el tejido residual de PDL se acentúa en rojo.
   4. Navega a Análisis > Cálculo > Área de Cálculo para calcular el área superficial total del ROI y el área superficial de las regiones azules (PDL residual).
   5. Calcula el porcentaje de cobertura PDL usando la Ecuación 1:
      Cobertura PDL (%) = (Área de PDL residual/Área total de ROI) x 100
3. Visualización
   1. Capturar imágenes de las cuatro superficies radiculares (bucal, lingual, mesial y distal) perpendiculares al eje dental para una evaluación visual detallada.

6. Validación biológica (ensayo de viabilidad celular)

NOTA: Esta sección describe los pasos de validación realizados en un subconjunto de muestras (n = 8 por grupo) para corroborar el análisis digital.

1. Inmediatamente después de la extracción, colocar los dientes en un tubo centrífugo estéril que contenga un medio de cultivo precalentado (37 °C).
2. Transporta las muestras al laboratorio en una nevera a 4°C en menos de 1 hora. Utiliza el Medio Águila Modificado de Dulbecco, complementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina de 100 U/mL y 100 μg/mL de estreptomicina para el transporte de muestras y pruebas de viabilidad celular.
3. Enjuaga los dientes con solución fisiológica estéril tamponada con fosfato (PBS) en un armario de bioseguridad inmediatamente al llegar.
4. Raspa cuidadosamente el tejido PDL del tercio medio de la raíz (ROI se define por sonda periodontal graduada) utilizando una hoja de bisturí estéril a temperatura ambiente en un plazo de 10 minutos desde la llegada para maximizar la viabilidad celular.
5. Digiera el tejido recogido con tripsina-EDTA al 0,25% durante 30 minutos. Centrifugar la suspensión de la celda a 120 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente (22–25 °C) para obtener el precipitado que contiene la celda.
   NOTA: Tras la centrifugación, debe formarse una pelota blanca visible en la parte inferior del tubo. Si no se observa ningún pellet, la muestra debe ser centrifugada de nuevo a 120 × g durante 1 minuto adicional.
6. Resuspende el precipitado en una mezcla de solución de 600 μL Kit de Conteo de Celas-8 (CCK-8) y medio en una proporción 1:10 (v/v), preparada según las instrucciones del fabricante.
7. Aloca esta suspensión a 200 μL por pozo en una placa de 96 pozos (3 réplicas técnicas por muestra). Incubar la placa a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ durante 3 horas.
8. Transfiere 50 μL del sobrenadante de cada pozo a una nueva placa de 96 pozos.
9. Mide la absorbancia (Densidad Óptica, OD) a 450 nm usando un lector de microplacas. Registra los valores medios de OD para una comparación estadística.
   PRECAUCIÓN: (i) Recoger la solución de tinción de azul de toluidina y enjuagar los residuos como residuos químicos peligrosos y desecharlos según las directrices institucionales de seguridad química; (ii) Tratar tejido de PDL, bisturí utilizado y residuos de cultivo celular como residuos biológicos peligrosos (Nivel de Bioseguridad 1) y autoclavarlos o incinerarlos según los protocolos institucionales de bioseguridad; (iii) Desechar el EPI (guantes, puntas de pipeta, papel de cocina) en recipientes designados para riesgos biológicos.

7. Análisis estadístico y validación metodológica

1. Recogida de datos: Compilar los datos cuantitativos, incluyendo el área total de la superficie radicular (mm²), el área total teñida (mm²) del análisis 3D, el porcentaje de cobertura de PDL (%) y los valores de OD del ensayo biológico.
2. Test de normalidad: Evalúa la distribución de datos para la normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk.
3. Comparación de grupos:
   1. Compara la cobertura de PDL y los valores de OD entre los grupos MI y Control.
   2. Utilice una prueba Student no emparejada para datos normalmente distribuidos o una prueba Mann-Whitney U para datos no distribuidos normalmente.
   3. Calcula el tamaño del efecto (d de Cohen) para determinar la magnitud de la diferencia.
4. Análisis de robustez metodológica:
   1. Realizar un análisis de regresión lineal con "Área de Superficie Raíz" como variable independiente y "Cobertura PDL" como variable dependiente.
   2. Calcula el coeficiente de correlación de Pearson (r) para evaluar si el método de medición está sesgado por el tamaño del diente. Una correlación no significativa (P > 0,05) indica robustez.
5. Análisis de fiabilidad:
   1. Genera diagramas de violín combinados con diagramas de caja para visualizar la densidad de probabilidad y las características de distribución de los datos.
   2. Compara la forma y concentración de la distribución de datos entre grupos.
6. Pruebas de fiabilidad intra-observador e inter-observador:
   1. Selecciona aleatoriamente 16 muestras del conjunto total de datos (8 por grupo) para la evaluación de la fiabilidad.
   2. Para la repetibilidad intra-observador, se repite el procedimiento completo de segmentación y medición en las mismas 16 muestras a intervalos de una semana, para un total de dos ensayos.
   3. Para el acuerdo entre observadores, proporcionar formación estandarizada a dos observadores independientes adicionales sobre el protocolo de segmentación.
   4. Que los tres observadores realicen de forma independiente la definición del ROI, el umbral de color y el cálculo de área en las mismas 16 muestras.
   5. Calcular el Coeficiente de Correlación Intraclase ICC(A,1) con intervalos de confianza del 95% para cuantificar la concordancia absoluta tanto en comparaciones intra-observadores como entre observadores. Informes ICC valoran >0,90 como excelentes, 0,75–0,90 como buenos, 0,50–0,75 como moderados y <0,50 como pobres.
   6. Realizar análisis de Bland-Altman para todas las comparaciones por pares. Calcula la diferencia media (sesgo) y los límites del 95% de concordancia (diferencia media +/- 1,96 de la diferencia de inversión). Un resultado no significativo de la prueba t pareada (P > 0,05) indica un sesgo sistemático despreciable.
7. Software: Realizar todos los análisis estadísticos utilizando el software adecuado. Consideremos P < 0,05 como estadísticamente significativo.

Resultados

El flujo de trabajo experimental establecido en este estudio demostró con éxito un protocolo no destructivo para la evaluación cuantitativa de PDL residual en dientes extraídos. Según se detalla en el diseño experimental (Figura 1), el protocolo integraba procedimientos de extracción clínica con adquisición digital y validación biológica. La aplicación del escaneo digital intraoral, seguida de ingeniería inversa 3D, permitió una reconstrucción precisa de la ...

Discusión

El éxito de la replantación intencionada depende fundamentalmente de la preservación de células PDL viables en la superficie radicular. Aunque los métodos de extracción de MI han sido defendidos clínicamente para reducir el trauma ^8,9,10, cuantificar su beneficio biológico en tejido residual de PDL ha seguido siendo un desafío debido a la falta de herramientas objetivas de evaluación. Este estud...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
96-well plate	Servicbio	CCP-96H	Placa de multi-pocillo para cultivo celular y medición de absorbancia
Gabinete de bioseguridad	Thermo Fisher Scientific	1300 Series4 A2	Gabinete de seguridad biológica Clase II para procedimientos estériles
Kit de conteo celular-8 (CCK-8) solución	MedChemExpress	HY-K0301	Reactivo de ensayo de viabilidad celular
Centrífuga	Ustc Zonkia Zcientific Instruments	SC-3610	Centrífuga de laboratorio para precipitación celular
Medio de cultivo	Gibco	DMEM 11965	Medio basal para transporte e incubación celular
Pinza dental	Jinzhong Surgical instruments	K0F130/K0F100	Instrumento estándar de extracción dental
Suero fetal bovino	Anhui Kangyuan Biotechnology Co., Ltd	KY-01003S	Suplemento de suero fetal bovino para medio de cultivo
Probador periodontal graduado	Jinzhong Surgical instruments	K6F040	Ayuda a raspar el PDL del tercio medio de la raíz
Pinza hemostática	Jinzhong Surgical instruments	J31130	Instrumento quirúrgico utilizado para asegurar el diente durante el escaneo
Incubadora humidificada	Thermo Fisher Scientific	Forma	Incubadora de cultivo celular mantenida a 37°C con 5% CO2
Software de edición de imágenes	Adobe Systems Inc.	Adobe Photoshop CC 2018	Software para selección de color
Software de edición de imágenes	Wayne Rasband, National Institutes of Health	ImageJ2 v2.14.0	Software para umbral de color
Escáner digital intraoral	Aidite (Qinhuangdao) Technology Co., Ltd.	Aidite Cameo	Escáner óptico para adquisición de modelo digital 3D
Anestesia local	Produits Dentaires Pierre Rolland	Primacaine Articaine	Agente anestésico dental (por ejemplo, Articaine o Lidocaína)
Lector de microplacas	Biotek	Elx808	Espectrofotómetro para medir OD a 450 nm
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15070063	Suplemento antibiótico para medio de cultivo
Periotomo	Carl Martin	LS529PT	Instrumento de extracción mínimamente invasivo
Software de ingeniería inversa	Geomagic Inc.	Geomagic Studio 2013	Software de modelado 3D para cálculo de área superficial
Tubo de centrífuga estéril	Servicbio	EP-1500-J	Tubo de plástico para recolección y procesamiento de muestras
Solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS)	Gibco	10010	Tampon de lavado para muestras biológicas
Lámina de bisturí estéril	Jiayuan Medical Devices	Lámina de bisturí estéril	Lámina para raspado de tejido PDL
Salina estéril	Servicbio	G4702-500ML	Solución salina para enjuague de dientes extraídos
Azul de toluidina	Proveedor de laboratorio general	Azul de toluidina (solución 0.1%)	Tinte biológico para visualización del ligamento periodontal
Tripsina	Gibco	25200056	Reactivo enzimático para digestión de tejido