Evaluación en tiempo real y no invasiva de la función mitocondrial mediante espectroscopía Raman por resonancia

Resumen

Presentamos un método no invasivo y en tiempo real para monitorizar la salud mitocondrial utilizando la espectroscopía Raman por resonancia (RRS). Utilizamos RRS para cuantificar los estados redox mitocondriales y desarrollamos una métrica para la salud mitocondrial, la Resonancia Raman reduce la relación mitocondrial (3RMR), que muestra una respuesta más rápida a los cambios en la oxigenación que los analitos hemato-gases tradicionales.

Resumen

Aunque las mitocondrias son centrales para la patogénesis y la progresión de la enfermedad, la visión mecanicista de la dinámica de la salud mitocondrial sigue siendo costosa e inaccesible. Para cubrir esta carencia, este estudio emplea la espectroscopía Raman por resonancia (RRS) para evaluar la función mitocondrial, utilizando un sistema portátil que proporciona mediciones en tiempo real, no invasivas y cuantitativas de los estados redox del citocromo mitocondrial en hígados de rata. En este protocolo, demostramos el uso de esta tecnología, incluyendo la configuración, adquisición y procesamiento de datos. Este estudio presenta un experimento de prueba de concepto que destaca la capacidad de RRS para medir cambios en tiempo real en el estado redox mitocondrial y, por extensión, en la función mitocondrial. Brevemente, el dispositivo RRS se conectaba a una bomba láser así como a un ordenador de adquisición de datos y se colocaba a 1 cm del hígado de la rata.  Los parámetros de adquisición se seleccionaron de acuerdo con el protocolo del hígado de rata; Los estados redox se midieron en condiciones oxigenadas e isquémicas mediante una prueba de esfuerzo de ogénio. Los cambios en los estados redox mitocondriales se registraron durante toda la prueba de esfuerzo de ogénigeno.

Introducción

Las mitocondrias desempeñan un papel crucial en la función celular y la homeostasis. Las mitocondrias son los principales motores del metabolismo celular, regulando la generación de ATP mediante fosforilación oxidativa. También actúan como orgánulos señalizadores que dictan el destino celular regulando las vías apoptóticas, así como ROS y señalización Ca^{+2 1}. Así, la disfunción mitocondrial puede conducir a diversas enfermedades neurodegenerativas, musculares y^{cardiovasculares 2,3}. A pesar del papel crucial que desempeñan las mitocondrias en la progresión de la enfermedad, evaluar la función mitocondrial puede ser invasivo, costoso y limitado.

Indicadores clave de la función mitocondrial, como la tasa de consumo de oxígeno, la fosforilación oxidativa y la actividad de varios complejos dentro de la cadena de transporte de electrones (ETC), se miden mediante respirometría. El ETC está compuesto por cuatro complejos (I–IV) incrustados en la membrana mitocondrial interna (IMM). Estos complejos, con la ayuda de otras coenzimas, transfieren electrones de sustratos reducidos, como NADH y FADH2, al aceptor final de electrones,_O2, que luego se reduce a agua. La mayoría de los ensayos respirométricos contemporáneos, como el Seahorse y el O2k de Orobros, requieren procesamiento de tejidos, restringiendo así su aplicación en investigación traslacional ^4,5. La medición del potencial de membrana mitocondrial (MMP) es otro método para evaluar la disfunción mitocondrial, que utiliza fluoróforos lipofílicos catiónicos, como JC-1, junto con imágenes microscópicas, donde las mitocondrias acopladas (sanas) y no acopladas (dañadas) fluorescen con diferentes longitudes^{de onda 6}. Sin embargo, estos ensayos pueden tener baja^{sensibilidad 5}. El propio colorante también puede tener alta citotoxicidad en concentraciones^{elevadas 5}. Por último, de forma similar a las mediciones de respirometría, esta técnica también requiere procesamiento de tejidos. Recientemente, las técnicas basadas en espectroscopía se han utilizado como métodos no invasivos para evaluar la salud mitocondrial. Por ejemplo, la Espectroscopía de Resonancia Magnética de Fósforo (P-MRS), un método que evalúa el metabolismo celular midiendo las concentraciones de metabolitos que contienen fósforo, se ha utilizado para caracterizar tejido adipogénico modificado que está en proceso^{de diferenciación 7}. Sin embargo, esta técnica también requiere equipamiento especializado y entrenamiento.

Nuestro grupo demostró recientemente una técnica en tiempo real, no invasiva y altamente específica para medir el estado redox mitocondrial como marcador de la viabilidad del órgano mediante la Espectroscopía Raman por Resonancia (RRS). El RRS utiliza dispersión inelástica de fotones para cuantificar los estados redox de los citocromos mitocondriales. Los anillos porfirinos en grupos hemos de moléculas como citocromos mitocondriales, hemoglobina y mioglobina producen un espectro Raman característico dependiendo de su estado de oxidación cuando se excitan con un láser^{de longitud de onda de 441 nm 8}. Aunque el sistema RRS utiliza una longitud de onda de 441 nm, también se pueden emplear láseres con longitudes de onda de 420 nm y 405 nm, cada uno de los cuales mejora preferentemente un complejo de citocromo diferente. El espectro obtenido de una muestra desconocida de interés se cruza con bibliotecas pregrabadas de mitocondrias intactas totalmente oxidadas o reducidas, lo que da la proporción de mitocondrias reducidas a totales o el estado redox medio de los citocromos ETC in situ . Esta relación se define como la Relación Mitocondrial Reducida por Resonancia Raman (3RMR).

Existen 3 cálculos/tipos distintos de 3RMR: 3RMR mitocondrial (mito-3RMR), 3RMR III complejo (cIII-3RMR) y 3RMR IV complejo (cIV-3RMR). Cada uno de estos índices se calcula a partir de la fracción de reducida al número total de un componente dado. Por ejemplo, la 3RMR de cIII sería la relación entre cIII reducido y el número total de cIII en el tejido (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). El mismo patrón se aplica al cIV. Así, 3RMR-cIII se referiría a la proporción de cIII reducido respecto a la cantidad total de cIII, y 3RMR-cIV se referiría a la proporción de cIV reducido respecto a la cantidad total de cIV. Mediante análisis de regresión, se calculan los estados redox mitocondriales (mito-3RMR) utilizando bibliotecas espectrales de mitocondrias intactas, o bien se calculan estados redox complejos individuales (cIII-3RMR y cIV-3RMR) utilizando bibliotecas espectrales cIII y cIV. Una publicación^{reciente 9} demostró que la mito-3RMR representa la media ponderada de los estados redox de cIII y cIV (o cIII-3RMR y cIV-3RMR). Es importante señalar que cI y cII no son activos en Raman ni resonan a través de la longitud de onda de 441 nm. En consecuencia, no se calculan al calcular el mito-3RMR.

Aprovechando este tipo de 3RMR, hemos estado definiendo el rango óptimo de 3RMR. En órganos "sanos", las mitocondrias están intactas y cuentan con suficiente suministro de oxígeno. En cambio, los órganos dañados pueden tener una entrega o utilización insuficientes de oxígeno, lo que provoca que los complejos ETC acumulen electrones. La acumulación de electrones provoca un "estrés reductor", desplazando las mitocondrias de oxidadas a reducidas y aumentando los valores de 3RMR. Varios estudios ^8,9,10,11,12, que abarcan corazones e hígados en modelos de roedores y porcinos, han comenzado a arrojar luz sobre el rango óptimo de "sano" para la 3RMR, que se propone que esté entre 10 y 30. Por ejemplo, Perry et al. sometieron corazones de mamíferos a hipoxia, donde se demostró que una 3RMR del 30% proporcionaba el equilibrio óptimo entre sensibilidad y especificidad para detectar tejido^{hipóxico 8}. Esta tendencia se confirmó en estudios adicionales con tejido^{cardíaco 11,12} e injertos hepáticos¹⁰. Además, Nyugen et ^al.9 demostraron que los valores de 3RMR caen a valores muy bajos (oxidados) en tejidos en los que el metabolismo se ha detenido, con 3RMR (7,667 ±± 4,926) de hígados cálidos-isquémicos no trasplantables tras 3 horas de perfusión normotérmica por máquina, en comparación con valores de 3RMR superiores a 10 (~12–15) para hígados cálidos-isquémicos frescos y^{trasplantables 9}.

Más allá de estas demostraciones de cómo la 3RMR puede medir la viabilidad tisular, la sensibilidad, especificidad y facilidad de uso del RRS lo hacen muy aplicable a muchos otros tipos de investigación donde se ven afectados el metabolismo celular y la función mitocondrial. En estudios previos, el RRS se ha utilizado para detectar la degeneración macular y el glaucoma en ratones mediante la evaluación de la actividad metabólica de axones no mielinizados de las células ganglionares retinianas en la cabeza del nervio^{óptico 13}. Además, se utilizó para detectar la coarctación de la aorta (CoA) en un modelo de ratas de cardiopatía congénita, un diagnóstico que a menudo pasa por alto en los cribados cardíacos^{neonatales 12}. Esta tecnología se utilizó para comprender la función y viabilidad de órganos bajo diversas condiciones experimentales relevantes en el campo del trasplante de órganos, incluyendo estudios que evalúan la viabilidad orgánica en perfusión de máquinas^{ex vivo 10,11}, evalúan la reoxigenación tras almacenamiento en frío^{estático 14}, o mitigan la lesión por reperfusión de hígados cálidos-isquémicos⁹.

Este artículo busca establecer el RRS como una herramienta sensible y en tiempo real para evaluar la salud mitocondrial. Hígados enteros de un modelo de rata fueron sometidos a diferentes niveles de isquemia y reperfusión de osígeno como prueba de esfuerzo para evaluar la respuesta mitocondrial. En esta prueba de esfuerzo de oxígeno, los hígados frescos son sometidos a 5 minutos de flujo inicial de perfusión, 5 minutos de isquemia y 5 minutos de reperfusión. Durante la prueba de esfuerzo se tomaron 3RMR, así como mediciones de lactato, K+ y presión parcial de oxígeno (pO2). Se observó una respuesta más rápida a los cambios en la oxigenación con la 3RMR en comparación con los analitos tradicionales de gases sanguíneos. Con estos experimentos, se destaca el uso del SRR no solo para estudios mecanicistas, sino también como método diagnóstico y banco de pruebas terapéutico. Por tanto, el protocolo compartido puede ser útil para una variedad de investigadores que trabajan con mitocondrias. En general, el RRS, con su naturaleza no invasiva, en tiempo real y altamente específica, podría tener un impacto sustancial en el metabolismo celular.

Protocolo

Todos los animales para los experimentos se mantuvieron conforme a las directrices del Consejo Nacional de Investigación y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Hospital General de Massachusetts (Boston, MA, EE. UU.).

1. Configuración y utilización de RRS

1. Descripción del dispositivo:
   NOTA: El sistema RRS portátil (Pendar Technologies; el producto es solo para fines de investigación) utiliza un láser de 441 nm debido a una mejora resonante del espectro Raman de los citocromos mitocondriales con esta longitud de onda. El láser funciona entre 4 mW y 8 mW.
   1. Conecta una fuente de excitación láser a una sonda personalizada mediante un cable de fibra óptica. La sonda ilumina el tejido con un punto láser de 2 mm de diámetro, además de recoger el espectro emitido. El espectro pasa entonces por un filtro pasa banda y es recogido por una matriz de dispositivo de carga acoplada (CCD). El espectro se recoge cada segundo en un periodo de 180 grados y se promedia para crear un espectro bruto y reducido en ruido para su análisis.
   2. El software compara este espectro obtenido con bibliotecas espectrales premedidas mediante un análisis de regresión.
2. Procedimiento para la pregrabación de bibliotecas
   NOTA: Para los experimentos presentados en este artículo, se crearon y utilizaron formas reducidas y oxidadas de bibliotecas de mitocondrias, complejos III y complejos IV, hemoglobina y mioglobina. Las señales RRS de todas las bibliotecas se tomaban en una caja negra a temperatura ambiente (21 °C). Estos archivos de biblioteca se proporcionan con el software de análisis por separado. Sin embargo, dependiendo del tejido de interés y la presencia de otras moléculas activas en Raman, también se podrían crear otras bibliotecas adaptando adecuadamente el siguiente protocolo. Se proporcionan espectros RRS en bruto de las bibliotecas de hemoglobina, mioglobina y complejos III/IV oxidados/reducidos en Figura suplementaria 1.
   1. Bibliotecas de hemoglobina (Figura suplementaria 1C):
      1. Recoge sangre fresca de roedor mediante exanguinación animal. Oxigena la sangre recogida usando 100% de oxígeno, o desoxigénala usando nitrógeno al 100%, en una cubetas de cristal, añadiendo ditionato de sodio.
      2. Mide el RRS de cada estado a través de la pared de la cubetas de cristal durante 10 minutos, con la sonda RRS situada a 9 mm de la cubeta.
      3. Utiliza picos espectrales en 1356 ^cm-1 para verificar el estado desoxigenado, y utiliza picos en 1376 ^cm-1 para confirmar el estado oxigenado.
   2. Bibliotecas mitocondriales reducidas/oxidadas (Figura 1)
      1. Aisla las mitocondrias de corazones de roedores homogeneizados y purificados en una cubeta de cristal. Coloca la sonda Raman a 9 mm de la cubeta de cristal y mide los espectros de estas mitocondrias a través de la pared de cristal.
      2. Crear condiciones completamente oxidadas proporcionando un flujo de oxígeno del 100% a las mitocondrias. Verifica el estado oxidado mediante la ausencia del pico RR reducido en 1357 ^cm-1.
      3. Crear condiciones completamente reducidas exponiendo las mitocondrias al 100% de nitrógeno con pequeñas cantidades de sulfuro de hidrógeno. Verificar las condiciones reducidas mediante la ausencia de un pico oxidado del marcador RR en 1371 ^cm-1.
   3. Complejo oxidado/reducido III/IV (Figura suplementaria 1A,B):
      1. Aislar los complejos III y IV como se describe en otros^lugares 9,15,16,17. En resumen, utiliza una muestra de stock de mitocondrias aisladas (correspondientes a 200 nanomoles de citocromo a) como material de partida.
      2. Diluir las mitocondrias a 10 nmol de citocromo A/mL en un tampón C helado (50 mM Tris, 1 mM MgSO_4, pH 8,45). Luego, añade un 10% de p/v de n-β-D-dodecil maltosido (DM) gota a gota hasta una concentración final del 1%, mientras se mezcla suavemente sobre hielo.
      3. Centrifuga el extracto a 40.000 × g durante 40 minutos a 4 °C. Aplicar el sobrenadante a una columna de vidrio de 2,5 cm × 20 cm que previamente ha sido rellenada con una resina de intercambio equilibrada con 5 volúmenes de columna de tampón C (que contienen 0,02% w/v DM).
      4. Tras lavar con 2 volúmenes de columna de tampón C, elude los complejos mitocondriales aplicando un gradiente lineal de 0–400 mM de NaCl en el mismo tampón y recoge el eluto en fracciones de 4 mL.
      5. Las fracciones verdes que contienen el Complejo IV eluían cerca de la mitad del gradiente (~180 mL NaCl), antes que las fracciones rojizas que contienen el Complejo III. Concentra las fracciones agrupadas que contienen cada complejo en 20–30 nmoles de citocromo a/mL.
      6. Una vez aislados los complejos individuales, exponerlos a condiciones oxidantes y reductoras. Reducir una muestra de 11 mM de Complejo III en tampón Tris usando 2 mL de ascorbato (1 M) para reducir el citocromo c1 y 2 mL de HS (hidrosulfito) para reducir completamente los citocromos b_L y_{b H}.
      7. Reducir una muestra de 18,67 mM del Complejo IV en Tampón Tris en varios pasos, ya que el Complejo IV pasa por un proceso de oxidación catalítica en varios pasos. Para reducir completamente el complejo IV, añade dos dosis de 2 mL de_H2O₂ (10 mM), seguidos de 2 mL de HS.
      8. Recopila espectros de biblioteca después de cada adición para capturar cada paso del ciclo. Añadir espectros totalmente oxidados y reducidos a la biblioteca de referencia final para representar los estados estacionarios del IV complejo.
      9. Preparar todas las muestras en un frasco de cristal de 1 mL y manténlas en una posición fija a 9 mm de la lente de la sonda y enciérralas en una caja negra para evitar la contaminación por luz. Recoge espectros RRS durante 600 s para cada complejo y estado de oxidación.
      10. Validar la pureza de cIII y cIV aislados como se describió^{anteriormente 17}, y validar la adecuación de las bibliotecas espectrales aisladas de cIII y cIV para explicar los espectros mitocondriales completos tal como se describe en un artículo^{reciente 9}.
   4. Bibliotecas de mioglobina (Figura suplementaria 1D):
      1. Utilizando flujos similares de oxígeno y nitrógeno (con ditionita sódica disuelta), varía la saturación de oximioglobina del extracto de mioglobina miocárdico entre 0% y 100%. Verifica los espectros Raman mediante picos de marcador en 1355 ^cm-1 y 1376 ^cm-1.

NOTA: La mayoría de los componentes espectrales mencionados anteriormente, como la hemoglobina o las mitocondrias oxidadas/reducidas, son moléculas que contienen hemos y son excitados por la misma longitud de onda. Este sistema RRS evita la superposición de señales creando una biblioteca de regresión para cada molécula basada en su señal espectral única. Los espectros dispersados obtenidos se ejecutan mediante un algoritmo de regresión contra las bibliotecas seleccionadas. El algoritmo de regresión proporciona un factor para cada espectro de biblioteca que representa la estimación más adecuada de su contribución relativa en el espectro registrado, y por tanto su concentración relativa en el tejido. Debido a que el algoritmo utiliza el mejor ajuste a lo largo de un rango de números de onda, pequeñas diferencias en la posición o intensidad de los picos espectrales de los distintos componentes de la biblioteca permiten que la regresión distinga incluso cromóforos estrechamente relacionados. A través del algoritmo de regresión y las bibliotecas espectrales, el sistema RRS puede descomponer la señal total dispersada en varios componentes según sus picos espectrales únicos, evitando la superposición de señales de moléculas que contienen hemos. Para mostrar la relación entre hemoglobina y mitocondrias, se incluye la Figura Suplementaria 2 , que proporciona imágenes de espectros tomados de una perfusión hepática, desglosados en la señal medida, la línea de mejor ajuste y el residuo inexplicado que resulta de las diferencias en los picos espectrales individuales. En el panel A, se seleccionan las bibliotecas de regresión de mitocondrias reducidas y oxidadas de hemoglobina reducida y oxidada. La línea de mejor ajuste curada a través de las bibliotecas y el análisis de regresión se solapa ordenadamente con la señal medida, y hay poco residuo inexplicable. En el panel B, solo se seleccionan bibliotecas de mitocondrias oxidadas y reducidas. Dado que existe una gran estructura residual inexplicada, el pico espectral mitocondrial se desplaza varios números de onda respecto al de la hemoglobina, que no se incluyó en el análisis de regresión. Además, en las figuras complementarias de Nguyen et ^al.9, los autores explican la relación entre las mitocondrias y los complejos individuales (cIII y cIV), así como la relación entre los complejos^{individuales 16}, donde el complejo III muestra picos más agudos y de menor frecuencia, mientras que el complejo IV muestra bandas más amplias y desplazadas hacia arriba. Además, los autores muestran que las bibliotecas reducidas de Complejo III y Complejo IV explican completamente el espectro medido de mitocondrias completas reducidas, resultando en un residuo inexplicado mínimo.

Figura 1: Bibliotecas espectrales de mitocondrias totalmente oxidadas y reducidas. Los espectros de biblioteca RRS se obtuvieron después de que se proporcionaran mitocondrias aisladas con (A) 100% oxígeno o 100% nitrógeno (B) para alcanzar estados oxidados y reducidos, respectivamente. Estos estados se confirmaron con la presencia de picos oxigenados y marcadores (D) reducidos de RR (C). El desplazamiento en estos picos corresponde a cambios en los modos vibracionales moleculares en presencia de oxígeno. La intensidad de cada pico se normaliza a 1 unidad arbitraria de intensidad (UA), ya que la mejora del estado reducido es mayor usando esta longitud de onda de excitación de 441 nm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Recogida de datos mediante RRS

1. Configuración del dispositivo:
   1. Conecta la unidad de espectrómetro (alojada dentro de una caja compacta) a la fuente de corriente continua (DC) y al adaptador de corriente usando los cables suministrados. La unidad del espectrómetro tiene un tapón redondo con hendiduras de alineación.
   2. Alinea las hendiduras del enchufe redondo con las del cable que se conecta al adaptador de corriente. No es necesario limpiar antes de conectar los puertos (Figura 2).
   3. Conecta el ordenador que ejecuta el análisis al mismo adaptador de corriente que conecta el espectrómetro y la fuente de alimentación usando los cables suministrados.
   4. Coloca la sonda láser en el soporte de la sonda. Ajusta la posición de esta sonda al inicio del experimento.
   5. Abre el software de control del espectrómetro (Software de Energética Celular).
2. Configuración de software:
   NOTA: El sistema proporciona archivos de configuración y bibliotecas de regresión para diferentes tipos de tejido. Estos archivos incluyen información sobre qué bibliotecas debe incluir el sistema RRS en la regresión, cuántos espectros se incluyen en la ventana de regresión y otros parámetros como la potencia del láser. Se pueden cambiar los ajustes por defecto y guardar un nuevo archivo de configuración para usarlo en futuros experimentos. Las capturas de pantalla del software detalladas a continuación se presentan en la Figura Suplementaria 3.
   1. Al abrir el software de control del espectrómetro, aparecerá un gráfico que muestra el porcentaje de 3RMR, la saturación de oxígeno (_{StO 2}) y la saturación de mioglobina. Esta pantalla es donde estas métricas se mostrarán, si se seleccionan, en tiempo real durante las mediciones. Haz clic en la pestaña de Configuración en la parte inferior izquierda de la página.
   2. En la pestaña Información , introduce la información de la sesión en Nombre de la sesión y cualquier detalle necesario en la pestaña Descripción de la sesión .
   3. Existen dos modos de recopilación de datos. Utiliza el modo Spot Check para acumular espectros hasta que se cumplan las métricas de calidad especificadas (por ejemplo, sigma objetivo o ventana/número de espectros de regresión), y luego detienes la grabación. Utiliza el Modo Continuo para registrar espectros hasta que se pulse el botón de parada. En ambos modos, todos los datos, tanto los resultados 3RMR como los espectros individuales, se almacenan automáticamente. Este experimento utiliza el Modo Continuo.
   4. Una vez introducida toda la información de la sesión, haz clic en la pestaña Sistema .
   5. En Archivo de Ajustes, seleccione el protocolo adecuado para el proyecto (para perfusiones acelulares de hígado de rata, seleccione el protocolo acelular de hígado de rata ). Esto ajustará automáticamente el tipo de medición, la duración media de la medición (ventana de regresión), así como el sigma objetivo.
      1. Para crear un nuevo archivo de configuración, ajusta cualquiera de los componentes mencionados arriba y luego haz clic en el botón Guardar . Esto debería guardar estos parámetros como un archivo de configuración separado que luego se puede importar al sistema.
      2. Para importar un nuevo archivo de configuración, haz clic en el menú desplegable junto a Predeterminado (Mod) y selecciona Importar Nuevo Archivo de Configuración. Haz clic en el nuevo archivo de Configuración para importarlo.
   6. En Bibliotecas de Regresión, selecciona y confirma la combinación de bibliotecas que se usarán para la adquisición y análisis de datos. Se seleccionaron las bibliotecas para mitocondrias reducidas y oxidadas [Solo Mito] para este experimento. Otros usuarios pueden optar por usar bibliotecas que también incluyan hemoglobina, mioglobina u otros complejos que se encuentran en Biblioteca Avanzada.
   7. Selecciona y confirma el modo de ancho de ventana preferido.
      1. Modo de ancho adaptativo: Utiliza el modo de ancho adaptativo para añadir espectros individuales al espectro promediado hasta alcanzar el objetivo máximo de sigma. Si no se alcanza el objetivo sigma, la grabación se detendrá cuando alcance el límite superior de la ventana de regresión establecida (es decir, el número máximo de espectros que se le indicó registrar). Los resultados de la medición se mostrarán en pantalla una vez alcanzado el objetivo mínimo de sigma.
      2. Modo de ancho fijo: Utiliza el modo de ancho fijo para añadir espectros individuales al espectro promediado hasta que se incluya el número objetivo de espectros (ajustado por debajo de la longitud media).
   8. Una vez completados los ajustes del sistema, haz clic en la pestaña Trama .
   9. En Serie Principal, selecciona los componentes que se van a representar y mostrar en pantalla durante las mediciones.
   10. Confirma que todos los componentes de medición seleccionados están en línea con el protocolo de interés.
3. Adquisición de datos:
   NOTA: Las mediciones Raman deben tomarse en un espacio oscuro. Antes de comenzar la adquisición de datos, asegúrate de que el espacio de trabajo esté lo más protegido posible de la luz. Si la habitación no puede protegerse completamente de la luz, el sistema RRS viene con una cubierta negra con una abertura rectangular en el centro (mostrada en Figura 2), a través de la cual se puede colocar la sonda láser. La caja puede cubrir la muestra/la sección del órgano desde donde se toman las mediciones RRS. Al trabajar con el láser RRS, evita la exposición ocular directa o prolongada. No apuntes un láser directamente al ojo ni a superficies reflectantes. Solo activa el láser cuando esté colocado directamente sobre el tejido de interés. El láser RRS es de Clase 3R cuando se usa a 4 mW, y de Clase 3B cuando se usa a 10 mW. El láser es seguro para el contacto con tejidos.
   1. Selecciona los ajustes pre-guardados, parámetros de grabación y archivos de la biblioteca apropiados.
   2. Coloca la sonda láser directamente sobre el tejido u órgano de interés. Coloca la sonda lo más perpendicular posible y a 1 cm del tejido. Utiliza una regla para medir con precisión a 1 cm de la superficie del órgano. Ajusta la sonda para que esté más cerca de 1 cm si la señal no es clara. Sin embargo, asegúrate de que la sonda nunca toque el tejido.
      NOTA: La sonda puede ser de mano, pero se recomienda usar un soporte o soporte para sonda que pueda ajustarse y que permanezca estable. Coloca la sonda lo más perpendicular posible y a 1 cm del tejido. Se podía usar una regla para medir con precisión 1 cm desde la superficie del órgano. La sonda podía ajustarse para posicionarse a menos de 1 cm si la señal no era clara. Sin embargo, la sonda nunca debe tocar el tejido.
   3. Confirma que el punto láser está en el lóbulo lateral izquierdo, lo más cerca posible de la vena porta.
   4. Confirma que todas las bibliotecas seleccionadas, ajustes de regresión, sigma objetivo, ventana de regresión y modos de adquisición estén correctos y sean los deseados.
      1. Asegúrate de que la habitación esté lo más oscura posible. Verifica que la sonda no tenga ninguna contaminación, especialmente sangre, en la ventana. En caso de contaminación, utiliza una toallita sin pelusa y no abrasiva con alcohol isopropílico al 70% para limpiar la ventana de cuarzo, seguida de un secado profundo con una toallita seca antes de continuar.
      2. En caso de contaminación grave, limpia la sonda lo más a fondo posible, como se ha descrito anteriormente. Luego, calibra el dispositivo colocando el láser en una carcasa oscura forrada con cinta negra y pulsando el botón Tomar Oscuridad . La calibración tarda entre 5 y 10 minutos. Independientemente de la contaminación, calibra el dispositivo una vez al mes y enviará mensajes automáticos de recordatorio.
         NOTA: Las explicaciones de cada métrica de control de calidad, ejemplos de dichas métricas de control de calidad y la señal espectral bruta obtenida de registros óptimos y subóptimos (Archivo suplementario 1, Figura 3, Figura suplementaria 3). Estos criterios de control de calidad se optimizaron para hígados enteros a partir del modelo de rata. Cualquier protocolo desarrollado que utilice un órgano o modelo animal diferente debería refinar y ajustar estas métricas en consecuencia.
   5. En la página principal, haz clic en el botón Inicio para empezar a obtener datos. Dependiendo de la configuración elegida, el software tomará grabaciones hasta alcanzar el valor de error objetivo (sigma) o 180 s. La adquisición de datos ya está completa.
      1. Infiera la calidad de la señal RRS a partir de estos gráficos y valores para permitir el ajuste de la posición de la sonda o de las condiciones de medición (Figura 3). Si la señal RRS obtenida no cumple estos criterios de control de calidad, ajustar la sonda para que sea lo más perpendicular posible y de unos 9 mm desde la superficie hasta la ventana de la sonda.
   6. Una vez completado el protocolo de adquisición de datos/experimento, descarta todo el hígado/tejido en un contenedor de biohazard. Limpia cualquier sistema o superficie que haya estado en contacto con el órgano/tejido con un 70% de etanol.
      1. Si trabajas con un sistema de perfusión, pasa agua DI mezclada con limpiador enzimático (7,8 mL diluidos en 1 L de agua desionizada [DI]), seguida de agua DI limpia.
         NOTA: Cada grabación se guardará como un archivo de análisis separado bajo un nuevo archivo de sesión. Los resultados para 3RMR y la intensidad de señal mitocondrial (r3RMR) se muestran en la ventana principal. También se puede mostrar el espectro en bruto. Otras métricas de control de calidad, como la intensidad residual de la señal y la intensidad total de la señal, se mostrarán en la pestaña Espectro .
4. Análisis de datos:
   1. Una vez terminada la adquisición de datos, haz clic en la carpeta Review en la parte inferior de la pantalla para abrir el archivo experimental y ver los resultados.
   2. Alternativamente, abre un archivo de texto que contenga los resultados. Selecciona el archivo de sesión que te interese. Se abrirá un archivo de análisis que contenga todas las mediciones obtenidas. Cada parámetro y su valor sigma tendrán su propia columna. Por ejemplo, los valores de 3RMR obtenidos cada segundo se listarán bajo la columna "3RMR", y su valor sigma se listará bajo "sigma_3RMR".
   3. La última fila de cada columna contendrá los valores finales de cada parámetro de ese archivo de sesión. Usa este valor para trazar.
   4. Repite los pasos para cada archivo de sesión o cada grabación. Traza los valores obtenidos según se desee.

Figura 2: Configuración del dispositivo RRS. Un esquema de la configuración del sistema RRS. La sonda está conectada mediante un cable de fibra óptica al sistema RRS, que contiene la fuente de excitación láser y el espectrómetro. Esta configuración se conecta a cualquier portátil que contenga la aplicación de control del espectrómetro para la recogida y análisis de datos. Tanto el ordenador como la unidad de espectrómetro están conectados a un enchufe de corriente. Las mediciones del RRS deben tomarse en la oscuridad. Si la habitación no puede protegerse completamente de la luz, el sistema RRS viene con una cubierta negra con una abertura rectangular en el centro, donde se puede colocar la sonda láser. La caja cubre la muestra/sección del órgano desde la que se toman las mediciones del RRS. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Ejemplos de trazas y métricas de control de calidad de la calidad subóptima y la óptima .La señal residual (ruido) está marcada con un soporte naranja, y la señal mitocondrial con un soporte verde. (A) Ejemplo de trazo de una señal Raman subóptima. La señal residual es demasiado grande para diferenciarse de la señal mitocondrial. Los picos espectrales son indistinguibles a lo largo de la señal medida. (B) Ejemplo de traza de la señal Raman óptima. La señal mitocondrial es visiblemente mayor y distinta de la señal residual. Los picos espectrales de la medición obtenida son distinguibles. (C) Métricas de control de calidad obtenidas de cada señal. En general, la señal total obtenida en la lectura subóptima es menor que la lectura óptima. Se mide más señal mitocondrial en el registro óptimo en comparación con el registro subóptimo, siendo la señal mitocondrial representando el 17% y el 14% de la señal total, respectivamente. La señal se midió con un error del 4,3% en la lectura óptima, en contraste con un error del 18,5% en la lectura subóptima. De manera similar, la señal residual inexplicada representa el 11% de la señal total en la grabación subóptima, mientras que representa el 3,6% en la óptima. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Evaluación de la salud mitocondrial mediante RRS

NOTA: Se empleó la tecnología de espectroscopía Raman por resonancia (RRS) para desarrollar una métrica de viabilidad mitocondrial (3RMR) que indica la viabilidad de órganos de trasplante. Este estudio pretende demostrar cómo los cambios en la oxigenación —y, por extensión, en la respiración celular— se reflejan en las tendencias de 3RMR en comparación con biomarcadores tradicionales de daño, como el lactato y el K⁺. Aquí se utiliza una prueba de esfuerzo de oxígeno, donde, tras 5 minutos de perfusión continua, el flujo de perfusión oxigenado se pausa durante 5 minutos y luego se reanuda durante 5 minutos. Durante toda la prueba de esfuerzo se toman mediciones de la RRS, así como muestras de perfusión de entrada y salida.

1. Obtención hepática:
   1. Sedar animales en una cámara de inducción usando isoflurano al 3%–5%. Filtra el exceso de vapor con carbón activado.
   2. Realizar una hepatectomía completa en ratas Lewis macho (150 g). Liga las ramas de la vena porta. Inyecta 50 U de heparina sódica a través de la VCI. Anular la vena porta con un catéter de 16 G durante la cirugía y lavar el hígado con 50 mL de suero fisiológico.
   3. Coloque los hígados obtenidos sobre hielo en una placa de Petri que contenga 30 mL de solución de la Universidad de Wisconsin (UW).
2. Configuración de perfusión subnormotérmica de máquinas (SNMP) y mediciones de Raman por resonancia:
   1. Configura el dispositivo RRS como se ha descrito antes. Configura el Protocolo Acelular de Hígado de Rata en el software de control del espectrómetro, que establece automáticamente el modo ancho en ancho adaptativo, longitud media en 180 y sigma objetivo en 1,5. También selecciona 3RMR y fluorescencia como parámetros de medición, así como Mito solo como biblioteca de regresión. Configura el modo de adquisición en modo continuo.
   2. Establecer el sistema SNMP como se describe en otro^{lugar 18}.
      1. En resumen, asegúrate de que el sistema de perfusión consistiera en una cámara de perfusión, una bomba peristáltica, un oxigenador de membrana y una trampa de burbujas.
      2. Suministrar osígeno con una mezcla atmosférica (95%_O2 y 5%_CO2); Mantén el_{pO 2} entre 400 y 500 mmHg. Controla la presión intrahepática con un sensor de presión y mantenla entre 3–5 mmHg. Recoge las muestras a través de puertos de muestreo.
   3. Una vez que el software y el sistema de perfusión estén instalados, conecta la cánula que penetra la PV al tubo de entrada de la máquina de perfusión. Mantén el órgano, la perfusión y la perfusión a temperatura ambiente (21 °C), sin la ayuda de un baño marea.
   4. Administra el perfusado al órgano a través de la cánula en la PV utilizando una bomba peristáltica.
      1. Para preparar el perfusado, mezcle 500 mL de Williams' Medium sin fenol rojo con 5 g de albúmina sérica bovina (BSA), 12 mg de dexametasona soluble en agua, 5 mL de penicilina-estreptomicina, 5 mL de L-glutamina, 2,5 μL de insulina y 1000 U de heparina.
      2. Remueve todos los componentes en una placa de agitación durante unos 20 minutos, o hasta que todos se hayan disuelto. Aumenta los flujos de perfusión a presiones de rendimiento de 3–5 mmHg.
   5. Después, coloca la fuente láser RRS en el soporte de la sonda y colócala a 1 cm sobre el lóbulo más grande del hígado, lo más cerca posible del PV. Pausa el flujo de perfusión a los 5 minutos (T₅) y reanudalo a los 10 minutos (T₁₀). Realiza la prueba de esfuerzo a los 15 minutos (T₁₅).
   6. Toma mediciones RRS durante toda la prueba de esfuerzo; tomar mediciones de entrada y salida cada 5 minutos, comenzando en T₀ (Figura 4). Grafica los valores de 3RMR, así como los niveles de K⁺ de salida y niveles de lactato para T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (n = 3) (Figura 5).
   7. Calcular la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ multiplicando la presión parcial de entrada/salida de oxígeno (_{pO 2}) por el coeficiente de solubilidad del ogénigeno en el plasma (0,00314). Grafica el OCR para T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (Figura 5).
      NOTA: Se muestran trazas espectrales ejemplares de Resonancia Raman en estados perfundidos (T₅), isquémicos (T₁₀) y reperfundidos (T₁₅) de un hígado (Figura 6)

Figura 4: Diagrama que representa el flujo experimental. Se realizó una hepatectomía completa en hembras de rata Lewis. El hígado extraído fue sometido a una perfusión subnormotérmica por máquina y suministrado con perfusado oxigenado durante los primeros 5 minutos. La perfusión fluye hacia el hígado a través de la vena porta y recircula por la bomba peristáltica (flujo de perfusión representado con flechas azules). La perfusión oxigenada se pausó durante los siguientes 5 minutos en T5 y se reinició otros 5 minutos en T10. Mediciones 3RMR realizadas durante toda la prueba de esfuerzo (representadas como el láser). Se obtuvieron muestras de perfusado en T0, T5, T10 y T15. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

Hígados frescos fueron sometidos a periodos de isquemia y reperfusión mediante una prueba de esfuerzo por oxígeno. Luego, los cambios en tiempo real en 3RMR se compararon durante la prueba de esfuerzo con la tasa de consumo de osígeno, el lactato de salida y el potasio obtenidos mediante análisis de perfusos en T₀, T₅, T₁₀, T₁₅. En condiciones saludables, se espera que los valores de 3RMR estén entre el 10% y el 30% (Figura 5A). Como era de esperar, los valores de 3RMR en T₀ y T₅ se encuentran dentro de este rango, ya que el hígado recibió suministro continuo de perfusado oxigenado entre estos puntos temporales (Figura 5A). Sin embargo, el valor de 3RMR al final del periodo isquémico (T₁₀) está fuera del rango óptimo (Figura 5A). Este aumento indica que las mitocondrias se desvían a su estado reducido, ya que los electrones se acumulan a lo largo de la cadena de transporte debido a la desoxigenación. En T_10, se reanuda el flujo oxigenado; comienza el periodo de reperfusión. Al final del periodo de reperfusión (T₁₅), los valores de 3RMR vuelven a niveles óptimos (Figura 5A) a medida que se restaura la actividad del ETC con la reintroducción del oxígeno como aceptor final de electrones. Estos cambios en el flujo de oxígeno también son visibles en los espectros en bruto. Los espectros RRS en bruto en T₀ y T₁₅ presentan características espectrales similares a las de las mitocondrias oxidadas (Figura 6A,C), como un pico de marcador espectral en 1371 ^cm-1 (Figura 6D,F). De manera similar, los espectros Raman en bruto en T₁₀ (Figura 6B) muestran marcadores RR reducidos, como un pico espectral de marcador en 1357 ^cm-1 (Figura 6E). En conclusión, RRS identifica los cambios en los estados redox mitocondriales en tiempo real, lo cual se demuestra tanto en la señal espectral bruta como como métrica de la salud mitocondrial (3RMR).

RRS también puede calcular valores de 3RMR basados en los estados redox de cIII y cIV. Se observó un patrón similar en los valores de 3RMR de cIII y cIV (Figura 5B). En T₀, se observaron valores de 3RMR completamente oxidados para cIV y valores de 3RMR dentro del rango óptimo para cIII. Este equilibrio redox entre los complejos es fisiológico, ya que los electrones fluyen de cIII a cIV para oxidarse rápidamente. Al inicio de la isquemia, se observó un aumento en los niveles de 3RMR para cada complejo. Durante el periodo isquémico, la acumulación de electrones a través del ETC aumenta el estrés reductor sobre cIII y cIV, lo que en consecuencia incrementa cIII-3RMR y cIV-3RMR. Sin embargo, tras la reintroducción del oxígeno, los valores de 3RMR de ambos complejos vuelven a niveles óptimos: cIV totalmente oxidado y cIII fisiológicamente reducido (Figura 5B). Las tendencias de 3RMR en ambos complejos muestran que la cesación del oxígeno afecta a todo el ETC, y ningún complejo individual es especialmente vulnerable a la isquemia sin flujo.

Por otro lado, los cambios en la dinámica de oxigenación no se reflejaron en biomarcadores de daño ni en analitos de gases sanguíneos obtenidos mediante análisis de perfusos. Al inicio de la isquemia, se espera que el lactato y el K⁺ aumenten, ya que la célula empieza a depender de la respiración aeróbia y se degrada lentamente para liberar K⁺ intercelular. También esperamos que el TOC disminuya, ya que las células no producen suficiente energía para continuar la respiración celular. Incluso tras un periodo de isquemia sin flujo, las tasas de consumo de oxígeno no mostraron signos de daño. Los niveles de lactato y K⁺ de salida se mantienen relativamente constantes durante la prueba de esfuerzo, a pesar de los cambios en la oxigenación (Figura 5D–E).

Figura 5: Cambios en la 3RMR y biomarcadores de daño durante la prueba de esfuerzo por oxígeno. El inicio de la isquemia y los periodos de reperfusión se representan mediante líneas punteadas en los minutos 5 y 10, respectivamente. Además, los periodos de flujo oxigenado se representan con líneas azules, y los periodos de isquemia con líneas rojas. (A) Valores de 3RMR a lo largo del ensayo mitocondrial. Los valores de 3RMR aumentan cuando el flujo oxigenado se pausa y vuelven a niveles óptimos cuando se reinicia el flujo. (B) 3RMR valores de complejo III y complejo IV. La suspensión del flujo conduce a una reducción en ambos complejos. (C) Valores medios de salida K⁺ durante toda la prueba de esfuerzo. Los valores de K⁺ se mantienen constantes durante toda la prueba de esfuerzo, a pesar de los cambios en la dinámica de oxigenación. (D) Niveles medios de lactato de salida durante la prueba de esfuerzo. La producción de lactato se mantiene constante durante toda la prueba de esfuerzo. (E) Tasas de consumo de oxígeno en T₀, T₁₀, T₁₅. Dado que los valores de_{pO 2} son mediciones basadas en flujo, OUR no pudo calcularse para un periodo de isquemia sin flujo. No se observaron cambios significativos (valor p: 0,2500) (n = 3). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Ejemplares trazas espectrales crudas de un hígado fresco de rata durante la prueba de esfuerzo. Perfiles espectrales completos de un hígado en (A) estados oxidados, (B) isquémicos y (C) reperfidos. El desplazamiento del marcador RR oxigenado al marcador RR reducido es visible al hacer zoom en el pico espectral de las mitocondrias, marcado con una caja roja en cada perfil espectral. (D–F) Los picos oxidados del marcador RR (1371 ^cm-1) están presentes en estados oxidados (D) y (F) reperfusos y están marcados con una línea punteada roja. El pico reducido del marcador RR (1357 ^cm-1) está presente en estado isquémico (E) y está marcado con una línea azul discontinuada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Trazas espectrales de complejo III, complejo IV, hemoglobina y mioglobina reducidos y oxidados. (A) Complex III, (B) complejo IV, (C) hemoglobina y (D) mioglobina. El análisis de regresión ejecuta los espectros recogidos frente a estas bibliotecas espectrales (si se selecciona), lo que da un factor para cada espectro de biblioteca que representa la mejor estimación de su contribución relativa en el espectro registrado y, por tanto, su concentración relativa en el tejido. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Ejemplo de cómo utilizar bibliotecas de regresión para descomponer moléculas que contienen hemos superpuestas (hemoglobina y mitocondrias oxidadas/reducidas). (A) Se seleccionaron trazas espectrales crudas del tejido hepático perfundido con perfusado celular, con todas las bibliotecas de regresión necesarias, como hemoglobina, hemoglobina oxidada, mitocondrias reducidas y mitocondrias oxidadas. Está claro que la línea de mejor ajuste, derivada de las bibliotecas y el análisis de regresión, se solapa ordenadamente con la señal medida, con poco residuo inexplicable. (B) Traza espectral cruda del mismo tejido, pero con solo bibliotecas de mitocondrias oxidadas y reducidas seleccionadas. Dado que existe una gran estructura residual inexplicada, está claro que el pico espectral mitocondrial está desplazado varios números de onda respecto al de la hemoglobina, que no se incluyó en el análisis de regresión. Esta figura muestra que el espectrómetro de alta resolución y el análisis de regresión contra todo el espectro pueden distinguir espectros estrechamente relacionados. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: La captura de pantalla del software. (A) Ventana principal que muestra valores de medición a lo largo del tiempo. Durante la medición se mostrarán aquí 3RMR, StO2 y cualquier otra serie seleccionada. Además, la intensidad de la señal de cada serie se mostrará como una línea discontinua en el gráfico, y un valor debajo en el lado derecho de la pantalla. Por ejemplo, la línea sólida capturada aquí representa la 3RMR de un tejido, y la línea discontinua representa la r3RMR (intensidad de señal de 3RMR). Si alguien quería ver la calidad de los espectros grabados, podía hacer clic en la pestaña Mostrar espectro (rodeada en morado). (B) Pantalla que muestra los espectros en bruto del tejido. Esta es la pestaña donde se puede evaluar la calidad de la señal a través de la intensidad de los espectros medidos frente al ruido residual. (C) Pestaña que muestra las tendencias en series a lo largo del experimento. Si se toman, por ejemplo, múltiples mediciones de 3RMR a lo largo de un experimento, cada medición se mostrará a lo largo del tiempo en esta pestaña. Las tendencias de otras series, si se seleccionan, también se mostrarán aquí. Esta pestaña se podía acceder haciendo clic en el botón de Tendencias en la pantalla principal (rodeado en verde sobre A). (D) Pestaña de información, donde se puede introducir información experimental, como el nombre y la descripción de la sesión. (E) Pestaña de sistema, donde se pueden subir protocolos preinstalados. Por ejemplo, si se selecciona el protocolo LiverContAcell, este protocolo establecerá la biblioteca de regresión, la ventana de regresión objetivo y sigma según el protocolo de perfusión acelular para hígados de rata. Para importar un protocolo, se puede hacer clic en Importar Configuración desde Archivo e importar el protocolo de interés. Si se quiere crear su propio protocolo, se pueden seleccionar las bibliotecas necesarias en el menú desplegable de la Biblioteca de Regresión (F), ajustar la sigma objetivo y la ventana de regresión, así como las alarmas, y hacer clic en Guardar (representado con un disco) en la esquina inferior izquierda. (F) Pestaña de gráficos, donde se puede seleccionar qué serie mostrar en la ventana principal. Si se está reanalizando un espectro y se quiere añadir más series a sus mediciones anteriores, puede seleccionar la serie de interés desde debajo de la sección Recal. Durante la recalibración (Recal), el software reanalizará los espectros en bruto medidos y mostrará los resultados de las series recién seleccionadas. También se puede seleccionar mostrar la intensidad de señal de las series seleccionadas desde esta pestaña. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Explicaciones de cada métrica de control de calidad.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este estudio destaca un método no invasivo, en tiempo real y altamente sensible para cuantificar la salud mitocondrial utilizando un sistema portátil de espectroscopía Raman por resonancia, compuesto por un láser en una sonda compacta, conectado mediante un cable de fibra óptica a una bomba láser. Este método utilizaba un láser de 441 nm para excitar mitocondrias, que producen señales espectrales únicas dependiendo de su estado de oxidación. Así, RRS es capaz de cuantificar cada estado de las mitocondrias a través de sus firmas espectrales y comparar los espectros emitidos con bibliotecas espectrales premedidas mediante análisis de regresión. A continuación, se creó una métrica de salud mitocondrial basada en la proporción de mitocondrias reducidas respecto al total: la Relación Mitocondrial Raman de Resonancia Reducida (3RMR).

Este artículo se centra en demostrar cambios en tiempo real en la 3RMR como función de la oxigenación con tejido nativo sin necesidad de procesamiento de muestras. Esto se logró mediante una prueba de esfuerzo por oxígeno: tras 5 minutos de perfusión oxigenada continua, el flujo de perfusión se pausa durante 5 minutos y se reinicia durante otros 5 minutos. Durante la prueba de esfuerzo se toman mediciones de 3RMR. Un modelo de prueba de esfuerzo, en el que alternamos entre periodos isquémicos y oxigenados, nos permite seguir los cambios continuos en los estados redox mitocondriales—y, por extensión, en la función mitocondrial. En otras palabras, la prueba de esfuerzo por ogénio nos permite seguir las tendencias en la 3RMR en función de la oxigenación. Nuestro grupo ha atribuido el aumento de los valores de 3RMR a condiciones isquémicas, que interrumpen el flujo de perfusión, lo que provoca que los electrones que atraviesan el ETC se acumulen, ya que el_O2 no está disponible como aceptor final de electrones. Esta acumulación de electrones provoca un estado reducido, lo que se traduce en un aumento en los valores de 3RMR. Sin embargo, tras la reintroducción de_O2, se espera que las mitocondrias sanas reanuden la actividad de ETC y se recuperen a estados fisiológicos redox, ya que sus elementos estructurales y funcionales permanecen intactos.

Como era de esperar, en el presente artículo se observó un aumento continuo y en tiempo real de la 3RMR durante todo el periodo isquémico (Figura 5A). De manera similar, la 3RMR vuelve gradualmente a niveles óptimos durante el periodo de reperfusión (Figura 5A). Este cambio en tiempo real en los estados redox mitocondriales también es visible en el gráfico espectral, ya que el pico mitocondrial pasa de estados oxidados (1371 ^cm-1) a estados reducidos (1357 ^cm-1) a lo largo del periodo isquémico, y vuelve a oxidarse al final de la reperfusión (Figura 6). Otros picos reducidos de marcadores RR también aparecen durante el periodo isquémico. A diferencia de los ensayos tradicionales de salud mitocondrial, el Raman de Resonancia es lo suficientemente sensible como para cuantificar los estados redox del complejo III y del complejo IV, lo que podría, y ha proporcionado, una visión mecanicista del impacto específico de las lesiones por isquemia-reperfusión en el ETC. En mitocondrias sanas, los electrones pasan a través de varios complejos en el ETC, comenzando desde el complejo I, hasta alcanzar_O2 como el último aceptor de electrones. Una pausa en el flujo de oxígeno puede desplazar cada complejo a un estado reducido, ya que los electrones se acumulan a lo largo del ETC. Como era de esperar, se observó un aumento en tiempo real en los valores de 3RMR de cIII y cIV al inicio de la isquemia. Esto indica que la falta de_O2 afecta a todo el ETC, más que a un complejo específico (Figura 5B). Como discutiremos a continuación, la sensibilidad del SRR facilita estudios mecanicistas detallados e informa el desarrollo de terapias dirigidas para la IRI.

Tradicionalmente, también esperamos observar niveles elevados de lactato en los órganos isquémicos, ya que dependen del metabolismo anaeróbico en ausencia de oxígeno para producir ATP. De manera similar, se esperaba un aumento en los niveles de K⁺ en órganos dañados, ya que la integridad de la membrana de las células se ve alterada, permitiendo un flujo de K⁺ intercelular. Por último, las células gravemente dañadas pueden tener un metabolismo más bajo, ya que sus vías metabólicas se ven afectadas por los desechos metabólicos y los ROS inducidos por isquemia, lo que conduce a una disminución del consumo de oxígeno. Sin embargo, no se observan cambios en el consumo de lactato, K⁺ o oxígeno durante ni después del periodo isquémico. De hecho, los valores no indican ninguna suspensión del flujo de oxígeno, ya que se mantienen relativamente consistentes durante toda la prueba de esfuerzo (Figura 5B–D). En esencia, utilizando una prueba de esfuerzo de oxígeno, este estudio muestra que los valores de 3RMR reflejan los cambios en los estados redox mitocondriales durante la isquemia-reperfusión de forma más rápida, en tiempo real y con mayor sensibilidad que los biomarcadores de daño tradicionales (Figura 5). Reconocemos que este estudio comparó la dinámica de la 3RMR con indicadores indirectos de salud mitocondrial, como el lactato y la OCR, en lugar de comparadores más directos aguas abajo, como NAD+/NADH y ATP. Aunque este estudio no correlaciona explícitamente los cambios en la 3RMR con las concentraciones de ATP/NADH, trabajos^{previos 9,14} han demostrado que la 3RMR es predictiva de los cambios en estos biomarcadores posteriores. Por ejemplo, Nguyen et ^al.9 demostraron que hígados de 3 horas con valores bajos de 3RMR (<10%) tienen concentraciones significativamente menores de ATP y proporciones NAD/NADH que hígados con 1 hora de IRM (valores de 3RMR de ~15%). Además, Jain et ^al.14 no observaron diferencias significativas en la proporción NAD+/NADH ni en la CE en grupos que no presentaron diferencias significativas en su 3RMR. También observaron que las proporciones NAD+/NADH y la CE eran significativamente diferentes en hígados frío-isquémicos (IC) de 24 horas tras la perfusión acelular en comparación con la perfusión celular, que también mostró valores estadísticamente significativos de 3RMR. En conjunto, estos resultados demuestran valores de 3RMR que reflejan cambios en medidas más directas de la función mitocondrial y del ETC.

Aunque este artículo utiliza RRS durante una perfusión de 15 minutos para demostrar el rendimiento del sistema, otros estudios publicados han demostrado la utilidad de RRS en estudios longitudinales. Más concretamente, en un trabajo anterior, demostramos que el RRS complementa los biomarcadores tradicionales durante perfusiones orgánicas más largas, ya que proporciona una visión sobre la salud y función mitocondrial que difieren significativamente de los métodos tradicionales. Por ejemplo, el estudio utilizó RRS para evaluar la viabilidad de hígados de rata isquémica fría trasplantable (24 h) y no trasplantable (72 h SCS) a lo largo de la perfusión^{subnormotérmica 10}. Aunque la respuesta inicial a la oxigenación en ambos grupos fue similar, la 3RMR de hígados no trasplantables aumentó con la perfusión, mientras que la 3RMR de hígado trasplantable se mantuvo constante mediante SNMP. De manera similar, los niveles de potasio y el aumento total de peso en hígados con IC 72 h fueron más altos en todo el SNMP en comparación con hígados con IC 24 h. El estudio demostró la utilidad del RRS para complementar biomarcadores tradicionales durante perfusiones largas. En otro estudio, utilizamos RRS para comprender la dinámica de la reoxigenación y la recuperación metabólica de hígados de rata frío-isquémica^{(IC) 14}. Perfundimos hígados mínimamente isquémicos (15 minutos de isquemia fría) y hígados isquémicos fríos de 24 horas con un perfusado acelular o con un complejo de glóbulos rojos (pRBC). Cuando el hígado de IC a 24 horas se perfundió con perfusado acelular, observamos una disminución latente en la 3RMR en comparación con cuando se perfundió con pRBC. El estudio atribuyó este aumento retardado en la 3RMR a la acumulación de electrones en los citocromos mitocondriales durante isquemia fría, que pueden transferirse rápidamente a las abundantes moléculas de osígeno en el caso de la perfusión basada en pRBC. Sin embargo, en combinación con otros marcadores de lesión, observamos un mayor daño hepático en hígados con IC a 24 horas perfundidos con glóbulos rojos p. El estudio concluyó que medir la oxigenación mitocondrial en tiempo real mediante RRS puede aportar información sobre la recuperación mitocondrial, lo que podría ser beneficioso para optimizar estrategias de perfusión larga. En esencia, los hallazgos indican que integrar biomarcadores tradicionales (por ejemplo, lactato, OCR, ATP) con conocimientos impulsados por el RRS sobre los estados redox mitocondriales y la dinámica de oxigenación proporciona una evaluación más completa de la recuperación mitocondrial.

Otros estudios han utilizado RRS como banco de pruebas para terapias que pueden mitigar la lesión isquemia-reperfusión en el^{ETC 9}. En períodos prolongados de isquemia, los electrones se acumulan dentro del ETC, con la capacidad de que los electrones escapen a través de los distintos complejos, especialmente durante la reperfusión. Comprender el estado redox de complejos individuales como función de isquemia-reperfusión puede ofrecer una comprensión más profunda de la localización de la lesión con potencial para intervenciones más específicas. Por ejemplo, nuestro grupo ha utilizado RRS para desarrollar intervenciones terapéuticas para la disfunción compleja-III en hígados porcinos cálidos-isquémicos. En un estudio realizado por Nguyen et al. (2026)⁹, se colocaron hígados WI de 1 h y 3 h en SNMP durante 3 horas. Como se mencionó anteriormente, se sabe que los hígados de tres horas con WI sufren daños en el ETC, lo que provoca sobreoxidación y reducción del metabolismo. Aunque los valores de 3RMR para hígados frescos y con WI de 1 h estuvieron dentro del rango óptimo durante toda la perfusión, observamos que los valores de 3RMR de hígados con WI a 3 h caían continuamente, llegando por debajo del rango óptimo (10%) a las 3 h. Además, no observamos diferencias en los valores de 3RMR de cIV entre ninguno de los dos grupos, ya que el cIV estaba completamente oxidado en cada grupo. La hiperoxidación de cIII, combinada con un estado redox saludable observado en cIV, indica una sobreoxidación inducida por reperfusión en el complejo III. Con este conocimiento, Nyugen et al. (2026)⁹pudieron seleccionar un tratamiento que pudiera superar la disfunción del cIII: el azul de metileno (MB), que actúa como un transbordador electrónico entre cI y citocromo c, evitando cIII y transfiriendo electrones directamente a cIV. Los resultados de la 3RMR reflejaron el efecto terapéutico de la MB en las mitocondrias, ya que los valores de 3RMR durante la SNMP de hígados WI a 3 horas aumentaron para reflejar electrones transportados directamente al cIV y el reinicio del metabolismo hepático. El efecto mitigador de la MB también se validó disminuyendo el flujo de lactato y mejorando las tasas de consumo de oxígeno. En esencia, la especificidad del RRS permitió el desarrollo de una vía terapéutica adaptada a las necesidades mitocondriales tras una isquemia tibia.

A lo largo de este artículo, presentamos la espectroscopía Raman por resonancia como un método no invasivo, en tiempo real y altamente específico para medir la salud mitocondrial. El estudio demuestra cómo el RRS puede medir cambios sutiles en los estados redox sin alterar el tejido antes de que tales cambios fisiológicos tengan efectos posteriores. Sin embargo, es importante señalar las varias limitaciones del sistema Raman de Resonancia. En primer lugar, la RRS requiere que todas las moléculas que están realzadas resonantemente en un tejido sean identificadas y tenidas en cuenta en la regresión, con cada molécula teniendo diferentes factores de mejora para tener en cuenta la intensidad relativa de la señal. Aunque hemos creado bibliotecas espectrales para todos estos componentes en una longitud de onda y tejido dados, el usuario puede necesitar crear y validar nuevas librerías para cada tejido y longitud de onda de interés. Además, algunos tejidos pueden tener elementos espectrales complejos, lo que dificulta la medición de citocromos mitocondriales que existen en concentraciones más bajas. Por ejemplo, los hígados de cerdo o humanos contienen betacaroteno, y la sangre contiene hemoglobina, ambos con señales espectrales fuertes que aumentan el número de firmas espectrales que RRS debe tener en cuenta en la regresión. Por último, el láser de 441 nm utilizado para estas mediciones tiene un diámetro de haz de 2 mm y una profundidad de penetración inferior a 1 mm. Estas mediciones localizadas y superficiales pueden favorecer el error de muestreo, ya que las diferencias en el estado redox en otras partes del órgano pueden pasar por alto. Para superar estos desafíos, se podrían tomar mediciones a partir de biopsias tomadas del núcleo del órgano, o un sistema multiláser podría permitir mediciones en una superficie mayor para proporcionar una comprensión más completa de la salud de todo el órgano.

En conclusión, mostramos que la espectroscopía Raman por resonancia es sensible a cambios sutiles en la dinámica mitocondrial en comparación con los analitos de gases sanguíneos. Aquí se ofrece una explicación detallada sobre cómo configurar y operar el sistema. Destacamos la naturaleza no invasiva, altamente específica y evaluativa en tiempo real de la RRS, y explicamos cómo podría utilizarse como un enfoque diagnóstico y mecanicista. También destacamos su uso en el desarrollo de vías terapéuticas específicas para la disfunción mitocondrial. Futuros estudios podrían centrarse en adaptar el sistema RRS para evaluar la salud mitocondrial a partir de biopsias, cortes de tejido con corte preciso u otros productos derivados de tejidos, incluido tejido humano para investigación traslacional. La adopción de RRS ofrece un enfoque poderoso en la investigación metabólica, mejorando nuestra comprensión de los procesos bioenergéticos celulares con mayor facilidad que los métodos tradicionales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
16 G Catéter	BD Insyte Authoguard	381454	Usado para canular la vena porta
Carbón Activado	Vet Equip Vapor Guard Carbón Activado	931401	Usado para filtrar el exceso de vapor durante la anestesia
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	Composición del perfusato
Trampa de Burbujas	Radnoti	130149
Dexametasona	Sigma-Aldrich	D2915	Composición del perfusato
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	Composición del perfusato
Tubo de bomba peristáltica Masterflex L/S de precisión (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	Usado para hacer fluir el perfusato a través del hígado
Bombas peristálticas Masterflex	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	Usado para hacer fluir el perfusato a través del hígado
Oxigenador de membrana	Radnoti	130144	Usado para oxigenar el perfusato.
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4458	Composición del perfusato
Sistema de análisis de gases en sangre RAPIDPoint 500	Siemens Healthineers	41115805	Para el análisis de gases en sangre
Sistema de Resonancia Raman	Pendar Technologies	A4D441	Póngase en contacto con Pendar Technologies para consultas sobre este producto