Citometría de flujo multicéntrica para enfermedad residual medible por leucemia mieloide aguda con LAIP/DfN y poblaciones enriquecidas con células madre leucémicas CD34+CD38

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo de citometría multicéntrica para la cuantificación medible de enfermedad residual medible por leucemia mieloide mediante análisis inmunofenotípico asociado a la leucemia/diferente de lo normal (LAIP/DfN) y poblaciones enriquecidas con células madre leucémicas definidas fenotípicamente por CD34⁺CD38⁻ .

Resumen

Se recomienda el seguimiento medible de la enfermedad residual (DMR) para la evaluación de la respuesta al tratamiento en ensayos clínicos de leucemia mieloide aguda (LMA) según las directrices ELN 2025. El objetivo de este estudio fue implementar un seguimiento estandarizado de los pacientes utilizando un enfoque armonizado de flujo MRD en 30 laboratorios franceses de hematología que participan en ensayos clínicos de LMA. Para obtener resultados comparables, la red estableció recomendaciones desde procedimientos de laboratorio húmedo hasta informes clínicos. Diseñamos un panel de 3 tubos con marcadores comunes obligatorios de 8 colores por tubo, según las recomendaciones del ELN, para identificar patrones de inmunofenotipo asociado a la leucemia/diferente de lo normal (LAIP/DfN) en células a granel y poblaciones enriquecidas con células madre leucémicas (LSC) en la fracción CD34⁺CD38⁻ . Se utilizó una columna vertebral de CD34/CD38/CD45/CD117, completada por marcadores de linaje para el primer tubo, marcadores asociados a LSC para el segundo tubo, y marcadores monocíticos y de diferenciación para el tercer tubo. Este panel puede usarse en formatos de 8, 10 y 12 colores e implementarse en múltiples plataformas convencionales de citómetros de flujo. Proponemos ajustes de citómetro de flujo adaptados a cada plataforma.

La armonización de la sensibilidad entre las cuatro plataformas se realizó utilizando cuentas arcoíris de 8 picos. Se realizó inmunotinción tras la lisis de volumen. Para detectar sesgos entre plataformas, se analizó el índice de tinción utilizando muestras frescas de médula ósea sana en paralelo en las cuatro plataformas. Se compartieron muestras regulares de control de calidad de médula ósea entre laboratorios para la evaluación externa de calidad húmeda (EQA) para verificar todos los pasos del protocolo. Finalmente, se evaluó la estandarización de la estrategia de análisis de datos obtenida en los centros utilizando EQA seca mediante el intercambio de archivos de datos MRD FCS. La viabilidad de este enfoque multicéntrico requiere la armonización de la sensibilidad del instrumento y la preparación de la muestra, así como la formación y educación sistemática de los operadores analíticos.

Introducción

La enfermedad residual medible (DMR) se refiere al pequeño número de células leucémicas que persisten durante o después del tratamiento y que no son detectables por morfología, especialmente en casos de remisión completa con menos del 5% de blastos en la médula ósea. Se recomienda el seguimiento de la DMR para la evaluación de la respuesta al tratamiento en ensayos clínicos de leucemia mieloide aguda (LMA) según las directrices ELN 2025¹. Además de los métodos de biología molecular, incluyendo la PCR transcriptasa inversa (RT-qPCR) y la secuenciación de nueva generación (NGS), la citometría de flujo multiparamétrica (MFC) es un enfoque^{comúnmente utilizado 2}.

Para obtener resultados consistentes de MRD, especialmente en ensayos clínicos, son posibles dos estrategias: centralizar la medición de MRD en un único laboratorio o implementar un protocolo que garantice la reproducibilidad entre los diferentes laboratorios implicados en la determinación de MRD. El número de muestras, el tamaño del ensayo y la capacidad de los laboratorios para procesar volúmenes de muestra mayores o menores pueden determinar la elección entre estas estrategias. Si se elige una estrategia multicéntrica, deben abordarse las diferencias entre plataformas de citómetros y la necesidad de un análisis comparable entre los centros.

Para este propósito, describimos un enfoque estandarizado de flujo MRD multicéntrico y multiplataforma que combina análisis inmunofenotípico asociado a la leucemia/diferente de lo normal (LAIP/DfN) y detección enriquecida con células madre leucémicas (LSC) definido fenotípicamente por CD34⁺CD38⁻, implementado en 30 laboratorios franceses de hematología basándose en recomendaciones ELN e informes^{previos 3,4}.

La citometría de flujo permite definir, en el momento del diagnóstico, la "firma" de leucemia que incorpora la expresión específica de marcadores en los blastos del paciente: LAIP. Tras el tratamiento, el flujo de MRD permite monitorizar los LAIPs identificados en el momento del diagnóstico. Dado que los blastos leucémicos pueden evolucionar y modificar su inmunofenotipo bajo presión terapéutica, debe implementarse sistemáticamente una segunda estrategia: el enfoque DfN, que se basa en identificar células con características que las diferencien de la hematopoyesis normal. Esta técnica también puede detectar la aparición de nuevos marcadores en los blastoplastios durante el curso de la enfermedad y su tratamiento.

En el grupo francés de flujo AML, el diseño del panel se basó en el estudio previamente publicado por HOVON sobre la definición de patrones de células leucémicas. No existe un LSC universal ni un marcador LAIP, por lo que diseñamos un panel de 3 tubos que permite la identificación simultánea de poblaciones enriquecidas con LAIP, DfN y CD34⁺CD38⁻ enriquecidas con LSC. Se utilizó una columna vertebral basada en CD34/CD38/CD45/CD117 en todos los tubos, completada por marcadores de linaje en el primer tubo, marcadores asociados a LSC en el segundo tubo y marcadores monocíticos de linaje o diferenciación en el tercer tubo para completar la definición de LAIP en LMA con blastos monocíticos. Los tres tubos se adquieren en el diagnóstico y en muestras de seguimiento.

Dada la fisiopatología de la leucemogénesis, la atención se ha desplazado del estudio del volumen de blastos a identificar la fracción más inmadura como poblaciones enriquecidas con células madre leucémicas. Dick y sus colegas demostraron la heterogeneidad de la leucemia describiendo las CSL CD34⁺CD38⁻ con potencial para generar leucemia en ratones^{inmunodeficientes 5,6}. En la cuantificación de los LSC en el diagnóstico y seguimiento, se están haciendo esfuerzos para estandarizar los paneles de anticuerpos y las estrategias de análisis dentro del grupo de trabajo ELN^{DAVID 1,7}. Actualmente, dos paneles, HOVON y ALFA, utilizan marcadores dicotómicos de LSC para distinguir poblaciones enriquecidas en LSC de células madre hematopoyéticas normales en el espacio CD34⁺CD38^{− 8,9}.

El método descrito aquí combina preparación estandarizada de muestras, diseño común de panel de anticuerpos, ajustes de sensibilidad adaptados a la plataforma, análisis enriquecido con LSC con LAIP/DfN y CD34⁺CD38⁻ , evaluación externa de la calidad y informes clínicos armonizados para la monitorización multicéntrica del flujo de MRD de LMA.

Protocolo

El protocolo sigue las recomendaciones y directrices de los comités de ética de los Centros Hospitalarios Universitarios Franceses. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado según la legislación francesa. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana de la CHU Lyon y el Comité de Ética del Comité de Revisión Institucional de la CHU de Lille conforme a la Declaración de Helsinki (observatorio HDF-AML, CNIL 2214454v0). Para el aloenjerto, los donantes fueron incluidos en la base de datos europea basada en internet ProMISE y proporcionaron consentimiento informado para la recopilación de sus datos personales. La extracción y el análisis de datos se realizaron de acuerdo con el Comité de Ética local (CNIL2093819). Todos los archivos de flujo FCS usados para la revisión de red se anonimizaban completamente mediante un script en Python.

1. Ajuste del citómetro

1. Determinar los valores objetivo adaptados a cada citómetro utilizando perlas arcoíris de 8 picos.
2. Configura cada máquina según los valores objetivo mostrados en la Tabla 1. Asegúrate de que cada canal alcance el valor objetivo ± 5%. Verifica esta configuración de forma sistemática para mantener la sensibilidad longitudinal de cada plataforma.
3. Establecer la matriz de compensación utilizando tubos de tinción única para cada anticuerpo, utilizando perlas de compensación y/o células según cada plataforma.
4. Guarde la matriz de ajuste y compensación como ensayo o protocolo identificado como MRD LAIP/DfN, LSC y MonoGran (T1, T2, T3). Utilice este ensayo o protocolo para la adquisición y la cuantificación del flujo de MRD AML.

2. Procedimiento de laboratorio húmedo

1. Aspirado de médula ósea
   1. Recoger 1-2 mL de médula ósea de EDTA en el diagnóstico y en los momentos de monitorización, incluyendo MRD1, MRD2, MRD3, MRD4 y recaída.
   2. Envía los tubos al laboratorio de flujo de referencia en un plazo de 24-48 horas.
2. Preparación de la citología de médula ósea para examen morfológico
   1. Coloca una gota de aspiración de médula ósea sobre una lámina de cristal. Extiende suavemente la muestra usando un portaobjetos u otra lámina.
   2. Tras 30 minutos de secado, teñe la mancha con May-Grünwald-Giemsa (Archivo Suplementario 1).
3. Lisis de volumen
   1. Añade 15 mL de solución lisante de NH₄Cl a 1-2 mL de muestra de médula ósea. Mezcla suavemente y incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   2. Centrifuga a 450 × g a temperatura ambiente durante 5 minutos y desecha el sobrenadante.
   3. Resuspende el pellet celular en 10 mL de PBS/0,1% BSA. Centrifuga a 450 × g a temperatura ambiente durante 5 minutos y desecha el sobrenadante.
   4. Resuspende el pellet celular a una concentración de 30 × 10⁶ leucocitos/mL en PBS.
4. Inmunotinción de la suspensión celular
   1. Distribuir los anticuerpos monoclonales en los tubos T1, T2 y T3 según la plataforma (Tabla 2). Proporciona el clon, volumen, referencia del catálogo y proveedor de cada anticuerpo en una tabla de anticuerpos.
      NOTA: Para cada tubo que use tintes violetas brillantes, usa buffer de tinción brillante antes de añadir los anticuerpos.
   2. Añade 2-3 ×10⁶ celdas lisadas por tubo en 100 μL de suspensión celular. Incuba las células con anticuerpos durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
   3. Lava las células con 3 mL de PBS. Centrifuga durante 5 minutos a 450 × g y descarta el sobrenadante.
   4. Resuspende las células teñidas en 300 μL de PBS.
      NOTA: Se pueden usar cócteles de anticuerpos premezclados o tubos de anticuerpos secos validados.

3. Adquisición del citómetro de flujo

1. Abrir el ensayo o protocolo de adquisición MRD con la configuración adaptada y la matriz de compensación para la medición MRD LAIP/DfN y LSC.
2. Adquirir un mínimo de 500.000 a 1.000.000 de glóbulos blancos en cada tubo en el diagnóstico y en muestras de seguimiento de MRD para mejorar el agrupamiento de células MRD y la confianza en MRD de bajo nivel.
   NOTA: Para la medición de LSC, adquirir un mínimo de 1.000.000 de WBC en el Tubo 2 para obtener una sensibilidad adecuada para la cuantificación de LSC (LOQ 0,002% y LOD 0,001%^)10,11.
3. Guarda los archivos de datos del FCS de las muestras de diagnóstico y MRD. Registrar la fecha de adquisición y la identificación del paciente para facilitar el seguimiento del análisis de MRD y LSC.

4. Estrategia de análisis

1. Utiliza una plantilla común y una secuencia común de diagramas de puntos que incorpore una estrategia de acceso armonizado predefinida adaptada al software de análisis utilizado en cada centro.
2. Aplicar la estrategia de gating para identificar células leucémicas utilizando tres enfoques: LAIP, DfN y análisis LSC en ^{la fracción} CD34⁺CD38-.
3. Identificar y excluir posibles eventos inespecíficos y poblaciones fisiológicas normales, incluyendo basófilos, células dendríticas plasmacitoides, hematógonos, células plasmáticas, eritroblastos, agrupaciones plaquetarias, restos y eritrocitos no lisificados.

5. Definición de LAIP/DfN y poblaciones fisiológicas

1. Para capturar LAIP en explosiones masivas, dibuja una compuerta de celda única basada en FSC-W frente a FSC-H.
2. Dibuja una compuerta de celda viva basada en FSC frente a SSC.
3. Dibuja una compuerta de explosión en el^dim/SSC CD45.
4. Dibuja la puerta marcadora primitiva usando CD34/CD117.
5. Utiliza gráficos de puntos biparamétricos fijos para dibujar las compuertas relevantes de LAIP, incluyendo LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 y LAIP8.
6. Poblaciones fisiológicas
   1. Hematógonos de compuertas usando la siguiente secuencia: células vivas, MNC en el gráfico de puntos FSC/SSC, gráfico de puntos CD19/SSC y gráfico de puntos CD34/CD38. Backgate usando CD45/SSC.
   2. Basófilos de compuerta usando la siguiente secuencia: células vivas, MNC en el gráfico de puntos FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA^-), excluyendo los hematomógonos CD19⁺ . Backgate usando CD45/SSC.
   3. Células dendríticas plasmacitoides de puerta usando la siguiente secuencia: células vivas, MNC en el gráfico de puntos FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺), excluyendo los hematógonos CD19⁺ . Backgate usando CD45/SSC.
   4. Identifica eritroblastos, agrupaciones plaquetarias, restos y eritrocitos no lisados usando el gráfico de puntos CD36/CD45. Backgate usando CD45/SSC y FSC/SSC.
7. Enfoque LAIP
   1. Defina MRD en AML primitivo CD34⁺ O CD117⁺ usando operadores booleanos de la siguiente manera: LAIP1 Y LAIP2 Y LAIP3 Y LAIP4 Y LAIP5 Y LAIP6 Y LAIP7 Y LAIP8 Y NO limpias CD36^brillante+/CD45 Y celdas individuales Y celdas vivas Y Marcadores primitivos CD34^+/CD117^+/ Y (compuerta explosiva CD45/SSC O MNC CD34⁺) (Figura 1).
   2. Defina MRD en CD34-CD117^- AML usando operadores booleanos de la siguiente manera: LAIP1 Y LAIP2 Y LAIP3 Y LAIP4 Y LAIP5 Y LAIP6 Y LAIP7 Y LAIP8 Y NO limpias CD36^bright+/CD45 Y células individuales Y células vivas Y CD34CD117 y CD45/SSC (Figura 2).
8. Enfoque DfN
   1. Utiliza la misma plantilla que el enfoque LAIP y aplica el espacio vacío definido en las muestras de médula ósea de referencia (Tabla 3).
   2. Defina poblaciones anormales cuando el grupo de células anormales se separa de las células normales por 0,5 décadas en la escala^{logarítmica 12}.
   3. Para capturar DfN en blasts a granel, dibuja celdas vivas usando FSC/SSC.
   4. Dibuja celdas individuales eliminando dobletes basados en el pico y área del SSC del FSC.
   5. Dibuja la compuerta MNC usando FSC/SSC.
   6. Aplica una compuerta de limpieza para eliminar linfocitos usando CD45/CD36/SSC.
   7. Aplica una compuerta de limpieza para eliminar eritroblastos y restos usando CD45/CD36.
   8. Utilizar dos compuertas de entrada, CD34⁺/CD45/SSC y CD117⁺/CD45/SSC, para definir las cajas vacías según las publicaciones^{anteriores 12,13}.
   9. Extraer cada casilla vacía de DfN en función de poblaciones de control interno, incluyendo linfocitos para marcadores cruzados de linaje y precursores mieloides normales para marcadores de pérdida, disminución o sobreexpresión.
   10. Compara las cajas vacías con muestras de médula ósea de referencia, incluyendo médula ósea regenerativa, inflamatoria y saludable de donante.

6. Definición de la población del LSC CD34⁺CD38^-

1. Identificar células enriquecidas con LSC en el momento del diagnóstico en ^{el espacio} CD34⁺CD38- basándose en marcadores de LSC con expresión dicotómica y ausencia de expresión en células madre hematopoyéticas normales de la médula ósea sana.
2. Defina la puerta de entrada LSC como MNC34⁺ usando la siguiente secuencia de gating: celdas vivas, celdas individuales, MNC y CD34⁺ en el gráfico de puntos CD45/CD34.
3. Defina la fracción CD34⁺CD38^- (P6) usando un umbral riguroso basado en el nivel de fluorescencia menos uno (FMO) de CD38.
4. Defina las células enriquecidas con LSC en el Tubo 1 en la fracción P6 usando operadores booleanos de la siguiente manera: P6CD7⁺ O P6CD33⁺ O P6CD19⁺ O P6CD56⁺ Y NO limpias CD36^brillantes y células simples Y vivas Y MNC Y MNC CD34⁺.
5. Definamos las celdas enriquecidas con LSC en el Tubo 2 de la fracción P6 usando operadores booleanos de la siguiente manera: P6CD45RA⁺ O P6MIX⁺ O P6CD123⁺ Y NO limpias^{CD36 brillantes} y células individuales y vivas y mnc CD34⁺.
6. Utiliza CD36 para limpiar eventos no específicos en la compuerta final del MRD LSC (Figura 3).

7. Definición del umbral CD38^- en la población CD34⁺

1. Ajusta el canal CD38 lo suficientemente alto para distinguir las poblaciones CD38^- de las poblaciones CD38^+/ con buena resolución.
2. Defina P6 como CD34⁺CD38^-, P7 como CD34^{+CD38 bajo}, y P8 como CD34⁺CD38^alto.
3. Basar la configuración del canal CD38 en poblaciones de CD38-brillante, identificando las células plasmáticas como las más brillantes y los hematógonos según el rango de medición de cada plataforma.
4. Defina la población CD34⁺CD38^- (P6) utilizando el enfoque FMO CD38 validado por un control isoclónico CD38.
5. Defina la población^baja (P7) de CD34⁺CD38 usando el nivel negativo de hematógonos.
6. Defina la población^alta de CD34⁺CD38 (P8) utilizando el nivel de positividad de hematógonos y el nivel de células plasmáticas negativas (Figura 4).
7. Utilizar el mismo nivel umbral CD38^- en todo el grupo armonizado utilizando métodos robustos como CD38-FMO o control isoclónico CD38.
8. Utilizar al menos un inmunofenotipo aberrante en la fracción CD34⁺CD38^- para definir células enriquecidas con LSC. Incluye marcadores LSC como CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123 o marcadores de linaje como CD7/CD19/CD56/CD33.
9. Aplicar los siguientes umbrales: sensibilidad al ensayo LOQ ^10-4 y LOD ^10-5; La positividad de LSC al diagnóstico ≥ 1% de los blastos CD45/SSC; y la positividad de los LSC en el seguimiento de la MRD ≥ 0,01% de los glóbulos blancos.

8. Informe de flujo clínico armonizado

1. Proporciona la siguiente información con cada resultado: calidad de la médula ósea, estrategia utilizada para la identificación de MRD, descripción del LAIP, LOD y LOQ, umbrales e interpretación de los resultados.
2. Hemodilución y representatividad de la médula ósea
   1. Evalúa la hemodilución en cada informe clínico de flujo de MRD para evaluar la robustez del resultado.
   2. Utiliza uno de los métodos de hemodilución descritos anteriormente cuando sea aplicable (Tabla 4)^{7,14,15,16,17,18,19,20,21}.
   3. Como enfoque complementario, calcular la representatividad de la médula ósea utilizando la relación observada CD34/WBC45 en comparación con la proporción esperada observada en muestras de médula ósea de referencia (Figura 5).
   4. Utiliza la siguiente fórmula:
      P: porcentaje de pureza = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s: proporción de células MNC CD34⁺ en sangre periférica normal: 0,0005
      m: proporción de células de CD34⁺ de MNC en médula ósea normal: 0,035
      L: número de leucocitos WBC45⁺ en la muestra de pacientes con MRD
      n: número de células MNC CD34⁺ en la muestra de pacientes con MRD
   5. Informa de la representatividad de la médula ósea como evaluación de calidad de la muestra. No utilices este valor para normalizar los resultados de la MRD.
   6. Interpreta la representatividad de la médula ósea de la siguiente manera: 100% a 10%, baja influencia en la proporción de células CD34⁺ en la médula ósea; 10% a 1%, advertencia para la interpretación de los resultados de la MRD; y < 1%, resultado no interpretable.
3. Cuantificación de la LSC en el diagnóstico
   1. Informe el perfil utilizado para identificar células enriquecidas con LSC, por ejemplo, CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Informa los resultados de los LSC en el diagnóstico como el porcentaje observado de los blastos CD45/SSC.
   3. Utiliza LSC ≥ el 1% del total de blastos como umbral para un mal pronóstico.
4. Seguimiento de MRD por LAIP/DfN
   1. Informa del perfil LAIP utilizado para identificar MRD, por ejemplo, CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117⁺CD7⁺.
   2. Informa de la sensibilidad del análisis como el valor menos sensible entre el umbral técnico y el valor de robustez observado para el perfil LAIP en comparación con muestras de médula ósea de referencia.
   3. Utiliza un clúster mínimo de 50 celdas entre los eventos de WBC adquiridos como límite de cuantificación. Por ejemplo, con 500.000 celdas de leucocitos, el LOQ es del 0,01% (1 × ^10-4).
   4. Informa de los resultados de LAIP/DfN como positivos, negativos, detectables pero por debajo del umbral clínico o no detectables.
   5. Reporta la positividad de LAIP/DfN como ≥ 0,1%, expresada como el porcentaje total de leucocitos CD45⁺ .
   6. Reporta la negatividad de LAIP/DfN como < 0,1%.
   7. Para resultados detectables pero por debajo del umbral, informa del valor representativo y del umbral de sensibilidad.
   8. Para resultados no detectables, informa que el resultado es inferior al umbral de sensibilidad al análisis y añade un comentario si es necesario, como hemodilución, baja especificidad LAIP o umbral técnico insuficiente.
5. Seguimiento de la MRD por parte de LSC
   1. Informe el perfil utilizado para identificar células enriquecidas con LSC, por ejemplo, CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Utiliza un grupo mínimo de 20 celdas entre eventos de WBC adquiridos como límite de cuantificación. Por ejemplo, con 1.000.000 de células de leucocitos, el LOQ es del 0,002% (2 × ^10-5).
   3. Informa de los resultados de los CSL como positivos, negativos, detectables pero por debajo del umbral clínico o no detectables.
   4. Reporta la positividad de los LSC como ≥ 0,01%, expresada como el porcentaje total de leucocitos CD45⁺ .
   5. Reporta la negatividad de los LSC en < 0,01%.
   6. Para resultados detectables pero por debajo del umbral, informa del valor representativo y del umbral de sensibilidad.
   7. Para resultados no detectables, informa que el resultado es inferior al umbral de sensibilidad al análisis y añade un comentario si es necesario, como hemodilución, baja especificidad de LSC o umbral técnico insuficiente.
6. Integra la interpretación del flujo MRD con los puntos temporales de monitorización anteriores. Indicar la modulación del perfil fenotípico durante el tratamiento y la dinámica del flujo de MRD, incluyendo repositividad, aumento, estabilidad o disminución.
7. Envía los resultados al clínico y al investigador que lo solicitan utilizando el informe de flujo clínico según el plazo del laboratorio de flujo de referencia.
8. Resume el informe de flujo clínico armonizado utilizando los siguientes ítems: calidad de la médula ósea, estrategia de identificación de MRD, descripción del LAIP, LOD y LOQ, umbrales e interpretación como MRD positivo, MRD negativo con valor de LOD o MRD detectable pero no cuantificable.

Resultados

Espejado de plataforma

Para la comparación inicial de dos plataformas entre CANTO y NAVIOS, los ajustes de voltaje se ajustaron adquiriendo cuentas arcoíris de 8 picos no compensadas para alcanzar valores MFI objetivo predefinidos. Los valores objetivo de la plataforma CANTO de referencia se transpusieron a la segunda plataforma NAVIOS usando la siguiente conversión: nuevo objetivo MFI = objetivo MFI de referencia/256²². Para detectar sesgos entre plataformas, se analizaron en paralelo 10 muestras frescas de médula ósea regenerativa de EDTA. El índice de tinción entre poblaciones positivas y negativas se comparó entre muestras y plataformas y mostró una separación comparable (Archivo Suplementario-Figura S3).

Durante el estudio, las plataformas fueron actualizándose progresivamente de configuraciones de 8 y 10 colores a configuraciones LYRIC y DxFLEX de 12 y 13 colores (Archivo Suplementario 1). El espejo se extendió a lo largo de cuatro plataformas utilizando cuentas arcoíris de 8 picos y tuétano ósea teñido sano adquirido con el mismo panel. La superposición de picos se comprobó ajustando solo las escalas logarítmicas de representación. Tras aplicar los ajustes definidos, los patrones de tinción de las células se solaparon, siendo la principal diferencia la traslación de las nubes celulares a lo largo de las escalas logarítmicas (Figura 6 y Archivo Suplementario S4 y Figura S5).

Evaluación de calidad y reproducibilidad en laboratorios de flujo

Tras la implementación del procedimiento operativo estándar inicial y sus actualizaciones durante las actualizaciones de plataforma, se realizó regularmente una evaluación externa de calidad (EQA) húmeda utilizando muestras de médula ósea de referencia frescas compartidas entre los centros participantes. Se utilizó EQA húmedo para verificar el procedimiento de laboratorio húmedo, la configuración de la plataforma y la estrategia común de análisis de compuertas. Las poblaciones reportadas incluyeron células MNC CD34⁺ en el denominador WBC CD45⁺ y células P6 CD34⁺CD38⁻ en el denominador WBC CD45⁺ . Los resultados se analizaron mediante puntuación z y/o representación gráfica (Figura 7).

Se han realizado cinco rondas de EQA húmeda desde 2017, con la participación de 22, 15, 17, 26 y 25 laboratorios, respectivamente. Para las células %CD34⁺CD38⁻ en glóbulos blancos CD45⁺ y %MNC CD34⁺ en los leucocitos CD45⁺, los resultados fueron los siguientes: EQA1, valores medios 0,015% y 1,01% (DE 0,09% y 0,24%); EQA2, 0,09% y 1,02% (DE 0,046% y 0,36%); EQA3, 0,097% y 1,46% (DE 0,024% y 0,32%); EQA4, 0,024% y 2,16% (DE 0,015% y 0,59%); y EQA5, 0,027% y 1,9% (DE 0,008% y 0,45%).

Para abordar la estandarización de la estrategia de análisis de MRD en diferentes centros, la EQA húmeda se complementó con la EQA seca utilizando archivos FCS compartidos para el diagnóstico, seguimiento de la MRD y médula ósea de referencia. Más del 90% de los datos analizados localmente se incluyeron dentro del intervalo centralizado basado en la media de la serie ± 2 de la DE: 95,6% y 91,3% para DryEQA2017, con 22 de los 23 laboratorios participantes, y 100% para DryEQA2024, con 24 de los 25 laboratorios participantes (Figura 8). Se realizaron dos rondas de EQA en seco para el %MRD LAIP en glóbulos blancos CD45⁺ y %MRD LSC CD34⁺CD38⁻ en leucocitos CD45⁺. DryEQA2017 mostró un valor medio de LAIP del 11,9% (DE 1,35%) y un valor medio de LSC del 0,16% (DE 0,05%). DryEQA2024 mostró un valor medio de MRD LAIP del 0,35% (DE 0,26%) y un valor medio de MRD de LSC CD34⁺CD38⁻ de 0,18% (DE 0,06%).

Ejemplo de medición de caudales multimodales de MRD AML utilizando estrategias LAIP/DfN y LSC

Para cuantificar la MRD, se utilizaron sistemáticamente tres enfoques. El primer enfoque estableció la cartografía LAIP de blastos leucémicos al diagnóstico utilizando compuertas booleanas, y esta cartografía se aplicó a muestras de médula ósea de seguimiento (Figura 9A). El segundo enfoque utilizó el análisis DfN para identificar células anormales con patrones de expresión atípicos que no se observan en áreas de "caja vacía" definidas a partir de diferenciación mieloide normal (Figura 9B). El tercer enfoque cuantificó células enriquecidas con LSC en la fracción CD34⁺CD38⁻ utilizando marcadores dicotómicos de LSC y gating booleano (Figura 10).

Muestras de médula ósea de referencia

Se estudiaron un total de 135 muestras de médula ósea de referencia, incluyendo 25 muestras de médula ósea de donante sana, 34 muestras inflamatorias de médula ósea y 76 muestras de médula ósea regeneradora. La médula ósea de donante sana se obtuvo de donantes sanos, con una edad media de 31 años y un rango de 21 a 49 años. Se obtuvo médula ósea inflamatoria de pacientes derivados a citopenia, incluyendo anemia, neutropenia o trombopenia, sin que los aspirados de médula ósea no mostraran malignidad hematológica; La edad mediana era de 52 años, con un rango de 25 a 82 años. La regeneración de médula ósea se obtuvo durante el seguimiento de LMA en diferentes momentos de quimioterapia, incluyendo tras inducción o consolidación, con negatividad de la evaluación molecular de MRD para transcritos NPM1 o CBF; La edad mediana era de 54 años, con un rango de 18 a 65 años.

La calidad de estas muestras fue validada mediante un examen microscópico. El porcentaje teórico esperado de células CD34⁺ en muestras de médula ósea sin diluir también se calculó utilizando la fórmula de Brooimans, con resultados >90% para todas las muestras. Estas muestras se utilizaron para establecer umbrales para el análisis LAIP/DfN y LSC y para calcular la fórmula de hemodilución y pureza. Se estudió la variación de la expresión de marcadores en la MFI según el estado de médula ósea en muestras sanas de donante, inflamatorias y en regeneración de médula ósea (Archivo Suplementario-Figura S6). Se determinaron valores de referencia para los parámetros más relevantes, incluyendo %MNC CD34⁺ de WBC, %P6 CD34⁺CD38⁻ en MNC CD34⁺, %P7 CD34⁺CD38^dim en MNC CD34⁺, y %P8 CD34^{+CD38 alto} en MNC CD34⁺ (Fichero suplementario S6).

Evaluación de sensibilidad y linealidad

La sensibilidad se evaluó para compuertas específicas de LAIP/DfN y LSC midiendo el número de eventos anormales en un conjunto de muestras de médula ósea de referencia, incluyendo médula ósea regeneradora, inflamatoria y sana de donante. Se utilizó la dilución en serie de un número conocido de blastos en médula ósea sana para verificar el límite de cuantificación y la linealidad de la medición de MRD (Figura 11 y Figura 12).

Figura 1: Estrategia de gating para el análisis de LAIP MRD en LMA utilizando marcadores primitivos (CD34⁺/CD117⁺) en el Tubo 1. Primera fila: filtración secuencial del tiempo, celdas vivas basadas en FSC frente a SSC, células individuales basadas en FSC-W frente a FSC-H, células WBC CD45⁺ en CD45 frente a SSC, blasts en^{CD45 dim}/SSC, células mononucleares (MNC) en FSC-A/SSC-A, MNC CD34⁺ en el gráfico CD45 frente a CD34, y la puerta marcadora primitiva en el gráfico CD34 frente a CD117. Segunda y tercera filas: gráficos de puntos biparamétricos fijos usados para definir las compuertas LAIP más relevantes (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP se definió usando la siguiente estrategia booleana: tiempo Y celdas vivas Y células individuales Y (blastos OR MNC CD34⁺) Y marcadores primitivos (CD34^+/−CD117^+/−) Y LAIP1 Y LAIP2 Y LAIP3 Y LAIP4 Y LAIP5 Y LAIP6 Y LAIP7 Y LAIP8. En el caso ilustrado, la MRD representó el 6,8% de los glóbulos blancos CD45⁺, frente al 0,04% ± 0,03 en médula ósea sana. Derecha: back-gate de la compuerta MRD final usada para cuantificación, permitiendo la limpieza de eventos inespecíficos, eritróblastos y restos. Abreviaturas: LMA = leucemia mieloide aguda; MRD = enfermedad residual medible; LAIP = inmunofenotipo asociado a leucemia; FSC = dispersión directa; SSC = dispersión lateral; WBC = glóbulos blancos; MNC = células mononucleares; hBM = médula ósea sana. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Estrategia de gating para el análisis de LAIP de MRD en LMA utilizando blastos maduros (CD34⁻CD117⁻) en el Tubo 3. Primera fila: gâmina secuencial del tiempo, celdas vivas basadas en FSC frente a SSC, células individuales basadas en FSC-W frente a FSC-H, células de blancos blancos CD45⁺ en CD45 frente a SSC, blasts en^{CD45 dim}/SSC, células mononucleares (MNC) en FSC-A/SSC-A, celdas mnc CD34⁺ en el gráfico CD45 frente a CD34, y la compuerta de explosión madura en el gráfico CD34 versus CD117.
Segunda y tercera filas: gráficos de puntos biparamétricos fijos usados para definir las compuertas LAIP más relevantes (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP se definió usando la siguiente estrategia booleana: tiempo y células vivas y células individuales y blastos y blastos CD34⁻CD117⁻ BLASTOS Y LAIP1 Y LAIP2 Y LAIP3 Y LAIP4 Y LAIP5 Y LAIP6 Y LAIP7 Y LAIP8. En el caso ilustrado, la MRD representó el 15% de los glóbulos blancos CD45⁺, en comparación con el 0,09% ± 0,02 en médula ósea sana.
Derecha: back-gating de la puerta MRD final utilizada para cuantificación, permitiendo la limpieza de eventos inespecíficos. Abreviaturas: LMA = leucemia mieloide aguda; MRD = enfermedad residual medible; LAIP = inmunofenotipo asociado a leucemia; FSC = dispersión directa; SSC = dispersión lateral; WBC = glóbulos blancos; MNC = células mononucleares; hBM = médula ósea sana. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Estrategia de acceso para células madre hematopoyéticas normales (nHSC) y células enriquecidas con células madre leucémicas (LSC) en la fracción CD34⁺CD38⁻ (Tubo 2). (A) Células madre hematopoyéticas normales (nHSCs) y (B) células enriquecidas con células madre leucémicas (LSC) en la fracción CD34⁺CD38⁻ (Tubo 2). Primera fila: bloqueo secuencial del tiempo, células vivas basadas en FSC frente a SSC, células individuales basadas en FSC-W frente a FSC-H, células de blancos blancos CD45⁺ en CD45 frente a SSC, blastos en CD45dim/SSC, células mononucleares (MNC) en FSC-A/SSC-A y células MNC CD34⁺ en el gráfico CD45 frente a CD34.
De la segunda a la cuarta fila: gráficos de puntos biparamétricos fijos usados para definir P6 (CD34⁺CD38⁻), P7 (CD34⁺CD38^bajo) y P8 (CD34⁺CD38^alto), junto con los marcadores dicotómicos de LSC más relevantes, incluyendo MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123 y CD45RA. MRD LSC se definió usando la siguiente estrategia booleana: tiempo Y celdas vivas y células individuales y blasts Y MNC Y MNC CD34+ Y P6 Y (P6 LSC MIX⁺ O P6 LSC CD123⁺ O P6 LSC CD45RA⁺).
Derecha: back-gating de la compuerta final del MRD LSC utilizada para cuantificación, permitiendo la limpieza de eventos inespecíficos.
(A) nHSCs en una muestra sana de médula ósea: los nHSCs (eventos púrpura) fueron CD34⁺CD38⁻, MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ y CD90⁺. La fracción de nHSC CD34⁺CD38⁻ representó el 0,02% de los glóbulos blancos CD45⁺, y las células LSC CD34⁺CD38⁻ fueron negativas. Los umbrales reportados para el ensayo fueron LOQ 0,0001% y LOD 0,001%.
(B) Células enriquecidas con LSC en una muestra de LMA: Las células enriquecidas con LSC (eventos naranjas) fueron CD34⁺CD38⁻, MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ y CD90⁺. La fracción LSC CD34⁺CD38⁻ representó el 3,7% del ^CD45+ de los WBC. Abreviaturas: nHSCs = células madre hematopoyéticas normales; LSC = célula madre leucémica; MNC = células mononucleares; WBC = glóbulos blancos; SSC = dispersión lateral; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = antígeno leucocitario humano-DR; LOQ = límite de cuantificación; LOD = límite de detección. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Definición del umbral CD38⁻ en la población CD34⁺ utilizando el canal de fluorescencia menos uno (FMO) CD38. Primera fila: acceso de poblaciones de referencia, incluyendo blastos en CD45/SSC, células MNC CD19⁺ y células MNC CD34⁺ .
Segunda fila: nivel de señal en el canal FMO CD38. La primera línea muestra las células de blast, la segunda muestra las celdas MNC CD19⁺ y la tercera muestra las celdas MNC CD34⁺ . La línea naranja indica el umbral que define la compuerta P6 CD34⁺CD38⁻ .
Tercera fila: nivel de señal CD38 PE-Cy7. La primera línea muestra células blasticas, la segunda muestra células MNC CD19⁺ con el nivel de hematógono CD38 usado para definir P8 CD34^{+CD38 alto}, y la tercera línea muestra células MNC CD34⁺, con células P6 CD34⁺CD38⁻ en naranja, P7 CD34⁺CD38^en verde y P8 CD34^{+CD38 alto} Celdas en azul. Abreviaturas: FMO = fluorescencia menos uno; MNC = células mononucleares; SSC = dispersión lateral; PE-Cy7 = ficoeritrina-cianena 7; P6 = fracción CD34+CD38−; P7 = CD34+CD38 fracción baja; P8 = CD34+CD38 fracción alta. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Evaluación de la representatividad de la muestra de médula ósea basada en células MNC CD34⁺ . (A) Estrategia de gating para las células MNC CD34⁺ y parámetros utilizados para el cálculo de fórmulas: n, número de células MNC CD34⁺ ; L, número ^{de células} CD45+ de los leucocitos; s, proporción de células MNC CD34⁺ en sangre periférica normal; y m., proporción de células MNC CD34⁺ observadas en la médula ósea normal de referencia. (B) Representación esquemática del impacto de la dilución de la médula ósea (BM) por sangre periférica (PB) sobre el origen de las células CD34⁺ en muestras de BM. (C) Criterios utilizados para interpretar la pureza de la BM. Abreviaturas: BM = médula ósea; PB = sangre periférica; MNC = células mononucleares; WBC = glóbulos blancos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Comparación de patrones de expresión entre cuatro plataformas de citómetros de flujo.
Se probó simultáneamente una muestra de médula ósea (BM) normal en cuatro plataformas de citómetro utilizando los ajustes definidos para cada plataforma y ajuste de escala. La primera fila muestra las celdas MNC en el gráfico de puntos CD45/CD33; la segunda fila muestra las celdas MNC en el marcador primitivo CD34/CD117 de puntos gráfico; la tercera fila muestra las células de blast en el gráfico de puntos CD34/CD38; y la cuarta fila muestra las celdas P6 CD34⁺CD38⁻ en el gráfico de puntos CD45RA/CD90. Abreviaturas: BM = médula ósea; MNC = células mononucleares; P6 = fracción CD34⁺CD38⁻ . Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Reproducibilidad de EQA en laboratorio húmedo entre los laboratorios de flujo participantes. (A) Gráfico de violín que muestra la distribución de las células %P6 CD34⁺CD38⁻ en celdas de glóbulos blancos CD45⁺ entre las cinco rondas de EQA de laboratorio húmedo y los laboratorios de flujo participantes. (B) Gráfico de violín que muestra la distribución de las celdas %MNC CD34^{+ en las células} de CD45+ de WBC a lo largo de las cinco rondas de EQA de laboratorio húmedo y los laboratorios de flujo participantes. Abreviaturas: EQA = evaluación externa de calidad; P6 = fracción CD34+CD38−; WBC = glóbulos blancos; MNC = células mononucleares. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: Evaluación de EQA en seco de la medición de LAIP/DfN y MRD de LSC. (A) Ejercicio de EQA2017 seco para la medición de MRD de LAIP/DfN y LSC utilizando seis archivos FCS compartidos de un grupo de panel de 8 colores, incluyendo diagnóstico de LMA, DMM de LMA y archivos de referencia de médula ósea normales para análisis de LAIP del tubo 1 y LSC del tubo 2. El ejercicio se compartió con 23 laboratorios participantes. (B) Ejercicio de EQA2024 en seco para la medición de LAIP/DfN y LSC MRD utilizando seis archivos FCS compartidos de un panel de 12 colores, incluyendo diagnóstico de LMA, DMM de LMA y archivos de referencia de médula ósea normal para el análisis del LAIP del tubo 1 y del LSC del tubo 2. El ejercicio se compartió con 24 laboratorios participantes. (C) Comparación interplataforma de celdas %MNC CD34⁺ y %nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ en células de blancos blancos CD45⁺ medida durante EQA2025 húmeda, compartida con 25 laboratorios participantes. Los valores esperados fueron del 1,6% para las células MNC CD34⁺ y del 0,02% para las células nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ . Abreviaturas: EQA = evaluación externa de calidad; LAIP = inmunofenotipo asociado a leucemia; DfN = diferente de lo normal; LSC = célula madre leucémica; MRD = enfermedad residual medible; FCS = estándar de citometría de flujo; LMA = leucemia mieloide aguda; MNC = células mononucleares; nHSC = célula madre hematopoyética normal; WBC = glóbulos blancos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 9: Medición representativa de MRD usando enfoques LAIP/DfN. (A) Ejemplo de medición MRD usando el método LAIP/DfN. El lado izquierdo muestra la cartografía LAIP de células leucémicas en la muestra de diagnóstico, y el lado derecho muestra la aplicación de la misma cartografía LAIP a la muestra de seguimiento, con la población de MRD mostrada en negro. (B) Ejemplo de medición de MRD usando el método DfN. Cada par de gráficos de puntos compara médula ósea sana (hBM; normal, gráfico izquierdo) con una muestra de seguimiento de médula ósea MRD (DfN, gráfico derecho). El área de la "caja vacía" se define en la médula ósea normal, y la presencia de células leucémicas en esta caja vacía se evalúa en la muestra de seguimiento, mostrando la población anormal en negro. Abreviaturas: MRD = enfermedad residual medible; LAIP = inmunofenotipo asociado a leucemia; DfN = diferente de lo normal; hBM = médula ósea sana. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 10: Medición representativa de células enriquecidas con LSC CD34⁺CD38⁻ en el diagnóstico y seguimiento. (A) Ejemplo de medición celular enriquecida con LSC en una muestra de diagnóstico de LMA. El lado izquierdo muestra el perfil enriquecido con LSC, con la población naranja expresando MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR y CD36 dentro de la fracción CD34⁺CD38⁻ .
(B) Muestra de seguimiento del mismo paciente que muestre persistencia de células enriquecidas con MRD LSC con el mismo perfil inmunofenotípico (población naranja). Abreviaturas: LSC = célula madre leucémica; LMA = leucemia mieloide aguda; MRD = enfermedad residual medible; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = antígeno leucocitario humano-DR. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 11: Sensibilidad analítica de la detección de CSL. (A) Evaluación del límite de vacío (LOB) para la detección de CSL. El lado izquierdo muestra la cuantificación de eventos CD34⁺CD38⁻ en una fusión de cinco archivos FCS de cinco muestras sanas de médula ósea (5.148.000 eventos de WBC adquiridos). El lado derecho muestra el número de eventos pertenecientes a la compuerta booleana LSC back-gate en el gráfico de puntos CD45/SSC (14 eventos), correspondiente a un LOB de <0,0005% (5 × ^10-6). (B) Evaluación de la linealidad para la cuantificación de las CSL. El lado izquierdo muestra dilución en serie por spik-in de células enriquecidas con LSC en una muestra sana de médula ósea. El lado derecho muestra la correlación entre los valores de MRD medidos y los valores teóricos, correspondiente a un límite de cuantificación (LOQ) de 2 × ^10-5 (0,002%). Abreviaturas: LSC = célula madre leucémica; LOB = límite de espacio en blanco; FCS = estándar de citometría de flujo; WBC = glóbulos blancos; MRD = enfermedad residual medible; LOQ = límite de cuantificación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 12: Linealidad y rango de cuantificación de la medición de LAIP de MRD. (A) Evaluación de la linealidad para la cuantificación de LAIP de MRD mediante dilución en serie de blastos con diferentes LAIPs en médula ósea sana, mostrando la correlación entre los valores de MRD medidos y los valores teóricos, con LOQ variable según los diferentes LAIPs y LOQ <0,1%. (B) Rango de cuantificación según diferentes LAIPs. La línea roja indica el umbral clínico del 0,1%. El LOQ alcanzó el umbral clínico para todos los LAIPs probados. Abreviaturas: MRD = enfermedad residual medible; LAIP = inmunofenotipo asociado a leucemia; LOQ = límite de cuantificación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Fluoro Chrome	Pico	LYRIC12c	Pico	DxFlex13c	Pico	NAVIOS10c	Pico	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
Educación Física	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

Tabla 1: Valores objetivo para cada plataforma usando cuentas arcoíris de 8 picos. Se muestran valores objetivo específicos para cada plataforma de citómetros (Canto, Lyric, Navios, DxFlex). Los picos retenidos se eligieron para estar cerca del MFI observado en las células blastográficas. Esto es especialmente importante para los citómetros basados en PMT, donde la intensidad de la señal no aumenta linealmente con el aumento del voltaje PMT. En cambio, en los citómetros basados en APD, la intensidad de la señal aumenta linealmente con la ganancia, permitiendo que se utilice el mismo pico para todos los detectores, mientras que en los citómetros basados en PMT se requieren picos diferentes para cada canal. Abreviaturas: MFI = intensidad mediana de fluorescencia; PMT = tubo fotomultiplicador; APD = fotodiodo de avalancha. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

CANTO 8C /NAVIOS 8c

FITC

Educación Física

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tubo 1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

Tubo 2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2 0,5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Flexible Mentaire Gran 8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supplem entaire - Monos 8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

LYRIC 10-12c

FITC

Educación Física

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tubo 1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

Tubo 2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

T3 Flexible Mentaire 12c-Monos

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

Educación Física

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2 Navios 10c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Flexible Mentaire 10c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13c

FITC

Educación Física

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13C

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13C

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR SNV786 (3μL)

T3 Flexible Mentaire 12c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

Tabla 2: Configuraciones de paneles de anticuerpos para análisis de LML, MRD, LAIP/DfN y LSC. La tabla resume configuraciones de paneles de 8, 10, 12 y 13 colores según la plataforma de citómetros. El tubo 1 se utiliza para el análisis LAIP/DfN, el tubo 2 para análisis celular enriquecido con LSC CD34⁺CD38⁻ , y el tubo 3 para marcadores de diferenciación monocítica/granulocítica. Se muestran los volúmenes de anticuerpos y las asignaciones de fluorocromo para cada plataforma. MIX3 corresponde a CD97, TIM3 y CLL1. Abreviaturas: LMA = leucemia mieloide aguda; MRD = enfermedad residual medible; LAIP = inmunofenotipo asociado a leucemia; DfN = diferente de lo normal; LSC = célula madre leucémica; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Pérdida total de marcadores normalmente expresados en precursores mieloides

CD13++CD33-/CD34+ o CD117+

CD13-CD33++/CD34+ o CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

Expresión cruzada de marcadores linfoides en precursores mieloides

CD7+CD13+/CD34+ o CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ o CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ o CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ o CD117+

CD19+CD117+/ o CD13+ o CD33+

Sobreexpresión en precursores mieloides

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

Disminución de la expresión en precursores mieloides

CD38loCD34+CD33+CD117+

Tabla 3: Definiciones de "caja vacía" basadas en LAIP sobre DfN. La tabla enumera patrones predefinidos de "caja vacía" diferentes de los normales (DfN) utilizados para identificar poblaciones anormales de precursores mieloides. Las categorías incluyen la pérdida total de marcadores normalmente expresados, la expresión de marcadores linfoides entre líneas, la sobreexpresión de marcadores y la disminución de la expresión de marcadores en precursores mieloides. Abreviaturas: LAIP = inmunofenotipo asociado a leucemia; DfN = diferente de lo normal. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Holdrinet et al.17
Broolmans et al.15
Pureza de médula ósea = (1 − (GRMO/GR SG) x (GBSG/GB MO)) x 100	>80%
Björlund et al.19	GPA > 15%
	CD3 < 20%
Loken et al.18	CD16alto < 30%
Theunissen et al.20; Dworzak et al.21
Flujo o Ctr DIL citológico: PNN < 40%, Ebl > 5%, Ly < 20%	CD16++ CD11b++ < 40%
	GPA > 5%
	CD3 < 20%
Porcentaje de pureza de BM: MNC 34+/WBC45+	Pureza del BM 100-10%

Tabla 4: Métodos de control de dilución de médula ósea para la notificación de flujo de MRD de LMA. La tabla resume los métodos publicados de dilución y control de representatividad de la médula ósea que pueden utilizarse para informes clínicos de flujo de DMM de LMA. Al menos un método de control por dilución debe aplicarse para apoyar la interpretación de los resultados de la MRD. El enfoque de pureza de la médula ósea CD34/WBC45⁺ se incluye como evaluación complementaria de calidad. Abreviaturas: LMA = leucemia mieloide aguda; MRD = enfermedad residual medible; BM = médula ósea; WBC = glóbulos blancos; CD34/WBC45⁺ = células CD34⁺ entre glóbulos blancos CD45⁺ . Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo suplementario 1: Antecedentes adicionales, armonización de plataformas, referencia de médula ósea y materiales de apoyo pronóstico. Este archivo suplementario contiene figuras y tablas de apoyo relacionadas con la identificación de CSL, heterogeneidad fenotípica de LMA, espejamiento interplataforma, optimización específica de la plataforma, perfiles de expresión de marcadores de médula ósea de referencia, evolución de panel longitudinal y el umbral pronóstico utilizado para la cuantificación de CSL en el momento del diagnóstico. Estos materiales proporcionan contexto adicional para el flujo de trabajo multicéntrico de citometría de flujo MRD, incluyendo la justificación para la evaluación celular enriquecida con LSC CD34⁺CD38⁻ , la base técnica para la armonización de plataformas y datos de apoyo utilizados para interpretar el fondo de médula de referencia, la migración de paneles y la selección de umbrales clínicos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Pasos críticos del protocolo

La calidad de la muestra es crucial para una cuantificación precisa de MRD y LSC. Las muestras frescas de médula ósea deben transportarse a temperatura ambiente y procesarse idealmente en un plazo de 24–48 horas y, si es necesario, en un plazo de 72 horas tras la^{recogida 23}. La hemodilución debe evaluarse en cada momento e incluirse en el informe clínico de flujo. El clínico debe especificar el momento del tratamiento, por ejemplo, tras inducción, consolidación, inmunoterapia dirigida, tratamientos menos intensivos como azacitidina/venetoclax o aloinjerto. El panorama de diferenciación está estrechamente relacionado con el tratamiento y el momento de tiempo, y es importante integrarlo en la interpretación de la MRD. Durante el seguimiento longitudinal, la misma sensibilidad del instrumento y fiabilidad del análisis debe mantenerse mediante comprobaciones regulares de los valores objetivo con perlas de control arcoíris, EQA regular y revisión colegiada de los archivos FCS a lo largo del estudio.

Se mantiene un alto nivel de estandarización y fiabilidad intercéntrica de la cuantificación de flujo de MRD mediante formación educativa online regular en el grupo de flujos. Se realizó al menos una sesión de formación web al mes, y durante estos años se discutieron y revisaron más de 100 casos de cuantificación de MRD LAIP/DfN, MRD LSC o LSC diagnóstico. Esta formación continua es importante porque interpretar datos de flujo requiere un biólogo altamente cualificado, especialmente para MRD de bajo nivel, poblaciones de fondo fisiológico, médula regenerante y cambios fenotípicos bajo tratamiento.

La cuantificación de poblaciones enriquecidas con LSC CD34⁺CD38⁻ es otro paso crítico. No existe un marcador universal que capture células madre hematopoyéticas normales o CSL. El grupo HOVON introdujo la monitorización de los LSC en el diagnóstico y seguimiento de LMA mediante un panel de 8 colores que incluye un conjunto de marcadores "dicotómicos" relevantes^{de LSC 3}. Los marcadores dicotómicos se definen como que no muestran expresión en células madre hematopoyéticas normales, pero sí expresión positiva en poblaciones enriquecidas con LSC, con patrones tenues, intermedios, altos, heterogéneos o bimodales. Existe interés en incluir una mezcla de marcadores dicotómicos específicos de LSC, como CLL1, TIM3 y CD97, en un solo canal, porque si solo uno es positivo, aún se pueden detectar células enriquecidas con LSC. Otros marcadores deben usarse por separado en canales específicos porque su expresión puede solaparse con la de células madre hematopoyéticas normales, dependiendo del estado de la médula ósea, incluyendo la médula²⁴ regenerada o estresada. La definición completa de células enriquecidas con LSC se basa en operadores booleanos, incluyendo la expresión aberrante de marcadores en la fracción CD34⁺CD38⁻ . Dado que esta sigue siendo una definición fenotípica, la población debe interpretarse como células enriquecidas con LSC CD34⁺CD38⁻ en lugar de como CSL funcionalmente demostradas en cada muestra. Este panel LSC también es aplicable en pacientes con MDS con exceso de blastocistos y AML MRC usando el mismo protocolo.

Modificaciones y resolución de problemas del método

Durante la evolución de plataformas y paneles, el enfoque de estandarización/armonización debe mantenerse dentro de la red de laboratorios, especialmente al pasar de paneles de 8 a 10 colores a paneles de 12 a 13 colores. Con la evolución de las máquinas, es necesario mantener una columna vertebral común de anticuerpos y la misma sensibilidad en la detección de anomalías fenotípicas a lo largo del estudio clínico. Durante la evolución de la plataforma, los fluorocromos de los anticuerpos en la columna principal permanecen estables y comunes en todas las máquinas (CD34/CD38/CD45/CD117). Sin embargo, para algunos canales, es necesario cambiar los fluorocromos debido al banco óptico específico de la máquina, lo que requiere un enfoque de armonización. Al cambiar de un citómetro detector PMT a un citómetro detector APD, debe considerarse la alta sensibilidad de los detectores APD a longitudes de onda altas. Por lo tanto, en algunos casos, la elección de fluorocromos para ciertos anticuerpos debe ajustarse para mantener el mismo índice de tinción y evitar una dispersión excesiva entre canales, adoptando así un enfoque de optimización. Los citómetros clínicos actuales soportan paneles de 12 a 13 colores, aumentando la especificidad en la detección de LAIP y mejorando la interpretación mediante la adición de marcadores que eliminan las células contaminantes en la compuerta MRD. Sin embargo, esto también aumenta la complejidad del^{análisis 23}.

La mejora de paneles de 8 colores a 12 colores mejoró la sensibilidad y especificidad de la evaluación de MRD en algunos casos (Archivo Suplementario 1). En el Tubo 1 se añadieron HLA-DR, CD36, CD10 y CD56, separados del CD7. En el Tubo 2 se añadieron HLA-DR, CD36, CD200 y CD19. En el Tubo 3 se añadieron CD4, CD64, CD38, CD36 y CD14. HLA-DR, ahora combinado sistemáticamente con CD38 en cada tubo, proporciona una definición más clara de LAIP y patrones de diferenciación alterados. CD36, ahora incluido sistemáticamente en cada tubo, es un marcador clave para identificar eritroblastos, glóbulos rojos, plaquetas y residuos, y para refinar la compuerta final del MRD. El CD19 en la sonda LSC también ayuda a identificar los hematomónos. Combinar marcadores de diferenciación de monocitos y granulocitos en un solo tubo permite una mejor delimitación de patrones de diferenciación monocítica y granulocítica y ayuda a distinguir aberraciones para identificar LAIP. Al pasar de paneles de 8 colores a 10 colores, la principal mejora vino de la detección LAIP, especialmente con la adición de HLA-DR y CD56 separados de CD7 en el Tubo 1 y HLA-DR y CD19 en el Tubo 2. Al pasar de paneles de 10 colores a 12 colores, la mejora se debió a una mejor limpieza de las compuertas de chorro y LSC con la adición del CD36 en cada tubo, completado por el CD10 en el Tubo 1 y el CD200 en el Tubo 2. Esto fue especialmente útil para pacientes con MRD de bajo nivel por encima del límite de detección pero por debajo del límite de cuantificación. En conjunto, la mayoría de los pacientes con positividad de MRD en el umbral clínico ≥ 0,1% ya estaban identificados con el panel de 8 colores; sin embargo, el uso de más marcadores en los tubos mejoró la especificidad e interpretación de la evaluación de la MRD, especialmente para MRD de bajo nivel, como se menciona en las directrices ELN 2025.

Limitaciones del método

Elegir un enfoque multicéntrico puede ser un reto. La viabilidad de este concepto requiere pasos obligatorios antes de implementar el flujo de MRD en ensayos clínicos de LMA: armonización de la sensibilidad del instrumento y preparación de muestras, y formación y educación sistemática para operadores^{analíticos 25}. A medida que las plataformas evolucionan, la estrategia multicentrada y multiplataforma debe adaptarse para mantener la robustez y reproducibilidad de los resultados. Esto incluye la estandarización, el uso del mismo panel y ajustes para el mismo tipo de plataforma; armonización, usando el mismo panel en múltiples plataformas con configuraciones armonizadas; y optimización, utilizando un panel y ajustes específicos adaptados a cada plataforma.

La hemodilución es uno de los puntos más desafiantes y críticos para la cuantificación de flujos de MRD. La fórmula de representatividad CD34/WBC descrita en este protocolo debe utilizarse como medida complementaria de control de calidad para la muestra de médula ósea y no debe emplearse para normalizar los resultados de la MRD. Su interpretación puede verse afectada por la regeneración de la médula, los efectos del tratamiento, la enfermedad residual y regímenes menos intensivos. De manera similar, marcadores como CD56, CD123 y CD45RA no deben interpretarse como marcadores independientes de DfN o LSC. Deben interpretarse dentro de la estrategia completa de acceso, compuertas de limpieza, antecedentes de referencia de médula ósea y contexto clínico.

Importancia del método respecto a métodos existentes o alternativos

Según las directrices ELN 2025, la MRD es un marcador pronóstico importante en pacientes con LMA, independientemente de la técnica o el momento de la evaluación. El uso de diferentes técnicas y marcadores de flujo MRD es altamente complementario. El MRD multimodal, incluyendo análisis LAIP/DfN y LSC, es útil siempre que el análisis se realice dentro de una red estandarizada con informes armonizados de resultados. La evaluación de la MRD permite una mejor definición de la respuesta terapéutica y la recaída. El flujo multicéntrico y multimodal de MRD, junto con la MRD molecular, desempeñará un papel estratégico en futuros ensayos clínicos dentro de un entorno terapéutico cada vez más complejo que incluye nuevas terapias dirigidas, tratamientos de primera y segunda línea, trasplantes alogénicos y terapias de baja intensidad.

Importancia y posibles aplicaciones del método en áreas de investigación específicas

Los grupos HOVON y ALFA informaron que la cuantificación de poblaciones enriquecidas con LSC CD34⁺CD38⁻ en el diagnóstico de LMA tiene un impacto clínico (Archivo Suplementario 1). Parece crucial definir umbrales clínicamente significativos para las CSL basándose en el método de cuantificación. Como se informó previamente utilizando el método descrito aquí, un umbral de LSC del ≥1% se asoció con un resultado desfavorable (Archivo Suplementario 1)²⁶. En el manejo de la LMA, la integración diferencial de la MRD, el seguimiento de los LSC y la hematopoyesis clonal pueden ayudar a refinar la interpretación terapéutica. El principal desafío radica en distinguir la MRD, que puede requerir tratamiento adicional, de los clones estables preleucémicos, que pueden no^{ser 27}. Recientemente se recomendó un sistema integrado de reporte para calcular el porcentaje de blastochistos para el seguimiento de LMA en las directrices EHA/ELN 2025²⁸. Integra los resultados de la MRD con la comparación morfológica para una evaluación armonizada de los blastos y debería facilitar la presentación consistente en ensayos clínicos para definir las categorías de respuesta en pacientes con LMA.

Tanto el estudio HOVON como el estudio ALFA/FILO BIG1 muestran que una puntuación que combina los enfoques LAIP/DfN y LSC permitió clasificar a los pacientes en cuatro grupos: ^LAIP−/^LSC−, ^LAIP+/LSC⁻, ^LAIP−/^LSC+, y ^LAIP+/^LSC+, con diferentes tasas de supervivencia global^{a 3 años 3,26,29}. En conjunto, estos resultados ilustran el impacto clínico pronóstico de la combinación de MRD LAIP/DfN y el estado de LSC. En el contexto del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas, la presencia de células enriquecidas con LSC CD34⁺CD38⁻ también se ha reportado como predictor del fracaso post-trasplante, incluso cuando el número total de blastos es inferior al 5%³⁰. Estos datos clínicos respaldan la relevancia de estrategias combinadas de flujo MRD, pero el protocolo actual se centra en estandarizar el flujo de trabajo técnico y la elaboración de informes entre centros.

Desde perspectivas, la tecnología de flujo espectral puede ampliar el panel de marcadores probados simultáneamente en un enfoque de citometría de flujo multidimensional, aumentando así la especificidad de los LAIPs monitorizados y reduciendo el ruido biológico de fondo de la regeneración hematopoyética. La evaluación de la reproducibilidad del flujo espectral entre plataformas, paneles y centros, como se propone aquí, será un reto para su implementación clínica. Nuevos algoritmos de análisis no supervisados, incluyendo FlowSOM, t-SNE y UMAP, pueden facilitar la discriminación entre la hematopoyesia normal y el compartimento leucémico, desde la fracción enriquecida con LSC CD34⁺CD38⁻ hasta el volumen del blasto. Capturar fracciones de LSC de forma más profunda podría ayudar a mejorar el monitoreo del enjerto en modelos de xenoinjertos derivados de pacientes^31,32. Se han establecido grupos de trabajo ELN para validar y armonizar estos nuevos^{enfoques 33,34}.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500