Análisis micro-CT cuantitativo del parénquim pulmonar y la remodelación de las vías respiratorias en un modelo de Ferret de fibrosis pulmonar

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para usar micro-CT para evaluar cuantitativamente las características de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en un modelo de hurón. Este modelo de hurón demuestra un fuerte potencial traslacional para comprender la fibrosis pulmonar y probar nuevas terapias.

Resumen

La fibrosis pulmonar (PF) es una enfermedad pulmonar crónica y progresiva caracterizada por una lesión alveolar repetitiva que provoca engrosamiento del parénquimato, cicatrización y deterioro respiratorio. Los modelos actuales de roedores, especialmente los que utilizan bleomicina (BLEO), tienen una relevancia traslacional limitada para la fibrosis pulmonar idiopática humana (IPF) debido a diferencias anatómicas como la ausencia de bronquiolos respiratorios. Para abordar esta limitación, desarrollamos un modelo animal grande de fibrosis pulmonar en hurones, que poseen bronquiolos respiratorios similares a los humanos. Los hurones salvajes de tres meses recibieron instillación intratraqueal de BLEO. Se extrajeron pulmones 8 semanas después del tratamiento para tomografía microcomputarizada (micro-TC) y evaluación histológica. Debido a la limitada resolución espacial de la TC multidetector (MDCT) para visualizar las pequeñas vías respiratorias del hurón, los pulmones extirpados se fotografiaron ex vivo usando un microescáner CT a presiones controladas de las vías respiratorias (0 cmH₂O y 25 cmH₂O) para simular condiciones espiratorias e inspiratorias.

La imagen micro-TC reveló diferencias estructurales claras entre los pulmones de hurón normales y tratados con BLEO. Los pulmones normales mostraron baja atenuación y arquitectura preservada, mientras que los pulmones tratados con BLUO mostraron una atenuación marcadamente aumentada compatible con fibrosis. Eran evidentes características de la enfermedad pulmonar fibrótica humana, incluyendo panalización con espacios quísticos, engrosamiento de los septos interlobulares y opacidades del vidrio esmerilado indicativas de cambios fibróticos o inflamatorios tempranos. Mediante análisis cuantitativo de micro-TC, se observó que las vías respiratorias en pulmones de hurón tratados con BLEO mostraron una reducción significativa de la expansión radial, el estiramiento longitudinal y el cambio de volumen a ambas presiones aplicadas. Además, el análisis emparejado por generaciones reveló un engrosamiento significativo de las paredes de las vías respiratorias en regiones con fibrosis visualmente visible. La evaluación histológica, incluida la tinción tricroma de Masson, confirmó una extensa deposición de colágeno y fibrosis.

Este estudio demuestra que los hurones tratados con BLUO desarrollan características radiológicas, mecánicas e histopatológicas similares a la fibrosis pulmonar humana. Además, la micro-TC permite una evaluación de alta resolución de la distribución fibrótica, la dinámica de las vías respiratorias y los cambios en el volumen pulmonar. Estos hallazgos ponen de relieve el potencial del hurón como modelo traslacional para estudiar la patogénesis de la fascia plantar y evaluar nuevas estrategias terapéuticas.

Introducción

La fibrosis pulmonar (PF) es una enfermedad pulmonar intersticial crónica y progresiva en la que una lesión alveolar repetida provoca engrosamiento parénquimatoso, fibrosis y disfunción respiratoria^{progresiva 1}. La fibrosis pulmonar puede ser inducida por diversas exposiciones, incluyendo medicamentos, toxinas ambientales, infecciones, trastornos autoinmunes subyacentes, o puede ser^{idiopática 1}. Aunque se han desarrollado medicamentos para ralentizar la progresión de la enfermedad, especialmente en pacientes con fibrosis pulmonar idiopática (FI), la fibrosis pulmonar sigue siendo incurable, con una tasa de supervivencia de 3–5 años tras el diagnóstico ^1,2. En la mayoría de los casos, el único tratamiento definitivo es un trasplante de pulmón; Por lo tanto, es urgente desarrollar opciones terapéuticas nuevas y más efectivas.

La bleomicina es un medicamento comúnmente utilizado en humanos para el tratamiento de malignidades; sin embargo, su uso está limitado por la toxicidad pulmonar, que puede progresar rápidamente hacia fibrosis^{pulmonar 3}. Tras el descubrimiento de este efecto secundario, la bleomicina se utilizó en investigación para desarrollar modelos animales de fibrosis pulmonar. Los ratones se han utilizado comúnmente para este^{propósito 4,5,6} con varios métodos de administración de Bleomicina, incluyendo la instillación intraintraqueal^{e intratraqueal 7,8}. Aunque la fibrosis se desarrolla en estos modelos, ninguno de ellos abarca todas las características cardinales de la fibrosis pulmonar observadas en humanos^. Los modelos de fibrosis pulmonar en roedores no reflejan características clave de la enfermedad avanzada, incluyendo la formación de quistes en panales y la bronquiolización de los alvéolos^{distales 9}. Además, los estudios han demostrado que la lesión pulmonar inducida por la bleomicina comienza a resolverse espontáneamente en roedores aproximadamente 28 días después del tratamiento^{con bleomicina.} Además, ninguno de los agentes que han demostrado inhibir la fibrosis en estos modelos ha tenido un efecto equivalente en humanos, limitando nuestras opciones^{terapéuticas 11}.

Los hurones domésticos (Mustela putorius furo) se utilizan cada vez más en la investigación biomédica respiratoria debido a sus similitudes anatómicas con el sistema respiratorio^{humano 12}. Además, son susceptibles a patógenos respiratorios similares que infectan a los humanos, incluyendo el virus respiratorio sincitial (VRS) y la gripe, lo que muestra sus similitudes^{fisiológicas.} Los modelos de bleomicina de hurón demuestran bronquiolización, la formación de focos fibróticos y la presencia de células aberrantes similares a basaloides (KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^–/TP63⁺)⁹. Una sola dosis de bleomicina indujo fibrosis pulmonar sostenida en hurones, con fisiología restrictiva y anormalidades fibróticas en los pulmones que persistieron al menos durante 22^semanas. Este hallazgo difiere sustancialmente del modelo ampliamente utilizado de la bleomicina en ratón, donde la fibrosis suele ser autolimitante y comienza a resolverse tras aproximadamente 28 días, con una regresión sustancial que ocurre entre las 6 y 8 semanas, lo que sugiere que el modelo de hurones puede recapitular mejor la naturaleza crónica y progresiva de la fibrosis pulmonar humana. Además, los hurones se han utilizado recientemente en la investigación sobre la fibrosis quística, una enfermedad sistémica que afecta más comúnmente al sistema respiratorio, debido a su similitud con los humanos^. Por lo tanto, estos animales pueden servir como mejores modelos para la fascita plantar que los modelos anteriores de roedores.

Este estudio actual tenía como objetivo desarrollar un modelo animal de fibrosis pulmonar que se asemeje más a la condición humana. Administramos bleomicina intratraqueal a hurones domésticos. Tras 8 semanas, estos hurones mostraron cambios radigráficos e histológicos similares a los observados en humanos con fibrosis pulmonar.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan (Aprobación del protocolo animal nº PROTO202300066). Los protocolos de cuidado animal y experimentales fueron aprobados por la Universidad Estatal de Michigan y realizados en cumplimiento con los estándares institucionales para el uso ético de animales en la investigación.

1. Instillación broncoscópica de bleomicina en hurones

1. Adquiere hurones machos que tengan entre 3 y 4 meses de edad. El peso medio de un hurón macho a esta edad debería ser aproximadamente de 0,9 a 1,6 kg. Alojar a los animales a 21 °C con una humedad del 40%–50%.
2. Administra gas isoflurano al hurón entre un 3% y un 5% utilizando una máquina de anestesia vaporizadora de precisión.
3. Mantener la anestesia cubriendo la nariz del hurón con un cono nasal y continuar administrando gas isoflurano a una concentración del 3%–5%.
4. Cuando el hurón esté adecuadamente sedado y recostado, inicia la broncoscopia usando un broncoscopio de 2,7 mm de diámetro exterior.
5. Inyecta una mezcla de bleomicina (2 U/kg de peso corporal) y suero fisiológico a través del canal de trabajo en la tráquea distal para permitir la dispersión difusa de la bleomicina. Asegúrate de que el volumen total infundido no supere 1 mL. Devuelve a los hurones a sus respectivas viviendas y vigila durante 8 semanas.
   NOTA: La instalación no debe durar más de dos minutos.
6. Administra isoflurano usando una máquina de anestesia de gas vaporizador de precisión. Cubre la nariz del hurón con un cono nasal, y administra isoflurano entre 1% y 5% hasta que el hurón esté recostado. Continúa con la exposición a gases hasta que se pueda confirmar una muerte clínica aparente. Administrar solución de eutanasia intravenosa a una dosis de 90 mg/kg y controlar los signos vitales hasta confirmar la muerte.
7. Extraer los pulmones 8 semanas después del tratamiento para microtomografía computarizada (micro-TC) y evaluación histológica.

2. Micro-TC de alta resolución de pulmones de hurón

1. Prepara tejido pulmonar extirpado para la imagen, extrayendo tejido y sangre extrínsecos mediante la incisión de la vena cava inferior para permitir el drenaje sanguíneo. Realiza el TAC inmediatamente después de preparar los pulmones.
2. Obtén imágenes tomográficas micro-CT usando un sistema micro-CT con los siguientes ajustes de adquisición de imagen: 90 keV, 88 μA, ajuste de potencia con un filtro colimador de rayos X de cobre de 60 μm y de aluminio de 500 μm, usando un campo de visión (FOV) de 72 mm a una resolución isotrópica de imagen de 144 μm.
3. Adquirir un total de 5 imágenes a tiempos estándar de pórtico de 18 s usando un protocolo de unión automatizado para solapar, unir y rechazar cortes duplicados para crear una imagen final cogida para análisis de la tubería de vías respiratorias; esto resultará en un FOV cilíndrico de 68 mm de diámetro x 186 mm de profundidad total de imagen cosida (plano Z) a 144 μm de resolución voxel, permitiendo la captura completa de todo el bloque pulmonar de hurón ex vivo .
   1. Repita este protocolo de imagen para cada conjunto de pulmones de hurón ex vivo a presiones pulmonares de 0_{cmH 2}O y 25 cmH₂O.
   2. Utiliza un sistema de monitorización de presión conectado directamente al pulmón para controlar y mantener con precisión la presión en las vías respiratorias durante la imagen.
   3. Acopla el medidor a una fuente de flujo de aire regulado para permitir un ajuste continuo de la presión intrapulmonar.
   4. Antes de la imagen, ajusta el sistema al nivel de presión deseado (ya sea 0 cmH₂O o 25 cmH₂O) e infla el pulmón con un flujo de aire constante.
   5. Durante la imagen, utiliza el medidor de presión para proporcionar retroalimentación en tiempo real sobre la presión de las vías respiratorias y compensar cualquier pequeña fluctuación de presión usando la fuente de flujo de aire.

3. Procesamiento de imágenes y segmentación

1. Carga los volúmenes de imagen micro-CT reconstruidos en formato DICOM, que se convierten a un formato de iniciativa de tecnología informática de neuroimagen (NIfTI), en la tubería de segmentación de las vías respiratorias.
2. Defina la región de interés (ROI) en la imagen micro-CT recortando manualmente las cortes axiales en el extremo superior para excluir el tubo y otras inserciones traqueales (véase la Figura 1A).
3. Realizar segmentación de vías respiratorias utilizando el algoritmo automatizado de congelación y crecimiento^15,16 descrito en los siguientes pasos principales.
   1. Colocar una semilla dentro de la tráquea en la sección axial más alta dentro del ROI; crear un array de imágenes vacío con tamaño de imagen de entrada para representar el volumen inicial de la vía aérea segura (CAV) con todos los vóxeles asignados a '0'; y añadir el vóxel semilla a CAV estableciendo su valor en '1'.
   2. Establezca un umbral conservador inicial de intensidad micro-CT t = -1000 HU para la segmentación del lumen de la vía aérea.
   3. Crea un array de imágenes vacío con tamaño de imagen de entrada para representar el volumen prohibido (FV) con todos los vóxeles inicializados a '0'.
   4. Repite la segmentación iterativa hasta que la convergencia de la segmentación de lumenes de las vías respiratorias esté definida por una de las dos señales: 1) se comprueba todo el rango umbral (-1000 a -600 HU), o 2) todos los vóxeles '0' adyacentes a los vóxeles '1' en la imagen CAV se marquen como '1' en la imagen FV.
      1. Calcular el árbol central de la línea^{central del CAV 17} e identificar los extremos de la rama^{terminal 18}.
      2. Aplicar umbral binario en la imagen micro-CT al valor actual de t y calcular el nuevo volumen conectado con^{lúmenes 18} con CAV como semillas sobre la región umbral (valor de vóxeles ≤ t), excluyendo FV.
      3. Para cada extremo CAV, calcular los vóxeles asociados dentro del nuevo volumen de lúmenes, excluyendo los CAV, que están más cerca de ese extremo que de cualquier otro extremo CAV.
      4. Detectar el extremo CAV con un gran volumen de vóxeles asociados (>150 vóxeles, equivalente a 0,5 mm³) como posibles sitios de fuga en el nuevo volumen de lúmenes.
      5. Confirmar una posible fuga de lumen utilizando los criterios automatizados definidos en Nadeem et ^al.15.
      6. Elimina cualquier fuga en el volumen de lumen eliminando el volumen del subárbol distal a las raíces de fuga, y añade vóxeles alrededor de las raíces de fuga para aumentar la FV usando los algoritmos descritos^{anteriormente 15}.
      7. Asigna el volumen de lúmenes eliminados por fuga para actualizar el CAV usando los algoritmos descritos^{anteriormente 15}.
      8. Incrementa el umbral t por '1'.
      9. Ve al paso 3.3.4.
4. Realizar el cálculo de un árbol de línea central de vía aérea de un vóxel de grosor utilizando un algoritmo automatizado previamente^{validado 17} descrito en los siguientes pasos principales.
   1. Introduce el árbol segmentado de la vía aérea como una imagen binaria NIfTI.
   2. Calcular el árbol inicial de la línea central de la vía aérea usando un enfoque de camino de coste mínimo^{preferido medialmente 17} descrito en los siguientes pasos principales.
      1. Crear un array de imágenes esqueléticas vacías con tamaño de imagen de entrada con todos los vóxeles asignados a '0'; Añadir la semilla automatizada del paso 3.3.1 como el vóxel esqueleto inicial con el valor '1'.
      2. Crea un array de imágenes vacío con el tamaño de la imagen de entrada asignando todos los vóxeles a '0' para representar la imagen marcada del volumen de la vía aérea.
      3. Identifica el vóxel en el volumen no marcado de la vía aérea que está más alejado al esqueleto actual y calcula el camino de coste mínimo medialmente preferido que conecta este punto con el esqueleto actual usando el algoritmo descrito^{anteriormente 17}.
      4. Añadir el camino resultante como una nueva rama esquelética al array de imágenes del esqueleto, y actualizar el volumen marcado por la vía aérea aplicando dilatación local adaptativa a escala a lo largo de la rama, como se describió^{anteriormente en 17}.
      5. Repite los pasos 3.4.2.3–3.4.2.2.4 hasta que el volumen marcado de las vías respiratorias esté lleno.
   3. Poda ramas topológicas espurias preservando las verdaderas líneas centrales de las vías respiratorias utilizando una estrategia de selección local basada en escala sobre la longitud de las ramas, como se describió^{anteriormente 17}.
   4. Eliminar los puntos^{simples 19} en la línea central de la vía aérea que no sean extremos de ramificación (es decir, aquellos adyacentes a más de un vóxel central) para asegurar la consistencia topológica y mantener una línea central de un solo voxel de grosor.
5. Realizar segmentación del parénquima pulmonar en microimágenes de pulmones de hurón a 0_{cmH 2O}.
   1. Delimitar manualmente el parénquima pulmonar en cada cinco cortes de imagen coronal utilizando algoritmos computacionales e interfaces gráficas integradas en^{ITK-SNAP 20}.
      NOTA: El contraste de intensidad micro-TC entre el parénquima pulmonar y el fondo circundante en el estado de inflación 25 cmH_2Ofue insuficiente, lo que impidió una segmentación fiable del volumen pulmonar.
   2. Aplicar interpolación de imagen para generar una segmentación del parénquima pulmonar en las cortas intermedias de la imagen.
   3. Realizar una revisión secundaria de control de calidad para asegurar la continuidad estructural de la segmentación parenquimatosa tanto en la dirección axial como en la sagital.
   4. Excluye la luz de las vías respiratorias y las regiones de la pared del parénquima pulmonar mediante una dilatación local basada en escamas del volumen del lumen, y luego resta el volumen dilatado del parénquima pulmonar.
6. Cuantificar las medidas mecánicas de las vías^{aéreas 21}.
   1. Cuantificar la expansión radial relacionada con la respiración de las vías respiratorias individuales midiendo los cambios en el área de sección transversal del lumen de las vías aéreas (CSA) entre los volúmenes inspiratorios (25 cmH₂O) y los espiratorios (_{0 cmH}2 O). Calcular la expansión radial en una rama de la vía aérea b, denotada por Δ_aire-R(b), como:
      (1)
      donde,_{CSA ins}(b) y CSA_exp(b) denotan el lumen de las vías respiratorias CSA en volúmenes pulmonares inspiratorios y espiratorios. La CSA en b se calcula utilizando un trazado de línea radial y métodos de semi-máximo localmente adaptativos sobre la mitad central de la rama b²².
   2. Cuantifique el estiramiento longitudinal relacionado con la respiración de las vías respiratorias individuales de la siguiente manera:
      (2)
      donde L_ins(b) y L_exp(b) denotan longitudes de trayectoria geodésica de la rama de la vía aérea b en volúmenes pulmonares inspiratorios y espiratorios, respectivamente. La longitud del camino geodésico de una rama se calcula trazando el camino central desde la carina hasta el extremo distal de la^{rama 21}.
7. Cuantificar las medidas basadas en la intensidad del parénquima pulmonar.
   1. Visualiza espacialmente la distribución de intensidad micro-TC del parénquima pulmonar en hurones sanos y fibróticos generando una "representación de volumen 3D a través de la mirada" del volumen del parénquima pulmonar en el contexto del árbol de las vías respiratorias. Logra el efecto de mirada usando mapeo de transparencia definido por intensidad micro-CT y codificación de colores. Aplica el mismo mapeo de transparencia y escalas de codificación por colores tanto a los pulmones de hurón sanos como a los fibróticos. Se aplican los siguientes pasos para generar la representación de volumen 3D con revisión.
      1. Utiliza el Slicer^{3D 23} para abrir la imagen tridimensional (3D) de la segmentación de las vías respiratorias a 0_{cmH 2}O de inflación como una "segmentación".
      2. Genera una representación 3D de la vía aérea usando el módulo de Segmentaciones . Selecciona el volumen de las vías respiratorias como entrada y, en la pestaña Representaciones , haz clic en Crear en la opción Superficie cerrada .
      3. Importa la imagen de intensidad micro-CT con parénquima pulmonar separado en un Slicer 3D como volumen. En esta imagen, los valores originales de intensidad micro-CT se conservan para los vóxeles pulmonares, mientras que a todos los vóxeles no pulmonares se les asigna un valor de -2000 HU.
      4. Configura el mapeo de color y transparencia para las intensidades parenquimatas pulmonares usando el módulo de Renderizado de Volumen . Valores de intensidad del mapa de -1500 HU, -600 HU, 0 HU y 1500 HU a negro, verde, amarillo y rojo, con opacidades de 0, 0,15, 0,3 y 1, respectivamente.
   2. Utiliza el algoritmo desarrollado en este estudio para estimar la fracción de tejido enfermo dentro del parénquima pulmonar analizando la distribución de intensidad observada en la microTC. El método asume que los valores de intensidad de las regiones parenquimales sanas siguen una distribución gaussiana. En contraste, las regiones fibróticas, con intensidades característicamente más altas, distorsionan la gaussianidad del lado derecho del histograma observado. Realiza esta tarea en los siguientes pasos.
      1. Calcular el histograma para una imagen parenquimatosa pulmonar aislada en el paso 3.7.1.3 con 50 bins en el rango de intensidad de -1500 HEU a 500 HU.
      2. Calcular la media de la distribución gaussiana objetivo como modo del histograma y derivar el parámetro de desviación estándar usando los valores de intensidad a la izquierda del modo en el histograma.
      3. Cuantificar el volumen de tejido fibrótico como el exceso de área en el lado derecho del histograma observado que se encuentra por encima de la curva de distribución gaussiana esperada definida por los parámetros medios y de desviación estándar obtenidos en el paso 3.7.2.2.
      4. Calcular la fracción tisular enfermo como la relación entre el volumen del tejido fibrótico y el recuento total de histogramas que representa el volumen de la región parénquima.

Resultados

De los cinco hurones, los pulmones extirpados de un hurón sano y un hurón fibrótico fueron fotografiados mediante un micro-CT a presiones controladas de las vías respiratorias de 0_{cmH 2}O y 25 cmH₂O para simular las inflaciones pulmonares espiratorias e inspiratorias, respectivamente.

La Figura 1 ilustra los resultados intermedios de la cadena de procesamiento de imágenes para la imagen micro-TC (Figura 1A) de un pulmón de hurón ex vivo a 0_{cmH 2}O de presión. La Figura 1B presenta resultados intermedios de segmentación del volumen del árbol de las vías respiratorias a lo largo de iteraciones y parámetros umbral correspondientes en una imagen micro-TC de un pulmón de hurón extirpado inflado a 0_{cmH 2}O. La Figura 1B demuestra la eficacia del algoritmo FG para capturar vías respiratorias más pequeñas mediante relajación de parámetros en iteraciones posteriores. La Figura 1C ilustra los resultados de la detección de árboles en la línea central de las vías respiratorias antes y después de podar ramas espurias.

Se observó que, más allá de la quinta generación, el número de vías respiratorias detectadas en los pulmones fibróticos es notablemente menor que las detectadas en la generación correspondiente en el pulmón sano (Figura 2A). Específicamente, se detectaron 161 ramas de las vías respiratorias en el pulmón sano más allá de la quinta generación, mientras que solo 91 en los pulmones fibróticos se detectaron a lo largo de las generaciones correspondientes. En general, las paredes de las vías respiratorias eran más gruesas en los pulmones fibróticos en comparación con los pulmones sanos (Figura 2B). El análisis computacional reveló un aumento significativo en el grosor de la pared de las vías respiratorias normalizado por el diámetro del lumen en regiones con fibrosis visualmente aparente en comparación con regiones emparejadas en el pulmón sano.

Los pulmones fibróticos mostraron espacios aéreos quísticos pequeños y de paredes gruesas, compatibles con el peinado de miel, engrosamiento de los septos interlobulares y regiones de opacidad del vidrio esmerilado. Las opacidades del vidrio esmerilado se refieren a regiones del pulmón donde el tejido pulmonar engrosado y los espacios aéreos parcialmente llenos hacen que el área se vea difusa y gris en las imágenes de TC. Se observó que los pulmones fibróticos presentaban valores de intensidad TC más altos en el parénquima, correspondientes a las regiones fibróticas. La Figura 3A presenta una "representación de volumen 3D a través de la mirada" del volumen segmentado del parénquima pulmonar junto con el árbol segmentado de las vías respiratorias. Los valores de intensidad de micro-TC sobre el parénquima en los pulmones fibróticos de hurón (-502 ± 238 HU) fueron significativamente más altos (p < 0,001) que en el pulmón sano de hurón (-588 ± 167 HU). El análisis de elevación de intensidad regional (Figura 3B) mostró que el pulmón fibrótico tiene un volumen parénquimata del 27,8% con una intensidad TC elevada (indicado por el área morada en el histograma). En comparación, el pulmón sano tiene solo el 1,24% de su volumen parénquimata con una intensidad TC elevada.

Una comparación visual de la mecánica de las vías respiratorias entre pulmones normales y enfermos ilustra la distribución de biomarcadores mecánicos respiratorios de las vías respiratorias en pulmones de hurones sanos y fibróticos a lo largo de las ramas de las vías respiratorias (Figura 4). Se observó una expansión radial de las vías respiratorias del 66,8% ± 9,8% en los pulmones sanos de hurón, que fue significativamente mayor (p < 0,001) que en los pulmones de hurón fibróticos (32,4% ± 7,6%). También se observó una diferencia significativa (p < 0,001) en el estiramiento longitudinal de las vías respiratorias entre pulmones de hurón sanos (35,7% ± 5,3%) y fibróticos (16,0% ± 4,9%).

Se obtuvieron imágenes representativas de TC utilizando un microescáner CT a dos presiones diferentes de las vías respiratorias (0 cmH₂O y 25 cmH₂O) para cada pulmón. La Figura 5 ilustra las diferencias entre los pulmones de hurón normales (Figura 5B,C) y los tratados con BLUO (Figura 5E,F). En los pulmones normales, las tomografías computarizadas muestran una arquitectura pulmonar típica con baja atenuación y sin signos de fibrosis (Figura 5B, C). En cambio, los pulmones de hurón tratados con BLIO presentan cambios patológicos significativos, incluyendo un aumento de la atenuación pulmonar, indicativa de fibrosis tisular (Figura 5E,F). Además, se observa un prominente panal, caracterizado por espacios quísticos y tabos interlobulares engrosados (Figura 5E,F). Las opacidades del vidrio esmerilado (GGO), que representan áreas de inflamación o cambios fibróticos tempranos, también son visibles en los pulmones tratados con BLUO (Figura 5E, F).

El análisis histológico (Figura 6) confirmó una remodelación y fibrosis significativa en pulmones de hurón tratados con bleomicina. La tinción de hematoxilina y eosina (HE) reveló una arquitectura alveolar preservada en pulmones normales (Figuras 6A, C), mientras que los pulmones fibróticos mostraron una extensa distorsión estructural, aumento de la celularidad, engrosamiento de la pared de las vías respiratorias y lesiones fibróticas prominentes (Figura 6B,D). La tinción tricroma de Masson demostró además una deposición mínima de colágeno en las vías respiratorias y parénquima de pulmones normales (Figura 6E,G), mientras que los pulmones fibróticos mostraron una marcada acumulación de colágeno tanto en las vías respiratorias (Figura 6F) como en las regiones parénquimales (Figura 6H). El análisis cuantitativo de imágenes (Figura 6I,J) confirmó un aumento significativo en el área positiva de colágeno en pulmones fibróticos en comparación con controles normales tanto en las vías respiratorias como en los compartimentos parenquimales (P < 0,0001), lo que indica una extensa deposición de matriz extracelular y un remodelado progresivo del tejido.

Figura 1: Procesamiento y segmentación de imágenes CT. (A) Selección de la región de interés (ROI) en una imagen micro-CT. La línea de corte se seleccionó manualmente para excluir el tubo y otros insertos traqueales usados para inflar los pulmones de hurón extirpados. (B) Resultados intermedios de la segmentación del árbol de las vías respiratorias en una imagen micro-TC de un pulmón de un hurón extirpado inflado a 0_{cmH 2O}usando el algoritmo de congelar y crecer (FG). (C) Resultados de detección de línea central antes y después de la poda de ramas esqueléticas espurias aplicadas sobre el volumen de segmentación de las vías respiratorias a partir de una imagen micro-TC de un 0_{cmH 2O}. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Análisis computacional de la generación de árboles en las vías respiratorias. (A) El número de vías respiratorias detectadas en pulmones sanos frente a los fibrosos. (B) Diferencias en el grosor de la pared de las vías respiratorias en pulmones sanos frente a los fibróticos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Visualización de la intensidad micro-CT codificada por colores. (A) Una visualización 3D de las distribuciones de intensidad micro-CT codificadas por colores a lo largo del parénquima para pulmones de hurón sanos y fibróticos a 0 cmH2O de inflación. (B) Histogramas de intensidad micro-CT de pulmones sanos y fibróticos de hurones, con el área del histograma marcada en morado indicando regiones de intensidad elevada de TC según modelado gaussiano. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Biomarcadores mecánicos respiratorios de las vías respiratorias para pulmones de hurón sanos y fibróticos. Para cada biomarcador (A muestra la expansión radial de la vía aérea, B muestra el estiramiento longitudinal de la vía aérea), se aplicó un esquema de codificación por colores normalizado que abarca un rango de μ_x ± 3σ_x, donde se calcularon la media (μ_x) y la desviación estándar (σ_x) de cada métrica en todas las ramas del pulmón sano del hurón. Consulte el texto para obtener resultados comparativos cuantitativos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: La imagen micro-TC demuestra una extensa remodelación estructural y pérdida de volumen pulmonar aireado en pulmones fibróticos inducidos por bleomicina. (A–F) Imágenes micro-CT representativas obtenidas a una presión de inflación de 25 cm H₂O comparen hurones controladores sanos (A–C) con hurones fibróticos tratados con bleomicina (D–F). Las reconstrucciones tridimensionales (3D) con renderizado volumétrico (A,D) muestran arquitectura pulmonar preservada y expansión homogénea en pulmones sanos (A), mientras que los pulmones fibróticos (D) presentan una reducción de la expansión pulmonar y una marcada distorsión parénquima. Las TAC transversas (B,E) y coronal (C,F) resaltan aún más las diferencias entre grupos. Los pulmones sanos muestran parénquima uniformemente aireado con ramificación normal de las vías respiratorias y densidad tisular mínima (B,C). En contraste, los pulmones fibróticos muestran una amplia opacación bilateral subpleural y predominante basilar, aumento de la densidad parénquima, distorsión arquitectónica y agrandamiento del espacio aéreo quístico compatible con una remodelación similar a un panal (flechas rojas) (E,F). Líneas amarillas discontinuas delimitan los límites pulmonares. Estos hallazgos de imagen indican una remodelación fibrótica severa y una reducción sustancial del volumen pulmonar funcional aireado tras la exposición a la bleomicina a hurones. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Validación de la fibrosis pulmonar de hurón inducida por BLEO. (A–H) Las secciones representativas de campo claro teñidas con hematoxilina y eosina (HE) muestran diferencias entre pulmones normales (A,C) y pulmones fibróticos (B,D). Las imágenes de HE de bajo aumento muestran arquitectura alveolar preservada en pulmones normales (A) y remodelación extensa de tejidos y lesiones fibróticas en pulmones fibróticos (B). Las imágenes de HE con mayor aumento destacan además la estructura alveolar normal en pulmones normales (C) y el aumento de la celularidad, el engrosamiento de la pared de las vías respiratorias y la distorsión arquitectónica en pulmones fibróticos (D). Imágenes representativas en campo claro de secciones pulmonares de hurón teñidas con el tricromo de Masson muestran una deposición mínima de colágeno en las vías respiratorias pulmonares normales (E) y parénquima (G), y un aumento del depósito de colágeno (azul) en las vías respiratorias fibróticas pulmonares (F) y parénquima (H). (I,J) La cuantificación del área positiva para colágeno reveló un aumento significativo en la deposición de colágeno en pulmones fibróticos en comparación con pulmones normales en ambas regiones respiratorias (I) y parénquima pulmonar (J). P < 0,0001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Este estudio describe un protocolo que combina la administración intratraqueal de bleomicina en hurones con microtomografía computarizada ex vivo de alta resolución (micro-CT) para caracterizar características estructurales y mecánicas de la fibrosis pulmonar. La micro-TC puede detectar pequeñas vías respiratorias de tan solo 0,2 mm y medir volúmenes, grosor, densidad y morfología de las vías respiratorias. El aumento de la densidad tisular, la pérdida de volumen y la heterogeneidad regional corresponden estrechamente con la histopatología. El objetivo principal era establecer la viabilidad y demostrar que este modelo de animales grandes, junto con análisis avanzados de imagen, puede capturar características radiológicas, respiratorias e histopatológicas que se asemejan a la fibrosis pulmonar humana. Varios pasos del protocolo son fundamentales para la reproducibilidad y la interpretabilidad. En primer lugar, la instillación de bleomicina intratraqueal guiada broncoscópicamente permite una exposición difusa pulmonar minimizando la acumulación de vías respiratorias proximales, una limitación conocida de los modelos de animales^{pequeños 4,7,11}. Este enfoque probablemente reduce la variabilidad en la distribución regional de lesiones, lo cual es especialmente importante en pulmones grandes con ramificaciones respiratorias más complejas. En segundo lugar, seleccionar un punto temporal de 8 semanas tras la instillación favorece la fibrosis establecida frente a la inflamación aguda. En los modelos murinos, la fibrosis inducida por bleomicina suele resolverse parcialmente con el tiempo, limitando la relevancia^{traslacional 4,8,11}. En contraste, los pulmones de hurón en este estudio mostraron características fibróticas radiológicas e histológicas persistentes.

La inflación pulmonar controlada durante la imagen ex vivo representa otro elemento crítico. La obtención de imágenes a presiones estandarizadas de las vías respiratorias (0 cmH₂O y 25 cmH₂O) permitió cuantificar la expansión radial de las vías respiratorias y el estiramiento longitudinal, reduciendo así los efectos de confusión del volumen y la compaciencia pulmonares variables. Estos biomarcadores mecánicos de las vías respiratorias, derivados mediante algoritmos automatizados y adaptados a generaciones, proporcionan medidas objetivas de la disfunción de las vías respiratorias que son difíciles de evaluar solo con la histología^{convencional 15,21}.

Varias modificaciones del protocolo pueden mejorar aún más la robustez. La dosificación de bleomicina podría ajustarse o administrarse en dosis bajas repetidas para modelar mejor la lesión epitelial crónica, que es central en los paradigmas actuales de la patogénesis de fibrosis^{pulmonar 1,3}. Las estrategias de instillación segmentaria pueden permitir comparaciones dentro del animal entre regiones fibróticas y relativamente conservadas. Desde el punto de vista de la imagen, es esencial una cuidadosa estandarización de la presión de las vías respiratorias, las condiciones de fijación y la temperatura para minimizar la deformación tisular durante el escaneo ex vivo. La fibrosis grave puede complicar la segmentación automatizada de las vías respiratorias debido a la obliteración de las vías respiratorias y alta densidad tisular; Por lo tanto, el umbral adaptativo y el control manual de calidad siguen siendo complementos esenciales para las tuberías^{automatizadas 15}.

Este método tiene varias limitaciones. Lo más notable es que el pequeño número de animales imaginados por micro-TC limita la inferencia estadística, y los hallazgos deben interpretarse como descriptivos. Este trabajo fue diseñado como un estudio piloto para determinar la viabilidad de caracterizar un modelo de fibrosis pulmonar inducido por bleomicina mediante micro-CT cuantitativo. Serán necesarios futuros estudios con cohortes más grandes para validar estos hallazgos y mejorar el poder estadístico. Sin embargo, la descripción muestra una diferencia notable en los biomarcadores de imagen y las mediciones.

Además, aunque ampliamente utilizada, la fibrosis inducida por bleomicina sigue siendo un modelo de lesión impulsada por toxinas y no refleja completamente la etiología multifactorial de la fibrosis pulmonar idiopática, incluyendo el envejecimiento, la susceptibilidad genética y las exposiciones^{ambientales 3,6,11}. Se realizaron imágenes ex vivo, lo que impidió la evaluación directa del intercambio gaseoso, las contribuciones vasculares y la progresión longitudinal de la enfermedad. No obstante, la micro-TC ex vivo ofrece una resolución espacial superior y permite un análisis tridimensional detallado de pequeñas vías respiratorias, algo que actualmente no es posible con la TC multidetector clínica en hurones.

A pesar de estas limitaciones, este protocolo ofrece varias ventajas respecto a los modelos existentes. Los hurones poseen bronquiolos respiratorios y patrones de ramificación de las vías respiratorias que se parecen más a los humanos que a los roedores, lo que los hace especialmente adecuados para estudiar aspectos centrados en las vías respiratorias de la^{fibrosis 6,12}. La combinación de una anatomía de las vías respiratorias relevante para el ser humano con imágenes cuantitativas basadas en micro-TC permite evaluar simultáneamente la densidad parénquima, el grosor de la pared de las vías respiratorias, la pérdida de vías respiratorias y la deterioración de la mecánica de las vías respiratorias. Estas características reflejan patrones radiológicos observados en la enfermedad pulmonar fibrótica humana, incluyendo el peinado de miel, el engrosamiento del tabique y la heterogeneidad^{regional 1,2}.

La tomografía computarizada de alta resolución (HRCT) es una modalidad de imagen fundamental para el diagnóstico y el seguimiento longitudinal de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) en la práctica clínica. La HRCT se basa en principios similares a la tomografía microcomputarizada (micro-CT) y ha sido optimizada para detectar anomalías pulmonares parénquimales minimizando la exposición a la radiación en^{pacientes 24}. Es importante destacar que los avances en la HRCT han mejorado la precisión diagnóstica hasta el punto de que la biopsia pulmonar quirúrgica a menudo ya no es necesaria para el diagnóstico de IPF cuando se presentan características de imagen²⁵. Los hallazgos radiográficos característicos de la FPI, incluyendo la distorsión arquitectónica, bronquiectasia por tracción, peinado de miel y espacios aéreos quísticos, pueden identificarse mediante HRCT en pacientes. En consonancia con estas observaciones clínicas, nuestro modelo de hurón demuestra la distorsión de las vías respiratorias y la formación de espacio aéreo quístico detectables mediante micro-TC, proporcionando un fenotipo de imagen que se asemeja estrechamente a la enfermedad humana.

Además de la HRCT, la tomografía de coherencia óptica endobronquial (EB-OCT) ha surgido como un enfoque de imagen valioso para la evaluación de la^{IPF 26}. EB-OCT es una técnica mínimamente invasiva que utiliza ondas de luz para generar imágenes tridimensionales de alta resolución del pulmón periférico in vivo mediante un broncoscopio^{estándar 26}. Al igual que la TRH, la EB-OCT ha demostrado ser prometedora para identificar remodelación fibrótica sin necesidad de biopsia quirúrgica. La capacidad de nuestro modelo de hurón para desarrollar anomalías estructurales detectables mediante imágenes basadas en TC sugiere que también podría ser muy adecuado para futuras evaluaciones utilizando modalidades emergentes de imagen clínica como EB-OCT.

Es importante destacar que muchas terapias que atenuan la fibrosis en modelos de roedores no han demostrado una eficacia similar en humanos^. El enfoque descrito aquí puede ayudar a salvar esta brecha traslacional proporcionando biomarcadores de imagen sensibles y espacialmente resueltos que reflejen tanto la estructura como la función. Estos biomarcadores podrían utilizarse para evaluar la respuesta terapéutica más allá de la carga global de colágeno, capturando mejoras regionales en la mecánica de las vías respiratorias o la remodelación parénquima.

En conclusión, este estudio establece un protocolo factible para modelar la fibrosis pulmonar en hurones y para evaluar cuantitativamente los cambios estructurales y mecánicos relacionados con la enfermedad mediante micro-TC. Aunque preliminar, el enfoque destaca el potencial de combinar modelos de animales grandes con análisis avanzados de imagen para mejorar la relevancia traslacional, mejorar la comprensión mecanicista de la fibrosis pulmonar y apoyar la evaluación preclínica de nuevas estrategias terapéuticas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 mL Luer locking syringe	BD	309628
10 mL Luer locking syringe	BD	303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet catheter	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL Luer locking syringe	BD	309657
30 mL Luer locking syringe	BD	302832
5 mL Luer locking  syringe	BD	309647
BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide needle 20 G ´ 1"	BD	305175
BD Precision glide needle 23 G ´ 1"	BD	305145
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-)	Gibco	14190250
Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheter	Caphstion	2.0MM
ET Tube, Uncuffed, 2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater stabilization solution	Fisher Scientific	AM7021
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Lubricant PM ointment	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	Pomada para ojos
MADgic 700 atomizer	Teleflex	MAD700
Manometer, Professional air pressure meter	Leaton	T168
Rodent ventilator model 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
Sterile saline, 0.9%	CellPro	DS0329
Veterinary pulse oximeter	uPM60V	UVMI