Transferencia mitocondrial exógena en adipocitos marrones diferenciadores y preadipocitos deficientes en AGPAT2

Resumen

Las mitocondrias exógenas de origen humano y murino pueden internalizarse diferenciando preadipocitos y rastrearse a lo largo de la diferenciación adipogénica mediante herramientas de imagen y genéticas. Aunque estas mitocondrias interactúan físicamente con la red mitocondrial endógena, no aumentan la expresión de marcadores asociados a adipocitos marrones maduros.

Resumen

Las mitocondrias son núcleos clave de señalización; sin embargo, si la expansión de masa mitocondrial es mecánicamente necesaria para la diferenciación sigue siendo una cuestión abierta. AGPAT2 cataliza la conversión del ácido lisofosfatídico en ácido fosfatídico, y su deficiencia conduce a una deficiencia del tejido adiposo y a una adipogénesis deteriorada asociada a la reducción de la masa mitocondrial. El impacto de la expansión de masas mitocondriales en la adipogénesis se evaluó transfiriendo mitocondrias exógenas a adipocitos marrones diferenciados. También se investigó si la transferencia mitocondrial podría rescatar la adipogénesis alterada de células deficientes en AGPAT2. Las mitocondrias humanas y murinas fueron transferidas con éxito e incorporadas a la red mitocondrial endógena de preadipocitos diferenciadores de ratón, y persistieron durante toda la adipogénesis marrón. Se requería diferenciación adipogénica para la retención de las mitocondrias transferidas. La transferencia mitocondrial no modificó la expresión de marcadores moleculares de adipocitos marrones maduros ni el contenido de gotas lipídicas, aunque afectó la distribución relativa del tamaño de las gotas lipídicas de manera dependiente de la especie. En los preadipocitos Agpat2^-/- , la transferencia mitocondrial no logró rescatar la adipogénesis, lo que indica que la expansión de masa mitocondrial por sí sola es insuficiente para revertir los mecanismos que conducen a la lipodistrofia en este modelo. Estos resultados indican que, aunque las mitocondrias exógenas humanas y murinas pueden incorporarse a la red mitocondrial de adipocitos diferenciados, no influyen directamente en el programa adipogénico.

Introducción

Más allá de sus funciones bioenergéticas principales, las mitocondrias actúan como núcleos de señalización en múltiples procesos celulares, incluyendo la diferenciación celular 1,2,3,4. El tejido adiposo marrón (BAT) posee una masa mitocondrial notablemente alta para apoyar su actividad termogénica, lo que destaca su papel en el balance energético de todo el cuerpo y en la patogénesis de la obesidad⁵. Aunque la masa mitocondrial está regulada por el equilibrio entre biogénesis y mitofagia, sigue sin estar claro si la expansión de masa mitocondrial durante la diferenciación de adipocitos marrones es funcionalmente necesaria para la adipogénesis o simplemente una consecuencia del proceso.

Se ha documentado la transferencia mitocondrial fisiológica entre células tanto in vitro como in vivo, contribuyendo a la adaptación tisular bajo condiciones patológicas, incluyendo disfunción del tejido adiposo asociada a la obesidad y resistencia a^{la insulina 6,7}. Además, se ha demostrado que la transferencia mitocondrial artificial in vitro mejora la capacidad respiratoria de las células^{receptoras 8}. En conjunto, estos hallazgos apoyan el concepto de que la transferencia mitocondrial puede modificar la función metabólica celular y puede contribuir a la adaptación tisular bajo condiciones de estrés bioenergético ^9,10,11. En comparación con las estrategias farmacológicas o genéticas que estimulan la biogénesis mitocondrial endógena activando programas de transcripción nuclear y mitocondrial, la transferencia mitocondrial entrega directamente orgánulos a las células receptoras, permitiendo la rápida modificación de la masa mitocondrial independientemente de las manipulaciones^{transcripcionales 12,13}. Este enfoque es fundamental para corregir defectos en enfermedades mitocondriales, pero también permite estudiar las acciones mitocondriales sin los posibles efectos fuera del objetivo de los enfoques farmacológicos o^{genéticos 14}.

En el presente estudio, investigamos el efecto de aumentar artificialmente la masa mitocondrial mediante transferencia mitocondrial exógena en la diferenciación de adipocitos marrones. Este enfoque permitió una evaluación directa del impacto de la masa mitocondrial en el programa adipogénico. Para lograr esto, los protocolos de transferencia mitocondrial desarrollados originalmente para células madre mesenquimales fueron adaptados¹⁵ utilizando tanto células hepáticas humanas como preadipocitos murinos como donantes mitocondriales. Se desarrolló un método para rastrear las mitocondrias humanas en células de ratón diferenciadas utilizando herramientas genéticas combinadas con técnicas de imagen, demostrando que las mitocondrias de ambos orígenes se incorporan a la red mitocondrial endógena y persisten a lo largo de la diferenciación adipogénica.

Para modelar la adipogénesis defectuosa asociada a baja masa mitocondrial, se utilizaron adipocitos marrones diferenciados derivados de ratones deficientes en 1-acilglicerola-3-fosfato-O-aciltransferasa 2 (AGPAT2) (AGPAT2^-/-). AGPAT2 se expresa altamente en tejido adiposo, donde cataliza la formación de ácido fosfatídico en la vía de biosíntesis de gliceropidos. La deficiencia de AGPAT2 causa lipodistrofia severa tanto en humanos como en ratones y afecta la adipogénesis en modelos de adipocitos blancos y marrones en asociación con una masa mitocondrial^reducida 16,17,18. La incorporación de mitocondrias exógenas en preadipocitos diferenciados alteró ligeramente la distribución del tamaño de las gotas lipídicas, pero no aumentó la expresión de marcadores maduros de adipocitos marrones ni rescató el deterioro adipogénico de los preadipocitos Agpat2^-/-.

Protocolo

Los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Pontificia Universidad Católica de Chile, protocolo 210609003. En este estudio se utilizaron ratones neonatales de tipo salvaje y Agpat2^-/- P0.5 de ambos sexos, derivados de un fondo genético mixto C57BL/6J y 129J. Equipo de protección individual (EPP): Lleva bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes de nitrilo. Consulte el Archivo Suplementario 1 para detalles adicionales del protocolo y la Tabla 1 para los buffers necesarios para este protocolo.

Todos los residuos químicos tóxicos generados durante la preparación por microscopía electrónica, la fijación de paraformaldehído y la extracción de ácidos nucleicos deben segregarse estrictamente en arroyos designados y claramente etiquetados, en cumplimiento con las normativas institucionales de Salud y Seguridad Ambiental (EHS). Bajo ninguna circunstancia se debe verter ninguno de estos reactivos en el fregadero del laboratorio ni en el sistema público de alcantarillado. Todos los residuos químicos peligrosos generados deben segregarse según las clasificaciones institucionales de EHS.

1. Cultivo celular

1. Aislamiento, diferenciación y mantenimiento de los adipocitos primarios (iBAT)
   NOTA: Consulte el Archivo Suplementario 1 para una breve descripción de los procedimientos y la Tabla 1 para la composición de las soluciones requeridas. Una explicación completa y detallada de nuestro protocolo de diferenciación adipogénica marrón in vitro puede encontrarse en Figueroa et ^al.19.
   1. Aislar preadipocitos del tejido adiposo marrón interescapular (iBAT) de ratones neonatales (P0.5) siguiendo los procedimientos quirúrgicos y enzimáticos de digestión descritos por Figueroa et ^al.19.
   2. Diferenciar y mantener el cultivo de adipocitos marrones según el cóctel de diferenciación y el programa de intercambio de medios.
      NOTA: Para una diferenciación adipogénica exitosa, es fundamental que los cultivos alcancen una confluencia del 90–100% antes de iniciar la inducción adipogénica.
2. Cultura HepG2
   1. Cultivar células de HepG2 en DMEM suplementadas con suero bovino fetal al 10%, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 0,25 μg/mL de anfotericina B. Mantener las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂.
      NOTA: Estas células crecen en racimos y pueden parecer subconfluentes a pesar de la alta densidad debido al crecimiento en varias capas.

2. Aislamiento y transferencia mitocondrial

1. Aislamiento mitocondrial
   NOTA: Realizar todos los pasos en un armario de bioseguridad a 4 °C o sobre hielo. Usa la preparación en menos de 2 horas.
   1. Semillas 2 × 10⁶ células donantes (HepG2 o preadipocitos) en recipientes de cultivo de 100 mm. Crece las células hasta que alcancen el 80% (HepG2) o 100% (preadipocitos) de confluencia.
   2. Aplicar células donantes de mancha con MitoTracker Deep Red FM de 100 nM en medio libre de FBS durante 30 minutos a 37 °C en una incubadora de_CO-2 al 5%.
   3. Lava las células dos veces con medio de crecimiento para eliminar el exceso de tinte.
   4. Desacopla las células usando tripsina, recoge la suspensión y centrifuga a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
   5. Resuspende el pellet en 1 mL de buffer de aislamiento mitocondrial (MIB) suplementado con BSA, inhibidores de proteasas e inhibidores de fosfatasa. Altera la membrana plasmática pasando la suspensión por una jeringuilla de tuberculina 5 veces. Homogeneiza la suspensión pasándola por una jeringuilla de insulina al menos 10 veces hasta que la solución sea marrón claro y careza de grumos visibles.
      NOTA: Para el análisis western blot, se obtienen 50 μL del lisado total y se almacenan a -20 °C.
2. Centrifuga el homogenado a 900 × g durante 11 minutos a 4 °C.
   NOTA: Si el sobrenadante tras el spin de 900 × g no está turbio, la lisis celular probablemente esté incompleta.
   1. Recoge el sobrenadante y centrifuga a 10.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para pelletar las mitocondrias. Lava la cápsula mitocondrial 3 veces con MIB complementado con BSA.
   2. Realizar una resuspensión final en 100 μL de MIB libre de BSA. Cuantifica la concentración de proteínas usando un ensayo de proteínas BCA.
3. Ensayo de transferencia mitocondrial (MTA) en preadipocitos
   1. Preadipocitos receptores de semillas a 5 × 10⁵ células/pozo en placas de 12 pozos (con coberturas de 18 mm para microscopía) 24 horas antes del ensayo.
   2. Añadir mitocondrias aisladas de donante directamente al medio receptor en una proporción de 10 μg de proteína mitocondrial por 10^{a 5} células. Balancea suavemente las placas para distribuir las mitocondrias. Incubar las células durante 24–120 horas (correspondientes a los días 1, 3 y 5 de diferenciación) a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO₂ antes del análisis.

3. Consumo mitocondrial de oxígeno y eficiencia de MTA

1. Respirometría mitocondrial
   1. Ajusta el baño maria circulante externo a 25 °C y asegura un equilibrio térmico estable en la camisa de la cámara antes de iniciar cualquier medición.
   2. Realiza una calibración de fase líquida en dos puntos utilizando el software de adquisición del instrumento.
      1. Calibración de saturación de aire (High Point): Añadir 500 μL de agua desmineralizada saturada en aire a la cámara. Ajusta el agitador magnético a 60 rpm y registra la señal hasta que se estabilice en una meseta (>1.500 mV).
      2. Calibración cero de oxígeno (Punto Bajo): Añadir una pequeña cantidad (~3 mm de diámetro) de sulfito de sodio a la cámara para desplazar el aire restante. Graba hasta que la señal baje a una meseta estable (~1% de la señal basal, ~20 mV).
   3. Iniciar la grabación en tiempo real (duración total: ~10 min).
   4. Graba durante 3 minutos hasta que se logre una lectura lineal estable.
   5. Resuspende mitocondrias aisladas en 200 μL de tampón de ensayo mitocondrial (MAS⁾²⁰ suplementado con 5 mM de glutamato y 2,5 mM de malato.
      NOTA: Para el presente trabajo, el pellet de mitocondrias totales fue extraído de dos placas celulares de 100 mm.
   6. Transfiere la suspensión a la cámara de oxigrafo y cierre herméticamente el émbolo de sellado de la cámara, asegurándose de que no queden burbujas de aire.
   7. Registra el consumo de oxígeno durante 3 minutos.
   8. Añade 150 μM de ADP para activar la respiración acoplada mitocondrial y mide la respiración acoplada a la síntesis de ATP durante 3 minutos.
   9. Define manualmente los segmentos estables y lineales correspondientes a cada fase respiratoria. Extrae los valores automáticos de pendiente calculados por el software, expresados como tasas de consumo de oxígeno en nmol∙^mL-1∙^min-1.
      NOTA: Para la limpieza entre cámaras de placa, enjuaga la cámara dos veces con 1 mL de agua desmineralizada y asegúrate de que el interior esté completamente seco. Añade 100 μL de PBS a la recámara antes de pasar a la siguiente placa.
2. Citometría de flujo
   NOTA: Conserva todas las muestras en hielo durante todo el procedimiento para preservar la integridad celular y bioenergética.
   1. Aislar mitocondrias y realizar el ensayo de transferencia mitocondrial (MTA), tal como se describe en las Secciones 2.1 y 2.2, respectivamente, en placas de cultivo de 35 mm, utilizando células donantes previamente etiquetadas con MitoTracker Deep Red FM.
   2. Aspira el medio de cultivo y lava la monocapa celular una vez con 1 mL de PBS estéril.
   3. Añadir 500 μL de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar las antenas a 37 °C hasta observar un desprendimiento celular completo bajo el microscopio.
   4. Neutraliza la tripsina añadiendo 1 mL de medio de crecimiento completo (DMEM con 10% FBS). Transfiere todo el volumen a un tubo cónico de 15 mL y centrifuga a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
   5. Descarta el sobrenadante por aspiración y conserva la pelota celular. Resuspende el pellet en 500 μL de PBS helado mediante pipeteo suave.
   6. Analizar las muestras utilizando un citómetro de flujo equipado con un láser de 640 nm (véase el Archivo Suplementario 1 para detalles sobre la adquisición y análisis de citometría de flujo).
      1. Define la población celular usando gráficos de dispersión directa (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) y aplica una estrategia de acceso para excluir los residuos y los dobletes celulares.
      2. Cuantifique la intensidad de fluorescencia en el canal rojo lejano (filtro de emisión de 670/30 nm) para detectar mitocondrias internalizadas marcadas con MitoTracker.
      3. Realizar análisis usando Floreada.io (véase Archivo Suplementario 1 para detalles del protocolo de acceso).
         NOTA: Incluir un control negativo (células receptoras sin MTA) para establecer la línea base de autofluorescencia de fondo.
3. Microscopía confocal y electrónica
   1. Ensayo de imagen con células vivas
      1. Semilla de preadipocitos primarios derivados de ratones neonatales P0.5 en placas de 12 pozos que contienen laberintos de cobertura de 18 mm, siguiendo los requisitos específicos de densidad celular y medios detallados en la Sección 1.
      2. Aislar las mitocondrias y ejecutar el ensayo de transferencia mitocondrial (MTA) utilizando células donantes previamente etiquetadas con MitoTracker Deep Red FM, según lo especificado en la Sección 2.
      3. Mantener los cultivos receptores en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de_CO2 durante 24 horas para permitir la absorción mitocondrial.
      4. Prepara una solución de trabajo MitoTracker Green de 70 nM diluyendo la culata en un medio de cultivo libre de FBS.
      5. Aspira el medio de crecimiento de las placas de 12 pozos y retitúyelo por la solución verde MitoTracker de 70 nM. Incubar las placas durante 25 minutos a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de_CO-2 para contrarrestar la red mitocondrial total.
      6. Retira la solución de manchas y lava las cubiertas dos veces con 1 mL de medio de cultivo tibio y completo.
      7. Sustituye el volumen final por un medio completo libre de fenol rojo para minimizar la autofluorescencia de fondo durante la adquisición.
      8. Transfiere las cubiertas o la placa al escenario del microscopio confocal. Ajustar la cámara de incubación del microscopio para mantener un entorno constante de 37 °C y 5% de_CO2.
      9. Captura imágenes inmediatamente usando los ajustes adecuados de excitación/emisión tanto para el rojo lejano (MitoTracker Deep Red FM) como para el verde (MitoTracker Green). Consulte el Archivo Suplementario 1 para más detalles.
         NOTA: Realiza todos los pasos de tinción y manipulación en condiciones de poca luz para evitar el fotoblanqueamiento de los fluoróforos. Utiliza un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica (NA) (60x o 100x) para una resolución óptima de la morfología mitocondrial.
   2. Ensayo de inmunofluorescencia confocal con células fijas
      NOTA: Tras la fijación celular, las soluciones tóxicas de paraformaldehído y glutaraldehído se clasifican como orgánicos no halogenados. Los subproductos de extracción de ácidos nucleicos requieren una segregación estricta: las mezclas de fenol/cloroformo deben eliminarse como orgánicos halogenados, mientras que los tampones a base de guanidinio se clasifican como orgánicos corrosivos.
      1. Preadipocitos primarios de semilla derivados de ratones neonatales P0.5 en placas de 12 pozos que contienen láminas de cobertura de 12 mm, como se describe en la Sección 1.
      2. Aislar las mitocondrias y realizar el ensayo de transferencia mitocondrial (MTA) siguiendo los procedimientos especificados en la Sección 2.
      3. Incuba los cultivos durante 24 horas para permitir la absorción mitocondrial.
      4. Induce la diferenciación adipogénica marrón siguiendo el protocolo descrito en el Archivo Suplementario 1 y consulta la Tabla 1 para la composición de los buffers requeridos.
      5. Fija las células en el día 7 de diferenciación (168 h). Aspira el medio de cultivo y añade 500 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% por pozo. Incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente.
      6. Lava las fundas dos veces añadiendo 1 mL de PBS bien frío por pozo. Permeabiliza y bloquea las células incubando las cubiertas en PBS que contienen 0,05% de saponina y 0,2% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Coloca la placa sobre un agitador orbital bajo una agitación suave.
      7. Lava las células dos veces con 1 mL de PBS. Tiñe simultáneamente los núcleos y las gotas lipídicas. Aplicar 1 μg/mL de Hoechst 33342 y 1 μg/mL de BODIPY preparado en el tampón de bloqueo/permeabilización. Incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente, asegurando que la placa esté protegida de la luz.
      8. Lava las fundas dos veces con 1 mL de PBS bien frío. Monta las cubiertas sobre correderas de cristal limpias. Dispensa 10 μL de montador sobre la corredera y coloca el portaobjetos con el lado de la celda hacia abajo sobre el medio de montaje. Deja que las muestras se sequen durante la noche en un ambiente oscuro a temperatura ambiente antes de la imagen.
      9. Toma imágenes usando un microscopio confocal. Utiliza dos canales de fluorescencia calibrados para los espectros de emisión de Hoechst y BODIPY. Consulte el Archivo Suplementario 1 para más detalles de imagen.
      10. Realiza análisis de gotas lipídicas usando ImageJ v1.54s. Abrir el canal de gotas lipídicas, identificar gotas individuales manualmente usando las herramientas de selecciones a mano alzada y Gestor de ROI , y calcular el área de gotas usando el Analizar | Medir el mando.
      11. Procesa y analiza los datos resultantes utilizando los scripts R proporcionados en el Archivo Suplementario 2 dentro del entorno RStudio v4.5.2.
          NOTA: Adquiere exactamente cinco imágenes por cubierta con un aumento de 10x para asegurar una muestra representativa. Utiliza la versión 4.5.2 o superior de R para compatibilidad con los scripts proporcionados.
   3. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
      NOTA: Para los subproductos de microscopía electrónica, los tampones altamente tóxicos de tetróxido de osmio y cacodilato de sodio que contienen arsénico deben recogerse como residuos tóxicos de metales pesados, mientras que el acetato de uranilo se gestiona por separado como residuos radiactivos de metales pesados bajo los protocolos institucionales de seguridad radiológica.
      1. Centrifugar las mitocondrias aisladas, de la Sección 2, a 10.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para obtener un pellet compacto.
      2. Fija el pellet añadiendo un 2,5% de glutaraldehído en un tampón cacodilato sódico de 0,1 M (pH 7,0). Incuba durante 2 horas a 4 °C.
         NOTA: Siempre manipula soluciones de glutaraldehído y realiza los pasos iniciales de fijación dentro de una campana extractora química. Usa guantes y gafas de nitrilo para proteger los ojos. Evita cualquier contacto con fuentes de calor, ya que el glutaraldehído calentado libera vapores muy irritantes.
      3. Lava la preparación mitocondrial durante 3 × 10 minutos con un tampón de cacodilato de sodio de 0,05 M, y centrifuga brevemente para retener el pellet entre cambios de tampón.
      4. Fija la muestra añadiendo tetróxido de osmio acuoso al 1% (_{OsO 4}). Incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente.
         NOTA: El tetróxido de osmio solo debe abrirse y manipularse dentro de una campana extractora química certificada y totalmente funcional. Lleva bata de laboratorio, gafas de seguridad o pantalla facial completa, y guantes gruesos o dobles de nitrilo (cambia los guantes inmediatamente si ocurre algún salpicadura, ya que el_{OsO 4} puede penetrar el nitrilo fino con el tiempo).
      5. Lava la muestra durante 3 × 5 minutos con agua destilada doblemente. Tiñe el pellet con acetato de uranilo acuoso al 1% durante 15 minutos.
         NOTA: Trabaja en papel de banco desechable con respaldo plástico. Dedica una zona específica del laboratorio para la tinción radiactiva. Lleva guantes dobles, bata de laboratorio y gafas de seguridad. Lávate bien las manos tras completar el procedimiento.
      6. Deshidrata la preparación usando una serie de etanol graduado. Incuba el pellet en 30%, 50%, 70%, 95% y 100% de etanol durante 5 minutos en cada concentración.
      7. Incrusta las fracciones mitocondriales. Incubar en una solución 1:1 de Epon/etanol durante 30 minutos, seguido de resina pura de Epon durante 1 hora.
      8. Transfiere las muestras a moldes de incrustación y polimeriza en un horno a 60 °C durante 48 horas.
      9. Une los bloques de resina al ultramicrotomo y corta secciones ultrafinas (80 nm).
      10. Recoge secciones en cuadrículas. Tiñe las rejillas con acetato de uranilo acuoso al 1% durante 4 minutos. Enjuaga con agua doble destilada.
      11. Mancha con citrato de plomo durante 5 minutos siguiendo el método²¹ de Reynolds. Enjuaga bien. Visualiza las cuadrículas usando el TEM. Consulte el Archivo Suplementario 1 para más detalles sobre el método de Reynolds y la adquisición de imágenes TEM.

4. Cuantificación molecular

1. Curva estándar del ADN mitocondrial (mtDNA)
   1. Semilla las células de HepG2 en cinco recipientes de cultivo de 100 mm. Incuba los cultivos hasta que lleguen al 80% de la confluencia.
   2. Aislar las mitocondrias de las células extraídas siguiendo el procedimiento técnico detallado en la Sección 2.
   3. Extrae el ADN total del pellet mitocondrial resultante utilizando el método ácido-guanidinio-fenol-cloroformo descrito en la Sección 4.2.6. Mide la concentración de ADN y evalúa la pureza ((relaciones A₂₆₀/_{A 280} y (A₂₆₀/A₂₃₀ )) utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen.
   4. Prepara una serie de dilución en serie usando agua libre de nucleasa como diluyente. Diluye el stock de ADN para obtener cantidades finales de 1, ^10-1, ^10-2, ^10-3, ^10-4 y ^10-5 ng por volumen de reacción. Pulveriza cada dilución durante 5 segundos para asegurar una homogeneidad completa antes de pasar al siguiente paso de la serie.
      NOTA: Ajuste el rango de concentración de la curva estándar en función de la concentración específica de la muestra y el volumen final de la reacción PCR.
2. Detección de ADN mtd humano en células receptoras
   1. Semillar preadipocitos primarios derivados de ratones neonatales P0,5 en recipientes de cultivo de 60 mm, siguiendo las condiciones de densidad y medio especificadas en la Sección 1.
   2. Aislar las mitocondrias de células de HepG2 donadas y ejecutar el ensayo de transferencia mitocondrial (MTA) según se detalla en la Sección 2.
   3. Incubar los cultivos durante 24 horas a 37 °C y 5% de_CO2.
   4. Inducir la diferenciación adipogénica marrón durante 24–120 horas (en los días 1, 3 y 5) siguiendo el protocolo de intercambio de medios descrito en la Sección 1.
   5. Aspira el medio de cultivo y lava las células dos veces con 2 mL de PBS bien frío.
   6. Extrae ADN total usando el método ácido-guanidinio-fenol-cloroformo²².
      NOTA: Siempre hay que hacer alicuota y realizar separación de fases dentro de la campana extractora para evitar inhalar vapores tóxicos de fenol. Utiliza guantes dobles de nitrilo o guantes resistentes a productos químicos de alta resistencia.
   7. Realizar la separación de fases y descartar toda la fase acuosa situada sobre la interfase.
      PASO CRÍTICO: Eliminar completamente la fase acuosa para evitar la contaminación y asegurar una alta pureza del ADN para la qPCR posterior.
   8. Añade 0,3 mL de etanol al 100% por cada 1 mL del reactivo de extracción inicial. Tapa el tubo y mezcla vigorosamente por inversión.
   9. Déjalo reposar 3 minutos a temperatura ambiente y centrifuga a 2.000 × g durante 5 minutos a 4 °C para pelletar el ADN.
   10. Transfiere el sobrenadante fenol-etanol a un tubo separado para un posible aislamiento de proteínas. Resuspende el pellet de ADN en 1 mL de citrato de sodio 0,1 M (en etanol al 10%, pH 8,5) por cada 1 mL de reactivo de extracción utilizado.
   11. Déjalo reposar 30 minutos a temperatura ambiente, invirtiéndolo suavemente varias veces, y centrifuga a 2.000 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante.
   12. Repite los pasos de lavado de citrato de sodio dos veces más.
   13. Lava el pellet resultante con 2 mL de etanol al 75% por cada 1 mL de reactivo de extracción inicial.
   14. Déjalo reposar 20 minutos a temperatura ambiente y centrifuga a 2.000 × g durante 5 minutos a 4 °C.
   15. Descarta el sobrenadante y seca la cápsula al aire durante 10 minutos. Solubilizar el ADN añadiendo 0,3–0,6 mL de 8 mM de NaOH y pipetear repetidamente hacia arriba y hacia abajo hasta que el pellet desaparezca.
   16. Centrifuga a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar cualquier residuo insoluble. Transfiere el sobrenadante a un tubo estéril y ajusta el pH a 7–8 usando HEPES.
   17. Mide la concentración y pureza del ADN ((A(260)/A(280) y (A(260)/A(230)) usando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen.
   18. Diluir la plantilla hasta obtener una cantidad final de 15 ng de ADN total en agua libre de nucleasa. Realizar PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para ADNmt humano utilizando placas ópticas de 96 pozos según lo especificado en la Sección 4.3.
   19. Analizar los resultados de la amplificación aplicando un modelo de regresión logarítmica.
       NOTA: Realizar el análisis de regresión logarítmica utilizando la concentración de ADN y los valores correspondientes del ciclo umbral (Ct) como variables.
3. RT-qPCR para expresión génica
   1. Preparación y diferenciación celular
      1. Preadipocitos primarios de semillas derivados de ratones neonatales P0,5 en platos de cultivo de 60 mm, según se detalla en la Sección 1.1.
      2. Aislar las mitocondrias y realizar el ensayo de transferencia mitocondrial (MTA) siguiendo los procedimientos de la Sección 2. Incuba los cultivos durante 24 horas.
      3. Inducir adipogénesis marrón durante 24–120 horas (muestreo en los días 1, 3 y 5 de diferenciación) según el protocolo de la Sección 1.
   2. Aislamiento total de ARN
      1. Retira el medio de cultivo y añade 1 mL de extractor de ácido-guanidinium-fenol-cloroformo por cada 1 × 10⁶ células directamente al plato. Homogeneizar las muestras pipeteando repetidamente hasta que el lisado sea uniforme.
         NOTA: Siempre hay que hacer alicuota y realizar separación de fases dentro de la campana extractora para evitar inhalar vapores tóxicos de fenol. Utiliza guantes dobles de nitrilo o guantes resistentes a productos químicos de alta resistencia.
      2. Añade 0,2 mL de cloroformo por cada 1 mL de reactivo extractivo utilizado. Tapa bien los tubos y agita vigorosamente a mano durante 15 segundos. Déjalo reposar 3 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C.
      3. Transfiere cuidadosamente la fase acuosa superior a un nuevo tubo libre de nucleasa. Evita el contacto con la interfase. Guarda las muestras en hielo.
      4. Añade 0,5 mL de isopropanol por cada 1 mL de reactivo extractivo utilizado. Mezcla suavemente por inversión y incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
      5. Centrifugar a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para pelletar el ARN. Descarta el sobrenadante por inversión.
      6. Lava el pellet de ARN con 1 mL de etanol al 75%. Vórtice brevemente y centrifugación a 7.500 × g durante 5 minutos a 4 °C.
      7. Desecha el sobrenadante y seca al aire el pellet de ARN durante 10 minutos a temperatura ambiente. Suspende el pellet en 30 μL de agua libre de nucleasa. Incubar las muestras a 60 °C durante 15 minutos para asegurar una solubilización completa.
      8. Determinar la concentración y pureza del ARN (relaciones A₂₆₀/_{A 280} ) utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen.
      9. Verifica la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa.
   3. Tratamiento con DNasa
      1. Añadir 0,1 volúmenes de 10× de tampón de DNasa y 1 μL de enzima DNasa a cada muestra de ARN. Mezcla suavemente pipeteando. Incuba las reacciones a 37 °C durante 30 minutos.
      2. Resuspende el reactivo de inactivación de DNasa mediante un flick o vortex hasta que la suspensión sea homogénea. Añade el reactivo de inactivación (0,1 volúmenes de la muestra de ARN o 2 μL, lo que sea mayor) y mezcla bien. Incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. Gira los tubos 3 veces durante este periodo para mantener el reactivo en suspensión.
      3. Centrifugar a 10.000 × g durante 1,5 minutos. Transfiere el sobrenadante que contiene ARN a un nuevo tubo.
         PASO CRÍTICO: Asegúrate de que no se conserve ningún reactivo de inactivación de DNasa, ya que inhibe la síntesis posterior de ADNc.
   4. Transcripción inversa (RT)
      1. Cuantifique el ARN tratado y diluilo en agua libre de nucleasas para utilizar hasta 2 μg de ARN total por reacción de 20 μL.
      2. Prepara la mezcla master RT sobre hielo siguiendo las instrucciones del fabricante. Dispensa la mezcla en tubos de reacción y añade las muestras de ARN.
      3. Carga en un ciclador térmico y ejecuta el programa de transcripción inversa según lo especificado por el fabricante del kit.
   5. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
      1. Utiliza el ADNc generado en la Sección 4.3.4 como plantilla de PCR. Diluir el ADNc en agua libre de nucleasas hasta una concentración operativa de 20 ng por reacción de 10 μL. Guarda todos los reactivos en hielo.
      2. Prepara una mezcla maestra que contenga SYBR Green, cebadores y agua libre de nucleasa. Incluye el volumen excesivo para la pérdida por pipeteo. Dispensar 10 μL de la mezcla de reacción en cada pozo de una placa óptica qPCR.
      3. Sella la placa con película adhesiva óptica y centrifuga brevemente para recoger el líquido en el fondo. Carga la placa en un instrumento PCR en tiempo real y realiza la amplificación usando el modo de ciclo rápido.
      4. Determinar los valores del ciclo umbral (Ct) y realizar la cuantificación relativa usando el método ΔΔCt. Incluye un análisis de curva de fusión al final de la prueba para verificar la especificidad de amplificación.
         NOTA: Normalizar la abundancia de ARNm objetivo a niveles de ARNm 36B4 como el gen de mantenimiento endógeno. Ejecuta las placas qPCR en menos de 2 horas desde la instalación; de lo contrario, guarda las placas selladas a 4 °C.
4. Western blot
   1. Cuantifique la concentración de proteínas de extractos de células enteras y mitocondriales (véase las Secciones 2.1.8 y 2.1.12) mediante un ensayo BCA.
   2. Preparar 30 μg de proteína por muestra y añadir el volumen adecuado del buffer de carga de muestras SDS-PAGE (por ejemplo, buffer de Laemmli).
   3. Desnaturalizar las muestras calentando a 95 °C durante 5 minutos (o seguir los requisitos específicos de temperatura para proteínas de membrana).
   4. Carga las muestras en los pozos de un gel de poliacrilamida. Separar proteínas mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE) a un voltaje constante (por ejemplo, 80–120 V) hasta que el frente del colorante alcance el fondo del gel.
   5. Activa una membrana PVDF sumergiéndola al 100% en metanol durante 1 minuto, seguido de un equilibrio en el tampón de transferencia.
   6. Monta el sándwich de transferencia, asegurando la ausencia de burbujas de aire entre el gel y la membrana.
   7. Transfiere las proteínas a la membrana PVDF electroblottando a 400 mA durante 2 horas. Mantener el sistema a 4 °C durante todo el proceso.
   8. Bloquear los sitios de unión inespecíficos incubando la membrana en leche desnatada al 5% preparada en solución fisiológica con Tris-buffer que contiene 0,1% Tween 20 (TBS-T) durante 1 hora a temperatura ambiente.
   9. Incubar la membrana con anticuerpos primarios (diluidos 1:1.000 en solución bloqueante) durante la noche a 4 °C bajo una agitación suave.
   10. Lava la membrana 3 × 15 minutos con TBS-T.
   11. Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 2 horas a temperatura ambiente.
   12. Lava la membrana 3 veces con TBS-T, seguido de un lavado final de 5 minutos con 1× cucharadas.
   13. Visualiza las bandas proteicas usando un sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL). Captura la señal usando un sistema de imagen digital.
       NOTA: Ajustar el porcentaje de gel de poliacrilamida (por ejemplo, 8%, 10% o 12%) en función del peso molecular de las proteínas objetivo. Si el aparato de electrotransferencia carece de un sistema de refrigeración activo, se sustituyen los recipientes de hielo cada hora y se mantenga la cámara sumergida en un baño de hielo. Almacena las membranas en 1× cucharadas a 4 °C si la visualización se retrasa.

Resultados

Extracción mitocondrial e integridad estructural y respiratoria

Para evaluar el impacto del aumento de la masa mitocondrial en la adipogénesis marrón, se realizó un ensayo de transferencia mitocondrial (MTA) en preadipocitos indiferenciados (Figura 1A). Las mitocondrias fueron aisladas de preadipocitos murinos primarios (mMito) y de la línea celular hepática humana HepG2 (hMito). El análisis de Western blot demost...

Discusión

Implicaciones biológicas de la transferencia mitocondrial en la adipogénesis

Nuestros resultados muestran que, aunque las mitocondrias exógenas tanto de origen humano como murino pueden incorporarse a la red mitocondrial endógena de preadipocitos diferenciados, un aumento artificial de la masa mitocondrial es insuficiente para impulsar el programa adipogénico marrón. Estos hallazgos sugieren que la expansión mitocondrial característica de la ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100 mm plate	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glicina Buffer	BioRad	1610734
12 mm cubreobjetos de vidrio	Marienfeld	111520
plato de 12 pocillos	SPL Life Science	30012SPL
16% Solución Acuosa de Paraformaldehído	Invitrogen	28908
18 mm cubreobjetos de vidrio	HART	-
plato de 24 pocillos	SPL Life Science	30024SPL
3,3′,5-Triyodotironina sal sódica (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrilamida/Bis Solución, 37.5:1	BioRad	1610158
plato de 35 mm	SPL Life Science	20035SPL
plato de 6 pocillos	SPL Life Science	30006SPL
plato de cultivo de 60 mm	SPL Life Science	20060SPL	Usado para experimentos de preadipocitos primarios y ADN/qPCR; proveedor/catálogo no proporcionado
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulina)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarosa	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	Usado para verificación de integridad del ARN; proveedor/catálogo no proporcionado
Persulfato de amonio	BioRad	1610700
Anti-IgG de conejo, Anticuerpo ligado a HRP	Cell Signaling	7074
Anti-IgG de rata, Anticuerpo ligado a HRP	Cell Signaling	7077
Antibiótico-antimiticótico	Gibco	15240062
Base invertida del microscopio Axio Observer	Carl Zeiss	431007-9901-000	Agregado de Métodos Suplementarios
Kit de Ensayo de Proteína BCA	Thermo Scientific	D49328
Perlas de configuración y seguimiento del citómetro BD	BD Biosciences	-	Agregado de Métodos Suplementarios; catálogo no proporcionado
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	Agregado de Métodos Suplementarios
Analizador de células BD LSRFortessa X-20	BD Biosciences	-	Entrada existente estandarizada para que coincida con el archivo suplementario
BioRender	BioRender	-	Usado para crear el flujo de trabajo de la Figura 1
Bloqueador de grado de bloteo	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Albúmina de suero bovino (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
Kit de Transcripción Reversa de cDNA	Invitrogen	4374966
Celador de células de 100 μm, nylon	Falcon	352360
Celador de células de 40 μm, nylon	Falcon	352340
Colagenasa tipo II	Gibco	17101-015
Dexametasona	Sigma	D4902
DMEM Polvo, Glucosa Alta, Piruvato	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, sin fenol rojo	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, polvo	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	Solvente para medio de inducción; proveedor/catálogo no proporcionado
KIT DE INCORPORACIÓN EMBED-812 (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Etanol absoluto	Merck	100983
Ácido tetrasódico éter tetraacético N,N,N′,N′-tetraacético de etilenglicol-bis(β-aminoetil) (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Suero bovino fetal	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	Software de análisis de citometría de flujo
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
Anticuerpo GAPDH	Santa Cruz	sc-32233
Glucosa	Gibco	15023-021
Glutamato	Sigma	G1626
Solución acuosa al 25% de glutaraldehído	Electron Microscopy Sciences	16210
Anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L), HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	Software de análisis estadístico/de regresión logarítmica
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	Software de análisis de imágenes de gotas de lípidos
Membran PVDF Immun-Blot	BioRad	1620177
Indometacín	Sigma	I7378
Jeringuilla de insulina	Cranberry	AAJECIN3	Usado para homogeneización celular; proveedor/catálogo no proporcionado
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339