Este estudio desarrolló y validó preliminarmente un modelo en ratas de cicatrización tardía de heridas bajo condiciones de hipoxia hipobárica a gran altitud.
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Artículo de investigación
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Este estudio desarrolló y validó preliminarmente un modelo en ratas de cicatrización tardía de heridas bajo condiciones de hipoxia hipobárica a gran altitud.
Las condiciones hipobáricas de gran altitud pueden causar hipoxia prolongada de heridas y una cicatrización deteriorada, aunque los modelos estandarizados siguen siendo escasos. En este estudio, desarrollamos un modelo de cicatrización retardada de heridas y lo validamos preliminarmente simulando la hipoxia a gran altitud utilizando un sistema hipobárico controlado. Las ratas fueron alojadas a altitudes simuladas de 3000 m (presión del aire: 70,1 kPa, presión parcial de oxígeno: 14,7 kPa) a 8000 m (presión del aire: 35,6 kPa, presión parcial de osígeno: 7,5 kPa) para determinar los umbrales de seguridad, evaluándose el estrés oxidativo y la hipoxia cutánea. Los resultados mostraron un aumento del riesgo de mortalidad a una altitud simulada de 6000 m, con tolerancia observada por debajo de 5000 m. Las altitudes elevadas se asociaron con un empeoramiento del estrés oxidativo y un aumento de la hipoxia cutánea; Mostró retrasos en la cicatrización de la herida dependientes de la altitud, reducción de la perfusión, remodelación del colágeno suprimida y respuestas inflamatorias agravadas. A pesar de la regulación al alza de los factores regenerativos vasculares, la densidad microvascular disminuyó. En conjunto, este estudio desarrolló y validó preliminarmente un modelo de rata adecuado para investigar mecanismos e intervenciones en heridas crónicas inducidas por hipoxia en altitud.
La reparación de heridas cutáneas presenta un desafío clínico generalizado y significativo. Desde traumatismos agudos hasta diversos tipos de heridas que no cicatrizan, estas condiciones imponen una carga persistente para los sistemas sanitarios y la calidad de vida delos pacientes 1,2,3,4,5,6. La cicatrización de heridas no es un evento singular, sino un proceso altamente coordinado y superpuesto en varias etapas: las células inflamatorias, las células estromales, los queratinocitos y el sistema microvascular reconstruyen colectivamente barreras y remodelan tejidos bajo la regulación conjunta de la matriz extracelular y diversas redesde señalización 7,8,9,10 . Dada la naturaleza intensiva en energía de la reparación y su extrema sensibilidad al entorno interno, alteraciones en el metabolismo sistémico y los estados fisiológicos —como un aumento del estrés oxidativo, la desregulación inmunitaria y una perfusión microcirculatoria deteriorada— pueden alterar la cascada normal de reparación en múltiples puntos, conduciendo a inflamación prolongada, regeneración insuficiente y remodelación anormal 9,11,12,13.14,15.
El suministro de osígeno es un factor clave que limita los procesos de reparación de heridas, participando en el metabolismo energético y la migración/proliferación celular, al tiempo que modula la angiogénesis y las respuestas inflamatorias a través de las vías de señalización dela hipoxia 16,17,18. La hipoxia transitoria en la fase temprana de la herida estabiliza el factor inducible por hipoxia e inicia programas de reparación adaptativa. Sin embargo, cuando la hipoxia se vuelve excesiva o persistente, aunque las señales de angiogénesis puedan estar compensatoriamente reguladas al alza, pueden no traducirse en una reconstrucción microvascular eficaz. Mientras tanto, el cambio de fenotipo de macrófagos y la regresión inflamatoria se vuelven más propensos al desequilibrio, formando un círculo vicioso de "deficiencia de hipoxia-inflamación-revascularización"19,20,21,22. Esto es especialmente relevante en entornos de gran altitud: la reducción de la presión atmosférica reduce la presión parcial de oxígeno inspirado, induciendo hipoxia persistente que incrementa los riesgos de cicatrización deficiente de la herida y complicaciones relacionadas conla infección 23,24,25,26.
La exposición a grandes altitudes desencadena una marcada respuesta de estrés hipóxico en humanos27. Los ambientes de gran altitud pueden provocar hipoxia tisular persistente, perfusión insuficiente y respuestas inflamatorias en los sitios de laherida 28. Estos cambios fisiopatológicos pueden dificultar el proceso de curación al promover un exceso de especies reactivas de oxígeno, activar proteasas e inducir la senescencia celular, mientras simultáneamente alteran la función de las células madre mesenquimales29,30. Los estudios que evalúan directamente los efectos de la exposición a gran altitud en la cicatrización de heridas cutáneas humanas siguen siendo limitados. Por lo tanto, el uso de modelos animales hipóxicos hipobáricos puede ayudar a validar el impacto de factores relacionados con la altitud en la reparación de heridas.
Modelos animales previos a altitudes fijas han reportado retrasos en la cicatrización de heridas; Sin embargo, los efectos dependientes de la altitud, el umbral de seguridad para la exposición prolongada a condiciones hipobáricas y la evidencia directa de hipoxia cutánea local siguen siendoinciertos. Además, existe una falta de evaluación sistemática de las deficiencias de la cicatrización, lo que ha limitado la investigación sobre los mecanismos subyacentes y la identificación de posibles objetivos de intervención31. En este estudio, desarrollamos y validamos preliminarmente un modelo de herida cutánea basado en un sistema de control hipobárico para simular hipoxia hipobárica a gran altitud bajo condiciones controladas. Empleando una estrategia graduada de exposición simulada en altitud, primero definimos los márgenes de seguridad para la exposición hipobárica sostenida y evaluamos los efectos biológicos de la hipoxia hipobárica mediante indicadores sistémicos. De forma crucial, validamos aún más in vivo que el ambiente hipobárico causaba una limitación localizada del suministro de oxígeno en la piel. Posteriormente, demostramos que la hipoxia hipobárica sostenida retrasa el cierre de la herida de manera dependiente de la altitud, acompañada de alteraciones histológicas y anomalías clave en las vías. En conjunto, este estudio desarrolló y validó preliminarmente una plataforma modelo animal para heridas crónicas asociadas a hipoxia en gran altitud, permitiendo la elucidación de mecanismos y la evaluación sistemática de estrategias terapéuticasposteriores 32.
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Todos los procedimientos experimentales que involucraban animales fueron revisados y aprobados por los comités de ética de la Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China (N.º 106142025091534170) y la Universidad Médica del Ejército (N.º AMUWEC20265509). El flujo de trabajo gráfico para el diseño experimental y el análisis involucrado en este estudio se muestra en la Figura 1. Además, los reactivos y equipos empleados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
Animales experimentales y declaración ética
Este estudio utilizó ratas macho Sprague-Dawley (SD), adquiridas a Chengdu Dashuo Laboratory Animal Co., Ltd., China. Todos los animales pasaron por un periodo de aclimatación de 7 días bajo condiciones estándar antes de la experimentación.
Criterios de inclusión y exclusión
Los criterios de inclusión en animales fueron los siguientes: ratas machos de SD de 6 a 8 semanas de edad, peso corporal de 200 a 250 g, aparentar estar sanos y mostrar comportamiento normal, y libres de lesiones o infecciones cutáneas.
Los criterios de exclusión animal fueron los siguientes: heridas que mostraran infección evidente tras modelar la herida; heridas con cicatrización o laceraciones no estándar; muerte durante el experimento o muerte accidental por anestesia.
Los criterios de exclusión de puntos de datos fueron los siguientes: imágenes de heridas con costras extensas, obstrucción capilar o iluminación desigual; imágenes de imagen con contraste de motas láser (LSCI) que muestran artefactos de movimiento; secciones de tejido que presentan arrugas evidentes, fragmentación o áreas objetivo ausentes; muestras de suero que muestran hemólisis evidente; Imágenes de inmunofluorescencia (IF) o inmunohistoquímica (IHC) con sobreexposición o localización incorrecta de anticuerpos
Gestión de exclusiones:
Para todos los animales o puntos de datos excluidos, se obtuvieron datos válidos mediante experimentos suplementarios para asegurar que el tamaño final de muestra válido para cada grupo fuera N ≥ 3 para todos los análisis de los puntos finales.
Sistema de control hipobárico y entorno simulado de hipoxia a gran altitud
El entorno hipóxico simulado a gran altitud se estableció mediante un sistema de control hipobárico. Este sistema permite regular con precisión la presión del aire en la cabina para reproducir la presión atmosférica correspondiente a diferentes altitudes, reduciendo así la presión parcial de oxígeno ambiente e induciendo una exposición hipóxica controlada (Figura 2A).
La presión de la cabina se ajustó para simular altitudes de 3000 m, 4000 m, 5000 m, 6000 m, 7000 m y 8000 m, con parámetros detallados proporcionados en la Tabla 1. Durante todo el experimento, las ratas SD se alojaron en grupos según su asignación experimental. Durante el funcionamiento de la cabina, la presión interna, la temperatura y la humedad se monitorizaban continuamente para asegurar que, salvo la presión, todas las condiciones ambientales permanecieran comparables a las de las viviendas estándar de laboratorio. El entorno residencial mantenía una temperatura de 22–24 °C, una humedad relativa del 50%–60%, un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, y ofrecía acceso libre a comida y agua potable estándar.
Evaluación de la seguridad de la exposición a hipobárico y análisis de supervivencia
Para evaluar los márgenes de seguridad de la exposición hipobárica sostenida, las ratas fueron numeradas individualmente y asignadas aleatoriamente a grupos experimentales utilizando una secuencia de números aleatorios generada por ordenador (la función RAND en Excel). La asignación fue realizada por un investigador no involucrado en el cuidado posterior de animales, la recogida de datos ni la evaluación de resultados. Basándose en estudios de referencia con animales que expusieron a gradientes de gran altitud, el tamaño de la muestra para cada grupo se estableció en 1233. Las ratas se dividieron en un grupo de control normóxico (500 m sobre el nivel del mar) y grupos de altitud simulados a 3000 m, 4000 m, 5000 m, 6000 m, 7000 m y 8000 m. Las ratas de cada grupo fueron alojadas continuamente en sus respectivos entornos durante 30 días. Cada 2 días, el sistema de control hipobárico se restaura brevemente a condiciones de nivel del mar durante 30 minutos para permitir la limpieza de la jaula y el suministro de comida y agua. Durante la descompresión y recompresión, la velocidad de variación de presión se mantiene en aproximadamente 300 m/min para minimizar el riesgo de barotraumatismos. Durante este periodo, se observaron y registraron diariamente la condición general de todas las ratas y cualquier evento de mortalidad. Se graficaron curvas de supervivencia utilizando el método Kaplan-Meier, y se realizaron pruebas logarítmicas para comparar las diferencias de supervivencia entre grupos.
Detección de marcadores sueros relacionados con el estrés oxidativo
En el día 21 de exposición hipobárica, se recogieron muestras de sangre venosa de ratas bajo anestesia. Tras mantenerse a temperatura ambiente, el suero se separaba mediante centrifugación (1.000 × g durante 15 minutos a 4 °C) y se almacenaba a -80 °C para su uso posterior. Se midieron los niveles séricos de lactato deshidrogenasa (LDH), malondialdehído (MDA) y superóxido dismutasa (SOD) utilizando kits de análisis correspondientes.
Evaluación de condiciones hipóxicas en tejido cutáneo
El kit de detección de hipoxia se utilizó para evaluar la hipoxia en tejido cutáneo. En resumen, en los días 4 y 7 de exposición hipobárica, se inyectaron a las ratas por peritonice con pimozida (60 mg/kg); Las ratas fueron eutanasiadas 1 hora después de la inyección y se recogió tejido cutáneo de la parte posterior para su análisis. El procedimiento detallado de eutanasia es el siguiente: Según las directrices de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria sobre eutanasia, el animal fue colocado en una cámara de inducción y se indujo anestesia utilizando oxígeno que contenía un 4–5% de isoflurano. Una vez que el animal ha perdido el conocimiento, la concentración de isoflurano se reduce al 2–3% y se mantiene durante al menos 10 minutos. Antes de realizar una luxación cervical como método confirmatorio, debe confirmarse que el latido cardíaco y la respiración han cesado. Las muestras de tejido se criopreservaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para su uso posterior. Las secciones se preparaban utilizando un microtomo crioposto. Se realizó una tinción de IF para marcar regiones hipóxicas dentro del tejido.
Todas las imágenes de fluorescencia se adquirieron mediante un escáner automático de diapositivas. Los parámetros de fluorescencia fueron los siguientes: DAPI (longitud de onda de excitación 365 nm ± 10 nm, longitud de onda de emisión 440 nm ± 40 nm), Cy3 (longitud de onda de excitación 542–566 nm, longitud de onda de emisión 579–611 nm) y Cy5 (longitud de onda de excitación 628 nm, longitud de onda de emisión 692 nm). Las señales de hipoxia se analizaron cuantitativamente usando el software ImageJ.
Modelo de herida cutánea de grosor completo en ratas
Para evaluar las alteraciones en la cicatrización de heridas cutáneas bajo condiciones hipobáricas sostenidas, las ratas fueron primero agrupadas y aclimatadas a sus respectivos entornos antes de la modelización de la herida. Las ratas fueron numeradas individualmente y asignadas aleatoriamente al grupo de control normóxico o a los grupos de exposición hipobáricos simulando altitudes de 3000 m, 4000 m y 5000 m usando una secuencia de números aleatorios generada por ordenador (la función RAND en Excel). La aleatorización fue realizada por un investigador que no participó en la creación posterior de la herida, el cuidado postoperatorio ni la evaluación de resultados. Los parámetros detallados de cada grupo son los siguientes: el grupo control normóxico estaba ubicado a 500 m sobre el nivel del mar (presión atmosférica: 101 kPa, presión parcial de oxígeno: 21 kPa); el grupo de 3000 m (70,1 kPa, 14,7 kPa); el grupo de 4000 m (61,6 kPa, 13,1 kPa); y el grupo de 5000 m (54 kPa, 11,3 kPa).
Tras el periodo de adaptación de 7 días, las ratas SD fueron anestesiadas y mantenidas bajo anestesia mediante inhalación de isoflurano al 2%. Simultáneamente, se administra una inyección local de infiltración con lidocaína al 5% de epinefrina (relación de dilución: 1:100.000) en el lugar quirúrgico marcado para proporcionar analgesia perioperatoria y hemostasis. Utilizando un punzón de biopsia (con una hoja circular de 10 mm de diámetro en la base), crea una incisión en la piel. Presiona el punzón de la biopsia contra la piel dorsal de la rata y luego gíralo suavemente para que la hoja circular corte gradualmente la piel hasta llegar a la fascia subcutánea superficial. Al retirar el punzón de biopsia, se formará una incisión circular circular regular de aproximadamente 10 mm de diámetro.
Tras la creación de la herida, las ratas de cada grupo fueron devueltas y mantenidas en sus entornos originales hasta el punto final experimental, asegurando que todo el proceso de cicatrización de la herida se desarrollara bajo las condiciones de oxígeno predeterminadas.
Macroevaluación del proceso de cicatrización de heridas
Las fotografías de la herida se tomaron en los días 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 tras la formación de la herida bajo una iluminación uniforme y una distancia de imagen constante. El área de la herida se midió usando la Imagen J. En resumen, las imágenes obtenidas en cada punto temporal se importaron a la Imagen J, calibradas según la barra de escala, y los márgenes de la herida se delinearon manualmente para determinar el área34. La cicatrización de la herida se calculó de la siguiente manera: cicatrización de la herida (%) = (Área inicial de la herida − Área actual de la herida)/Área inicial de la herida × 100%.
Evaluación de la microcirculación de la herida
En el séptimo día de cicatrización, se evaluó la perfusión microcirculatoria de sangre en la zona de la herida utilizando un sistema LSCI. Antes del examen, las ratas fueron anestesiadas por inhalación con isoflurano al 2% y sujetas a una mesa de operaciones con temperatura controlada para mantener la temperatura corporal. La zona dorsal de la herida quedó completamente expuesta, y la sonda láser de speckles se colocó verticalmente aproximadamente 20 cm por encima de la herida. La potencia de la sonda se ajustó a 110 mW, la frecuencia de muestreo a 30 Hz y el tiempo de exposición a 3 segundos. En condiciones de oscuridad, adquiere una imagen pseudocolor de perfusión de flujo sanguíneo de la zona de la herida. Utiliza el software LSCI para delimitar manualmente la zona de la herida en la imagen de perfusión de flujo sanguíneo en pseudocolor; el software calculará automáticamente el valor de perfusión del flujo sanguíneo para esa zona durante un periodo de 3 s (en unidades arbitrarias [U.A.]). Finalmente, exporta los valores de perfusión a un software adecuado para la gráfica.
Tinción histológica y análisis de remodelación del colágeno
Los animales fueron eutanasiados en los momentos designados, y la herida intacta y los tejidos cutáneos circundantes se extrajeron, repararon, deshidrataron, incrustaron parafina y seccionaron. Hematoxilina y eosina (HE): utilizadas para evaluar el ancho de la herida, el grado de re-epitelialización y el grosor epidérmico regenerado; Tinción tricroma de Masson: utilizada para evaluar la deposición de fibras de colágeno y calcular la fracción de volumen de colágeno; Tinción roja Sirius: utilizada para distinguir el colágeno tipo I (COL I) y el colágeno tipo III (COL III) bajo microscopía de luz polarizada y calcular la relación COL I/COL III.
Tinción inmunohistoquímica
Las secciones de parafina se sometieron a descerado, rehidratación y extracción de antígenos antes de la tinción de IHC o IF. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C, seguidos de la adición de los anticuerpos secundarios correspondientes. La información específica sobre anticuerpos y la dilución correspondiente se proporcionan en la Tabla de Materiales. Las secciones IHC se desarrollaron con DAB, mientras que las secciones IF usaron anticuerpos secundarios fluorescentes con contratinción DAPI para losnúcleos 35,36. Todas las imágenes se adquirieron en condiciones idénticas y se cuantificaron utilizando el software ImageJ.
Análisis estadístico
Todos los datos se presentan como desviación media ± estándar. Se realizaron análisis estadísticos utilizando el software GraphPad Prism. Para comparaciones entre múltiples grupos en un mismo momento de tiempo, se aplicó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), y cuando se detectó una diferencia global significativa, se utilizó la prueba de comparación múltiple de Tukey para análisis intergrupales posteriores. Para los datos de cicatrización de heridas evaluados en múltiples puntos temporales, se realizó ANOVA bivial con el grupo de tratamiento e incluyó el tiempo como factores independientes para evaluar los efectos principales así como su interacción. También se realizaron análisis post-hoc utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey. Para evaluar más a fondo la potencia estadística, se realizó un análisis post-hoc de potencia en el software G*Power basado en el punto final primario (cicatrización de heridas en el día 14).
El análisis de supervivencia empleó el método de Kaplan-Meier para trazar curvas de supervivencia, utilizando pruebas logarítmicas para comparar las diferencias de supervivencia entre grupos. Para comparaciones por pares entre varios grupos, la corrección de Bonferroni se aplicó para controlar el riesgo de errores de tipo I derivados de comparaciones múltiples. Todas las pruebas estadísticas fueron bifácemas, considerándose P < 0,05 estadísticamente significativas.
Todas las evaluaciones de resultados, incluyendo mediciones del área de la herida, análisis cuantitativos histológicos e inmunohistoquímicos, y análisis LSCI, fueron realizadas por un solo investigador que no se percibió ante las tareas del grupo de estudio.
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Validación de los márgenes de seguridad para hipoxia persistente inducida por baja presión
El análisis de supervivencia de Kaplan–Meier demostró un desplazamiento gradual hacia abajo en las curvas de supervivencia a medida que aumentaba la altitud simulada, con eventos de mortalidad observados por primera vez en el grupo de 6000 m (Figura 2B). Las comparaciones por pares con corrección de Bonferroni no revelaron diferencias estadísticamen...
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Las condiciones de gran altitud dificultan el proceso de cicatrización de la herida al inducir hipoxia tisular, reducción de la perfusión sanguínea y respuestas inflamatorias, que a su vez promueven una producción excesiva de especies reactivas de oxígeno, activación de proteasas, senescencia celular y disfunción de las células madremesenquimales 27,28,29,30 . ...
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Los autores no declaran intereses en competencia.
Esta investigación fue financiada por los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales, UESTC (ZYGX2025YGLH006); Proyecto de Investigación en Ciencias de la Salud de la Provincia de Sichuan (2025-205); Fundación de Ciencias Naturales de Shigatse, Tíbet, China (RKZ2024ZR-003).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Escáner automático de diapositivas | Olimpo | VS200 | Escaneo de secciones tisulares |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Servicebio | GC305010 | Reactivo bloqueante para IHC/FI |
| Anticuerpo CD206 | Proteintech | 18704-1-AP | Detección de macrófagos M2 (Dilución 1:200) |
| Anticuerpo CD31 | Abcam | a. 182981 | Detección de la densidad de microvasos (Dilución 1:800) |
| Anticuerpo CD86 | HuaBio | ER1906-01 | Detección de macrófagos M1 (Dilución 1:200) |
| Anticuerpo CK19 | HuaBio | ET1601-6 | Evaluación de la re-epitelialización (Dilución 1:200) |
| Kit de sustrato DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | Sustrato cromogénico para la tinción de IHC |
| IgG anticonejo de cabra conjugada con FITC | Servicebio | GB22303 | Anticuerpo secundario fluorescente para el AI (dilución 1:100) |
| G*Power | Universidad de Duisburg-Essen, Alemania | www.gpower.hhu.de | Cálculo de la potencia estadística |
| Software GraphPad Prism | GraphPad Software | https://www.graphpad.com/ | Análisis estadístico y generación de grafos |
| Solución de tinción de hematoxilina | J& K Scientific | LM10N13 | H& Tinción con E |
| HIF-1 y alfa; anticuerpo | Bioss | BS-0737R | Detección de señalización relacionada con la hipoxia (Dilución 1:100) |
| IgG anticonejo conjugado con HRP | Servicebio | GB23303 | Anticuerpo secundario para IHC (Dilución 1:100) |
| Sistema de control hipobárico | Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd. | LP-1500 | Usado para simular hipoxia hipobárica graduada a gran altitud |
| Kit de hipoxiproba-1 | Hypoxyprobe Inc. | HP1-100 | Utilizado para la detección in vivo de hipoxia |
| Kit de amplificación de señal IF555 Tyramide | Servicebio | G1233 | Utilizado para amplificar señales de fluorescencia mejoradas |
| Anticuerpo IL-10 | HuaBio | HA722032 | Detección de citocinas antiinflamatorias (Dilución 1:100) |
| IL-1 y beta; anticuerpo | HuaBio | HA723965 | Detección de citocinas proinflamatorias (Dilución 1:100) |
| Software ImageJ | Institutos Nacionales de Salud (NIH), EE. UU. | https://imagej.net/ij/download.html | Cuantificación de imágenes |
| Isoflurano | RWD Life Science Co., Ltd. | R510-22-16 | |
| Anticuerpo Ki-67 | HuaBio | HA721115 | Detección de proliferación de queratinocitos (Dilución 1:400) |
| Sistema de imagen de flujo sanguíneo con mote láser | RWD Life Science Co., Ltd. | RFLSI ZW | Valoración de Perfusión sanguínea |
| Kit de ensayo LDH | Instituto de Bioingeniería Jiancheng de Nankín | A005-1-2 | Medición de LDH en suero |
| Masson' Kit de tinción tricroma S | Servicebio | G1006-100ML | Análisis de deposición de colágeno |
| Kit de ensayo MDA | Instituto de Bioingeniería Jiancheng de Nankín | A003-1-1 | Evaluación de la peroxidación lipídica |
| Kit de manchas rojas Sirius | Servicebio | G1078-100ML | Diferenciación del colágeno I/III |
| Kit de ensayo SOD | Instituto de Bioingeniería Jiancheng de Nankín | A001-1-1 | Medición de la actividad de la SOD en suero |
| TNF-& alfa; anticuerpo | HuaBio | ER65189 | Detección de citocinas proinflamatorias (Dilución 1:200) |
| Anticuerpo VEGF-A | HuaBio | ET1604-28 | Detección de señalización relacionada con la angiogénesis (Dilución 1:200) |