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Artículo de método

Análisis metabolómico por resonancia magnética nuclear de medios de cultivo embrionario humano gastados: validación de métodos y consideraciones técnicas

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DOI:

10.3791/71285

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31 de julio de 2026

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1Department of Reproductive Medicine and Gynaecological Endocrinology, University Medical Centre Maribor, 2Faculty of Medicine, University of Ljubljana, 3National Institute of Chemistry, 4EN-FIST Centre of Excellence, 5Faculty of Chemistry and Chemical Technology, University of Ljubljana, 6Department of Reproductive Science, Manipal Academy of Higher Education

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para recoger, preparar y analizar medios de cultivo embrionario humano usados utilizando espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), permitiendo la detección reproducible de metabolitos de bajo peso molecular a partir de muestras a escala de microlitros bajo condiciones de cultivo clínico rutinario.

Resumen

Los medios de cultivo embrionario humano usados contienen metabolitos de bajo peso molecular que pueden proporcionar una lectura no invasiva de la fisiología embrionaria preimplantacional. Sin embargo, el análisis metabolómico basado en resonancia magnética nuclear (RMN) de estas muestras resulta técnicamente complicado porque las condiciones rutinarias de cultivo embrionario implican volúmenes de microlitros, suplementación proteica y superposiciones de aceite de parafina que generan señales de fondo y comprometen la calidad espectral. Aquí presentamos un flujo de trabajo optimizado de metabolómica RMN para medios de cultivo embrionario usados que incorpora la recogida controlada de gotas para minimizar la contaminación por el petróleo, revestimientos de tubos de etileno propileno fluorado (FEP) para aislar químicamente la muestra de la referencia externa (TMSP) mientras acomodan volúmenes de microlitros, y adquisición mediante secuencia de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill para suprimir señales macromoleculares de fondo. El protocolo permite la detección y cuantificación consistente de metabolitos de bajo peso molecular a partir de embriones humanos cultivados individualmente y apoya el análisis reproducible bajo condiciones de laboratorio rutinarias. Debido a numerosos desafíos técnicos, el método debe estar debidamente validado antes de poder utilizarse para investigación o fines clínicos.

Introducción

Durante el desarrollo preimplantacional in vitro., los embriones consumen y liberan continuamente metabolitos de bajo peso molecular en el medio circundante. Por tanto, la composición del medio de cultivo embrionario gastado (SECM) refleja la actividad metabólica embrionaria y proporciona una lectura funcional no invasiva de la fisiología embrionaria y la competencia en desarrollo 1,2. El análisis de esta huella metabólica puede complementar los métodos convencionales de evaluación y mejorar las estrategias de selección de embriones en tecnología de reproducciónasistida 3,4. En particular, las alteraciones en la renovación de aminoácidos y carbohidratos se han relacionado con el potencial y la viabilidad del desarrollo embrionario 5,6,7.

La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) se utiliza ampliamente para el perfilado de metabolitos no dirigidos de diversas muestras biológicas, incluyendo medios de cultivo embrionariogastados 8,9,10. Sin embargo, el análisis de estas muestras sigue siendo analíticamentedesafiante 11. En la práctica clínica rutinaria, los embriones se cultivan en microambientes definidos diseñados para imitar condiciones fisiológicas. Los medios de cultivo se complementan con proteínas, normalmente albúmina, para estabilizar la presión osmótica, unirse a compuestos tóxicos y proporcionar moléculas portadoras para lípidos y factores de crecimiento que apoyan el desarrollonormal 12. Para evitar la evaporación y mantener concentraciones constantes de soluto, las gotas de cultivo se superponen con aceite estéril deparafina 13.

Los lípidos que se originan en componentes superpuestos de aceite y proteínas generan señales de fondo amplias que ocultan resonancias estrechas de metabolitos de bajo peso molecular como la glucosa, el piruvato y los aminoácidos. Además, analizar volúmenes de muestras de microlitros en tubos estándar de RMN de 5 mm requiere una dilución significativa para alcanzar el volumen activo de la bobina de RF. Esta reducción en la concentración de analitos disminuye severamente la relación señal-ruido (S/N), enmascarando metabolitos de baja abundancia y dificultando la cuantificación reproducible. Aunque numerosos estudios han aplicado metabolómica basada en RMN a medios de cultivo de embriones humanos gastados, la falta de protocolos estandarizados y reproducibles de recogida y preparación ha limitado la reproducibilidad y la comparabilidad entreestudios 8,9,11.

Aquí presentamos un flujo de trabajo metabolómico basado en RMN (Figura 1) diseñado para superar desafíos técnicos asociados al muestreo y análisis de medios de cultivo embrionario humano. El enfoque combina la recogida controlada de gotas para reducir la acumulación de aceite, adquisición de microlitros en volumen utilizando revestimientos de etileno propileno fluorado (FEP) para evitar artefactos de dilución, y atenuación de señales macromoleculares mediante una secuencia de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG).

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Protocolo

Este estudio se llevó a cabo entre enero y abril de 2023 en el Departamento de Medicina Reproductiva y Endocrinología Ginaecológica del Centro Médico Universitario de Maribor, Eslovenia. El análisis de RMN se realizó en el Instituto Nacional de Química de Liubliana, Eslovenia. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Recibió la aprobación tanto del Comité de Ética Institucional (n.º: UKC-MB-KME-21/1) como del Comité Nacional de Ética Médica (n.º: 0120-37/2021/15).

1. Diseño del estudio

NOTA: El estudio analizó medios de cultivo embrionario humano gastado utilizando metabolómica basada en RMN.

  1. Recoger muestras tras un cultivo embrionario prolongado tras la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Recoger un número igual de muestras de control incubadas sin consumir.

2. Recogida de muestras

  1. Recoger muestras de medios de cultivo embrionario (SECM) usados tras la incubación, como se ilustra en la Figura 2.
  2. Tras la extracción del embrión de la gota de cultivo, aspira cuidadosamente el exceso de aceite superpuesto de la superficie del plato de cultivo sin alterar el medio (Figura 2, paso 1).
  3. Utilizando una pipeta estéril, aspira aproximadamente 35 μL de medio de cultivo de la gota original, dejando aproximadamente 5 μL para evitar que se absorba aceite superficial residual. Transfiere este volumen a una placa de Petri estéril para formar una nueva gota (Figura 2, paso 2).
  4. Bajo un estereomicroscopio, inspecciona visualmente la gota recién formada. Aspirar cuidadosamente aproximadamente 30 μL de esta gota, dejando nuevamente aproximadamente 5 μL para minimizar la retención de aceite. Transfiere este volumen a una segunda ubicación estéril para formar una gota más limpia (Figura 2, paso 3).
  5. Inspecciona visualmente la segunda gota bajo aumento. Identifica las regiones donde las gotas de aceite son menos pronunciadas. Inserta la punta de la pipeta en esta región y aspira aproximadamente 25 μL de medio, dejando de nuevo aproximadamente 5 μL para minimizar la acumulación de aceite (Figura 2, paso 4).
  6. Transfiere inmediatamente los 25 μL recogidos a un tubo microcentrífuga estéril y libre de RNasa. Evita tocar las paredes internas del tubo al dispensar la muestra para evitar la contaminación y la pérdida de la muestra. Congelar inmediatamente todas las muestras recogidas en nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 °C hasta el análisis de RMN (Figura 2, paso 5).
  7. Recoger las gotas de control incubadas no gastadas (medio incubado sin embriones) preparadas, incubadas y procesadas bajo condiciones de cultivo idénticas utilizando los mismos platos de cultivo, aceite superpuesto, duración de incubación, ambiente de incubación y procedimiento de manipulación descritos anteriormente para minimizar la variabilidad ambiental y el posible sesgo sistemático.
    NOTA: El estricto cumplimiento de la transferencia secuencial de gotas y la inspección visual reduce significativamente la contaminación por aceite. En esta fase, el experimento puede pausarse y reanudarse antes de un procesamiento adicional de la muestra para la adquisición de RMN.

3. Preparación de muestras para el análisis de RMN

  1. Muestras de descongelación a temperatura ambiente durante ~10 minutos.
  2. Prepara la mezcla de RMN:
    1. Transfiere 25 μL de SECM a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Añade 200 μL de D₂O. Haz un vórtice durante 10 s y luego centrifuga a 1000 × g durante 10 s a temperatura ambiente.
  3. Insertar carga: Transfiere 225 μL de la mezcla a un revestimiento FEP.
  4. Prepara el tubo de referencia externo.
    1. Llena un tubo de RMN de 5 mm con 150 μL de D₂O que contiene 1 mM de sal sódica ácido 3-(trimetilsilil)propiónico-2,2,3,3-d4 (TMSP-d4).
  5. Monta la muestra: Inserta el inserto FEP en el tubo de RMN y sella con parafilm.

4. Adquisición de RMN y procesamiento espectral

  1. Adquirir 1adquisición de H-CPMG usando la secuencia de pulsos Bruker cpmgpr1d con: 64 escaneos; 65.536 puntos de datos; Retraso de relajación: 8 s; Ancho espectral: 11,9 kHz; Tiempo de eco: 400 μs × 80 bucles (filtro efectivo T₂ 32 ms); Tiempo total de adquisición: ~15 min.
    NOTA: La duración efectiva del filtro CPMG T₂ de 64 ms se seleccionó en base a protocolos de metabolómica establecidos para muestras biológicas que contienen proteínas, donde este valor proporciona una supresión eficiente de señales macromoleculares mientras preserva resonancias de metabolitos de bajo pesomolecular 14.
  2. Realizar procesamiento espectral:
    1. Obtén espectros de transformada de Fourier.
    2. Aplica ensanchamiento exponencial de línea a 0,3 Hz.
    3. Realiza corrección de fase y línea basal.
    4. Referencia espectros para TMSP-d4 a 0 ppm.
    5. Referencia los desplazamientos químicos (δ) a la señal externa TMSP-d4 a 0 ppm.
      NOTA: Dado que la mezcla de muestra dentro del revestimiento FEP (225 μL) y la solución de referencia externaTMSP-d 4 en la brecha coaxial exterior (150 μL) ocupan geometrías físicas y volúmenes distintos dentro de la ventana activa de detección de la bobina RMN, sus intensidades absolutas de señal no escalan 1:1. La cuantificación absoluta directa usando la referencia externa requiere una curva de calibración geométrica específica del sistema. Por lo tanto, dado el volumen de muestra estrictamente constante y la alta precisión de pipeteo reproducible de este protocolo, se utilizaron integrales de cubo en bruto directamente para rastrear las variaciones metabólicas relativas entre muestras, omitiendo la necesidad de referencia externa o de normalización de intensidad total.
  3. Realizar binning espectral:
    1. Excluyamos la región de resonancia del agua (por ejemplo, 4,65–5,00 ppm) y la región de referencia TMSP-d4 (por ejemplo, -0,05–+0,05 ppm) antes del binning.
    2. Divide los espectros en cubos de ancho variable para evitar la división de picos.
    3. Utiliza integrales de cubo en bruto para análisis estadístico en lugar de normalizarlas a la señal externa TMSP-d4, ya que la referencia está físicamente aislada en el volumen exterior del tubo. Este enfoque evita errores de cuantificación derivados de los diferentes volúmenes activos del inserto frente al tubo exterior.
    4. Exportar integrales de cubo como matriz numérica de datos para análisis estadístico.
      NOTA: Cada "cubo" (o contenedor) representa la integral numérica sumada de todas las señales de RMN dentro de un rango definido de ppm. Aunque estas integrales reflejan la concentración relativa de los grupos químicos presentes en ese rango, un solo cubo puede contener señales de múltiples metabolitos superpuestos o solo una parte de la señal total de un metabolito específico.

5. Análisis estadístico

  1. Importación procesada de 1espectro H-CPMG a Python (v3.12) usando nmrglue15.
  2. Eliminar el agua y las regiones espectrales TMSP-d4.
  3. Exportar integrales de cubo para análisis.
  4. Realizar pruebas estadísticas usando SciPy (v1.14.1):
    1. Evalúa la normalidad de cada cubo espectral utilizando la prueba de Shapiro–Wilk.
    2. Aplicar ANOVA unidireccional (para datos normalmente distribuidos) o Kruskal-Wallis (para datos no paramétricos) para identificar cubos con diferencias estadísticamente significativas entre control incubado no gastado y medios gastados.
    3. Para cubos que muestren diferencias significativas, realizar asignación estructural usando una combinación de experimentos de RMN 1D y 2D: 1 H-13CHSQC, 1 H-13C HMBC y 1 H-1H COSY.
    4. Comparar las correlaciones 2D observadas con bases de datos estándar (por ejemplo, HMDB) para verificar la identidad de los metabolitos que contribuyen a los grupos discriminatorios.

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Resultados

El flujo de trabajo analítico para el perfilado metabolómico RMN no dirigido de medios de cultivo embrionario gastados se resume en la Figura 1.

Eliminación de la contaminación por aceite durante el muestreo
La Figura 2 ilustra el procedimiento secuencial de transferencia de gotas utilizado para reducir la retención de aceite en superposición. Las muestras recogidas sin un pipeteo cuidadoso mostraron amplias re...

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Discusión

En este estudio, abordamos los principales retos analíticos asociados con la identificación y cuantificación de metabolitos de bajo peso molecular en medios de cultivo embrionario gastados utilizando metabolómicas de RMN no dirigidas. Nuestros resultados muestran que el flujo de trabajo optimizado permite la adquisición de espectros de alta calidad y ricos en información, adecuados para la detección fiable de metabolitos de bajo peso molecular.

Una transferenc...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Agencia Eslovena de Investigación e Innovación (ARIS) [número de proyecto P3-0327].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5 mm FEP tube linerSP Wilmad-LabGlass4682701Inserto interior para NMR coaxial
5 mm NMR tubeSP Wilmad-LabGlass535-PP-7-SBTubo exterior
6-well culture plateOosafeOOPW-SW02Placa de cultivo de embriones
Cryogenic liquid nitrogenMesserContact manufacturerCongelación instantánea de muestras
Deuterium oxide (D2O)EurisotopD214LSolvente para NMR
Micropipette (10–100 µL)Eppendorf4924000053Pipeta de volumen ajustable
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL, RNase-freeEppendorfN216966NRecolección y almacenamiento de muestras
Mineral oilVitrolifeVTL-10029Cubierta de gota de cultivo
NMR spectrometer, 600 MHzBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.htmlAdquisición de espectros
Pasteur pipetteFalconFAL-357575Transferencia de gotas
Pipette, single-channel mechanicalSartorius728060Manipulación de muestras
Pipette tips, sterileEppendorf22491148Compatible con micropipeta
Pipette tips, sterile filterSartorius790201FBarrera contra aerosoles
Sequential G-series culture mediaVitrolifeVTL-10143Medio de cultivo de embriones
TMSP-d4 (sodium 3-trimethylsilylpropionate-d4)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-48-1Referencia de desplazamiento químico
Tubes, Safe-LockEppendorf0030121589Tubos de almacenamiento

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