Este protocolo presenta un enfoque de ecocardiografía transtorácica basado en Doppler en ratones para la evaluación reproducible de la función sistólica y los índices diastólicos convencionales.
Artículo de método
Ecocardiografía Doppler para la evaluación de la función diastólica en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La insuficiencia cardíaca (IC) es una carga global importante para la salud caracterizada por una función cardíaca deteriorada. Puede originarse en función sistólica reducida o relajación diastólica anormal, como se observa en la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF). Modelos preclínicos fiables y herramientas cuantitativas son esenciales para estudiar los mecanismos de la enfermedad y las intervenciones terapéuticas. La ecocardiografía transtorácica es una modalidad de imagen no invasiva ampliamente utilizada para medir la estructura y función cardíaca en modelos murinos. Este protocolo describe un método estandarizado para realizar ecocardiografía de alta resolución basada en Doppler en ratones utilizando transductores de alta frecuencia (30–40 MHz) bajo anestesia inhalada. Los animales se colocan sobre una plataforma controlada de temperatura con monitorización continua de la frecuencia cardíaca, la respiración y la temperatura corporal para garantizar la estabilidad fisiológica. El flujo de trabajo incluye la adquisición de Doppler en modo B, modo M, Doppler de onda pulsada, Doppler en color e imagen Doppler tisular para evaluar la estructura del ventrículo izquierdo, el rendimiento sistólico y los índices diastólicos convencionales. El análisis offline se realiza utilizando mediciones a ciegas promediadas sobre varios ciclos cardíacos. Este método permite una evaluación reproducible de la función cardíaca y es adecuado para estudios longitudinales en modelos murinos de enfermedades cardiovasculares.
Introducción
La insuficiencia cardíaca (IC) afecta a más de 64 millones de personas en todo el mundo y sigue siendo una de las principales causas de morbilidad ymortalidad 1,2. Clínicamente se clasifica como insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (HFrEF), fracción de eyección ligeramente reducida (HFmrEF) y fracción de eyección preservada (HFpEF)3,4. La creciente prevalencia de la HFpEF y la falta de terapias dirigidas ponen de manifiesto la necesidad de modelos preclínicos sólidos y métodos cuantitativos para la fenotipización cardíaca5. Una característica central de la HFpEF es la función diastólica deteriorada, lo que subraya la importancia de herramientas fiables para evaluar la relajación ventricular y la dinámica del llenado en sistemas experimentales.
Los modelos murinos se utilizan ampliamente para estudiar enfermedades cardiovasculares, incluyendo sobrecarga de presión, lesiones isquémicas y modelos farmacológicos, y son susceptibles de modificacionesgenéticas 6,7. La evaluación precisa y reproducible de la función cardíaca es fundamental en estosmodelos 8,9. La ecocardiografía transtorácica proporciona un método no invasivo, rápido y reproducible, susceptible de mediciones repetidas para documentar el curso de la enfermedad y su respuesta a intervenciones potencialmente terapéuticas, con la capacidad de evaluar la estructura y función cardíaca in vivo 10. Tiene la ventaja adicional de eliminar la exposición a la radiación para investigadores o animales de estudio, lo que podría confundir los resultados experimentales.
El objetivo principal de este manuscrito es proporcionar un enfoque estandarizado y reproducible para evaluar la función diastólica del ventrículo izquierdo en ratones mediante ecocardiografía Doppler. Este protocolo integra mediciones convencionales de flujo transmisral y imágenes Doppler tisulares para cuantificar parámetros como las relaciones E/A y E/e′, que sirven como marcadores de relajación ventricular y presiones de llenado. Al permitir la evaluación longitudinal en el mismo animal, esta técnica facilita el estudio de la progresión de la enfermedad y las respuestas terapéuticas en modelos preclínicos de insuficiencia cardíaca.
La razón de ser del desarrollo y uso generalizado de la ecocardiografía Doppler en estudios murinos radica en su capacidad para salvar las brechas traslacionales entre los modelos preclínicos y la cardiología clínica. Aunque las mediciones hemodinámicas invasivas siguen siendo el estándar de oro, su naturaleza terminal impide su uso en estudios seriados. La ecocardiografía Doppler, adaptada de la práctica clínica, permite a los investigadores obtener índices fisiológicamente relevantes de la función diastólica de manera mínimamente invasiva. Los avances en sistemas de ultrasonido de alta frecuencia han mejorado aún más la resolución espacial y temporal, permitiendo capturar con precisión ciclos cardíacos murinos rápidos para análisiscuantitativo 11.
Las técnicas alternativas, como la resonancia magnética cardíaca, son caras, requieren mucho tiempo y tienen una disponibilidad limitada, lo que hace que los estudios repetidos sean poco prácticos. El análisis de bucles presión-volumen, aunque se considera el estándar de oro para evaluar la función diastólica, es invasivo, técnicamente exigente y normalmente un procedimiento terminal. En cambio, la ecocardiografía ofrece un equilibrio práctico entre precisión y viabilidad, convirtiéndola en la modalidad más accesible para la fenotipificación longitudinal en animales pequeños. En comparación con enfoques emergentes como la imagen de deformación con seguimiento de motelas o el análisis funcional del atrio izquierdo, los métodos convencionales basados en Doppler requieren menos especialización y se implementan más fácilmente en laboratorios, mejorando la reproducibilidad y la comparabilidad de los hallazgos. Por ello, este método proporciona un enfoque robusto, accesible y trasladable para evaluar la función diastólica en modelos murinos, especialmente en HFpEF o disfunción cardíaca en fasetemprana 12,13.
Protocolo
Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC: Aprobación nº A00007272-23-R26) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales. En este estudio se utilizaron un total de 8 ratones control C57BL/6NJ. Se administró anestesia con isoflurano utilizando un vaporizador calibrado con un saqueo adecuado para minimizar la exposición del personal. Los animales fueron monitorizados continuamente para medir la frecuencia cardíaca y la respiración para mantener la estabilidad fisiológica y evitar sobredosis anestésicas. Se utilizó una plataforma de calentamiento para prevenir la hipotermia. Los investigadores pueden optar por monitorizar la temperatura corporal profunda utilizando un termómetro anal. Se aplicó un lubricante oftálmico para evitar el resecamiento corneal. Los animales no se dejaban sin supervisión bajo anestesia y se monitorizaba hasta estar completamente despiertos, como indica la recuperación de la postura erguida y el movimiento normal en la jaula (Tabla de Materiales).
1. Preparación animal
- Elimina el vello del pecho entre 24 y 48 horas antes de la imagen con crema depilatoria y limpia bien con gasa húmeda.
- Asegura la eliminación completa de la zona torácica y permite que la irritación/enrojecimiento de la piel desaparezca completamente antes de la imagen.
- Prepara el sistema de imagen, el sistema de anestesia y el equipo de monitorización antes de la inducción.
- Seleccione el preset de imagen cardíaca y establezca la profundidad de imagen en 2–2,5 cm, la tasa de fotogramas ≥200 fotogramas/s, y ajuste la ganancia para optimizar la visualización miocárdica.
2. Anestesia y monitorización fisiológica
- Inducir anestesia usando isoflurano al 2–3% en oxígeno y mantenerse entre 1–1,5% a través del cono nasal.
- Coloca al ratón en posición supina sobre una plataforma con control de temperatura y asegura las extremidades a electrodos de ECG.
- Aplica lubricante oftálmico para evitar el resecamiento corneal.
- Controla la frecuencia cardíaca y respiratoria de forma continua.
- Mantener la frecuencia cardíaca aproximadamente entre 450 y 500 latidos/min para asegurar la separación de las ondas Doppler E y A.
NOTA: Las frecuencias cardíacas demasiado bajas (<400 latidos/min) pueden reflejar anestesia más profunda y condiciones de carga alteradas, mientras que frecuencias cardíacas más altas (>500 latidos/min) pueden provocar fusión E/A. Mantener los parámetros fisiológicos dentro de rangos que preserven tanto la fisiología normal como la interpretación óptima de la señal Doppler. Se recomienda una frecuencia cardíaca de aproximadamente 400–500 lpm para permitir una separación clara de las ondas transmisoras E y A y mejorar la precisión de las mediciones diastólicas. Este rango objetivo está impulsado principalmente por consideraciones de medición más que por un requisito fisiológico estricto. Las frecuencias cardíacas por debajo de 400 lpm pueden reflejar niveles más profundos de anestesia y condiciones alteradas de carga, lo que puede afectar los índices diastólicos. Por el contrario, las frecuencias cardíacas superiores a 550 bpm pueden provocar la fusión de ondas E y A, limitando la interpretabilidad. La frecuencia respiratoria debe mantenerse entre 80 y 120 respiraciones por minuto, y la temperatura corporal entre 37 ± 0,5 °C. La concentración de isoflurano debe ajustarse de forma incremental (±0,1–0,2%) para mantener la estabilidad.
3. Flujo de trabajo de imagen
- Imagen en modo B
- Posiciona el transductor a lo largo del esternón para obtener una vista parasternal en el eje largo.
- Adquiere bucles de cine (grabaciones de vídeo continuas) que muestran cámaras cardíacas y el movimiento de las paredes a lo largo de varios ciclos cardíacos.
- Imagen en modo M
- Posiciona el transductor para obtener una vista parasternal de eje corto a nivel de los músculos papilares, donde el ventrículo izquierdo parece una rosquilla con la base de dos músculos papilares visibles en las posiciones de las 4 y 8 en punto.
- Alinear el cursor en modo M perpendicular al tabique interventricular y a la pared posterior.
- Registra entre 3 y 5 ciclos cardíacos y guarda para análisis.
- LVOT Doppler
- Activa el Doppler en color para visualizar el flujo a nivel aórtico.
- Alinear el haz Doppler paralelo al flujo en el tracto de salida ventricular izquierdo.
- Registrar señales Doppler de onda pulsada durante 3–5 ciclos cardíacos.
- Doppler de entrada mitral
- Obtén una vista apical de cuatro cámaras.
- Coloca el volumen de muestra Doppler pulsado en las puntas de los folios de la válvula mitral.
- Ondas E y A de registro a una velocidad de 200–300 mm/s.
- Imagen Doppler tisular
- Coloca el volumen de la muestra en el anillo mitral septal.
- Registrar las velocidades diastólicas tisulares tempranas (e′) y tardías (a′) a lo largo de varios ciclos cardíacos.
4. Recuperación
- Suspende la anestesia y quita el gel de ecografía.
- Coloca al ratón en una jaula de recuperación caliente.
- Vigila hasta que sea completamente ambulatorio antes de volver a la vivienda.
5. Análisis de imágenes
- Abre el software de análisis y carga el bucle de cine.
- Mide las dimensiones ventriculares en el extremo de la diástole y el extremo de la sístole.
- Mide las velocidades de onda E y A y calcula la relación E/A.
- Mide la velocidad e′ y calcula la relación E/e′.
- Mediciones medias en 3–5 ciclos cardíacos.
Resultados
Este protocolo permite la adquisición de imágenes ecocardiográficas de alta calidad para la evaluación fiable de la estructura y función cardíaca en ratones. Una anestesia adecuada, una posición y un seguimiento fisiológico son esenciales para obtener imágenes consistentes (Figura 1). La imagen en modo B proporciona una visualización clara de la anatomía cardíaca. La vista apical de cuatro cámaras permite evaluar todas las cámaras cardíacas (Figura 2A–B), mientras que la vista del eje largo paraesternal define la estructura del ventrículo izquierdo y sirve como referencia para las mediciones (Figuras 3A–B). La imagen en modo M a nivel del músculo papilar permite medir con precisión las dimensiones del ventrículo izquierdo y el grosor de la pared, incluyendo LVID, LVAW y LVPW (Figuras 4A–B), apoyando la evaluación del tamaño cardíaco y la función sistólica. La imagen Doppler demuestra ondas de entrada mitral distintas de entrada E y A para el cálculo de la relación E/ A (Figura 5), mientras que el Doppler tisular proporciona velocidades medibles de E′ y A′ para la evaluación E/e ′ (Figura 6). Una alineación óptima de la frecuencia cardíaca y de la sonda es fundamental para evitar la fusión de formas de onda y asegurar mediciones precisas.
Figura 1: Anestesia y posicionamiento del ratón para ecocardiografía transtorácica. (A) Montaje de imagen que muestre la plataforma controlada por temperatura, el sistema de administración de anestesia, las conexiones de los electrodos ECG y el aparato de posicionamiento de la sonda de ultrasonidos. El sistema está diseñado para permitir un seguimiento fisiológico estable y una manipulación precisa de la sonda durante la imagen. (B) Primer plano de la plataforma de imagen con electrodos ECG integrados y cono nasal para la administración de isoflurano, diseñado para asegurar al ratón en una posición dorada estandarizada mientras se mantiene la anestesia. (C) Ratón anestesiado colocado en posición supina sobre la plataforma de imagen con las cuatro patas sujetas a electrodos de ECG mediante cinta quirúrgica. El cono nasal administra isoflurano inhalado (1,0–1,5% de mantenimiento), y el tórax se alinea plano para asegurar una adquisición óptima de imagen y un seguimiento cardíaco constante. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 2: Vista ecocardiográfica apical de cuatro cámaras en modo B. (A) Imagen representativa en modo B en escala de grises que muestra las cuatro cámaras cardíacas: aurícula izquierda, ventrículo izquierdo, aurícula derecha y ventrículo derecho en un solo plano de imagen. (B) Imagen anotada que destaca estructuras anatómicas clave. La sonda de ultrasonido se sitúa en la pared torácica lateral izquierda y se inclina cranealmente hacia el ápice cardíaco para obtener una visualización óptima. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 3: Imagen en modo B de eje largo parasternal. (A) Imagen representativa del modo B de eje largo paraesternal que muestra anatomía cardíaca, incluyendo la cámara ventricular izquierda, el tabique interventricular y la pared posterior. (B) Imagen de alta resolución exportada para análisis cuantitativo de dimensiones cardíacas. Esta visión se utiliza para evaluar la estructura cardíaca global y guiar los modos de imagen posteriores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 4: Imagen en modo M a nivel del músculo papilar. (A) Vista del eje corto parasternal a nivel ventricular medio con músculos papilares visibles. (B) Traza correspondiente en modo M con el cursor alineado perpendicularmente al tabique interventricular y a la pared posterior. (C) La imagen en modo M con análisis asistido por software, donde el sistema detecta y dibuja automáticamente líneas a lo largo de las paredes del corazón. Luego calcula valores como LVID, LVPW y LVAW a lo largo de los ciclos cardíacos. Abreviaturas; LVID = diámetro interno del ventriculo izquierdo (distancia entre el tabique interventricicular y la pared posterior); LVPW = grosor de la pared posterior del ventrículo izquierdo; LVAW = grosor de la pared anterior del ventrículo izquierdo; ECG = electrocardiograma. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 5: Montaje experimental y visión general de la señal Doppler. (A) Preparación experimental que muestra un modelo animal pequeño situado sobre una plataforma con una sonda de ultrasonido colocada sobre la región torácica para la imagen cardíaca. (B) Mapa Doppler representativo en color que ilustra la intensidad y dirección localizadas de la señal de flujo sanguíneo. (C) Trazado Doppler de onda pulsada que demuestra la colocación del volumen de muestras, junto con una forma representativa de onda Doppler de onda pulsada que demuestra velocidades de llenado tempranas (E) y auriculares (A). Se indican IVRT y IVCT, con trazo simultáneo por ECG para correlación del ciclo cardíaco. Abreviaturas; IVRT = tiempo de relajación isovolumétrico; IVCT = tiempo de contracción isovolumétrica Haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 6: Imagen Doppler tisular del movimiento miocárdico. Registro Doppler tisular que ilustra patrones de velocidad miocárdica con componentes identificables tempranos (E′) y auriculares (A′), adquiridos de la pared miocárdica. La forma de onda se muestra con una traza ECG sincronizada para correlacionar la actividad eléctrica y mecánica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Discusión
Este protocolo proporciona un enfoque estandarizado y reproducible para la ecocardiografía transtorácica basada en Doppler en ratones, permitiendo una evaluación integral de la estructura cardíaca, la función sistólica y los índices diastólicos convencionales. El uso combinado de la imagen B-mode, M-mode y Doppler permite cuantificar de forma fiable las dimensiones ventriculares, la función contráctil y la dinámica de llenado en modelos preclínicos de enfermedadcardiovascular 14.
Una consideración crítica en la ecocardiografía murina es la influencia de la anestesia inhalada en la fisiología cardiovascular. Se sabe que el isoflurano reduce la frecuencia cardíaca, altera la precarga y la postcarga, y modula la contractilidad miocárdica, todo lo cual puede afectar los índices de función diastólica derivados delDoppler 15. Por ello, es esencial un uso cuidadoso de la anestesia y el mantenimiento de condiciones fisiológicas estables para garantizar mediciones reproducibles e interpretables. La estandarización de la frecuencia cardíaca, la temperatura corporal y la frecuencia respiratoria minimiza la variabilidad y mejora la comparabilidad entre los gruposexperimentales 16.
Los índices convencionales derivados del Doppler, incluyendo el flujo transmisor (E/A) y el E/e′ derivado del Doppler tisular, se utilizan ampliamente para la evaluación de la función diastólica y son generalmente reproducibles cuando se siguen protocolos de adquisiciónestandarizados 17. La reproducibilidad puede mejorarse aún más promediando mediciones a lo largo de múltiples ciclos cardíacos y realizando análisis de forma cega para reducir la variabilidad entre y dentro del observador. La colocación consistente de las sondas y los planos de imagen también son esenciales para mejorar la fiabilidad de la prueba y la reprueba en los estudioslongitudinales 18.
Mantener una frecuencia cardíaca adecuada durante la imagen es especialmente importante en ratones debido a su alta frecuencia cardíaca intrínseca. A frecuencias cardíacas más bajas, a menudo asociadas a anestesia más profunda, las condiciones alteradas de carga pueden influir en los patrones de empaste ventricular. Por el contrario, frecuencias cardíacas excesivamente altas pueden provocar la fusión de ondas E y A, limitando la interpretación precisa de los índices diastólicos. Por lo tanto, mantener la frecuencia cardíaca dentro de un rango que preserve tanto la relevancia fisiológica como la separación Doppler de la señal es esencial para una evaluación precisa19.
Aunque este protocolo se centra en los índices convencionales de función diastólica basados en Doppler, no incorpora técnicas ecocardiográficas más avanzadas que han cobrado protagonismo en la literatura reciente. La evaluación funcional del atrio izquierdo por deformación y velocidad de deformación miocárdico (incluyendo las fases del reservorio, conducto y bomba de refuerzo), y la evaluación del destorsión, el ventrículo izquierdo proporcionan una visión mecanicista adicional sobre la relajación y la compasiónmiocárdica 19. Sin embargo, estas técnicas requieren protocolos de adquisición especializados, mayor resolución temporal y herramientas dedicadas al postprocesamiento, por lo que están fuera del alcance del flujo de trabajo actual. Estas modalidades deben considerarse enfoques complementarios cuando se requiera un fenotipado diastólico másdetallado 16.
Además de la ecocardiografía, técnicas alternativas como la resonancia magnética cardíaca (RM) y el análisis invasivo de lazos presión-volumen proporcionan evaluaciones complementarias de la función cardíaca. La resonancia magnética ofrece alta resolución espacial y mediciones volumétricas precisas, mientras que el análisis presión-volumen proporciona datos hemodinámicos de referencia de excelencia. Sin embargo, estos métodos están limitados por el coste, la invasividad y la menor idoneidad para estudios longitudinales. En cambio, la ecocardiografía transtorácica sigue siendo una técnica rápida, no invasiva y ampliamente accesible para la evaluación en serie de la función cardíaca en modelosmurinos 20.
En general, este protocolo permite la adquisición de datos ecocardiográficos de alta calidad y reproducibles en ratones cuando se presta una atención cuidadosa al monitoreo fisiológico y a las técnicas de imagen estandarizadas. La integración de mediciones estructurales, sistólicas y diastólicas convencionales hace que este enfoque sea muy adecuado para estudios longitudinales que investiguen la fisiología cardíaca, la progresión de la enfermedad y las intervenciones terapéuticas en la investigación cardiovascular preclínica.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH/NHLBI HL153407.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Crema depilatoria | Nair y reg; | N/A | Depilación antes de la imagen |
| Almohadilla térmica | VetEquip (o equivalente) | N/A | Mantiene la temperatura corporal (~37 ºC; C) |
| Sistema de ultrasonido de alta frecuencia | FUJIFILM VisualSonics | Vevo F2 (o equivalente) | Sistema de imagen para animales pequeños con preajustes cardíacos |
| Plataforma de imagen | VisualSonics | Plataforma integrada | ECG y Monitorización de la respiración |
| Cámara de inducción y cono nariz | VetEquip (o equivalente) | N/A | Administración de anestesia gaseosa |
| Vaporizador de isoflurano | VetEquip (o equivalente) | Sistema Clásico de Anestesia (o equivalente) | Sistema de administración de anestesia |
| Transductor de matriz lineal (30-40 MHz) | VisualSonics | MS550D | Sonda de alta frecuencia para imagen cardíaca murina |
| Lubricante oftálmico | Genérico (por ejemplo, Refresh PM/equivalente) | N/A | Previene el secado corneal |
| Cinta quirúrgica | 3M (o equivalente) | Cinta quirúrgica para microporos | Asegura las extremidades para el ECG |
| Gel de ultrasonidos | Parker Labs | Aquasonic 100 (o equivalente) | Acoplamiento acústico |
| Software Vevo LAB | VisualSonics | Dependiente de la versión | Adquisición y análisis de imágenes |
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