Diseño del estudio
Esta investigación utilizó un enfoque de MR de dos muestras para explorar la relación causal entre los rasgos inflamatorios asociados con las NETs y la diabetes tipo 2 (T2DM) y sus complicaciones. El marco del MR se basa en tres supuestos clave20: 1) la variante genética debe estar sólidamente asociada con la exposición, 2) la variante genética debe influir en el resultado únicamente a través de la exposición (exclusión de pleiotropía) y 3) la variante genética no debe estar asociada con ningún factor de confusión. Para una descripción detallada del proceso de este estudio, consulte Figura 1. El manuscrito sigue las directrices MR-STROBE para la presentación de estudios de MR, garantizando estándares rigurosos de transparencia y reproductibilidad21.
Fuentes de datos
Los datos de estudios de asociación del genoma completo (GWAS) utilizados en este análisis de MR se obtuvieron de bases de datos públicas de GWAS. En cuanto a los GWAS a nivel resumido sobre DM2, se incluyó la metaanalización más grande de una población europea, compuesta por 74.124 casos y 824.006 controles, junto con un estudio prospectivo anidado de casos y controles realizado en Europa, que incluyó 9.978 casos y 12.348 controles22. Para las complicaciones diabéticas, incluyendo DM2 con complicaciones renales y DM2 con complicaciones circulatorias periféricas, este estudio recuperó estadísticas resumidas de GWAS de estudios en los que los casos eran pacientes con DM2 que presentaban la complicación específica, y los controles eran individuos sin DM2. La información detallada sobre las fuentes de datos se puede encontrar en la Tabla Suplementaria 1.
Los datos de GWAS para rasgos inflamatorios asociados con NETs se obtuvieron del catálogo de GWAS (véase la Tabla Suplementaria 2). Para abordar la heterogeneidad en la especificidad biológica, este estudio categorizó las exposiciones incluidas en dos grupos distintos según sus funciones en la biología de los neutrófilos: (1) Factores relacionados con la NETosis principal: Esta categoría incluye marcadores directamente implicados en la formación estructural de las NETs o en el proceso enzimático de descondensación de la cromatina. Específicamente, este estudio incluyó las propias NETs, mieloperoxidasa (MPO), elastasa de neutrófilos (NE) y el complejo MPO-ADN. La MPO y la NE son enzimas esenciales para la degradación de histonas y la descondensación de la cromatina, mientras que el complejo MPO-ADN es un marcador sustituto específico para las NETs23. (2) Medios inflamatorios asociados con NETs: Esta categoría comprende citocinas y mediadores que actúan como reguladores ascendentes o efectores descendentes estrechamente vinculados a la NETosis, pero que también participan en vías inflamatorias más amplias. Este grupo incluye interleucina-6 (IL-6)24, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)25, niveles de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL)26 y factor de red de comunicación celular 1 (CCN1)27.
Los datos utilizados en este estudio se obtuvieron de bases de datos de acceso abierto o de estudios publicados previamente sobre GWAS; por lo tanto, no se requirió aprobación ética para esta investigación.
Selección de instrumentos genéticos relacionados con las NET
Dado que la formación de NETs representa un proceso biológico dinámico que no se mide directamente en los estudios de asociación del genoma completo (GWAS) convencionales, este estudio empleó un enfoque basado en genes para identificar instrumentos genéticos relacionados con rasgos inflamatorios asociados a las NETs. Se compiló un conjunto exhaustivo de 257 genes conocidos por estar críticamente implicados en la formación y regulación de las NETs, como MPO, junto con genes que codifican histonas y proteínas de gránulos neutrófilos, a partir de estudios mecanicistas establecidos y literatura publicada28.
Selección de variables instrumentales
Para identificar instrumentos genéticos robustos para rasgos inflamatorios asociados con NET, este estudio implementó un flujo de trabajo de filtrado secuencial utilizando estadísticas resumidas de GWAS. Los pasos operativos específicos fueron los siguientes:
Cribado inicial: se extrajeron variantes genéticas significativamente asociadas con los rasgos de exposición29 según un umbral de significancia de P < 5 × 10⁻6.
Filtrado por frecuencia del alelo menor (MAF): para garantizar el poder estadístico, se excluyeron los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con una MAF ≤ 0,0130.
Agrupamiento por desequilibrio de ligamiento (LD): para mitigar el confounding causado por el desequilibrio de ligamiento (LD), se seleccionaron SNPs independientes utilizando la función de agrupamiento con parámetros establecidos en r2 < 0,001 dentro de una ventana de 10 000 kb31.
Evaluación de la fuerza del instrumento: La fuerza de cada IV restante se cuantificó mediante el estadístico F, calculado como F = R2 × (N-2) / (1-R2). Solo se conservaron los SNPs con un estadístico F > 10 para minimizar el sesgo por instrumentos débiles32.
Identificación de SNP proxy y armonización de datos
Para abordar los SNPs faltantes en el conjunto de datos del resultado, este estudio realizó una búsqueda de marcadores sustitutos y un proceso de armonización de datos:
Sustitución por proxy: Cuando un SNP objetivo del estudio de GWAS de exposición no estaba disponible en el estudio de GWAS de resultado, este estudio utilizó la función LDproxy() basada en el panel de referencia europeo del Proyecto 1,000 Genomas. Solo se seleccionó un SNP proxy candidato si mostraba una alta desequilibrio de ligamiento con el SNP original (r2> 0.8). Si no se encontraba ningún proxy calificado, el SNP se excluía.
Harmonización: los conjuntos de datos de exposición y resultado se alinearon utilizando la función harmonise_data() del paquete TwoSampleMR (R versión 4.0.5). Este estudio estableció el parámetro action = 2 para alinear automáticamente todos los SNPs a la cadena directa y eliminar los SNPs palindrómicos con orientación de cadena ambigua.
Verificación: tras la armonización, este estudio inspeccionó manualmente el conjunto de datos armonizados para confirmar que las frecuencias del alelo de efecto fueran consistentes entre los datos de exposición y los datos de resultado.
Análisis de RM y pruebas de sensibilidad
Se realizó la inferencia causal utilizando el paquete TwoSampleMR (R versión 4.0.5).
Análisis primarios y secundarios: este estudio aplicó el método ponderado por varianza inversa (IVW) como enfoque principal33. Se realizaron análisis complementarios utilizando los métodos MR-Egger34, mediana ponderada y moda ponderada para garantizar la solidez35.
Evaluaciones de sensibilidad: La heterogeneidad entre las VI se evaluó mediante la prueba Q de Cochran36 utilizando la función mr_heterogeneity(). La pleiotropía horizontal se evaluó mediante la prueba del intercepto MR-Egger34 (mr_pleiotropy_test()).
Detección de valores atípicos: este estudio utilizó el paquete MR-PRESSO para detectar posibles valores atípicos37. Se ejecutó la función mr_presso() con 1.000 simulaciones. Se eliminaron los SNPs atípicos identificados (P < 0,05) y se recalcularon las estimaciones causales para verificar la estabilidad de los resultados. Además, se realizó un análisis leave-one-out para asegurar que la asociación causal no estuviera determinada por un solo SNP38.
Corrección estadística
Para tener en cuenta las pruebas múltiples, los valores P obtenidos a partir de los análisis de MR se corrigieron utilizando el método de tasa de descubrimientos falsos (FDR). Esto se implementó mediante la función P.adjust() en R con el parámetro method = "fdr". Se consideraron estadísticamente significativas las asociaciones con un valor P corregido (PFDR) < 0,05.