Fenotipado conductual multimodal de estados depresivos inducidos por el estrés en Drosophila melanogaster

Resumen

Este protocolo proporciona un marco para evaluar los cambios conductuales inducidos por el estrés en Drosophila melanogaster. Combinar ensayos complementarios permite cuantificar la actividad, la exploración y la toma de decisiones para moscas individuales. El enfoque es flexible y puede adaptarse a una amplia gama de estudios que investiguen la biología del estrés, el metabolismo y la función neuroconductual.

Resumen

Los trastornos metabólicos, neurodegenerativos y relacionados con el estrés suelen ir acompañados de alteraciones en la locomoción, alteración de la toma de decisiones y reducción de la flexibilidad conductual. Sin embargo, los marcos conductuales multimodales accesibles para cuantificar estos fenotipos en Drosophila melanogaster siguen siendo limitados. Aquí se presenta un protocolo que integra la exposición forzada a la natación, el comportamiento y la mano en el laberinto en Y, la fototaxia y la evaluación de actividad en el sistema FlyVac, la exploración en campo abierto y la monitorización locomotora a largo plazo utilizando el Monitor de Actividad Drosophila . Estos ensayos complementarios capturan múltiples dimensiones del comportamiento, incluyendo la salida motora, la motivación, la estructura de decisión y la variabilidad conductual, como lecturas funcionales de estados neuronales y metabólicos. La cadena es escalable, reproducible y adaptable a manipulaciones farmacológicas, genéticas y ambientales, proporcionando un marco versátil para detectar fenotipos conductuales relacionados con el estrés, metabólicos y neurodegeneración en Drosophila.

Introducción

Las alteraciones conductuales como cambios en la locomoción, la toma de decisiones y la actividad exploratoria se utilizan ampliamente como indicadores a nivel de organismo del estado neural y fisiológico. En todos los taxones, la disfunción neural suele manifestarse como alteración de la estructura del movimiento, reducción de la motivación exploratoria, deterioro del comportamiento de decisión guiado por los sensores y cambios en la previsibilidad conductual. Debido a que estas salidas a nivel de organismo integran estados neural, metabólico y fisiológico, proporcionan lecturas escalables para detectar fenotipos relevantes para la enfermedad. Sin embargo, a pesar del uso extensivo de Drosophila melanogaster en genética molecular y neurociencia, los marcos conductuales multimodales estandarizados que capturan simultáneamente el rendimiento locomotor, la estructura de decisión y la variabilidad conductual siguen siendo limitados.

Los organismos modelo son esenciales para estudiar los mecanismos subyacentes a los fenotipos relacionados con el estrés y neuropsiquiátricos, ya que la manipulación experimental controlada suele ser imposible en humanos. Los síndromes conductuales relacionados con el estrés se producen en muchos taxones, incluidos los insectos, e implican sistemas neuromoduladores conservados, como la serotonina y la dopamina, así como vías metabólicas de señalización. Por ello, la mosca de la fruta ha surgido como un sistema poderoso para vincular la disfunción molecular con los resultados conductuales a nivel de organismo debido a su corto tiempo de generación, su traabilidad genética y la conservación de las vías relevantes para^{enfermedades 1,2}.

Al mismo tiempo, muchos ensayos conductuales en Drosophila se aplican típicamente de forma aislada, lo que dificulta distinguir entre los efectos generales de las náuseas, el deterioro motor, los cambios motivacionales y las alteraciones conductuales a nivel de decisión. Además, las medidas conductuales medias por sí solas pueden ocultar fenotipos biológicamente significativos, ya que las perturbaciones neuromoduladoras y del desarrollo suelen alterar la variabilidad conductual en lugar de la producción conductual media. Por tanto, es necesario un enfoque conductual multimodal que combine ensayos locomotores, exploratorios, sensoriales y de toma de decisiones para generar firmas fenotípicas robustas a nivel^{de organismo 3}.

Aquí se presenta una tubería conductual multimodal que integra exposición a nado^{forzado 4,5}, comportamiento y manevra de giro en Y^{en laberinto} 6,7,8,9, fototaxia y evaluación de actividad utilizando el sistema FlyVac ^10,11, exploración en campo^{abierto 12} y monitorización locomotora a largo plazo usando el Drosophila Activity^{Monitor 5,13} (Figura 1)). Cada ensayo en este marco captura una dimensión conductual distinta relevante para fenotipos relacionados con el estrés. La prueba de natación forzada mide el comportamiento pasivo de afrontamiento, donde una transición más temprana a la inmovilidad refleja una menor motivación para mantener respuestas de escape. Los ensayos de campo abierto y DAM cuantifican la actividad locomotora general y la estructura circadiana, proporcionando medidas de referencia de la salida motora y la activación. El ensayo Y-maze captura la estructura de toma de decisiones mediante secuencias de elecciones izquierda-derecha, permitiendo estimar tanto el sesgo de giro (lateralización) como la variabilidad conductual como medida de la previsibilidad. Finalmente, el ensayo FlyVac evalúa la toma de decisiones guiada sensorialmente y el comportamiento de enfoque-evitación mediante elecciones fototácticas repetidas. En conjunto, estos ensayos proporcionan lecturas complementarias que distinguen cambios en la actividad, la motivación y el comportamiento a nivel de decisión.

Este protocolo recoge aspectos complementarios de la salida motora, la motivación, la estructura de decisión y la variabilidad conductual, proporcionando un marco escalable para detectar fenotipos conductuales relacionados con el estrés, metabólicos y neurodegeneración en D. melanogaster¹⁴. El objetivo principal de este estudio es establecer un marco multimodal de fenotipado conductual que integre ensayos complementarios para capturar múltiples dimensiones del cambio conductual inducido por el estrés. El paradigma de tensiones se utiliza aquí como una perturbación estandarizada para demostrar la sensibilidad y aplicabilidad del marco.

Protocolo

El ensayo de nado forzado se realizó conforme a los principios de los 3R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento). La sustitución se logró utilizando Drosophila melanogaster como modelo de invertebrados, evitando así paradigmas de natación forzada en vertebrados que están cada vez más restringidos por razones éticas. La reducción estuvo respaldada por la naturaleza de alto rendimiento del ensayo, que permite una inferencia conductual robusta a partir de cohortes relativamente pequeñas mientras minimiza el uso animal. El refinamiento se abordó limitando la exposición a la natación a 2 minutos, una duración que previene el agotamiento o el ahogamiento y permite la recuperación completa del comportamiento locomotor normal inmediatamente después de la prueba. En conjunto, estas consideraciones aseguran que el ensayo proporcione datos conductuales significativos minimizando el posible malestar y maximizando la aceptación ética, incluso en entornos educativos.

1. Inducción de un estado similar a una depresión en Drosophila (protocolo de tensiones por vibración)

1. Recoger al macho D. melanogaster en un plazo de 24 horas tras la ecloción bajo anestesia ligera de CO₂. Todos los detalles se mencionan en la Tabla de Materiales.
2. Colocar las moscas en grupos de 10 en viales de polipropileno o acrílico (95 mm de longitud × 25 mm de diámetro interior) sellados con tapones de algodón.
3. Exponer las moscas a vibraciones mecánicas (300 Hz) usando una plataforma vibratoria.
4. Aplicar ciclos repetidos que consisten en una vibración de 45 minutos seguida de una recuperación de 15 minutos en viales que contienen alimentos estándar.
5. Continúa con los ciclos de vibración durante un total de 6 horas al día.
6. Repite el protocolo de estrés durante 3 días consecutivos.
7. Mantener las moscas de control bajo condiciones idénticas de alojamiento sin exposición a vibraciones.
   NOTA: En el protocolo actual, solo se utilizaron moscas machos para reducir la variabilidad asociada a diferencias fisiológicas y conductuales específicas del sexo, incluyendo el estado reproductivo y las influencias hormonales. Esta estandarización facilita la detección de efectos conductuales inducidos por el estrés en un entorno controlado. Sin embargo, el protocolo es totalmente aplicable a las moscas hembras, y las respuestas específicas por sexo representan un área importante para futuras investigaciones. Dado que la sensibilidad a fenotipos relacionados con el estrés y similares a la depresión puede variar según el sexo y la edad según los taxones, incluida Drosophila, ampliar este marco a diferentes grupos demográficos puede aportar una visión biológica adicional. Este paradigma está adaptado a partir de modelos establecidos de estrés vibracional incontrolable que inducen alteraciones motivacionales y de actividad en las moscas.

2. Prueba de natación forzada en Drosophila melanogaster

PRECAUCIÓN: El dodecilo sulfato de sodio (SDS) es un irritante. Utiliza el equipo de protección individual adecuado (por ejemplo, guantes y protección ocular) al preparar y manipular soluciones SDS. Evita el contacto visual con la piel. Eliminar los residuos que contienen SDS conforme a las directrices de seguridad química institucional.

1. Recoge las moscas adultas en un plazo de 24 horas tras la eclosión y mantenlas bajo luz constante y condiciones ambientales controladas.
2. Prepara portaobjetos de cámara multi-pozo y llena cada pozo con ~2 mL de solución SDS al 0,08% a temperatura ambiente.
3. Transfiere una sola mosca a cada pozo inmediatamente antes de grabar. No se requiere anestesia.
4. Graba el comportamiento usando una cámara aérea durante 2 minutos para cuantificar la latencia a la primera inmovilidad.
5. Cuantifica la latencia hasta la primera inmovilidad.
6. Retira las moscas tras registrarlas y colócalas sobre papel absorbente para confirmar la recuperación de la locomoción normal.
   NOTA: La inmovilidad se define como la cesación de movimientos activos de escape manteniendo la posición en superficie. Para registrar parámetros adicionales como la duración total de la inmovilidad y el número de episodios de inmovilidad, se necesitan duraciones de grabación más largas (por ejemplo, 3 minutos). Este ensayo refleja un comportamiento pasivo de afrontamiento; La menor latencia de inmovilidad se interpreta como una disminución de la motivación para sostener respuestas de escape. Variabilidad en la latencia a inmovilidad / inmovilidad total entre moscas. Este ensayo puede inducir estrés transitorio o fatiga. Cuando se utilice en diseños longitudinales, realízalo antes de otros ensayos y permite una recuperación suficiente (por ejemplo, ≥24 horas) antes de las pruebas posteriores.

3. Monitorización de la actividad locomotora a largo plazo utilizando el Monitor de Actividad de Drosophila (DAM)

1. Anestesiamos brevemente a las moscas de la fruta (5 s) usando CO₂ para la clasificación.
2. Coloca moscas individuales en tubos de vidrio DAM que contienen comida y tapones de^{algodón 17}.
3. Inserta tubos en el sistema de Monitor de Actividad de Drosophila.
4. Registrar actividad locomotora de forma continua (48 h) bajo condiciones controladas de temperatura y luz-oscuridad.
5. Almacena los conteos de rupturas de haz usando software de adquisición.
6. Agrupa los datos de actividad en intervalos de tiempo definidos (por ejemplo, 1–10 minutos).
7. Excluye las moscas que mueran o no muestren actividad tras aclimatarse.
   NOTA: La monitorización continua de la locomotora durante un periodo de 48 horas es suficiente para capturar los patrones de actividad circadiana. DAM: variabilidad en la distancia total, velocidad y estructura de la zona entre individuos.

4. Ensayo locomotor de campo abierto

1. Anestesiar brevemente (5 s) a las moscas de la fruta usando CO₂.
2. Transfiere las moscas individuales a arenas rectangulares de 25 x 75 mm (una mosca por pista).
3. Permite que las moscas se aclimaten (20 min) al entorno de la arena antes de registrarlas bajo luz blanca difusa constante y de baja intensidad.
4. Registrar el comportamiento bajo iluminación constante utilizando un sistema automatizado de seguimiento de vídeo.
5. Analizar trayectorias utilizando software de seguimiento para extraer:
   Distancia total recorrida
   Velocidad media de locomotora
   Aceleración y métricas de giro
   NOTA: Este ensayo proporciona una base para interpretar los cambios conductuales relacionados con el estrés. El periodo de aclimatación minimiza el estrés inducido por la manipulación y permite que las moscas se adapten a la arena, asegurando que la actividad locomotora registrada refleje el comportamiento base. Se utilizó iluminación constante para reducir la variabilidad asociada a las fluctuaciones circadianas y para asegurar condiciones conductuales consistentes entre los ensayos. Las trayectorias pueden extraerse utilizando software automatizado de seguimiento como EthoVision XT (Noldus Information Technology), o alternativas de código abierto como Ctrax, idTracker y TrackMate (ImageJ/Fiji), dependiendo de la disponibilidad y la preferencia del usuario. Ensayo en campo abierto: variabilidad en la distancia total, velocidad y estructura de los puntos entre individuos. Para reducir los efectos de orden, estandariza las condiciones de aclimatación e iluminación a lo largo de las sesiones. Cuando se realizan múltiples ensayos en los mismos individuos, mantener la duración de la exposición en la arena constante.

5. Comportamiento de giro en Y y ensayo de variabilidad conductual

1. Anestesiar brevemente (5 s) las moscas de la fruta usando CO₂.
2. Coloca moscas individuales en las cámaras del laberinto^{en Y 8,9}. Los laberintos se cortaron en acrílico negro de 1,6 mm de grosor usando un grabador láser. Colocamos moscas en una serie de 95 laberintos individuales, cada uno compuesto por tres brazos simétricos (12 mm de largo y 3,3 mm de ancho).
3. Permite que las moscas exploren libremente durante largos periodos de grabación (20 min).
4. Registrar decisiones de giro (izquierda o derecha) durante la locomoción exploratoria (1 h).
5. Calcula el sesgo individual de giro como la proporción de giros a la derecha. Calcular métricas relevantes como velocidad, aceleración, movimiento sin movimiento, variaciones de actividad basadas en el^{tiempo 12,15}.
6. Cuantifique la variabilidad conductual entre moscas utilizando la desviación absoluta mediana (MAD) del sesgo de giro.
   NOTA: Este ensayo mide la manos locomotoras y la previsibilidad conductual independientemente de los niveles generales de actividad. Las secuencias de giro capturan la estructura de decisión; El sesgo de giro refleja la lateralización, mientras que la variabilidad entre individuos refleja la previsibilidad conductual. sesgo = proporción de giros a la derecha (por mosca); variabilidad = dispersión (MADn) del sesgo entre moscas. Para pruebas repetidas, considera contrarrestar el orden de los ensayos entre individuos o cohortes para controlar los efectos de la secuencia.

6. Elecciones fototácticas: monitorización de actividad en el aparato FlyVac

1. Carga moscas individuales en las cámaras^{FlyVac 6 y 11} sin usar anestesia de CO₂.
2. Permite la aclimatación (10 minutos) antes de iniciar los ensayos.
3. Presenta elecciones binarias repetidas de luz–oscuridad para cada mosca.
4. Registrar elecciones en 40 ensayos mediante detección automatizada.
5. Calcular la probabilidad de elección de luz por mosca y el tiempo medio entre elecciones de luz como medida de actividad.
6. Cuantifique la variabilidad conductual entre individuos que utilizan DMA.
   NOTA: El sistema FlyVac permite la evaluación simultánea del sesgo de decisión medio y la variabilidad interindividual. Los ensayos conductuales descritos en este protocolo son modulares y pueden realizarse en diferentes secuencias dependiendo del diseño experimental. Sin embargo, para minimizar posibles efectos derivados, se recomienda realizar la prueba de natación forzada antes de otros ensayos. Para reducir los efectos de orden, estandariza las condiciones de aclimatación e iluminación a lo largo de las sesiones.

7. Análisis de datos

NOTA: Los análisis de comportamiento se realizaron utilizando moscas individuales como unidad de inferencia, salvo que se indique lo contrario.

1. Prueba de natación forzada: Analiza las grabaciones de vídeo manualmente o usando un software de puntuación conductual.
   NOTA: La inmovilidad se definió como la ausencia de movimientos activos de escape mientras la mosca permanecía a flote. Se extrajeron los siguientes parámetros por mosca: latencia a la primera inmovilidad. Las comparaciones de grupos se realizaron utilizando pruebas estadísticas no paramétricas debido a la distribución no normal de las medidas conductuales.
2. Actividad locomotora a largo plazo (DAM): Conteo récord de rupturas de haz por el Drosophila Activity Monitor. Exporta y haz el bin en intervalos de 10 minutos.
   NOTA: Para cada mosca, se calcularon los conteos de actividad total y los patrones de actividad circadiana. Estos patrones pueden calcularse en R, Python o Excel, lo que esté disponible. Las moscas que mostraran inactividad debido a la mortalidad o artefactos técnicos fueron excluidas antes del análisis. El ensayo duró 48 horas.
3. Ensayo de locomotora en campo abierto: Procesar los datos de seguimiento de vídeo utilizando software automatizado de seguimiento. Importa los archivos de vídeo en EthoVision XT. Realiza el seguimiento utilizando detección automatizada con umbrales basados en contraste.
   NOTA: Las trayectorias se suavizaron usando el algoritmo de filtrado por defecto. Los parámetros locomotores por mosca (distancia, velocidad, aceleración) se exportaban como archivos CSV para análisis posteriores. Los parámetros de locomotora por mosca incluían: distancia total recorrida (mm), aceleraciones (mm/^{s 2}). Las estadísticas resumen se calcularon a nivel individual antes de la comparación de grupos. La duración de esta prueba fue de 1 hora para cada grupo.
4. Comportamiento de giro en Y-laberinto: Extrae las decisiones de giro de las trayectorias grabadas, clasifícalas como izquierda o derecha y exporta como secuencias binarias (izquierda/derecha) para cada individuo.
   NOTA: Para cada mosca, el sesgo de giro se calculó como la proporción de giros a la derecha en todas las decisiones registradas. La variabilidad conductual entre moscas se cuantificó utilizando la desviación absoluta mediana escalada (MAD_n = 1,4826 × MAD) del sesgo de giro. La duración de esta prueba fue de 1 hora para cada grupo.
5. Elecciones fototácticas FlyVac: Registra automáticamente las elecciones binarias de luz–oscuridad. Para cada mosca, calcular la probabilidad de elección de luz (LCP) como la proporción de ensayos en los que se seleccionó el brazo ligero. Expresa el sesgo fototáctico como la media de los resultados binarios de los ensayos (luz = +1, oscuro = −1).
   NOTA: La variabilidad entre moscas se cuantificó usando MAD_n de índices individuales de fototaxia.
6. Análisis estadístico: Evalúa las diferencias de grupo en las medidas de comportamiento utilizando pruebas basadas en permutaciones con 10.000 aleatorizaciones de etiquetas.
   NOTA: Para comparar la variabilidad, se realizaron pruebas de permutación sobre las diferencias absolutas en la_{MAD n} entre grupos. Se obtuvieron intervalos de confianza para las estimaciones_{de la MAD n} mediante remuestreo bootstrap. Se utilizó una prueba t sin pareja de dos colas para comparar la distancia recorrida por las moscas (mm) y la aceleración máxima (mm/^{s 2}). Para la visualización de datos, se usaron diagramas de violín (principalmente para mostrar densidad, concentración y asimetría), diagramas de caja y diagramas de columnas. La significación estadística se evaluó en α = 0,05.

Resultados

La aplicación del protocolo de estrés vibracional produjo alteraciones conductuales medibles a través de múltiples ensayos (Figura 1) diseñadas para capturar actividad, comportamientos de afrontamiento y toma de decisiones en D. melanogaster.

Inducción similar a la depresión

Las moscas expuestas a vibraciones mecánicas repetidas (Figura 1A) mostraron una actividad exploratoria redu...

Discusión

El protocolo actual demuestra un enfoque multimodal para inducir y cuantificar estados conductuales similares a la depresión en D. melanogaster. Utilizando un paradigma de estrés basado en vibraciones combinado con ensayos conductuales complementarios, este estudio muestra que la inducción similar a la depresión puede detectarse en medidas de comportamiento de afrontamiento, actividad locomotora, dinámica exploratoria, toma de decisiones y variabilidad^conductua...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anesthesia equipment: e.g., Benchtop Flowbuddy, Complete System w/ Ultimate Flypad	Genesis Scientific, El Cajon, CA, USA	59-122BCU
BioSan MSV-3500 multispeed vortex	Biosan SIA, Riga, Latvia	BS-010210-TAH	Con todas las plataformas
Tapones de algodón para viales estrechos	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	Número de catálogo: 51-101
Monitor de actividad de Drosophila (DAM2)	TriKinetics Inc, Waltham, MA, USA	DAM2; RRID: no disponible	32 tubos
Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	BDSC:25211; RRID:BDSC_25211
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, MA, USA;	Nombre de catálogo: GraphPad Prism, RRID:SCR_002798	Versión 11.0.1
Logitech C920 HD Pro Webcam, lente HD 1080pNombre de catálogo: HD Pro Webcam C920	Logitech Europe S.A., Lausanne, Suiza	RRID: no disponible	La cámara de grabación superior utilizada para FST
Vial de moscas estrecho, polipropileno	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	Número de catálogo: 32-120BF
Noldus EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, Países Bajos	RRID: SCR_000441	v. 15.0
Sulfato de dodecil sodio (SDS, ≥99%)	Merck KGaA (Sigma-Aldrich), Darmstadt, Alemania	Nombre de catálogo: Sulfato de dodecil sodio (reactivo ACS, ≥99% de pureza); RRID: no disponible
ZEISS Stemi 508 Estereomicroscopio	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Baden-Württemberg, Alemania	15634448