La clase común de variantes genéticas asociadas a vasculitis en interferonopatías tipo I dentro de una cohorte pediátrica

Resumen

La secuenciación del exoma completo en 1.204 pacientes pediátricos con sospecha de enfermedad autoinflamatoria identificó variantes asociadas a interferonopatía en 132 casos, incluyendo 79 mutaciones nuevas. La mayoría eran heterocigotas y vinculadas a fenotipos vasculíticos. Estos hallazgos subrayan el valor diagnóstico de las pruebas genéticas y el papel central de la señalización interferónica tipo I desregulada en la vasculitis pediátrica.

Resumen

La vasculitis pediátrica se diagnostica tradicionalmente mediante evaluación histopatológica; sin embargo, cada vez más, en la práctica clínica se utilizan enfoques basados en imágenes menos invasivos. A pesar de estos avances, la identificación de una etiología monogénica subyacente sigue siendo esencial para comprender los mecanismos de la enfermedad, predecir el pronóstico y guiar estrategias terapéuticas específicas. Las interferonopatías tipo I comprenden un grupo heterogéneo de trastornos inmunomediados caracterizados por la señalización constitutiva del interferón y manifestaciones vasculíticas o vasculopáticas frecuentes. La activación persistente de las vías de detección de ácidos nucleicos y la alteración de la homeostasis intracelular contribuyen a la disfunción endotelial y a la inflamación vascular crónica.

Este estudio presenta un flujo de trabajo integral de análisis genético para detectar variantes asociadas a la vasculitis en genes relacionados con interferonopatía dentro de una cohorte pediátrica de enfermedades autoinflamatorias. Se realizó la secuenciación del exoma completo en 1.204 pacientes con sospecha de trastornos autoinflamatorios. Las variantes que afectan a regiones codificadoras y sitios de empalme se analizaron utilizando una canalización bioinformática basada en las directrices del American College of Medical Genetics and Genomics, integrando técnicas de filtrado estadístico y procesamiento de señales inspiradas en transformadas de Fourier discretas (DFT) y distribuciones estadísticas para mejorar la priorización e interpretación de variantes.

Se identificaron variantes asociadas a interferonopatía en 132 pacientes pediátricos evaluados a través de una base de datos de una clínica de reumatología. En total, se detectaron 92 variantes únicas, incluyendo 13 variantes patógenas o probablemente patógenas previamente reportadas y 79 variantes nuevas que no estaban presentes en bases de datos públicas a fecha de febrero de 2026. Las manifestaciones clínicas incluyeron principalmente fiebre recurrente, manifestaciones vasculíticas y presentaciones autoinflamatorias complejas.

Las variantes involucraron genes asociados a la señalización desregulada del interferón y la activación inmunitaria innata, incluyendo vías vinculadas a la activación STING, metabolismo de ácidos nucleicos y disfunción del tráfico intracelular. Este flujo de trabajo interdisciplinar demuestra la posible utilidad diagnóstica del análisis genómico en la vasculitis pediátrica y destaca la importancia de la señalización sostenida por interferón en la lesión vascular y la patogénesis de enfermedades autoinflamatorias.

Introducción

La vasculitis pediátrica se ha diagnosticado tradicionalmente mediante evaluación histopatológica, que sigue siendo el estándar de oro. Sin embargo, las estrategias diagnósticas recientes han favorecido cada vez más enfoques menos invasivos, especialmente modalidades basadas en imagen. A pesar de estos avances, identificar una etiología monogénica subyacente es de suma importancia en la vasculitis infantil, ya que proporciona información fundamental sobre los mecanismos de la enfermedad, el pronóstico y las oportunidades para terapias^{dirigidas 1,2}.

Se debe sospechar de vasculitis infantil en niños que presentan inflamación sistémica y afectación multiorgánica. Se requiere una exhaustiva historia clínica, un examen físico exhaustivo, estudios de laboratorio, estudios de imagen y, en algunos casos, biopsias de tejido para establecer el diagnóstico y excluir los imitadores. La detección y el tratamiento tempranos son esenciales porque la enfermedad no tratada puede provocar complicaciones potencialmente mortales o secuelas a^{largo plazo 1}.

Las interferonopatías tipo I incluyen un espectro diverso de trastornos monogénicos y complejos mediados por el sistema inmunitario, caracterizados por una activación sostenida de la vía del interferón tipo I y características vasculíticas o vasculopáticas^{recurrentes 3,4}. La detección desregulada de ácidos nucleicos y la alteración de la homeostasis intracelular son mecanismos patógenos centrales que vinculan la sobreproducción sostenida de interferón con la inflamación y lesión vascular. Las mutaciones de ganancia de función en TMEM173 (STING1) causan vasculopatía asociada a STING con inicio en la infancia (SAVI), mientras que las mutaciones autosómicas dominantes en COPA interrumpen el tráfico endoplasmático del retículo de Golgi, lo que conduce a una activación aberrante de STING y a un fenotipo^{vasculítico 3-5}. Interferonopatías adicionales causadas por defectos en genes del metabolismo de ácidos nucleicos (TREX1, RNASEH2A/B/C, SAMHD1, ADAR1 e IFIH1) enfatizan aún más el vínculo mecanicista entre la desregulación del interferón y la patología^{vascular 3} (véase Figura 1).

Figura 1. Arquitectura patógena detallada de interferonopatías tipo I que impulsan la disfunción endotelial y la lesión microvascular en cohortes pediátricas. (Izquierda) Contexto sistémico de la interferonopatía pediátrica tipo I: discriminación defectuosa entre uno mismo y no uno mismo y detección aberrante de ácidos nucleicos del huésped desencadenan autoinflamación sistémica. Los fenotipos clínicos se caracterizan principalmente por vasculopatía cutánea de inicio temprano y afectación sistémica, presentándose frecuentemente como lesiones cutáneas similares a sabañones. (Medio) Cascada mecanicista de defectos genéticos hacia la desregulación sistémica: las mutaciones de pérdida de función en enzimas de eliminación de ácidos nucleicos (por ejemplo, DNASA1, TREX1) conducen a la acumulación aberrante de ADN y ARN endógenos dentro del citoplasma. Simultáneamente, mutaciones de ganancia de función en sensores como STING1 impulsan la activación constitutiva de la vía cGAS-STING independientemente de los desencadenantes virales. Esta detección patogénica intracitoplasmática hiperactiva los factores reguladores del interferón, lo que da lugar a la síntesis continua de interferones tipo I (IFN-α/β). La producción crónica de citocinas establece un bucle sistémico de amplificación autosostenido a través de los receptores IFNAR1/2, agravado por mecanismos de eliminación deteriorados y controles de retroalimentación positiva. (Derecha) Resultado patológico: la unión persistente del IFN-α/β circulante al complejo receptor de células endoteliales induce una activación sostenida de JAK-STAT. Esta constante alteración homeostática provoca un estrés endotelial continuo y perjudica los mecanismos fisiológicos de vasorelajación. A nivel capilar, este estado hiperinflamatorio provoca daño directo de las células endoteliales, un engrosamiento significativo de la pared vascular y trombosis microvascular luminal, culminando en isquemia tisular grave y microvasculopatía necrosante sin vías autoinmunes mediadas por autoanticuerpos. Abreviaturas: cGAS-STING = estimulador cíclico GMP-AMP sintasa de genes de interferón; DNASA1 = desoxirribonucleasa 1; GoF = ganancia de función; IFN = interferón; IFNAR = receptor de interferón alfa/beta; IRF = factor regulador del interferón; JAK-STAT = Transductor de señal de la quinasa Janus y activador de la transcripción; STING1 = estimulador de la respuesta al interferón, interactor cGAMP 1; TREX1 = tres exonucleasas principales de reparación 1. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Este enfoque se desarrolló para detectar variantes génicas asociadas a interferonopatía en cohortes autoinflamatorias pediátricas, ya que los métodos convencionales pueden enfrentar desafíos analíticos en la priorización temprana de mutaciones raras, y la heterogeneidad neutrófila desempeña un papel crítico en la predicción del riesgo de^{recaída 6}. En la literatura, el papel de la desregulación de la señalización interferónica en la vasculitis de pequeños vasculíes ha sido elucidado mediante análisis de células individuales, lo que subraya la ventaja de la secuenciación del exoma completo (WES) para el diagnóstico precoz en cohortes^{pediátricas 6}.

Los síndromes autoinflamatorios monogénicos pueden presentarse con vasculitis o manifestaciones similares a la vasculitis. Por ejemplo, la SAVI puede imitar la vasculitis de vasculitis de vasculitis de vasos pequeños^{o medianos 7}. De manera similar, la artritis idiopática juvenil (AIJ) representa un grupo heterogéneo de enfermedades inflamatorias de inicio infantil que pueden persistir en la edad adulta y están asociadas con una desregulación similar a la interferonopatía, lo que subraya la necesidad de análisis genético en cohortes^{pediátricas 8}.

Las interferonopatías tipo I son errores innatos mendelanos de inmunidad caracterizados por la activación de sensores antivirales activados por ácidos nucleicos derivados del huésped, lo que representa un fallo en la discriminación entre el propio y el no propio ^3,4. Estos trastornos se definen por la regulación al alza de la señalización interferónica tipo I, y las manifestaciones dermatológicas suelen proporcionar pistas diagnósticas importantes. La SAVI está asociada a mutaciones de ganancia de función en TMEM173 y se presenta con vasculopatía cutánea de inicio temprano e inflamación pulmonar⁹. La mutación p.V155M es la^{variante 10} más frecuentemente reportada. La SAVI es una enfermedad autoinflamatoria rara asociada a mutaciones STING1, caracterizada por enfermedad pulmonar intersticial temprana (ILD) y lesiones cutáneas, y puede imitar clínicamente el lupus eritematoso sistémico (LES⁾¹¹. La señalización desregulada del interferón tipo I también ha estado implicada en la vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA) (VAA). En la VAA, una firma de interferón tipo I predomina en la poliangiitis microscópica/vasculitis asociada a mieloperoxidasa (MPA/MPO-AAV) y está asociada con el pronóstico renal, lo que destaca la contribución de variantes raras a la desregulación del^{interferón 12}.

Los síndromes autoinflamatorios monogénicos pueden presentarse con vasculitis o manifestaciones similares a la vasculitis. Por ejemplo, la SAVI puede imitar la vasculitis de vasculitis de vasculitis de vasos pequeños^{o medianos 7}. Anteriormente, se describió la mayor cohorte global de pacientes portadores de mutaciones activadoras de STING1, proporcionando una caracterización fenotípica clínica e inmunológica ampliada de SAVI¹³. En las dos últimas décadas, se han logrado avances notables en la comprensión del reconocimiento de patógenos tanto por células hematopoyéticas como no hematopoyéticas. Los componentes microbianos se detectan mediante receptores codificados por la línea germinal, un paso clave para iniciar esta^{respuesta 14}. En 2006, se demostró que la transfección de ADN en varios tipos celulares induce una regulación al alza de interferones tipo I de manera independiente del receptor tipo toll (TLR). En este contexto, STING, una proteína transmembrana localizada en el retículo endoplásmico, fue identificada en 2008 como mediador clave de las respuestas de interferón tipo I al ADN^{sintético y viral 13}. Las mutaciones de ganancia de función en STING1 conducen a una interferonopatía tipo I conocida como SAVI⁹˒¹⁰˒¹⁴. Esta enfermedad grave se caracteriza de forma variable por inflamación sistémica de inicio precoz, vasculopatía cutánea y enfermedad pulmonar intersticial (ILD)¹⁴. La SAVI es rara, hasta la fecha se han reportado 52 pacientes de 37 familias y la mayoría de los casos surgen de novo, aunque también se ha documentado herencia autosómica dominante. Anteriormente, se describió la mayor cohorte global de pacientes portadores de mutaciones activadoras de STING1, proporcionando una caracterización fenotípica clínica e inmunológica ampliada de SAVI ^9,10,11˒¹⁴.

Este protocolo se desarrolló para permitir la detección temprana de variantes genéticas asociadas a interferonopatía mediante análisis genético basado en WES en pacientes pediátricos con características autoinflamatorias, ya que los enfoques convencionales suelen ser insuficientes para identificar mutaciones raras y pueden perder oportunidades de intervención temprana. La literatura demuestra que el papel de la regulación al alza del interferón en fenotipos similares a la vasculitis se ha aclarado mediante el estudio de trastornos mendelianos, lo que subraya aún más la ventaja de la WES para la detección de variantes^{raras 4,7,12}.

El objetivo principal de este método es integrar principios de procesamiento de señales basados en física con modelado computacional biofísico simplificado para apoyar la detección de variantes en datos WES para interferonopatías tipo I, mientras se interpretan los efectos posteriores sobre las vías de señalización del interferón, particularmente la cascada de transductor de señal quinasa Janus y activador de transcripción (JAK-STAT). Este enfoque exploratorio pretende complementar el análisis de regiones genómicas frecuentemente afectadas por el ruido de secuenciación y la cobertura no uniforme de trastornos inmunomediados, en los que la activación desregulada del interferón impulsa fenotipos vasculíticos. Los flujos de trabajo bioinformáticos estándar suelen centrarse en métricas de calidad estándar, lo que puede dejar espacio para un filtrado adicional y de apoyo al identificar variantes en regiones complejas de genes como STING1 o TREX1. Aplicando técnicas de procesamiento de señales inspiradas en transformadas de Fourier discretas (DFT) y distribuciones estadísticas, este método extrae características genómicas subyacentes de secuencias nucleótidicas, mapeando bases (A, T, C, G) a indicadores binarios para el análisis de patrones^{de mutaciones 15}. Además, la modelización biofísica de las vías del interferón incorpora el comportamiento umbral y la amplificación acumulativa de señales para evaluar cómo las variantes genéticas pueden sostener la disfunción endotelial, con especial atención al papel de la vía JAK-STAT en la transmisión de señales de interferón tipo I (IFN-α/β).

Esta aplicación exploratoria fue diseñada para estudiar perfiles de alineación en regiones de baja cobertura. Mientras que las herramientas computacionales estándar proporcionan filtración primaria de variantes, el modelo de apoyo investiga si la evaluación basada en SNR puede ofrecer un gating cualitativo secundario de variantes codificantes de un solo nucleótido (SNVs) afectadas por la distribución de lecturas no uniforme. Este enfoque basado en la física utiliza optimización SNR para evaluar la calidad del genotipo y las proporciones menores de lectura. En la literatura en general, un modelado estocástico similar ha revelado respuestas graduadas en las vías JAK-STAT en lugar de dinámicas todo o nada, lo que permite una mejor predicción de la sobreproducción de^{interferones 16}. La vía JAK-STAT, activada por interferones tipo I (IFNs) que se unen a los receptores IFNAR1/IFNAR2, implica que las quinasas de Janus (JAK1, TYK2) fosforilan STAT1 y STAT2, formando el complejo ISGF3 con IRF9 para la translocación nuclear y la transcripción^{ISG 17}. Esto puede modelarse usando ecuaciones diferenciales ordinarias (EDO) para inducción IFN-β:

donde los parámetros listados representan la tasa de fosforilación, la desfosforilación y la retroalimentación negativa vía SOCS1, destacando la amplificación dependiente del^{umbral 17}. Detalles adicionales incluyen la formación de homodímeros STAT1 para la señalización de IFN-γ, pero en interferonopatías tipo I, la activación sostenida conduce a una expresión excesiva de ISG. Las simulaciones estocásticas explican además la variabilidad, utilizando algoritmos de Gillespie para modelar el ruido en la unión receptor-ligando y la importación nuclear, revelando heterogeneidad célula a célula en las respuestas^{IFN 16}. Este método es especialmente adecuado para investigadores que investigan la vasculitis autoinflamatoria, ya que proporciona un marco cuantitativo que vincula variantes con la desregulación de las vías, como a través de EDOs extendidas que incorporan efectos paracrinos:

donde los parámetros listados representan la tasa de producción, la degradación y el refuerzo^{paracrino 18}. Los usuarios con acceso a datos de secuenciación de alto rendimiento y recursos computacionales pueden aplicar este enfoque para priorizar variantes candidatas y explorar posibles efectos de la vía.

Este estudio fue planificado utilizando un enfoque multidisciplinar de reumatología y genética para identificar variantes asociadas a la vasculitis en genes relacionados con interferonopatía en una gran cohorte pediátrica que presentaba características autoinflamatorias, utilizando un protocolo de análisis genético basado en secuenciación clínica del exoma (CES)/WES debido a las dificultades en la clasificación de la vasculitis y las limitaciones de los enfoques tradicionales. Además, el estudio pretendía enfatizar el valor diagnóstico de la evaluación genética en la vasculitis infantil.

La Clasificación de Vasculitis de Chapel Hill de 2012 no incluye la vasculitis autoinflamatoria^{monogénica 19}. Este estudio tuvo como objetivo determinar la frecuencia de variantes relacionadas con la interferonopatía detectadas en un grupo de pacientes pediátricos con síntomas autoinflamatorios, contribuir a la ampliación de la base de datos de enfermedades raras y enfatizar la importancia de la evaluación genética en la vasculitis pediátrica.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ege. Todas las muestras de sangre periférica se recogieron tras obtener el consentimiento informado por escrito de los pacientes o de sus tutores legales, de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Este estudio retrospectivo monocéntrico fue diseñado para evaluar la frecuencia de variantes asociadas a interferonopatía entre pacientes sometidos a análisis genéticos por sospecha de enfermedad autoinflamatoria y para investigar su relación con la vasculitis. Entre 2022 y 2025, se incluyeron muestras de sangre periférica enviadas al Laboratorio de Medicina Molecular de la Universidad de Ege con un diagnóstico preliminar de enfermedad autoinflamatoria. Un total de 1.204 muestras fueron sometidas a análisis genético. CES/WES se utilizó como un enfoque de secuenciación de nueva generación (NGS) dirigido a exones y secuencias intrónicas adyacentes. Las variantes se clasificaron según criterios ACMG y análisis bioinformático. Se excluyeron variantes benignas y potencialmente benignas. Entre estos, 132 casos pediátricos con variantes asociadas a interferonopatía identificadas que cumplían los criterios de inclusión fueron incluidos en la cohorte final del estudio.

Dentro de esta cohorte pediátrica, se obtuvieron datos clínicos de una base de datos de una clínica de reumatología. En total, se identificaron 92 variantes genéticas únicas entre los 132 pacientes, incluyendo 13 variantes patógenas previamente reportadas o probablemente patógenas documentadas en bases de datos públicas de variantes (por ejemplo, ClinVar) y 79 variantes nuevas que no estaban en las bases de datos públicas a fecha de febrero de 2026. La mayoría de las variantes eran heterocigotas y se asociaron con fenotipos similares a la CAPS o presentaciones de vasculitis autoinflamatoria compleja. WES utilizó un enfoque NGS dirigido a regiones codificadoras de proteínas (exones) y secuencias intrónicas adyacentes para detectar variantes del sitio de la espal y variantes reguladoras. Aunque el WES cubre aproximadamente entre el 1% y el 2% del genoma humano, captura casi el 85% de las mutaciones conocidas que causan enfermedades, lo que lo convierte en una herramienta altamente eficiente para la detección de variantes raras.

El flujo de trabajo de laboratorio incluyó extracción de ADN genómico de sangre periférica, fragmentación del ADN, preparación de bibliotecas ligadas con adaptador y enriquecimiento del exoma utilizando sondas de captura basadas en hibridación mediante pulldown de biotina-estreptavidina. La secuenciación de extremos emparejados de alto rendimiento se realizó en una plataforma de secuenciación de nanobolas de ADN, logrando una profundidad media de cobertura de 100–200x para asegurar una detección fiable de variantes. El análisis bioinformático implicó alineación con el genoma de referencia, llamada de variantes y anotación utilizando bases de datos seleccionadas de variantes, realizándose la clasificación de variantes según las directrices del American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Las variantes se clasificaron como previamente reportadas o novedosas. Variantes seleccionadas fueron validadas mediante secuenciación Sanger.

Además de las canalizaciones bioinformáticas estándar, se aplicaron principios de procesamiento de señales basados en física y modelado computacional simplificado para evaluar la profundidad de secuenciación, la uniformidad de cobertura y las características señal-ruido, proporcionando así una capa exploratoria y complementaria para analizar la profundidad de secuenciación bruta y la cobertura regional. Además, se emplearon conceptos de modelización biofísica para evaluar el impacto acumulativo de las variantes genéticas asociadas a la vasculitis.

Este marco interdisciplinar sirve como un modelo preliminar de laboratorio para estudiar características de filtrado variante en un contexto de investigación exploratoria, especialmente para guiar estrategias terapéuticas anti-interferón. Las limitaciones incluyen una sensibilidad reducida para variantes de mosaico de bajo nivel y la necesidad de validar funcionalmente los hallazgos novedosos. Las aplicaciones potenciales incluyen el diagnóstico precoz de la vasculitis pediátrica, la toma de decisiones terapéuticas personalizada y la ampliación de bases de datos de variantes relevantes para inmunología, reumatología y medicina vascular.

Fragmentación del ADN

Veinte microlitros de ADN diluido fueron transferidos a nuevos tubos estériles de PCR. A cada tubo se añadieron 2 μL de tampón de fragmentación/adenilación y 3 μL de mezcla enzimática de fragmentación/adenilación; el volumen total de reacción era de 25 μL. La mezcla se mezcló suavemente, se centrifugó brevemente y el programa de fragmentación se ejecutó en el ciclador térmico. Inmediatamente después de su finalización, los tubos fueron centrifugados brevemente y colocados sobre hielo. El resultado esperado era un tamaño medio de fragmento de ADN de 200–300 pb.

Ligación de adaptadores

A cada producto de fragmentación se añadieron 2,5 μL de adaptador de secuenciación, seguidos de 10 μL de mezcla maestra de ligación (sin vórtice). La mezcla se pipeteó suavemente para asegurar la homogeneidad, se centrifugó brevemente e incubó a 20 °C durante 15 minutos con la tapa del ciclador térmico abierta. Tras la incubación, los tubos se centrifugaron brevemente y se mantuvieron en hielo.

Purificación a base de cuentas

Se añadieron treinta microlitros de perlas magnéticas a cada muestra y se mezclaron minuciosamente mediante pipeteo hasta obtener una suspensión homogénea. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego los tubos se colocaron sobre un soporte magnético durante 3 minutos. Tras despejar el sobrenadante, fue retirado con cuidado. El pellet se lavó dos veces con 100 μL de etanol al 80%, y se eliminó el etanol residual tras el lavado final. Las cuentas se secaron al aire sobre el soporte magnético durante hasta 5 minutos. Se añadieron nueve microlitros de agua libre de nucleasa, el pellet fue resuspendido mediante pipeteo e incubado durante 2 minutos a temperatura ambiente. Tras una separación magnética durante 3 minutos, se transfirieron 7,5 μL de sobrenadante a un nuevo tubo PCR etiquetado.

Amplificación por PCR

Los cebadores de transcripción in vitro (IVT) se diluyeron (20 μL de cebador + 80 μL de agua libre de nucleasa). Para la reacción PCR (volumen total 17,5 μL), se añadieron 2,5 μL de cebador IVT 1, 2,5 μL de cebador IVT 2 y 12,5 μL de mezcla maestra de amplificación de biblioteca. La mezcla se pipeteó suavemente y se realizó el programa PCR-3.

Purificación post-PCR

Se añadieron veinticinco microlitros de perlas magnéticas a cada producto de PCR. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente y separación magnética, las perlas se lavaron dos veces con 100 μL de etanol al 80%. Tras secar al aire hasta 5 minutos, se añadieron 11 μL de agua libre de nucleasa. Diez microlitros de sobrenadante se transfirieron a un nuevo tubo. Se medía la concentración en la biblioteca; objetivo: >25 ng/μL.

Agrupación e hibridación (muestras por grupo)

Las bibliotecas se agruparon con ocho muestras de pacientes por grupo (93,75 ng por muestra, un total de 750 ng). El volumen se ajustaba a 12,5 μL con agua libre de nucleasas si era necesario. La mezcla de hibridación se preincubó a 65 °C durante 15 minutos. Se añadieron de forma secuencial solución bloqueante, oligonucleótidos bloqueantes universales, sonda de captura del exoma, agua libre de nucleasas y potenciador de hibridación. Se inició el programa de hibridación de 16 horas (18:00–10:00).

Captura de objetivos híbridos sobre perlas de estreptavidina

Las cuentas de estreptavidina se lavaron tres veces con un tampón de encuadernación. Tras la hibridación de 16 horas, la mezcla se añadió a las perlas e incubó a 25 °C durante 30 minutos, mezclando suavemente cada 5 minutos. El lavado se realizó con el tampón de lavado de captura 1 a temperatura ambiente, seguido de tres lavados con el tampón de lavado de captura 2 precalentado (48 °C), incluyendo incubación a 48 °C. Tras el lavado final, el pellet se resuspendió en 23 μL de agua libre de nucleasa.

Preparación de ADN monocatenario (ssDNA)

Se añadieron veinticuatro microlitros de tampón TE, y la mezcla se desnaturalizó a 95 °C durante 3 minutos, para luego colocarse inmediatamente sobre hielo. Se añadió una mezcla maestra que contenía un tampón de ligadura por férula y una ligasa rápida de ADN, y se ejecutó el programa SS-2 (37 °C, 30 min) para circularizar el ADN monocatenario. Se añadió buffer de digestión y mezcla de enzimas digestivas, y se ejecutó el programa SS-3 (37 °C, 30 min). Luego, se añadieron 3,75 μL de buffer de paradas de digestión. Se añadieron ochenta y cinco microlitros de perlas magnéticas, seguido de la purificación estándar de las perlas. Quince microlitros de sobrenadante se transfirieron a un nuevo tubo; la concentración esperada era de 0,8–2 ng/μL.

Preparación de nanobola de ADN (DNB)

Los productos de ssDNA se utilizaron para la formación de DNB. Se añadieron buffers de formación DNB, buffer TE de bajo EDTA y mezclas enzimáticas DNB 1 y 2. Los programas DNB-1 y DNB-2 se ejecutaban de forma secuencial. Tras finalizar, se añadieron 20 μL de buffer DNB para la parada de reacción y se mezclaron suavemente (5–8x) usando puntas de pipeta de gran diámetro; La concentración esperada era de 8–40 ng. Los DNBs preparados se cargaron en la plataforma de secuenciación de nanobolas de ADN para una secuenciación de alto rendimiento de datos.

Procesamiento de datos de secuenciación y análisis de señales

Las lecturas de secuenciación en bruto se controlaban en calidad usando FastQC (v0.11.9) y fastp (v0.23.1). El umbral de relación señal-ruido (SNR) de 20 dB se optimizó mediante análisis de curvas de características de funcionamiento del receptor (ROC) frente a un conjunto de datos de referencia de variantes autoinflamatorias conocidas, equilibrando una tasa de falsos descubrimientos (FDR) del <1% con una sensibilidad objetivo del >95% para variantes de baja frecuencia; las lecturas que cayeran por debajo de este umbral de 20 dB fueron descartadas. La alineación con el genoma de referencia del Consorcio de Referencia del Genome Consortium Human Build 38 (GRCh38) y la llamada inicial de variantes se realizó utilizando BWA-MEM (v0.7.17) y el Kit de Herramientas de Análisis del Genoma (GATK, v4.2.6).

Para los pasos de procesamiento de señales basados en física, las secuencias de nucleótidos se convirtieron en señales numéricas binarias (0 representando purinas; 1 representando pirimidinas). Para calcular la DFT, la señal binaria se procesó con una ventana deslizante de N = 512 pares de bases y un solapamiento del 50% (tamaño de paso de 256 pb) para mantener una resolución genómica localizada. La DFT se definió como:

Para filtrar artefactos de secuenciación de alta frecuencia sin suavizar en exceso las variantes verdaderas de un solo nucleótido (SNVs), que se manifiestan como transiciones localizadas bruscas y de alta frecuencia, se calibró programáticamente un filtro digital pasa-bajas. La frecuencia de corte (fc) normalizada óptima se determinó iterativamente escaneando el rango de 0,05–0,25 ciclos/base. El algoritmo de optimización seleccionó fc = 0,15 ciclos/base, definido como el punto de inflexión donde el espectro de potencia de la señal retenía el ≥85% de la varianza total de las variantes de control true-positive conocidas mientras eliminaba el ruido técnico de fondo. El filtrado basado en DFT se aplicó mediante scripts personalizados escritos en Python (v3.9), utilizando específicamente las librerías NumPy (v1.23.0) y SciPy (v1.9.1), para reducir el ruido de alta frecuencia mientras se preservaban las características espectrales asociadas a la mutación. Los parámetros de filtrado se calibraban iterativamente de forma programática para evitar un sobresuavizado de señales variantes raras. El flujo de trabajo integrado para el procesamiento de señales y la modelización biofísica se resume en la Figura 2.

Modelado biofísico y estocástico de la señalización por interferón

Para investigar las consecuencias funcionales de las variantes identificadas, se modelaron la dinámica de las vías JAK–STAT utilizando ecuaciones diferenciales ordinarias (EDOs) definidas como:

Las simulaciones deterministas de EDO se ejecutaban usando COPASI (Complex Pathway Simulator, v4.36) y se corroboraban con scripts personalizados en Python usando el módulo scipy.integrate.solve_ivp. Se establecieron condiciones iniciales biológicamente realistas y se realizaron análisis de sensibilidad sobre constantes de velocidad de amplificación utilizando el SALib (Sensitivity Analysis Library in Python, v1.4.5). Se incorporaron cinéticas de señalización IFN-α mediada por TYK2 para simular la amplificación de STAT2 impulsada por ganancia de función.

Se introdujeron efectos estocásticos usando una formulación de Langevin:

dX = f(X) dt + g(X)dW

Además, se realizaron simulaciones estocásticas de Gillespie utilizando la biblioteca Python de GillesPy2 (v1.7.0) para modelar el estallido transcripcional y la activación heterogénea del gen estimulado por interferón inducido por IFN-β (ISG). Las funciones de retardo distribuidas representadas por formulaciones de núcleo gamma se implementaron en Python mediante integración numérica para simular mecanismos de retroalimentación transcripcional retardada. Todas las canalizaciones computacionales, incluyendo el filtrado de señales y el modelado matemático, se ejecutaban en un entorno de computación de alto rendimiento (HPC) basado en Linux.

Figura 2. Marco integrado para el procesamiento de señales y modelado biofísico de la señalización JAK-STAT. 1: Etapa de procesamiento de señales: mapeo binario de secuencias nucleotídicas (purinas = 0, pirimidinas = 1) seguida de filtrado basado en DFT. Nótese el umbral crítico de SNR en 20 dB para una llamada variante precisa. 2: Modelado biofísico: Simulación basada en EDO de tasas de amplificación donde pequeñas perturbaciones en condiciones iniciales provocan cambios umbral en la señalización sostenida. 3: Fenotipo biológico: modelado de variantes de ganancia de función de TYK2 en la vía IFN-α, que conduce a una activación amplificada de STAT2 y a fenotipos de interferonopatía resultantes. Abreviaturas: DFT = transformada discreta de Fourier; IFN-α = interferón alfa; JAK-STAT = Transductor de señal de la quinasa Janus y activador de la transcripción; EDE = ecuación diferencial ordinaria; SNR = relación señal-ruido; STAT2 = transductor de señal y activador de la transcripción 2; TYK2 = tirosina quinasa 2. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La Figura 2 resume la integración del procesamiento de señales basado en DFT con componentes de modelado de EDO y estocástico utilizados en el flujo de trabajo computacional exploratorio. Este protocolo integral integra genética molecular avanzada, tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (SEC), algoritmos de procesamiento de señales y modelado biofísico para apoyar la detección e interpretación funcional de variantes asociadas a interferonopatía en la vasculitis autoinflamatoria pediátrica.

Marco estadístico y distribución de probabilidad de mapeo de señales

Para formalizar el mapeo digital de las secuencias genómicas antes del filtrado de señales, se estableció un marco de conversión binaria basado en la bioquímica de nucleótidos. Para cualquier ventana genómica estructural de longitud N, las purinas {A, G} se mapean a un valor digital de 0, y las pirimidinas {C, T} a 1. Bajo la hipótesis nula (H0) de una distribución genómica de fondo uniforme y sesgada, esta conversión binaria sigue un marco de ensayos de Bernoulli. La función de masa de probabilidad (PMF) de la señal mapeada X se define de la siguiente manera

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x para x ∈ {0,1}

donde p = 0,5 representa la probabilidad de encontrar un residuo de pirimidina a lo largo de una pista de fondo no seleccionada. Al escalar esta conversión a través de bases secuenciales para el cálculo de densidad espectral de potencia (PSD) mediante la DFT, la distribución acumulada de ruido de fondo se comporta como un paseo aleatorio, convergiendo a una distribución gaussiana de ruido blanco según el Teorema Central del Límite. En consecuencia, el espectro de potencia normalizado de esta distribución nula sigue una distribución chi-cuadrado (χ²) con 2 grados de libertad. Para mantener un umbral de significación estadística estricta (α = 0,05), se calculó analíticamente el umbral de intensidad de potencia crítica para definir un pico genuino de señal de variante patogénica utilizando la siguiente integración de densidad de probabilidad:

Umbral = - In(a) x a²

donde σ² representa la varianza operativa del fondo local de ruido genómico de fondo. Cualquier pico espectral que superara este umbral (p < 0,05, equivalente a una SNR > 20 dB) se priorizó para compuertas de filtración in silico aguas abajo, asegurando que la llamada variante sea basada en datos y menos afectada por el ruido de secuenciación estocástica.

Eficiencia operativa y análisis de costes (Figura 3)

Desde una perspectiva traslacional e implantación clínica, la eficiencia operativa, el tiempo de respuesta clínica (TAT) y la viabilidad económica de este protocolo integrado se compararon con las vías diagnósticas tradicionales, como la secuenciación secuencial de Sanger o paneles génicos dirigidos restringidos. Mientras que las odisea diagnósticas convencionales para vasculitis pediátrica o interferonopatías sospechosas de tipo I suelen durar entre 8 y 12 semanas debido a pruebas iterativas de un solo gen, el flujo de trabajo optimizado —que abarca WES de alto rendimiento, hibridación optimizada a 16 horas y filtrado de señales DFT paralelizadas en un clúster de computación de alto rendimiento (HPC)— logra un TAT clínico total reportado de 10–14 días desde la recepción inicial de la muestra hasta el informe molecular final. Además, debido a la multiplexación eficiente de muestras (agrupando ocho muestras de pacientes por bloque de hibridación), se informa que el coste principal de reactivos y secuenciación es de aproximadamente 250–300 dólares por paciente, en comparación con los paneles integrales tradicionales que a menudo superan entre 1.200 y 1.800 dólares. Esta compresión tanto de los marcos de cronología diagnóstica como de costes sugiere que el flujo de trabajo propuesto en bioinformática inspirado en la física podría ser factible y escalable para laboratorios clínicos rutinarios de genética.

Resultados

En esta cohorte de 132 pacientes con variantes asociadas a interferonopatía identificadas, se identificó un amplio espectro de variantes genéticas (Tabla 1). De los pacientes, 53 (40,2%) eran mujeres y 79 (59,8%) hombres. La edad media era de 10,2 años (rango: 0–18 años). Los datos a nivel de paciente correspondientes a la cohorte final se proporcionan en la Tabla Suplementaria S1.

Tabla 1: Distribución y clasificación de variantes genéticas asociadas a interferonopatía tipo I identificadas dentro de la cohorte autoinflamatoria pediátrica (n = 132). Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla

Los genes más frecuentemente afectados fueron ADAR (25 pacientes, 18,94%) y DNASE1 (24 pacientes, 18,18%). Las variantes de DNASE1 eran exclusivamente de clase 3 (100% dentro del gen; 18,18% de la cohorte total). De manera similar, la mayoría de las variantes de ADAR eran de clase 3 (24 pacientes, 96,00%; 18,18% de la cohorte), con solo una variante de clase 2 (4,00% dentro del gen; 0,76% de la cohorte) (Tabla 2).

Tabla 2: Variantes identificadas en el panel de NGS de enfermedades raras. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla

También fueron comunes variantes en STING1 (20 pacientes, 15,15%) y RNASEH2B (14 pacientes, 10,61%). Todas las variantes STING1 eran de clase 3 (100%). Para RNASEH2B, 10 pacientes (71,43%) tenían variantes de clase 3 (7,58% de la cohorte), mientras que 4 pacientes (28,57%) tenían variantes de clase 2 (3,03% de la cohorte).

Se identificaron RNASEH2A mutaciones en 13 pacientes (9,85%), todos ellos portadores de variantes de clase 3 (100%). Las mutaciones de TREX1 estuvieron presentes en 10 pacientes (7,58%), incluyendo 8 variantes de clase 3 (80,00%; 6,06% de la cohorte) y 2 variantes de clase 2 (20,00%; 1,52% de la cohorte).

Se detectaron variantes SAMHD1 en 9 pacientes (6,82%), con 7 pacientes portadores de variantes de clase 3 (77,78%; 5,30% de la cohorte), 1 paciente portador de una variante de clase 1 (11,11%; 0,76%) y 1 paciente portador de una variante de clase 2 (11,11%; 0,76%).

Se encontraron RNASEH2C mutaciones en 8 pacientes (6,06%), todos ellos de clase 3. Se identificaron DNASE1L3 mutaciones en 6 pacientes (4,55%), incluyendo 5 variantes de clase 3 (83,33%; 3,79% de la cohorte) y 1 variante de clase 2 (16,67%; 0,76%). Se detectaron mutaciones en PSMB8 y COPA en 5 pacientes (3,79%), siendo todas las variantes de clase 3 (100%). Las mutaciones DNASE2 y STAT4 estuvieron presentes en 3 pacientes (2,27%), clasificándose todas las variantes como clase 3.

En general, las variantes de clase 3 constituyeron la clase predominante en casi todos los genes de la cohorte. Los sitios variantes específicos, incluyendo sustituciones detalladas de nucleótidos y alteraciones correspondientes de aminoácidos a través de los genes objetivo, se catalogan en la Tabla 3.

Análisis exploratorio del rendimiento de procesamiento de señales

Para explorar la robustez y sensibilidad de la cadena de procesamiento de señales basada en DFT, se realizó una comparación comparativa con el flujo de trabajo estándar de llamada de variantes solo GATK, centrándose específicamente en regiones genómicas de baja cobertura (profundidad < 30x). En la comparación preliminar, el diseño integrado de filtrado DFT mostró una posible tendencia hacia una mejor priorización en regiones seleccionadas de baja cobertura, sugiriendo una estimación exploratoria de recuperación de hasta el 96,8% bajo estas condiciones específicas de control de laboratorio. Es importante destacar que estos parámetros y métricas numéricas de eficiencia representan hallazgos preliminares y exploratorios calibrados dentro del contexto institucional específico de la cohorte, en lugar de una cadena clínica universalmente validada. El oleoducto también recuperó variantes de true-positive previamente descartadas en regiones de alto ruido. Además, el FDR se redujo del 6,4% al 1,2%, lo que pone de manifiesto la posible robustez del filtro pasa bajos para eliminar artefactos de secuenciación de alta frecuencia. Entre las variantes novedosas identificadas en la cohorte, 14 variantes (que representan el 17,7% de los hallazgos novedosos), predominantemente ubicadas en regiones de cobertura no uniforme en STING1 y TREX1, fueron inicialmente clasificadas como artefactos de baja calidad según umbrales algorítmicos estándar, pero fueron recuperadas y validadas con éxito por secuenciación Sanger siguiendo el protocolo de mejora de señal-ruido. Esta observación analítica sugiere que evaluar las características físicas de la señal puede ser una herramienta útil en los flujos de trabajo de investigación exploratoria.

Comparativa comparativa con flujos de trabajo estándar

Para evaluar el rendimiento comparativo de este marco integrado, se realizó un análisis de comparación lado a lado con dos pipelines estándar de llamadas de variantes: el flujo de trabajo de Mejores Prácticas GATK (BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6) y DeepVariant (v1.5). Las métricas de rendimiento se calcularon utilizando un subconjunto de validación de alta confianza de la cohorte, evaluado en regiones genómicas de baja cobertura (profundidad < 30x) y de alto ruido. La arquitectura comparativa se resume en la Tabla 4.

Parametrización cuantitativa y validación de modelos computacionales

Para fundamentar los marcos biofísicos y estocásticos en términos cuantitativos, las EDO y las simulaciones de Gillespie se parametrizaron utilizando valores cinéticos empíricos calibrados según condiciones de control experimentales. Las simulaciones continuas de ODE rastrean la concentración absoluta de STAT2 fosforilado ([STAT2p]) durante un curso de 720 minutos tras la exposición simulada al interferón tipo I. En el modelo computacional de tipo salvaje (WT), la cascada de señalización demostró una atenuación homeostática rápida, caracterizada por un pico de activación en t = 45 minutos seguido de un rápido despeje impulsado por realimentación negativa programada (k3 = 0,45 min-1) mediante expresión simulada de SOCS1. En contraste, el modelado de las variaciones de ganancia de función (GoF) en las vías STING1 y TYK2 reveló cambios severos en el umbral, resultando en un estado hiperinflamatorio persistente y no atenuante. Los cambios en la vida media de la señal (t1/2) y en el pliegue en estado estacionario se resumen en la Tabla 5.

Declaración de Disponibilidad de Datos

https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level datos clínicos correspondientes a la cohorte final se proporcionan en la Tabla Suplementaria S1. Los umbrales discretos de procesamiento digital de señales, las formulaciones matemáticas, la configuración del entorno de software y los parámetros computacionales necesarios para replicar el filtrado DFT y las simulaciones de vías biofísicas (EDOs y modelado estocástico) se han hecho públicos al público. Para garantizar un acceso permanente y sin restricciones para los lectores, este marco de replicación ha sido depositado en GitHub y archivado permanentemente en Zenodo a través de DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497. GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology. Las bibliotecas de software estándar de código abierto y las plataformas de computación numérica utilizadas en este flujo de trabajo, como NumPy, SciPy y COPASI, son de acceso público.

Figura 3. Storyboard operacional y arquitectura de pipeline basada en datos para la identificación y modelado biofísico de variantes asociadas a interferonopatías tipo I. El esquema describe un flujo de trabajo experimental y computacional cronológico de cuatro niveles, integrando el análisis clínico de cohortes con el procesamiento biológico de señales. (A) Estratificación de cohortes y canal NGS: flujo de trabajo para la cohorte autoinflamatoria pediátrica (n = 132) que está sometida a WES. El recuadro muestra las pistas brutas de puntuación Phred de control de calidad FastQ, pasando a la llamada de variantes GATK/DeepVariant y la generación final de matrices VCF. (B) Procesamiento de señales basado en DFT: traducción algorítmica de texto genómico en señales genómicas numéricas para la reducción de ruido. El gráfico basado en datos incrustados representa una distribución del espectro de potencia, identificando frecuencias variantes patógenas (picos de señal) frente al ruido genómico de fondo con un umbral SNR de >20 dB. (C) Puerta de curación in silico : embudo de priorización multilayer que integra las directrices de patogenicidad de 5 niveles de ACMG, HGMD y verificaciones cruzadas de Infevers para priorizar las 79 variantes novedosas y las 13 reportadas. (D) Validación de modelado biofísico funcional: capa de validación biológica. El marco determinista de ODE y las curvas de simulación de Gillespie estocásticas se integran como componentes gráficos, representando la recuperación temporal de 720 minutos y la señalización sostenida de la cinética celular tipo salvaje frente a la mutante simulada. Abreviaturas: ACMG = Colegio Americano de Genética Médica y Genómica; DFT = transformada de Fourier discreta; GATK = Kit de herramientas para análisis genómico; HGMD = Base de Datos de Mutaciones Genéticas Humanas; NGS = secuenciación de nueva generación; EDE = ecuación diferencial ordinaria; SNR = relación señal-ruido; VCF = formato variante de llamada; WES = secuenciación de todo el exoma. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 3: Control integral de anotaciones y bases de datos de locus de variantes genéticas identificadas asociadas a interferonopatía tipo I dentro de la cohorte pediátrica (n = 132). Criterios ACMG (según las directrices ACMG/AMP de 2015): Los códigos de evidencia ACMG/AMP se agruparon por fuerza de evidencia. La evidencia muy sólida incluyó PVS1, que se refiere a variantes predichas de pérdida de función en genes donde la pérdida de función es un mecanismo establecido de la enfermedad. La evidencia sólida incluyó PS1–PS4, que cubrían cambios de aminoácidos previamente establecidos, la aparición confirmada de novo, evidencia funcional de apoyo y aumento de la frecuencia de variantes en individuos afectados. La evidencia moderada incluyó PM1–PM6, incluyendo localización en un dominio crítico o punto de interés mutacional, ausencia o muy baja frecuencia en bases de datos poblacionales, ocurrencia trans en trastornos recesivos, cambios en la longitud de proteínas, cambios novedosos en residuos con variación patógena conocida y ocurrencia de novo asumida. La evidencia de apoyo incluyó PP1–PP5, incluyendo cosegregación, restricción de error específica de genes, evidencia in silico , especificidad fenotípica e informes previos reputados de patogenicidad cuando no había evidencia independiente disponible. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla

Tabla 4: Comparación de rendimiento lado a lado de las tuberías de llamada variante en regiones genómicas de alto ruido. Se realizó una evaluación de benchmarking en áreas de baja cobertura (<30x) para evaluar el rendimiento del filtro pasa-bajos DFT basado en física en la eliminación del ruido de secuenciación y la protección de señales verdadeiramente positivas en comparación con configuraciones algorítmicas estándar. Abreviaturas: DFT = transformada discreta de Fourier. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla

Tabla 5: Parámetros cinéticos cuantitativos y variaciones en estado estacionario de la señalización JAK-STAT aguas abajo. Resumen de los límites de simulación de la EDO y la simulación estocástica de Gillespie a lo largo de un curso de 720 minutos, destacando el fracaso de la atenuación homeostática celular en modelos que presentan variaciones patógenas STING1 y TYK2. Abreviaturas: JAK-STAT = Transductor de señal de la quinasa Janus y activador de la transcripción; EDE = ecuación diferencial ordinaria; STING1 = estimulador de la respuesta al interferón, interactor cGAMP 1; TYK2 = tirosina quinasa 2. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla

Tabla suplementaria S1. Conjunto de datos a nivel de paciente para la cohorte pediátrica con variantes asociadas a interferonopatía. La tabla proporciona los datos a nivel de paciente correspondientes a la cohorte final de 132 pacientes analizada en el manuscrito. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los pasos críticos del protocolo incluyen la fragmentación del ADN, la ligación de adaptadores, la amplificación por PCR y la circularización de ADN monocatenario (ssDNA). Durante estas etapas, una ejecución meticulosa es esencial para minimizar el riesgo de contaminación. Lavados precisos con etanol y tiempos adecuados de incubación en soporte magnético durante la purificación a base de perlas son obligatorios, ya que las desviaciones pueden resultar en una reducción del rendimiento del producto o en la detección omisa de variantes. Durante la preparación de la biblioteca agrupada, se requiere un cálculo preciso de 93,75 ng por paciente y un ajuste cuidadoso del volumen.

Para la optimización y resolución de problemas de protocolos, mediciones de cuantificación fluorométrica baja, especialmente concentraciones de ADN de sss por debajo del umbral de 0,8–2 ng/μL, pueden requerir aumentar la profundidad de secuenciación o acortar los tiempos de secado de las perlas para mejorar la sensibilidad a la llamada de variantes. En casos de variantes sospechosas de mosaico, la integración de tecnologías de secuenciación de lectura larga puede mejorar la precisión de la detección. Además, la transferencia rápida de muestras sobre hielo tras la digestión enzimática es fundamental para mantener la estabilidad del^{producto 12,13}. Durante la preparación de DNB, el pipeteo lento y suave, junto con la adición cuidadosa de buffer de parada, preserva la integridad de la nanobola. Esto es especialmente importante para establecer correlaciones genotipo-fenotipo en interferonopatías de inicio temprano como^{SAVI 6,11}.

Este análisis genético basado en WES proporciona un marco para evaluar variantes asociadas a interferonopatía en pacientes pediátricos con características autoinflamatorias y vasculitis. Al identificar variantes en genes clave como DNASE1, ADAR, STING1, RNASEH2A/B/C, TREX1, SAMHD1 y COPA, el estudio pone de manifiesto la heterogeneidad genética subyacente a los fenotipos vasculíticos impulsados por interferón. La frecuencia de variantes en el metabolismo de los ácidos nucleicos y en genes sensores, particularmente DNASE1 y ADAR, en esta cohorte es coherente con el papel central de la señalización interferónica tipo I desregulada en la patogénesis de la vasculitis pediátrica y enfermedades autoinflamatorias. Estos hallazgos son coherentes con informes previos que vinculan estos genes con interferonopatías y manifestaciones vasculíticas ^4,5,7.

Al elucidar presentaciones similares a la vasculitis de los síndromes autoinflamatorios monogénicos, como la afectación pulmonar cutánea e intersticial observada en la SAVI, este enfoque puede facilitar un diagnóstico precoz y ayudar a orientar terapias dirigidas al ^{interferón 4,5,7}. Las interferonopatías monogénicas pueden imitar clínicamente la vasculitis asociada a ANCA y otros vasculítidos infantiles, subrayando la importancia de las pruebas genéticas en casos atípicos o resistentes^{al tratamiento 9,10,11}. Un diagnóstico genético precoz también puede permitir el inicio oportuno de tratamientos dirigidos como los inhibidores de JAK, que han mostrado beneficios clínicos en pacientes con STING1 y otras mutaciones relacionadas con^{el interferón 7,13,14}.

Este estudio también refuerza que una proporción significativa de pacientes pediátricos que presentan vasculitis autoinflamatoria compleja albergan variantes raras o novedosas en genes relacionados con la interferonopatía. La identificación de 79 variantes nuevas en esta gran cohorte amplía el espectro genético conocido y puede contribuir a mejores correlaciones genotipo-fenotipo en la vasculitis infantil.

Una consideración operativa en este flujo de trabajo exploratorio implica evaluar los límites umbral, ya que las desviaciones en los parámetros exploratorios de la SNR pueden alterar la salida del filtrado. Por ejemplo, el filtrado basado en DFT de las distribuciones de nucleótidos ayuda a reducir el ruido en lecturas, pero requiere calibración para evitar un sobresuavizado de las señales de mutación; La resolución de problemas incluye ajustes iterativos de parámetros binarios de mapeo (0 para purinas, 1 para pirimidinas) para optimizar la extracción^{de características 15}. En la modelización biofísica, definir las condiciones iniciales para las EDOs es esencial, ya que pequeñas perturbaciones en las tasas de amplificación pueden alterar los comportamientos umbral, subestimando potencialmente la señalización sostenida del interferón. Los detalles mejorados de JAK-STAT incluyen el modelado del papel de TYK2 en la señalización IFN-α, donde variantes de ganancia de función amplifican la activación de STAT2, conduciendo a fenotipos de^{interferonopatía 20}.

Las modificaciones al método pueden incluir la integración de elementos estocásticos para entornos celulares ruidosos, como añadir términos de ruido de Langevin a las EDO:

dX = f(X)dt + g(X)dW

donde dW, el término listado, representa el ruido del proceso de Wiener, mejorando el realismo al simular la variabilidad^{JAK-STAT 21}. Las simulaciones estocásticas de vías de interferón, utilizando algoritmos de Gillespie, capturan la heterogeneidad en la expresión de IFN-β debido a bucles de retroalimentación negativa, donde las diferencias célula a célula en los niveles de factores de transcripción dan lugar a distribuciones bimodales de activación^{ISG 22,23}. La resolución de problemas en modelos de vías implica validar con datos experimentales de IFN-β; Si la amplificación diverge, se pueden recalibrar controles negativos como las tasas de activación de la fosfatasa, o incorporarse retardos distribuidos para la transcripción:

con núcleo gamma para procesos retardados.

En comparación con la secuenciación del genoma completo (WGS), este enfoque centrado en WES puede ser rentable, pero es menos completo para regiones no^{exónicas 24,25}. El alcance de este marco preliminar se limita a proporcionar un modelo de simulación bioquímica de apoyo para evaluar cómo las variaciones matemáticas se correlacionan con el comportamiento estimado de señalización del interferón, como se observa en modelos umbral donde los efectos acumulativos superan los valores críticos que conducen a la lesión vascular. Las limitaciones del método incluyen la posibilidad de pasar por alto variantes de mosaico de bajo nivel y la necesidad de validación funcional de hallazgos^{novedosos 6}.

Esta técnica tiene aplicaciones potenciales en inmunología y medicina vascular, incluyendo la orientación de terapias antiinterferónicas mediante la simulación de impactos de variantes en vías y el enriquecimiento de bases de datos para diagnósticos de enfermedades^{raras 19}. Las extensiones estocásticas pueden permitir además la predicción de respuestas heterogéneas en interferonopatías, facilitando la medicina personalizada.

En este estudio se enfatiza la evaluación genética en la vasculitis pediátrica junto con herramientas diagnósticas convencionales como la histopatología y las modalidades de imagen. En general, este estudio destaca la importancia de la evaluación genética en la vasculitis pediátrica, al tiempo que subraya la frecuencia de las variantes asociadas a interferonopatía identificadas entre pacientes sometidos a análisis genéticos por sospechas de enfermedades autoinflamatorias. Al evaluar el impacto de estas variantes en las vías de señalización del interferón y subrayar la importancia del diagnóstico precoz en la vasculitis pediátrica, este trabajo contribuye al enriquecimiento de bases de datos de enfermedades raras relacionadas con trastornos vasculíticos y autoinflamatorios, y proporciona perspectivas para futuros estudios que investiguen patogenicidad de variantes y polimorfismos específicos de población.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pipetas ajustables (P2, P10, P20, P200, P1000)	Cualquier proveedor		Para un manejo preciso de líquidos
Centrífuga de sobremesa	Cualquier proveedor		Para la centrifugación breve de tubos PCR
Equinox Library Amp Mix	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (o equivalente)	Master mix de amplificación PCR
Etanol (grado de biología molecular)	Cualquier proveedor		Usado para preparar solución de lavado de etanol al 80%
IVT Primer 1 & IVT Primer 2	MGI Tech	Incluido en el kit o por separado	Primers de amplificación de biblioteca
Tubos de PCR de bajo enlace (0,2 mL)	Cualquier proveedor		Tubos PCR estériles
Soporte magnético / Bastidor magnético	Cualquier proveedor		Para la separación de perlas magnéticas
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	Secuenciador de próxima generación de sobremesa que utiliza la tecnología DNBSEQ (Secuenciación de Nanobolas de ADN); admite múltiples longitudes de lectura (por ejemplo, SE50 a PE300); salida de alto rendimiento de hasta 1440 Gb por ejecución; ideal para aplicaciones WES, WGS y secuenciación dirigida.
Kit MGIEasy Circularization	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (Código de barras dual, 16 RXN) o 1000005260 (V2.0)	Kit de circularización para generar ADN circular de cadena sencilla (ssCirDNA); la versión de código de barras dual reduce el salto de índice; paso esencial posterior a la preparación de la biblioteca para la formación de DNB en el flujo de trabajo de secuenciación de MGI.
Perlas de limpieza de ADN MGIEasy	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	Perlas magnéticas para la purificación de ADN
Kit de preparación de DNB/ Kit de fabricación de DNB MGIEasy	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (integrado con circularización de código de barras dual) o DNB relacionado (por ejemplo, 940-000036-00 Onestep DNB)	Módulo de preparación de nanobolas de ADN (DNB); incluye circularización y generación de nanobolas para la carga de celdas de flujo; paso final en el procesamiento de la biblioteca para secuenciadores DNBSEQ (a menudo combinado con el kit de circularización).
Kit de accesorios MGIEasy Exome Capture	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (o equivalente)	Contiene solución bloqueadora, bloqueadores universales MGI, potenciador, tampón de unión, tampón de lavado 1 & 2 y perlas de estreptavidina
Probas de captura de exoma MGIEasy V4 (o probás Twist CES, compatibles con MGI/DNBSEQ)	MGI Tech Co., Ltd. (para MGIEasy) o Twist Bioscience (para Twist)	1000007745 (conjunto de probás V4, 16 RXN) o 1000007740 (Probás); Twist: Personalizado / específico del panel (basado en pedido, sin número estándar)	Probás de captura de exoma completo basado en hibridación; se dirige a ~ 59 Mb de regiones codificantes (CCDS, RefSeq, GENCODE, miRBase); diseñado para un enriquecimiento de alta eficiencia en flujos de trabajo WES en plataformas DNBSEQ; se utiliza con el kit de accesorios MGIEasy para hibridación (pre-incubación a 65°C, 16 horas durante la noche a 65°C), adición de bloqueador, captura de perlas de estreptavidina (búfer de unión, búfer de lavado 1/2 a 48°C), elución y amplificación PCR post-captura (compatible con el mix de Equinox).
Kit MGIEasy Fast Hybridization and Wash	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	Reactivos de hibridación y lavado
Kit de preparación de biblioteca de ADN MGIEasy FS	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (juego de 16 RXN) o 1000005256 (kit central de 96 RXN)	Kit de preparación de biblioteca de ADN basado en fragmentación rápida; fragmentación enzimática con 5–400 ng de ADNg de entrada; compatible con plataformas DNBSEQ para una construcción eficiente de bibliotecas WGS/WES.
Agua libre de nucleasa	Cualquier proveedor		Grado de biología molecular
Kit Qubit dsDNA HS Assay	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Para cuantificación de bibliotecas
Kit Qubit ssDNA Assay (opcional)	Thermo Fisher Scientific	Q10212	Para cuantificación de ssDNA después de la circularización
Perlas magnéticas de estreptavidina	MGI Tech	Incluido en el kit de accesorios	Para captura híbrida
Buffer TE (pH 8.0)	Cualquier proveedor		Para la etapa de desnaturalización
Termociclador	Varios (Bio-Rad, Thermo, etc.)		Utilizado para fragmentación, ligación, PCR y programas DNB
Mezclador Vortex	Cualquier proveedor		Para mezcla de muestras
Puntas de pipeta de gran calibre	Cualquier proveedor		Requerido para la preparación de DNB