Imagen en tiempo real sin etiquetar y análisis cuantitativo de la morfodinámica de macrófagos utilizando tomografía por difracción óptica

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo basado en tomografía de difracción óptica sin marcas para la imagen en tiempo real y el análisis cuantitativo de la morfodinámica de los macrófagos. El método permite el seguimiento continuo de la morfología y migración de células individuales, proporcionando mediciones resueltas en el tiempo del área proyectada, el perímetro y la velocidad media de migración durante la imagen a largo plazo de células vivas.

Resumen

Este estudio establece un flujo de trabajo basado en tomografía de difracción óptica (ODT) sin etiquetas para la imagen y análisis de células vivas, con el fin de observar cambios morfológicos dependientes del tiempo en macrófagos. El método permite el registro continuo de la morfología y el movimiento de células individuales durante períodos prolongados bajo condiciones ambientales estables y permite la extracción de parámetros cuantitativos, incluyendo el área proyectada, el perímetro y la velocidad media de migración. Este flujo de trabajo proporciona un enfoque práctico para capturar comportamientos celulares dinámicos a nivel de célula única sin marcaje exógeno. Utilizando los macrófagos RAW264.7 como modelo, se realizó la imagen en lapso de tiempo bajo estimulación de lipopolisacáridos con pretratamiento de baicalina para captar cambios celulares dinámicos bajo diferentes condiciones. Se seleccionaron células representativas para seguimiento y análisis cuantitativo. Los resultados muestran que este flujo de trabajo permite un seguimiento estable y a largo plazo de una sola célula y refleja cambios temporales en la morfología y motilidad celular. Este enfoque proporciona un método sin etiquetas para observar comportamientos celulares dinámicos en respuesta a diferentes estímulos y puede servir como complemento útil a los ensayos convencionales basados en puntos finales. También puede ser aplicable a otros tipos celulares adherentes para estudios de morfodinámica celular.

Introducción

Los macrófagos desempeñan un papel central en las respuestas inmunitarias innatas y en la homeostasis tisular, y sus estados funcionales pueden cambiar dinámicamente en respuesta a estímulos microambientales. Tradicionalmente, se ha descrito que los macrófagos adoptan fenotipos proinflamatorios o antiinflamatorios/asociados a^{la reparación 1,2}. Sin embargo, cada vez hay más evidencias que sugieren que la activación de los macrófagos es un proceso continuo y plástico en lugar de un estado binario discreto3,4. Bajo diferentes estímulos, los macrófagos experimentan cambios graduales a lo largo del tiempo, acompañados de alteraciones en la morfología celular y el comportamiento^{migratorio 5}. Por lo tanto, la caracterización resuelta en el tiempo de los cambios morfológicos y migratorios a nivel de célula única proporciona un enfoque importante para estudiar las respuestas celulares dinámicas.

Los enfoques actuales para estudiar los estados de los macrófagos se basan principalmente en la inmunotinción, la citometría de flujo y análisis transcriptómicos o^{proteómicos 6}. Estos métodos suelen basarse en muestras fijas o puntos temporales discretos, lo que limita su capacidad para seguir cambios continuos en la misma celda bajo condiciones^{de vida 7}. La imagen de células vivas basada en fluorescencia permite la observación dinámica, pero puede verse afectada por la fototoxicidad y el blanqueamiento fotográfico durante experimentos a largo^{plazo 8,9}. La tomografía por difracción óptica (ODT) es una técnica de imagen sin etiquetas que reconstruye la distribución tridimensional del índice de refracción de las células para proporcionar información estructural^{cuantitativa 10}. Como no requiere marcaje exógeno, la ODT es adecuada para la imagen a largo plazo de células vivas y reduce la perturbación del comportamiento celular. En los últimos años, la TDO se ha aplicado a estudios dinámicos en varios modelos^{celulares 11}, con estudios previos centrados principalmente en la capacidad de imagen y la caracterización estructural. En contraste, el presente estudio establece un flujo de trabajo estandarizado y sin etiquetas para el análisis a largo plazo y con resolución temporal de la morfodinámica de macrófagos bajo una condición definida de estimulación in vitro.

El flujo de trabajo se demuestra utilizando un modelo in vitro de macrófagos RAW264.7 con estimulación de lipopolisacáridos (LPS) y pretratamiento de Baicalina (BAI). BAI se utilizó como modulador experimental representativo para establecer una condición definida para demostrar el flujo de trabajo. La imagen continua permite extraer parámetros cuantitativos de una sola célula, incluyendo el área proyectada, el perímetro y la velocidad media de migración, permitiendo caracterizar en el tiempo los cambios morfológicos y de comportamiento. Este enfoque pretende proporcionar un análisis descriptivo de los cambios fenotípicos dinámicos en lugar de definir estados funcionales o polarización, y puede servir como método complementario a los ensayos basados en puntos finales proporcionando información temporal. El flujo de trabajo se valida en este sistema modelo y puede ser aplicable a otros tipos celulares adherentes.

Protocolo

1. Cultivo de macrófagos

PRECAUCIÓN: Realiza todos los procedimientos en un armario de bioseguridad mientras llevas guantes de laboratorio y bata de laboratorio.

1. Preparar un medio de cultivo completo (medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con alta glucosa, suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS) y 1% penicilina–estreptomicina).
2. Descongela un vial de células de macrófagos RAW264.7 en un baño maria a 37 °C durante menos de 1 minuto.
3. Transfiere la suspensión celular a DMEM de alta glucosa suplementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
4. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos.
5. Descarta el sobrenadante.
6. Resuspende las células en un medio fresco y completo.
7. Seleccionar las células de semillas en recipientes de 60 mm a 2–5 × 10⁵ celdas por plato.
8. Incubar células a 37 °C con un 5% de CO₂.
9. No cambies el medio en un plazo de 12–24 horas tras descongelar.
10. Cambia el medio cada 2–3 días.
11. Monitoriza la morfología celular usando un microscopio invertido.
12. Las células del paso están al 80–90% de confluencia por pipeteo suave.
    NOTA: Evita usar tripsina. Usa las celdas en los pasajes 6–18. Selecciona células con morfología uniforme y sin vacuolización para experimentos. La línea celular fue autenticada mediante perfilado STR y sometida a pruebas de control de calidad. En los Archivos Complementarios se proporcionan informes detallados y un resumen en inglés.

2. Tratamiento celular

1. Recoge células en la fase de crecimiento logarítmico mediante pipeteo suave.
2. Resuspende las células en un medio completo.
3. Mide la densidad celular usando un contador de celdas.
4. Ajusta la densidad de celdas a 4 × 10⁴ celdas/mL.
5. Siembra 2 mL de suspensión celular en cada plato de 35 mm.
6. Asignar los platos a dos grupos: (i) grupo LPS, (ii) grupo BAI + LPS.
7. Incubar las células a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 12–16 horas.
8. Prepara una solución de stock BAI de 50 mM en DMSO. Almacenar la solución de stock BAI a −20 °C.
9. Añadir BAI al grupo BAI + LPS a una concentración final de 100 μM. Diluir la solución stock BAI directamente en medio de cultivo para lograr la concentración final de trabajo.
10. Añade un volumen igual de DMSO al grupo LPS.
11. Prepara la solución de stock LPS (1 mg/mL) en medio completo.
12. Añadir LPS a ambos grupos hasta una concentración final de 1 μg/mL. Diluir la solución de la base LPS directamente en medio de cultivo para lograr la concentración final de trabajo.
13. Procede inmediatamente a la imagen y no cambies el medio durante la imagen.

3. Adquisición por tomografía por difracción óptica

1. Enciende el sistema de imagen ODT y arranca el módulo de control ambiental.
2. Ajusta la temperatura del escenario a 37 °C.
3. Fija la concentración de CO₂ al 5%.
4. Deja que el sistema se equilibre durante al menos 20 minutos.
5. Abre el software de adquisición.
6. Coloca el plato de cultivo en la fase de imagen.
7. Utiliza un objetivo 60x (NA = 1,42) para localizar celdas.
8. Selecciona células aisladas con límites claros para la imagen.
9. Pon el intervalo de imagen a 8 minutos.
10. Establece el número total de fotogramas en 181.
11. Activa la función de enfoque automático para mantener el enfoque durante la imagen en time-lapse.
12. Comienza la adquisición en time-lapse.
13. Monitorizar la estabilidad del sistema durante la adquisición.
    NOTA: Se aplicó estabilización de autoenfoque durante todo el experimento para minimizar la deriva focal.

4. Reconstrucción de imágenes y análisis cuantitativo

1. Tras la adquisición de la imagen, el software realiza automáticamente la reconstrucción de la imagen.
2. Usando el algoritmo estándar incorporado.
3. Espera a que la barra de progreso esté completa.
4. Abre el software de análisis (Intellyseg, v2.1.0).
5. Importa el conjunto de datos en bruto seleccionando Importar datos en bruto.
6. Navegando hacia la carpeta de destino.
7. Elige el archivo de destino e importa el conjunto de datos.
8. Haz clic en "Celda" para realizar la segmentación automática usando configuraciones consistentes entre los conjuntos^{de datos 13}.
9. Selecciona celdas según los siguientes criterios: (i) sin solapamiento con celdas vecinas, (ii) sin contacto con los límites de la imagen, (iii) rastreable continuamente a lo largo de la serie temporal.
10. Seleccione un número fijo de celdas (n = 8) por campo de visión para un análisis consistente entre conjuntos de datos.
11. Abre el módulo "Seguimiento a largo plazo".
12. Introduce el marco inicial y el fotograma final.
13. Haz clic en "Track" para iniciar el seguimiento, que se basa en la consistencia de posición de las celdas entre fotogramas^{consecutivos 14}.
14. Corregir manualmente los errores de seguimiento si es necesario para asegurar la continuidad de la trayectoria: (i) Haz clic derecho en las máscaras incorrectas y selecciona "Eliminar elemento", (ii) Abre "Segmentación manual", (iii) Selecciona "Celda" y haz clic en "Añadir", (iv) Usa "Clic" o "Caja" para añadir las máscaras correctas.
15. Haz clic en "Exportar" y luego selecciona "Exportar datos".
16. Selecciona "Exportar vídeo" y elige elementos de salida.
17. Introduce los fotogramas de inicio y fin.
18. Selecciona la ruta de guardado y el formato del archivo.
19. Haz clic en "OK" para exportar el vídeo.
20. Haz clic en "Exportar" y luego selecciona "Sistema de gráficos".
21. Selecciona "Gráfico de pistas".
22. Elige "Celda" como categoría de segmentación.
23. Entra en el rango de fotogramas de seguimiento.
24. Selecciona los parámetros de salida (por ejemplo, Área, Perímetro).
25. Haz clic en "Exportar imagen o Excel" y guarda el archivo.
26. Calcula la velocidad media de migración (μm/h) para cada celda en función del desplazamiento del centroide a lo largo de toda la serie temporal.

5. Presentación de datos

1. Las mediciones cuantitativas se presentan de forma descriptiva. No se realizó ninguna inferencia estadística. Cada grupo de tratamiento incluía cinco muestras independientes.
   Una visión general del flujo de trabajo experimental se muestra en la Figura 1. Los reactivos clave, instrumentos y software se enumeran en la Tabla de Materiales. Las condiciones de imagen se resumen en la Tabla 1.

Resultados

Para evaluar el rendimiento del flujo de trabajo basado en ODT, se realizó imágenes en lapso de tiempo para dos grupos de tratamiento (LPS y BAI + LPS), con cinco muestras independientes por grupo. Todas las muestras se obtuvieron bajo condiciones de imagen idénticas. Debido a la alta carga de trabajo asociada al seguimiento a largo plazo de células individuales y al análisis cuantitativo, se seleccionó una muestra representativa de cada grupo para el análisis y visualización de células individuales. Los resultados se pr...

Discusión

Este estudio establece un flujo de trabajo basado en ODT sin etiquetas para la obtención continua de imágenes y análisis cuantitativo de la morfodinámica de los macrófagos a nivel de célula única. El enfoque permite la medición resuelta en el tiempo del área proyectada, el perímetro y la velocidad media de migración durante la imagen de células vivas a largo plazo. La densidad de siembra de celdas es un factor clave que afecta al rendimiento de segmentación y seguimiento. Alta densidad r...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ODT imaging system	Pellucid Optics	MH-PanoView	Usado para imagen de células vivas sin etiquetas
Software de adquisición	Pellucid Optics	Lucida-Pano v2.1.0	Usado para la adquisición de imágenes
Software de análisis	Pellucid Optics	Intellyseg v2.1.0	Usado para la reconstrucción de imágenes, segmentación y seguimiento
RAW264.7	Wuhan Zishan Biotechnology	STCC20020P	Línea celular de macrófagos murinos utilizada para experimentos de polarización e imagen in vitro.
Baicalina (BAI)	Shanghai Yuanye	JB246114	Usado para el pre-tratamiento de células
Lipopolisacárido (LPS)	Solarbio	L8880	Usado para estimular los macrófagos
Medio DMEM	Gibco	C11995500BT	Medio de cultivo celular
Suero bovino fetal	Procell	164210	Suplemento para el cultivo celular
Penicilina–Estreptomicina (100x)	Procell	PB180120	Antibióticos para el cultivo celular
Placa de cultivo de 60 mm	Corning	CLS430166	Usado para el cultivo celular
Placa de fondo de vidrio de 35 mm	Cellvis	D35-10-1.5-N	Usado para imagen ODT
Microscopio invertido	OLYMPUS	CKX53	Usado para la observación rutinaria de células y el monitoreo durante el cultivo.
Contador de células	RWD Life Science	C100	Usado para la determinación de la densidad celular