El análisis integrado de bioinformática de datos transcriptómicos humanos identifica tres biomarcadores diagnósticos y pronósticos clave en el adenocarcinoma pulmonar

Summary

Este estudio identificó biomarcadores diagnósticos y pronósticos para adenocarcinoma pulmonar utilizando TCGA-LUAD y GEO GSE115002 datos transcriptómicos. B3GNT3, FERMT1 y SPP1 fueron regulados al alza, distinguiendo tumores del tejido normal. Estos genes están vinculados a la transición epitelial-mesenquimatosa y a la inmunosupresión. Un nomograma que combinaba la expresión génica con la etapa TNM mostró un valor predictivo fiable.

Abstract

El adenocarcinoma pulmonar (LUAD) es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer a nivel mundial. A pesar de los avances en cirugía, terapia dirigida e inmunoterapia, la tasa de supervivencia a 5 años de la LUAD avanzada sigue por debajo del 20%, lo que indica una necesidad urgente de biomarcadores moleculares fiables para la detección temprana y el pronóstico. En este estudio, los autores plantearon la hipótesis de que tres genes que aumentan de forma consistente podrían actuar como biomarcadores diagnósticos y pronósticos eficaces para la LUAD. Los autores analizaron datos transcriptómicos de dos cohortes independientes, TCGA-LUAD (535 tumores, 59 muestras normales) y GSE115002 (52 tumores, 52 muestras normales coincidentes), para analizar genes expresados diferencialmente. Tres genes centrales —B3GNT3, FERMT1 y SPP1— se sobreexpresaron consistentemente en los tumores LUAD en ambos conjuntos de datos. Estos genes mostraron un excelente rendimiento diagnóstico, con valores de AUC superiores a 0,95 en TCGA-LUAD y alta precisión en GSE115002. El análisis de supervivencia mostró que una alta expresión de cada gen se asociaba significativamente con una supervivencia global y libre de enfermedad más corta, y la regresión multivariante de Cox verificó su valor pronóstico independiente. El análisis de enriquecimiento funcional indicó que estos tres genes participan en la transición epitelial-mesenquimato, la remodelación de la matriz extracelular y la inmunosupresión, todos ellos estrechamente relacionados con la invasión y metástasis de LUAD. Los autores construyeron además un nomograma pronóstico combinando los tres genes y la etapa TNM, logrando un índice de concordancia de 0,743 y demostrando un buen rendimiento predictivo. Estos hallazgos confirman que B3GNT3, FERMT1 y SPP1 son biomarcadores diagnósticos y pronósticos prometedores para LUAD, apoyando su aplicación clínica en la estratificación y gestión del riesgo.

Introduction

El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad por cáncer a nivel mundial, representando aproximadamente 1,8 millones de muertes en 2020^. El adenocarcinoma pulmonar (LUAD) representa casi el 40% de todos los casos de cáncer de^{pulmón 2}. A pesar de los avances en cirugía, terapia dirigida e inmunoterapia, la tasa de supervivencia a 5 años para el LUAD avanzado sigue por debajo del 20^%3,4. Se necesitan urgentemente biomarcadores moleculares fiables para la detección precoz y una pronóstica precisa. La secuenciación de alto rendimiento y las bases de datos públicas como The Cancer Genome Atlas (TCGA) y Gene Expression Omnibus (GEO) permiten un perfil transcriptómico sistemático de^{cánceres 5,6}. La bioinformática integrativa entre cohortes mejora la fiabilidad del descubrimiento de biomarcadores candidatos⁵.

Muchos genes y vías han sido implicados en LUAD, incluyendo la proliferación celular, la señalización de EGFR y la fuga^{inmunitaria 7}. Sin embargo, pocas se han traducido en uso clínico. Los modelos de riesgo que combinan firmas génicas y características clinicopatológicas—especialmente los nomogramas—mejoran la precisión pronóstica en^{LUAD 8}. Aunque B3GNT3, FERMT1 y SPP1 se han vinculado individualmente a la progresión del cáncer, su valor diagnóstico combinado, pronóstico y regulador del microambiente inmunológico en LUAD no ha sido validado sistemáticamente entre cohortes independientes. Este estudio proporciona el primer análisis integrado y multiplataforma de estos tres genes como panel unificado de biomarcadores para LUAD, con un nomograma pronóstico clínicamente aplicable.

B3GNT3 codifica una glicosiltransferasa que estabiliza PD-L1 y promueve la evasión inmune ^9,10. FERMT1 (kindlin-1) regula la activación de la integrina y fomenta la metástasis en el cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCLC^)11,12. SPP1 (osteopontina) media la remodelación de la matriz extracelular, la transición epitelio-mesenquimatosa (EMT) y la quimioresistencia 13,14,15. También se ha demostrado que los genes relacionados con el reloj circadiano predicen el pronóstico y el diagnóstico de^{LUAD 16}, mientras que las diferencias sexuales en LUAD se han descubierto mediante redes integrativas de señalización proteica^{multiómica 17}. B3GNT3 y SPP1 son secretados o localizados en membrana, lo que apoya su posible uso como biomarcadores mínimamente invasivos. La clasificación efectiva de LUAD e identificación de biomarcadores también puede lograrse mediante métodos de selección de características^{superpuestas 18}, y las interacciones multiómicas desempeñan papeles funcionales importantes en la progresión del cáncer^{de pulmón 19}. Las firmas génicas mitocondriales, identificadas mediante integración integral de multi-ómicas, también tienen valor para el pronóstico de LUAD y la terapia^{personalizada 20}. B3GNT3 y SPP1 son secretados o localizados en membrana, lo que apoya su posible uso como biomarcadores mínimamente invasivos. Este estudio tuvo como objetivo identificar biomarcadores LUAD robustos utilizando bioinformática integrativa, evaluar su desempeño diagnóstico y pronóstico, explorar sus funciones biológicas y asociaciones inmunitarias, y construir un nomograma pronóstico clínicamente útil.

Protocol

1. Fuentes de datos y preprocesamiento

1. Procesar datos en bruto en R (versión 4.1.3; Windows 10 Pro).
2. Para GSE115002, aplicar la normalización de cuantiles usando limma (versión 3.52.3).
3. Filtrar genes de baja expresión para TCGA: retener genes con CPM > 0,5 en ≥50% de las muestras.
4. Filtrar genes de baja expresión para GSE115002: retener genes con señal media >50.
5. log₂Transformar valores de expresión con un pseudoconteo de +1.
   NOTA: La expresión génica y los datos clínicos de LUAD se obtuvieron de TCGA-LUAD (versión 33.0, GDC Portal, descargada el 7 de agosto de 2025) y GSE115002 (microarray Agilent, GEO, descargada el 7 de agosto de 2025). TCGA-LUAD incluyó 535 tumores y 59 muestras normales. GSE115002 incluyeron 52 tumores y 52 muestras normales coincidentes.

2. Identificación de genes expresados diferencialmente

1. Utiliza DESeq2 (versión 1.36.0) para TCGA RNA-seq y limma (versión 3.52.3) para GSE115002 para análisis de expresión diferencial. Calcula los valores P ajustados (FDR) usando el método de Benjamini–Hochberg.
2. Para garantizar la comparabilidad entre conjuntos de datos, un |log₂FC| unificado ≥ 1.0 se aplicó para ambas cohortes. Los DEG se definieron como FDR < 0,05 y |log₂FC| ≥ 1.0. Los DEGs superpuestos se identificaron usando VennDiagram (versión 1.7.3). B3GNT3, FERMT1 y SPP1 fueron seleccionados como candidatos consistentemente con relevancia al alza y relevancia cancerígena.

3. Evaluación del valor diagnóstico

1. Construye curvas ROC para cada gen candidato.
2. Determina los valores de corte óptimos usando el índice de Youden.
3. Calcula la UCA, la sensibilidad y la especificidad de cada gen.
4. Construye un panel diagnóstico combinado usando regresión logística multivariante.
   NOTA: El paquete pROC v1.18.0 se utilizó para el análisis ROC. La función glm con la familia binomial se utilizó para construir el modelo diagnóstico.

4. Análisis de supervivencia

1. Estratificar a los pacientes en grupos de alta y baja expresión usando la expresión mediana.
2. Genera curvas de supervivencia de Kaplan–Meier para cada gen.
3. Realizar pruebas log-rank para comparar las diferencias de supervivencia.
4. Realizar un análisis de regresión de Cox univariante.
5. Realizar un análisis de regresión de Cox multivariante.
6. Incluir covariables clínicas en los modelos de regresión.
7. Verificar la suposición de riesgos proporcionales usando residuos de Schoenfeld.
8. Calcula una puntuación de riesgo de tres genes.
   NOTA: Se usaron Survival v3.3.1 y survminer v0.4.9. Las covariables incluían edad, sexo, etapa T, etapa N y etapa M. La puntuación de riesgo se calculó como:
   Puntuación de riesgo = (0,328 × B3GNT3) + (0,331 × FERMT1) + (0,321 × SPP1). (1)

5. Enriquecimiento de conjuntos génicos y anotación funcional

1. Realiza un análisis de enriquecimiento GO usando DEGs.
2. Realizar análisis de enriquecimiento de vías KEGG utilizando DEGs.
3. Realizar un análisis de enriquecimiento de conjuntos génicos (GSEA).
4. Clasificar genes por correlación de Pearson con la expresión génica candidata.
5. Identificar términos significativos usando P ajustado < 0,05.
   NOTA: se utilizó clusterProfiler v4.6.2 para análisis GO y KEGG. FGSEA v1.22.0 y MSigDB Hallmark v7.5 se usaron para GSEA.

6. Correlación y análisis de redes

NOTA: La correlación de Pearson se utilizó para la expresión génica distribuida normalmente; Correlación de Spearman para fracciones de células inmunitarias. Las redes PPI se generaron usando STRING (versión 11.5, confianza > 0.7) y se visualizaron en Cytoscape (versión 3.9.1). La infiltración inmunitaria se estimó usando CIBERSORT (modo absoluto, 100 permutaciones). Se ha demostrado que la secuenciación de ARN unicelular revela transiciones específicas en el microambiente NSCLC, relevantes para el análisis de infiltración^{inmunitaria 21,22}, y el análisis integrativo de célula única puede diseccionar aún más los roles de las células inmunitarias, como las células de memoria CD8+, en LUAD 23,24,25.

7. Construcción y validación de nomogramas

NOTA: Las variables para el nomograma se seleccionaron en función de la significación multivariante de Cox (P < 0,05): Etapa T, etapa N, B3GNT3, FERMT1 y SPP1. El nomograma se construyó usando rms (versión 6.5.0). La validación interna utilizaba 1000 remuestreos bootstrap con reemplazo. Se realizaron curvas de calibración y análisis de curvas de decisión (DCA) utilizando RMDA (versión 1.7). El entorno computacional incluía R 4.1.3, Windows 10 Pro y Bioconductor 3.15. Los guiones de análisis están disponibles en https://github.com/[redactado]/LUAD-biomarker-2025 previa solicitud razonable.

8. Análisis estadístico

NOTA: Todas las pruebas estadísticas fueron bidireccionales; P < 0,05 se consideró significativo.

Results

Alteraciones globales de la expresión génica en LUAD

Las comparaciones transcriptómicas entre los tejidos adenocarcinomas pulmonares y los tejidos pulmonares normales identificaron cambios generalizados en la expresión génica. La Figura 1A muestra gráficos volcánicos de genes expresados diferencialmente en el conjunto de datos TCGA-LUAD, y la Figura 1B muestra los del conjunto de datos GSE115002. En la cohorte TCGA-LUAD (Figura 1A), 1865 genes estaban significativamente regulados al alza y 1247 genes a la baja. En la GSE115002 cohorte (Figura 1B), 645 genes fueron regulados al alza y 609 a la baja. Un total de 421 genes fueron consistentemente regulados al alza en ambos conjuntos de datos. Entre estos genes solapados, B3GNT3, FERMT1 y SPP1 están etiquetados en las Figuras 1A y 1B como marcadamente sobreexpresados en muestras tumorales. En TCGA-LUAD, la expresión de B3GNT3 aumentó aproximadamente 5 veces, FERMT1 8 veces y SPP1 10 veces más que los tejidos normales. Se confirmó una regulación al alza similar en GSE115002, con los tres genes mostrando una elevación superior al doble.

Rendimiento diagnóstico de B3GNT3, FERMT1 y SPP1

Se utilizó el análisis de la curva característica de funcionamiento del receptor para evaluar el rendimiento diagnóstico de B3GNT3, FERMT1 y SPP1. La Figura 2A presenta las curvas ROC en la cohorte TCGA-LUAD, y la Figura 2B presenta las de la cohorte GSE115002. Los tres genes alcanzaron una alta precisión diagnóstica en ambas cohortes. En la cohorte TCGA-LUAD (Figura 2A), el área bajo los valores de la curva superó 0,95 para todos los marcadores. En la cohorte independiente de GSE115002 (Figura 2B), se observaron áreas igualmente altas bajo los valores de la curva. La sensibilidad y especificidad oscilaron entre el 85% y el 95% en los valores de corte óptimos. Estos resultados confirman que cada gen proporciona una excelente discriminación entre tejidos tumorales y normales.

Significado pronóstico de la expresión de B3GNT3, FERMT1 y SPP1

Las curvas de supervivencia de Kaplan–Meier en la Figura 3 revelan que una alta expresión de cada gen se asoció significativamente con una supervivencia global más corta en ambas cohortes. Las figuras 3A–3C muestran las curvas de supervivencia global para B3GNT3, FERMT1 y SPP1 en la cohorte TCGA-LUAD. Las figuras 3D–3F muestran las curvas correspondientes en la cohorte GSE115002. Los pacientes con una expresión alta de B3GNT3, FERMT1 o SPP1 mostraron una supervivencia mediana reducida y tasas de supervivencia a 5 años más bajas. El análisis de regresión multivariante confirmó que una alta expresión de SPP1 seguía siendo un factor pronóstico independiente y pobre. La expresión elevada de los tres genes también se asoció con una supervivencia libre de enfermedad más corta. Las tendencias consistentes en ambas cohortes indican que la sobreexpresión de B3GNT3, FERMT1 y SPP1 predice resultados clínicos desfavorables en el adenocarcinoma pulmonar.

Análisis de enriquecimiento funcional

Los resultados del análisis de enriquecimiento funcional se resumen en la Figura 4. La Figura 4A muestra el enriquecimiento GO y KEGG en la cohorte TCGA-LUAD, y la Figura 4B muestra el enriquecimiento en la cohorte GSE115002. Los genes regulados al alza se enriquecieron fuertemente en progresión del ciclo celular, organización de la matriz extracelular, adhesión focal y señalización oncogénica. Los genes regulados a la baja se asociaron con diferenciación epitelial normal y señalización p53. Estas observaciones indican que los tres genes candidatos participan en vías que promueven la proliferación, invasión y desregulación inmunitaria en el adenocarcinoma pulmonar.

Redes de coexpresiones

Las redes de coexpresiones asociadas a B3GNT3, FERMT1 y SPP1 se muestran en la Figura 5. La Figura 5A muestra la red en la cohorte TCGA-LUAD, y la Figura 5B muestra la red en la cohorte GSE115002. Los nodos representan genes y las aristas representan coeficientes de correlación. Los tres genes clave se agrupan con los genes de remodelación de la MEC, la regulación inmunitaria y la organización del citoesqueleto. Estos hallazgos sugieren que la sobreexpresión de los tres genes está asociada a un microambiente tumoral inmunosupresor.

Rendimiento del nomograma pronóstico

El nomograma pronóstico se presenta en la Figura 6. El modelo se construyó integrando la etapa patológica T, la etapa patológica N y los niveles de expresión de B3GNT3, FERMT1 y SPP1 para predecir la supervivencia global a 1, 2 y 3 años en LUAD. Se asignan puntos a cada variable, y el total de puntos corresponde a la probabilidad de supervivencia predicha. El modelo alcanzó un índice de concordancia de 0,743, lo que indica un buen rendimiento predictivo. Las curvas de calibración mostraron una estrecha concordancia entre las probabilidades predichas y reales de supervivencia. El análisis de la curva de decisión confirmó el beneficio neto clínico. Este nomograma mejora la predicción individualizada de supervivencia más allá de la etapa convencional de TNM.

En resumen, este estudio destaca a B3GNT3, FERMT1 y SPP1 como actores moleculares clave en la patogénesis de LUAD. Su sobreexpresión se correlaciona con fenotipos tumorales invasivos, remodelación estromalica y evasión inmune. A través de la integración multiómica, demostramos el valor combinado de estos genes para el diagnóstico, el pronóstico y la estratificación del paciente. Futuras investigaciones deberían explorar su relevancia predictiva para la respuesta a la inmunoterapia y evaluar su potencial como objetivos terapéuticos en LUAD.

Figura 1: Gráficos volcánicos de genes expresados diferencialmente en tumores LUAD frente a tejidos normales. (A) Conjunto de datos TCGA-LUAD. (B) GSE115002 conjunto de datos. El rojo indica genes significativamente aumentados; El azul indica genes regulados a la baja. B3GNT3, FERMT1 y SPP1 están etiquetados como consistentemente regulados al alza. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Curvas ROC para B3GNT3, FERMT1 y SPP1 para distinguir LUAD de tejidos normales. (A) Cohorte TCGA-LUAD. (B) GSE115002 cohorte. Los valores de AUC demuestran una alta precisión diagnóstica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Curvas de supervivencia global de Kaplan-Meier estratificadas por niveles de expresión de B3GNT3, FERMT1 y SPP1 . (A–C) Cohorte TCGA-LUAD. (A) B3GNT3, (B) FERMT1, (C) SPP1. (D–F) GSE115002 cohorte. (D) B3GNT3, (E) FERMT1, (F) SPP1. Una alta expresión de cada gen se asocia significativamente con una supervivencia global más corta en ambas cohortes. Se proporcionan los valores de HR y P de las pruebas logarítmicas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Análisis de enriquecimiento GO y KEGG de los DEG correlacionados con los tres genes clave. (A) Cohorte TCGA-LUAD. (B) GSE115002 cohorte. Los términos de enriquecimiento incluyen proceso biológico (BP), componente celular (CC), función molecular (MF) y vías KEGG. Los genes regulados al alza se enriquecen en proliferación, remodelación de ECM y señalización oncogénica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Redes de coexpresiones génicas asociadas con B3GNT3, FERMT1 y SPP1. (A) Cohorte TCGA-LUAD. (B) GSE115002 compañero. Los nodos representan genes y las aristas representan coeficientes de correlación. Los tres genes clave se agrupan con los genes de remodelación de la MEC, la regulación inmunitaria y la organización del citoesqueleto. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Nomograma pronóstico integrando la etapa patológica T, etapa patóloga N, B3GNT3, FERMT1 y expresión de SPP1 para predecir la supervivencia global a 1, 2 y 3 años en LUAD. Se asignan puntos a cada variable, y el total de puntos corresponde a la probabilidad de supervivencia predicha. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

El nomograma se construyó mediante análisis de regresión de Cox multivariante basado en la cohorte TCGA-LUAD. Los predictores incluyen la etapa patológica de T, la etapa patológica N y el estado de expresión génica de B3GNT3, FERMT1 y SPP1 (categorizados como Alto vs. Bajo según la expresión mediana). Para cada paciente, las puntuaciones individuales de cada variable se suman para generar un valor de "Puntos Totales", que corresponde a probabilidades globales estimadas de supervivencia a 1, 2 y 3 años. Puntuaciones totales más altas indican un mayor riesgo de mortalidad. Esta herramienta proporciona predicciones individualizadas de supervivencia y ayuda a la estratificación del riesgo de LUAD. El aprendizaje automático se ha utilizado para revelar patrones diversos de muerte celular en el pronóstico y la terapia de^LUAD 21,22,23, lo que podría optimizar aún más nuestro modelo de nomogramas.

Este estudio identificó B3GNT3, FERMT1 y SPP1 como biomarcadores diagnósticos y pronósticos robustos en LUAD mediante análisis bioinformático integrado. Los tres genes están consistentemente sobreexpresados en los tumores, distinguen tumores del tejido normal con alta precisión, predicen una mala supervivencia y regulan las vías relacionadas con la EMT, la remodelación matricial y la evasión inmune. Un nomograma combinado mejora la estratificación del riesgo más allá de la etapa TNM. B3GNT3 promueve la evasión inmune estabilizando PD-L1 mediante^{glicosilación 9,10}. FERMT1 potencia la señalización de integrina y la motilidad celular, impulsando la invasión y la metástasis^11,12. SPP1 actúa como un impulsor secretado de EMT, angiogénesis y la polarización 13,14,15 de los macrófagos M2. En conjunto, definen un subtipo agresivo de LUAD caracterizado por invasividad e inmunosupresión.

Estudios previos informaron de los roles individuales de B3GNT3, FERMT1 o SPP1 en LUAD. Este estudio es el primero en validar los tres como un panel unificado entre cohortes transcriptómicas independientes, con el desempeño diagnóstico y pronóstico confirmado tanto en los datos de TCGA como en GEO. Trabajos recientes sobre biomarcadores LUAD respaldan el valor de las firmas génicas asociadas al sistema inmunitario para el pronóstico y la guía de inmunoterapia. Estudios recientes que utilizan bioinformática integrada y aprendizaje automático han identificado múltiples firmas génicas para el diagnóstico y pronóstico de^{LUAD 21,22}. Estos enfoques, similares a nuestro panel de tres genes, destacan el valor de los biomarcadores basados en transcriptomas en la estratificación clínica.

La remodelación de la matriz extracelular es una característica central de la LUAD agresiva, y las firmas relacionadas con ECM han sido validadas como factores pronósticos independientes. Nuestros hallazgos de que FERMT1 y SPP1 están estrechamente asociados con la adhesión focal y la interacción ECM–receptor apoyan aún más el papel crítico de la remodelación matricial en la progresión de LUAD. De forma similar a CHAF1B y las firmas génicas relacionadas con ubiquitina reportadas en medicina interdisciplinar (IMed^)21,23, nuestros tres genes están estrechamente asociados con la infiltración inmunitaria y pueden servir tanto como marcadores pronósticos como predictivos. Las estrategias alternativas para identificar biomarcadores de LUAD incluyen la secuenciación de ARN unicelular, la transcriptómica espacial, la selección de características basada en aprendizaje automático y el perfilado proteómico^plasmático 24,25,26. Algoritmos de aprendizaje automático como el bosque aleatorio o LASSO podrían refinar aún más la selección de biomarcadores. La validación en laboratorio húmedo mediante qPCR, IHC y ELISA es esencial para confirmar la traducción^clínica 27,28,29,30.

Este estudio está limitado por su diseño retrospectivo, la dependencia de datos transcriptómicos públicos y la falta de validación clínica externa. La validación por nomograma se limitaba al muestreo interno de bootstrap. Los datos transcriptómicos masivos no pueden resolver la expresión a nivel celular. La causalidad mecanicista requiere experimentos funcionales. Las correlaciones con la infiltración inmune se basan en la deconvolución computacional y deben interpretarse con cautela. Futuros estudios deberían validar estos biomarcadores en cohortes prospectivas utilizando IHC, qPCR y ELISA en suero. La transcriptómica unicelular y espacial aclarará las fuentes celulares y la distribución espacial. Debe evaluarse el valor predictivo de la inmunoterapia y la respuesta terapéutica dirigida. La selección terapéutica de B3GNT3, FERMT1 y SPP1 puede ofrecer nuevas estrategias para el tratamiento de LUAD.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Publicly Available Datasets	TCGA-LUAD Dataset	The Cancer Genome Atlas (TCGA) Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/); 535 LUAD tumor samples, 59 adjacent normal lung tissue samples (RNA-sequencing count/FPKM values + clinical data: survival, TNM staging)	Transcriptomic and clinical data for differential expression, survival, and nomogram analysis; primary study cohort
	GSE115002 Dataset	Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE115002); Agilent microarray, 52 LUAD tumor tissues, 52 matched adjacent normal lung tissues (treatment-naïve primary tumors)	Independent validation cohort for differential expression, diagnostic performance, and immune infiltration analysis
Bioinformatics Software & Programming Environment	R Programming Language	Version 4.1	Core platform for all transcriptomic, statistical, and graphical analyses
	R Packages (Differential Expression)	DESeq2, limma	DESeq2: TCGA RNA-seq raw count differential expression analysis; limma: GSE115002 microarray normalization and differential expression analysis (Benjamini–Hochberg FDR correction)
	R Packages (Diagnostic Analysis)	pROC	Construction of ROC curves, calculation of AUC (95% CI), optimal cutoff determination (Youden’s index) for diagnostic performance assessment
	R Packages (Survival Analysis)	survival, survminer	Kaplan–Meier survival curve generation, log-rank test, univariate/multivariate Cox proportional hazards regression (HR + 95% CI); patient stratification by median gene expression
	R Packages (Functional Enrichment)	clusterProfiler, fgsea	clusterProfiler: GO (BP/CC/MF) and KEGG pathway enrichment analysis (adjusted P < 0.05); fgsea: GSEA for MSigDB Hallmark/KEGG gene sets (FDR < 0.25)
	R Packages (Nomogram Construction & Validation)	rms	Development of prognostic nomogram (integration of gene expression + TNM stage); Harrell’s C-index calculation, bootstrap resampling (1000 repetitions) for bias correction, calibration plot generation
	R Packages (Statistical & Visualization)	ggplot2, ComplexHeatmap, corrplot	Generation of volcano plots, bubble plots (enrichment), heatmaps (immune infiltration correlation), scatter plots (gene co-expression); Pearson/Spearman correlation analysis
Bioinformatics Databases & Tools (Network/Immune Analysis)	STRING Database	Confidence score > 0.7	Construction of protein–protein interaction (PPI) networks for B3GNT3/FERMT1/SPP1 and first-degree interactors
	Cytoscape	-	Visualization of PPI and gene co-expression networks (edge weighting by correlation strength, hub gene identification)
	Immune Deconvolution Algorithm	CIBERSORT	Estimation of immune cell infiltration abundance (M2 macrophages, CD8+ T cells, neutrophils, NK cells, etc.) in LUAD samples; correlation with candidate gene expression
Other Tools	Microsoft Office/LaTeX	-	Manuscript preparation, figure assembly, and table formatting; statistical result compilation