Una ventana de cráneo ópticamente transparente montada en la cabeza (HOTS) para la imagen transcraneal profunda de la corteza del ratón

Resumen

Este protocolo describe una ventana de cráneo ópticamente transparente montada en la cabeza (HOTS) basada en un procedimiento optimizado de limpieza del cráneo en dos pasos. Este enfoque produce un cráneo altamente transparente, permitiendo la imagen de dos fotones de la corteza cerebral adulta del ratón a profundidades de hasta ~800 μm.

Resumen

La imagen de dos fotones de alta resolución de la corteza cerebral del ratón adulto está severamente limitada por la dispersión de luz desde el cráneo, que atenúa las señales y restringe la profundidad de imagen in vivo. Aunque se han desarrollado métodos de limpieza del cráneo para proporcionar acceso óptico a la corteza a través del cráneo intacto, su rendimiento práctico está limitado por el tiempo limitado de limpieza y cócteles de limpieza subóptimos. Aquí presentamos un protocolo detallado para implementar una ventana de cráneo ópticamente transparente montada en la cabeza (HOTS). En este enfoque, se utilizaba una gorra montada en la cabeza para mantener las soluciones de limpieza sobre el cráneo, evitando así la anestesia prolongada o la sujeción física, y permitiendo un despeje prolongado (varias horas) en ratones despiertos y que se comportan libremente. Además, se realizó un procedimiento de eliminación en dos pasos utilizando reactivos (HOTS-S1: 10% en peso/v EDTA, 15% en peso/v D-manosa, 10% en peso/v sulfolano, 0,5% en peso/v Tween 20; HOTS-S2: 70% en peso/v D-manosa, 5% en peso/v sulfolano, 0,5% en peso/v Tween 20) optimizado mediante cribado químico sistemático. Proporcionamos un protocolo paso a paso que incluye la exposición y estabilización del cráneo, la creación y montaje de la tapa montada en la cabeza, la administración y renovación de los reactivos de limpieza, y la posterior preparación por imágenes. En ratones de 6 semanas (~20 g), el protocolo HOTS produce rutinariamente un cráneo altamente transparente que permite la imagen de dos fotones de las estructuras corticales hasta profundidades de hasta ~800 μm por debajo del pia, aproximadamente al rendimiento de ventanas de cráneo abiertas. La ventana HOTS permite la imagen estructural en ratones Thy1-GFP-M y la imagen funcional de calcio en ratones Thy1-GCaMP6. Creemos que, como un enfoque conveniente y mínimamente invasivo, la ventana HOTS facilitará significativamente la imagen transcraneal profunda y las manipulaciones optogenéticas, fotofarmacológicas y otras basadas en la luz in vivo.

Introducción

El monitoreo intravital de las neuronas corticales es esencial para comprender la estructura y función cerebral¹. La microscopía de dos fotones (TPM) es una herramienta clave para estudios in vivo^{de este tipo 2,3}. Sin embargo, su calidad y profundidad de imagen están severamente limitadas por una fuerte dispersión de luz desde el cráneo opaco que recubre la^{corteza 4,5}.

Las ventanas de cráneo^{abierto 6} y de cráneo delgado ^7,8 han mejorado mucho el acceso óptico a la corteza y se utilizan ampliamente, pero ambos enfoques tienen limitaciones inherentes. Las ventanas abiertas del cráneo pueden inducir lesiones cerebrales agudas y respuestas^{inflamatorias 9,10}, mientras que el adelgazamiento del cráneo es técnicamente exigente y difícil de lograr un grosor uniforme^11,12.

Las técnicas de limpieza óptica in vivo del cráneo ofrecen una alternativa mínimamente invasiva que permite la imagen de dos fotones a resolución axónica en ratones adultos. Sin embargo, la profundidad de imagen alcanzable sigue siendo limitada (típicamente 150–400 μm por debajo del pia)12,13,14,15. En la práctica, el clearing craneal suele limitarse a un corto periodo bajo anestesia con fijación rígida de la cabeza, y la optimización sistemática de cócteles de limpieza para la composición ósea del cáneo ha permanecido poco^explorada 12,13,14,15.

Para superar estas limitaciones, anteriormente desarrollamos una ventana de cráneo ópticamente transparente montada en la cabeza (HOTS) que permite un despeje prolongado y fuera de línea del cráneo en ratones que se comportan libremente (Figura 1A⁾¹⁶. Este enfoque emplea un procedimiento de eliminación en dos pasos utilizando reactivos (S1 y S2), que fueron optimizados mediante cribado químico sistemático en nuestro trabajo^{previo 16}. La optimización sistemática de los reactivos de eliminación y la caracterización de la eficacia de la eliminación, reversibilidad, bioseguridad y rendimiento de imagen in vivo de la ventana HOTS se han reportado en nuestro^{trabajo previo 16}, que también demostraron una respuesta astroglial favorable tras el tratamiento HOTS. Aquí presentamos un protocolo paso a paso para establecer la ventana HOTS que permita la obtención profunda de imágenes transcraneales de dos fotones en ratones adultos. En preparaciones representativas, las profundidades de imagen alcanzan los ~800 μm por debajo del pia, casi igualando las que se pueden alcanzar con ventanas de cráneo abiertas. La ventana HOTS permite la imagen estructural profunda en ratones Thy1-GFP-M y la imagen funcional de calcio en ratones Thy1-GCaMP6 despiertos.

Protocolo

Todos los procedimientos de cuidado animal y experimentales fueron aprobados por el Comité Provincial de Cuidado y Uso Animal de Guangdong y se llevaron a cabo conforme a las directrices del Comité de Ética en Experimentación Animal del Instituto de Tecnología Avanzada de Shenzhen, Academia China de Ciencias. Los reactivos y equipos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

NOTA: Este protocolo está optimizado para ratones de 6 semanas (peso corporal ~20 g), que tienen un grosor craneal de aproximadamente 100 μm.

1. Preparación de soluciones para limpiar el cráneo

1. Preparar la solución de limpieza del cráneo S1 (10% en peso/v EDTA, 15% en peso/v D-manosa, 10% en peso/v sulfolano, 0,5% en peso/v Tween 20; RI: 1,38; pH final: 7.0-7.4)
   1. Pesa 0,35 g de hidróxido de sodio (NaOH). Añade 20 mL de agua desionizada en un vaso de precipitados y remueve hasta que se disuelva completamente. Esto eleva el pH de la solución, facilitando la posterior disolución de EDTA.
      NOTA: NaOH es corrosivo. Lleva el equipo de protección personal adecuado (guantes, bata de laboratorio, protección ocular) y maneja una campana extractora química.
   2. Añadir 4 g de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA) a la solución de NaOH. Coloca el vaso en un baño de aguas a 40 °C y remueve continuamente hasta que el EDTA esté completamente disuelto.
   3. Enfría la mezcla a temperatura ambiente. Añade 6 g de D-mannosa, 4 g de sulfolano y 0,2 g de Tween 20 a la solución. Remueve a temperatura ambiente hasta que todos los componentes estén completamente disueltos.
   4. Añade agua desionizada para llevar el volumen final a 40 mL. Mezcla bien para obtener S1.
      NOTA: S1 puede almacenarse a temperatura ambiente durante varios meses.
2. Preparar la solución de limpieza del cráneo S2 (70% en peso/v de D-manosa, 5% en peso/v de sulfolano, 0,5% en peso/v Tween 20; RI final: 1,44; pH final: 7,0-7,4)
   1. Pesa 28 g de D-mannosa, 2 g de sulfolano y 0,2 g de Tween 20 y transfiere a un vaso limpio.
   2. Añadir agua desionizada a aproximadamente 30 mL y remover a temperatura ambiente hasta que todos los componentes estén completamente disueltos.
   3. Añade agua desionizada para llevar el volumen final a 40 mL y mezcla bien para obtener S2.
      NOTA: El calentamiento suave (25–30 °C) y la agitación continua aceleran la disolución de la D-manosa. S2 puede almacenarse a temperatura ambiente durante varios meses.

2. Preparación para la cirugía

1. Autoclave de todos los instrumentos quirúrgicos y esteriliza completamente el espacio de trabajo con un 75% de alcohol.
2. Anestesiar al ratón mediante la inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (p/v) (150–200 μL por 20 g de peso corporal).
   NOTA: Otros anestésicos reversibles pueden usarse como alternativa al pentobarbital sódico.
3. Monitoriza la profundidad de la anestesia usando la prueba de reflejo de pellizco y asegúrate de que el ratón esté completamente anestesiado antes de comenzar la cirugía.
4. Coloca el ratón en un marco estereotáxico y asegura la cabeza con barras para los oídos.
5. Mantén la temperatura corporal en 37 °C usando una almohadilla térmica.
6. Aplica pomada oftálmica en ambos ojos para evitar la sequedad corneal.
   NOTA: Vigila de cerca la respiración y los reflejos para evitar sobredosis de anestesia y depresión respiratoria.

3. Cirugía y montaje de la placa frontal

1. Exposición y limpieza del cráneo (Figura 1Ba)
   1. Retira el cuero cabelludo de toda la superficie dorsal del cráneo usando pinzas finas y tijeras quirúrgicas. Recorta la piel lateralmente para exponer los bordes de los músculos temporales y hacia atrás hacia los músculos del cuello.
   2. Retira suavemente el periosteo de la superficie del cráneo usando pinzas finas.
   3. Limpia la superficie del cráneo con un aplicador húmedo con punta de algodón y seca el cráneo con un suave chorro de aire.
   4. Si se requiere una localización precisa de las áreas funcionales de la corteza cerebral, marque puntos de referencia espaciados 1 mm en la superficie del cráneo utilizando un aparato estereotáctico.
2. Aplicación de cemento dental y placa de cabeza (Figura 1Bb)
   1. Prepara el cemento dental según las instrucciones del fabricante. Se recomienda cementos dentales con fuerte adhesión y buena durabilidad, adecuados para fijación a largo plazo, para asegurar una fijación estable.
   2. Aplica una capa fina de cemento dental sobre la superficie expuesta del cráneo y los tejidos circundantes para protegerla, dejando sin recubrimiento la zona designada para la ventana de despeje.
      NOTA: Después de mezclar los componentes en polvo y líquido del cemento dental en una proporción de 1:1, espere aproximadamente 10 s a que el cemento se adhiera a la punta del palillo antes de aplicarlo. Esto reduce su fluidez y mejora el manejo. Durante la aplicación, aplica el cemento desde la periferia hacia la ventana de despeje designada y mantén la zona de la ventana completamente libre de cemento. La región despejada se define por el límite del sellador dental (cemento dental y material de revestimiento blando) en la superficie del cráneo. Por lo tanto, su tamaño puede ajustarse, pero está limitado por las suturas craneales o el tamaño de la gorra. Para aplicaciones comunes en un hemisferio, la región despejada suele tener un diámetro de ~3–5 mm.
   3. Asegura una pequeña placa de titanio (para fijar la cabeza a un soporte personalizado durante la posterior imagen) al cráneo usando cemento dental.
      NOTA: Se pueden usar diferentes diseños de placas frontales para la fijación de la cabeza. En este estudio, se utilizaron con éxito tanto las placas frontales comercialmente disponibles como las de titanio personalizadas de dos orificios. Independientemente del diseño, la placa frontal debe proporcionar suficiente estabilidad mecánica para la obtención posterior de imágenes y no debe obstruir la ventana prevista para despejar/imaginar.

4. Creación de una ventana HOTS

1. Sella el cráneo con un material de revestimiento dental blando autocurante (Figura 1Bc)
   1. Después de que el cemento dental ha curado completamente durante aproximadamente 5 minutos, cubre la capa de cemento, excluyendo la zona de la ventana de despeje, con una fina capa de material de revestimiento dental blando autocurante para formar un sellado continuo sobre el cráneo.
      NOTA: El material blando del revestimiento mejora el sellado y reduce las fugas durante la exposición prolongada a reactivos de limpieza.
   2. Da forma suave al material suave del delineador dental autocurante de forma suave alrededor del margen previsto de la ventana de despeje, creando una superficie plana de sellado para la tapa.
2. Montar la tapa (Figura 1Bd)
   1. Corta la cabeza de una pipeta de plástico desechable (polietileno, PE) para crear una pequeña tapa cilíndrica con la parte superior cerrada y la parte inferior abierta. El PE muestra buena estabilidad química y no muestra degradación ni reacción visible con las soluciones de limpieza S1 o S2 durante el proceso de limpieza.
      NOTA: La tapa cortada en la cabeza de una bombilla de pipeta de transferencia de 1 mL suele medir ~12 mm de diámetro y ~10–14 mm de altura.
   2. Coloca la tapa sobre la zona designada de la ventana de despeje y presiónala suavemente contra el material suave del forro.
      NOTA: La gorra es más grande que la zona despejada, y la parte del cráneo debajo de la gorra que no se utiliza para la zona despejada puede aplicarse con sellador dental para proteger el cráneo de la despeja.
   3. Fija la tapa en su lugar usando material adicional de forro suave alrededor de su base, asegurando que la unión entre la tapa y el cráneo esté completamente sellada.
   4. Utiliza una jeringuilla de 1 mL con una aguja de 26 g para perforar uno o más pequeños agujeros en la pared de la tapa que sirvan como puertos para inyectar y extraer soluciones de limpieza.
   5. Deja que el material suave del forro esté completamente curado. Comprueba que la tapa esté bien sujeta y que no queden huecos visibles en la interfaz.
   6. Saca el ratón del marco estereotáxico y colócalo en una jaula tibia hasta que se recupere completamente de la anestesia.
      NOTA: Este es un punto de parada adecuado. Realiza el procedimiento de limpieza del cráneo una vez que el cemento dental y el material del revestimiento suave hayan curado completamente. En nuestra consulta, la ventana HOTS puede instalarse por la tarde, seguida de un despeje craneal a la mañana siguiente, una vez que el ratón se ha recuperado completamente de la cirugía. Alternativamente, la limpieza de cráneo puede comenzar aproximadamente 15 minutos después de la instalación de la ventana HOTS. Durante la instalación de la ventana HOTS, el cráneo permanece estructuralmente intacto, aunque se retira el periostio.

5. Aclaramiento de cráneos en ratones despiertos y sin problemas

NOTA: Durante la fase de despeje, el ratón permanece despierto y se comporta libremente en su jaula de casa. Utiliza solo anestesia breve de isoflurano para la inyección de solución y el cambio a través de la tapa montada en la cabeza.

1. Carga inicial de S1
   1. Colocar al ratón en una cámara de inducción e inducir una anestesia breve con un 3–4% de isoflurano en el aire a un caudal de 300–500 mL/min hasta que el ratón quede inmóvil. No se aplicó anestesia de mantenimiento.
   2. Sujeta suavemente al ratón y estabiliza la tapa montada en la cabeza con la mano.
   3. Utiliza una jeringuilla de 1 mL con una aguja de 26 g para inyectar lentamente aproximadamente 1 mL de S1 en la tapa montada en la cabeza.
   4. Devuelvo al ratón a una jaula de casa y deja que S1 actúe sobre el cráneo durante 2 horas.
      NOTA: Durante la incubación de S1 y S2, aloja al ratón individualmente en una jaula estándar.
2. Refrescando la S1
   1. A las 2 horas de la carga inicial de S1, anestesiar brevemente al ratón con isoflurano.
   2. Aspira S1 de la cápsula usando una jeringuilla de 1 mL.
   3. Rellena el tapón con S1 fresco usando una jeringuilla de 1 mL.
   4. Devuelve al ratón a la jaula y deja que S1 actúe durante otras 2 horas.
   5. Repite los pasos 5.2.1–5.2.4 a las 4 horas de la carga inicial para realizar un segundo reemplazo de S1.
   6. Tras el segundo reemplazo, se permite que S1 continúe actuando hasta alcanzar un tiempo total de exposición de S1 de 6 horas.
      NOTA: Este protocolo (1 mL S1 durante 6 horas) está optimizado para ratones de 6 semanas (~20 g). En animales mayores con cráneos más gruesos, el tiempo de incubación de S1 puede extenderse incrementalmente. Cualquier ajuste debe ir acompañado de un seguimiento cercano del bienestar animal y de la calidad final de las imágenes para evitar un ablandamiento excesivo del cráneo.
3. Aplicación de S2
   1. Tras 6 horas de tratamiento con S1, anestesiar brevemente al ratón con isoflurano.
   2. Aspira S1 del condensador con una jeringuilla de 1 mL y reemplácialo por 0,7 mL de S2.
   3. Devuelve al ratón a la jaula y permite que S2 actúe sobre el cráneo durante 1 hora para mejorar la transparencia y proporcionar la coincidencia del índice de refracción.
      NOTA: Bajo estas condiciones, la fase combinada de limpieza de S1 y S2 suele completarse en un plazo de 7 h (6 h S1 + 1 h S2). El aclaramiento exitoso se indica por una superficie del cráneo visiblemente transparente sin sangrado. El cráneo puede ablandarse ligeramente tras despejarse; Cuando se toca suavemente con pinzas finas, debe mostrar una leve adherencia pero permanecer estructuralmente intacta. Evita la presión excesiva sobre la superficie del cráneo.

6. Preparación de imágenes

1. Anestesia y fijación de la cabeza para imagen
   1. Al final de la incubación de S2, anestesiar al ratón mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (p/v) a 150–200 μL por cada 20 g de peso corporal.
   2. Confirma la anestesia adecuada usando la prueba de reflejo de pellizco en el dedo del pie.
   3. Fija la cabeza del ratón atornillando la placa de titanio a un soporte de cabeza diseñado a medida.
   4. Aplica pomada oftálmica en ambos ojos para evitar que se resequen durante la imagen.
   5. Mantén la temperatura corporal en ~37 °C usando una almohadilla térmica.
2. Exponiendo la superficie despejada del cráneo (Figura 1Be,Bf)
   1. Aspira la solución de S2 del condensador usando una jeringuilla.
   2. Corta cuidadosamente la tapa de plástico con tijeras finas y sácala con pinzas, evitando una fuerza excesiva sobre el cráneo.
   3. Quita suavemente el material suave del forro que rodea la ventana del claro para exponer completamente la zona del cráneo despejada.
   4. Aplicar una pequeña gota de solución de S2 directamente sobre el cráneo despejado para servir como medio de inmersión que iguale el índice de refracción durante la imagen.
      NOTA: En este estudio se utilizaron objetivos estándar de inmersión en agua, incluyendo un objetivo de 16×/NA 0,8 (N16XLWD-PF, Nikon) y un objetivo de 25×/NA 1,1 (N25X-APO-MP, Nikon). Al usar S2 como medio de inmersión, ajusta el collar de corrección del objetivo, si está disponible, al ajuste adecuado para el índice de refracción de S2 y así reducir las aberraciones esféricas. En los experimentos aquí, el cráneo despejado mantuvo una claridad óptica suficiente durante aproximadamente 2 horas de imagen de dos fotones, sin degradación evidente en la calidad de imagen durante la observación de la espina dendrítica. Tras unos 2 días, fue necesario re-autorizar para más imágenes, y el tiempo de re-autorización fue sustancialmente más corto que el inicial, permitiendo realizar imágenes repetidas y eficientes del mismo animal.
3. Imagen con cabeza fija despierta (opcional)
   NOTA: Para la imagen despierta, acostúmbrate al ratón a la fijación de la cabeza antes del experimento. Anestesiar brevemente al ratón con isoflurano, luego asegurar la placa implantada al soporte durante 15–30 minutos por sesión, y repite esto durante 2–3 días.
   1. Utiliza una breve anestesia con isoflurano para facilitar el manejo. Fija solo la placa frontal implantada al soporte, permitiendo que el cuerpo se mueva libremente sobre la rueda o plataforma.
   2. Sigue los pasos 6.2.1–6.2.4 para exponer la superficie del cráneo despejada y aplica S2 antes de la imagen.

7. Recuperación

1. Después de la imagen, aspira suavemente y elimina cualquier solución residual de S2 de la superficie del cráneo.
2. Enjuaga la región del cráneo despejada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) varias veces para promover la restauración gradual del estado opaco nativo del cráneo.
3. Seca suavemente el líquido residual del cráneo y los tejidos circundantes con hisopos de algodón estériles, evitando daños mecánicos en el hueso.
4. Si el animal se mantiene con vida para experimentos posteriores, aplicar una capa del sellador biocompatible Kwik-Cast (WPI) sobre la ventana del cráneo para proteger el hueso durante el periodo de supervivencia.
5. Deja que la capa protectora cure completamente.
6. Desconecta el ratón del soporte para la cabeza y colócalo en una jaula caliente. Vigila al animal hasta que se recupere completamente de la anestesia y luego devuélvelo a su jaula de origen.

Resultados

Siguiendo el protocolo, la ventana de cráneo ópticamente transparente montada en la cabeza (HOTS) permite la imagen transcraneal profunda de dos fotones en ratones adultos, preservando la integridad del cráneo. Una preparación exitosa se indica por dos resultados clave: (1) la vasculatura cortical se vuelve claramente visible a través del cráneo al despejarse (Figura 1Bf), y (2) el cráneo despejado muestra una ligera hendidura bajo una presi...

Discusión

El método HOTS utiliza una ventana de cráneo ópticamente transparente montada en la cabeza (HOTS) que combina una tapa que contiene reactivos de limpieza con un procedimiento de limpieza craneal en dos pasos para mejorar la transparencia del cráneo en ratones adultos, preservando la integridad del cráneo. Bajo el protocolo estándar (6 h en S1 y 1 h en S2 para ratones de 6 semanas), la ventana resultante soportaba de forma fiable la imagen transcraneal profunda de dos fotones y permitía v...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 mL de pipeta desechable	Beijing Biotopped  Science   & Tecnología  Co., Ltd.	N/A
Cemento dental	Shanghai Rongxiang Dental Materials Co., Ltd.	N/A
D-mannosa	Macklin	D813082
EDTA	Aladdín	El 16428
Isoflurano	RWD	N/A
Kwik-Cast	WPI	N/A	Un sellador biocompatible
NaOH	Macklin	S832169
Autocurado        dental          Material blando del forro	Yangmahu Biotechnology (Hebi) Co., Ltd.	N/A
Pentobarbital sódico	Biopike	N/A
Aparato estereotáxico	RWD	N/A
Jeringuilla estéril desechable	Minank	N/A	1 mL; Aguja de 26 G
Sulfolano	Macklin	S817950
Ratones Thy1-GFP-M		N/A	Proporcionado  por el profesor Yang Zhan
Thyl-GCaMP6s  ratones	Laboratorio Jackson
Preadolescentes 20	Sigma-Vetec	V900548
Objetivo de inmersión en agua	Nikon	N25X-APO-MP	25×/NA 1.1 objetivo
Objetivo de inmersión en agua	Nikon	N16XLWD-PF	16×/NA 0.8 objetivo