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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
Este estudio combina un modelo de hipertensión ocular en rata con experimentos in vitro mecánicos de tensión, agonista/inhibidor y siRNA en fibroblastos esclerales humanos para mostrar que la expresión de Piezo1 está elevada durante la remodelación de la matriz extracelular escleral y está funcionalmente implicada en la diferenciación de miofibroblastos.
La diferenciación de miofibroblastos inducida por tensión mecánica es un mecanismo fundamental subyacente al remodelado de la matriz extracelular escleral (MEC) en el glaucoma. Sin embargo, la conversión de la tensión mecánica en señales bioquímicas dentro de los fibroblastos esclerales sigue siendo insuficientemente elucidada. Este estudio buscó investigar el papel de Piezo1 en la proliferación y diferenciación celular, en el contexto de la diferenciación de miofibroblastos inducida por tensión mecánica durante la remodelación de ECM escleral. El diseño del estudio combina observaciones de expresión in vivo de un modelo de hipertensión ocular en rata de una semana con ensayos mecanicistas in vitro utilizando estiramiento mecánico cíclico (10% a 0,5 Hz durante hasta 24 horas) y modulación farmacológica de Piezo1 (agonista Yoda1, inhibidor GsMTx4 y knockdown de siRNA) en fibroblastos esclerales humanos primarios (células HSF). Nuestros hallazgos demuestran que Piezo1 se expresa en tejido escleral y células HSF. En el grupo in vivo, se observó un aumento significativo en los niveles de proteína Piezo1 en la esclerótica de ratas hipertensas oculares tras una semana, lo que coincidió con una expresión elevada de colágeno tipo I (COL1) y actina α-liso-muscular (α-SMA). En los experimentos in vitro, el estiramiento mecánico (8–24 horas) aumentó la expresión de Piezo1 en células HSF. Además, la activación de Piezo1 con Yoda1 (24 h) facilitó la proliferación celular de HSF y mejoró la expresión de α-SMA y COL1. Por el contrario, la reducción o inhibición de Piezo1 suprimió la expresión de COL1 y dificultó la diferenciación de miofibroblastos bajo tensión mecánica. Además, la activación de Piezo1 llevó a una regulación alcista de la expresión de proteínas asociadas a sí (YAP), mientras que la expresión de YAP inducida por la tensión mecánica disminuía al ser eliminado o inhibido de Piezo1. En resumen, nuestros hallazgos sugieren que Piezo1 desempeña un papel en la expresión inducida por esfuerzo mecánico de componentes clave de la ECM en la esclerótica en el contexto del glaucoma y podría representar un posible objetivo terapéutico que requiere una validación in vivo adicional.
El glaucoma es una de las principales causas de ceguera irreversible caracterizada por la progresiva degeneración de las células ganglionares de la retina (RGC) y axones de la cabeza del nervio óptico (ONH), afectando a 76 millones de personas en todo el mundo en 2020. La presión intraocular elevada (PIO) es el mayor factor de riesgo para elglaucoma 3 y la reducción de la PIO es actualmente la única opción disponible para retrasar el desarrollo y progresión delglaucoma 4. La ONH, la estructura por donde los axones de la RGC salen del ojo, es el principal lugar de daño en el glaucoma. La elevación de la PIO induce tensión mecánica y desplazamiento en la ONH, lo que provoca la degeneración de los axones RGC dentro de la cribrosa laminar (LC), lo que finalmente conduce a la neuropatía ópticaglaucomatosa 5,6.
La esclerótica peripapilar (PPS) es el tejido principal portador de carga de la ONH, siendo las propiedades mecánicas de la PPS que determinan la respuesta de la ONH a la deformación mecánica inducida porla IOP 7,8. El modelado por elementos finitos y estudios ex vivo confirmaron que la deformación biomecánica del LC depende de la rigidez escleral, y que el aumento de la rigidez del PPS contribuye a una reducción de la deformación en el LC 9,10. Luego, la variación en la rigidez11,12 y el grosor13 de la PPS puede alterar las propiedades biomecánicas relacionadas con la PIO de la ONH, modificando aún más la susceptibilidad al daño del nervio ópticoglaucomato 14,15. En estudios biomecánicos, la rigidez ocular de la esclerótica glaucomatosa fue mayor que la normal en los ojos humanos postmortem 16,17, y el endurecimiento escleral peripapilar se ha observado de forma consistente tanto en glaucoma humano como en modelos animalesexperimentales 18,19,20. Estos datos sugieren que el endurecimiento de la esclerótica puede ser una respuesta protectora debido a la disminución de la deformación de ONH inducida por la PIO durante el glaucoma.
Las características biomecánicas del tejido de la esclerótica son resultado de la composición de la matriz extracelular sintetizada por losfibroblastos 21. Evidencias recientes sugieren que la tensión mecánica derivada del aumento de la PIO es capaz de activar fibroblastos esclerales que residen en laesclerótica 22, promover la diferenciación demiofibroblastos 23 y provocar una remodelación de laECM 24,25. La transformación de miofibroblastos inducida por la tensión mecánica es un proceso clave durante la remodelación de la ECM escleral en el glaucoma, pero no está claro cómo se convierte la deformación mecánica en señales bioquímicas y respuestas celulares en fibroblastos esclerales.
Piezo1 es uno de los miembros de una nueva familia de canales mecanosensibles catiónicos no selectivos y distintos implicados en la fibrosis de varios órganos, incluyendo la piel cardíaca y pulmonar26,27. La tensión mecánica puede activar los canales celulares Piezo1, lo que conduce a un aumento de la entrada de Ca2+ 28, lo que genera una señalización dependiente del calcio para regular una variedad de actividades celulares, incluyendo la proliferación, motilidad y diferenciación de fibroblastos29,30. Estudios recientes revelaron que, bajo tensión mecánica, Piezo1 promueve procesos fibróticos cutáneos estimulando la proliferación, motilidad y diferenciación defibroblastos. Este estudio incluye dos componentes complementarios: un estudio descriptivo in vivo de la expresión de Piezo1 en un modelo de hipertensión ocular en rata, y un estudio mecanicista in vitro utilizando fibroblastos esclerales humanos primarios bajo tensión mecánica cíclica. Planteamos la hipótesis de que la cepa mecánica activa Piezo1, que promueve la diferenciación de miofibroblastos y la expresión de componentes ECM en fibroblastos esclerales, potencialmente mediante señalización YAP.
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Los machos de ratas Sprague-Dawley (8 semanas de edad) se obtuvieron del Centro Experimental de Animales del Hospital Infantil de la Universidad Fudan. Todas las ratas fueron improvisadas y alojadas bajo condiciones de SPF a 22±1 °C y un ciclo de 12 horas de día/noche. Todos los experimentos con animales cumplieron con la Declaración ARVO sobre el Uso de Animales en la Investigación Oftalmológica y Visual y fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional y el Comité de Ética del Hospital Infantil de la Universidad de Fudan (2022JS-EKYY-019). Los tejidos esclerales humanos utilizados para derivar fibroblastos esclerales humanos primarios se obtuvieron de la esclerótica donante conforme a las directrices institucionales, y todos los procedimientos relacionados fueron aprobados por el Comité de Revisión Institucional de la Universidad de Fudan (2024-YS-187).
Diseño experimental
El presente estudio empleó enfoques tanto in vivo como in vitro, conceptualmente conectados por la tensión mecánica, para examinar la contribución de Piezo1 a la remodelación de la ECM escleral. In vivo, utilizamos un modelo de hipertensión ocular en rata para examinar la expresión de Piezo1 bajo PIO elevada. In vitro, sometimos fibroblastos esclerales humanos primarios a estiramiento mecánico cíclico para modelar la tensión mecánica que experimenta la esclerótica en el glaucoma, y manipulamos la actividad de Piezo1 usando agonista farmacológico (Yoda1), inhibidor (GsMTx4) y knockdown de siRNA.
Modelo experimental de hipertensión ocular crónica (OHT)
Se utilizaron un total de 18 ratas SD machos. En cada rata, el ojo derecho recibió inyección de carbómero para inducir hipertensión ocular (OHT), siendo el ojo izquierdo contralateral el grupo de control (NT). Se realizaron tres réplicas biológicas independientes de todo el experimento, sumando un total de 18 ojos por grupo. La unidad experimental era el ojo individual. Los investigadores que realizaron mediciones de PIO y análisis de Western blot quedaron ciegos ante la asignación por grupos.
Se generó un modelo experimental de OHT crónica en ratas como sedescribió previamente en 25. Brevemente, las ratas fueron anestesiadas con un 10% de cloral hidrato, y tras la dilatación pupilar con tropicamida, se inyectó solución de carbómero (0,3%, 20 μL) en la cámara ocular anterior. Se aplicó clortetraciclina clorhidrato para prevenir infecciones. Las mediciones de la PIO se realizaron con un tonómetro de rebote tras 3 y 7 días. Los tejidos de la esclerótica se recogieron una semana después de considerarse establecido el modelo.
Los tejidos esclerales fueron aislados como se describió anteriormente endetalle 25. Tras la anestesia, las ratas fueron perfundidas transcárdicamente con un 4% de formaldehído en PBS. Se diseccionó tejido orbitario externo del globo y se retiraron cuidadosamente las estructuras del segmento anterior (córnea, iris, cristalino) y el vítreo. La retina y la coroides fueron raspadas suavemente de la pared escleral interna. Los tejidos de la esclerótica posterior fueron recogidos e identificados mediante tinción patológica H&E.
Cultivo celular
Los fibroblastos esclerales humanos primarios (células HSF) eran una línea celular previamente establecida a partir de la esclerótica32 de donante humano. Se utilizaron tres réplicas biológicas independientes (células de tres donantes diferentes) para cada experimento. Las células HSF se mantuvieron en DMEM suplementadas con un 15% de suero bovino fetal y un 1% de penicilina-estreptomicina bajo condiciones estándar de cultivo (37 °C, 5% CO2, atmósfera humidificada). Los cultivos se dividieron cada cuatro días, y se emplearon células HSF entre los pasajes 5 y 9 para todos los experimentos. Las células HSF fueron confirmadas por inmunofluorescencia utilizando marcadores de células de actina tipo colágeno tipo I y α-músculo liso.
Aplicación de la estimulación mecánica
El sistema de estiramiento mecánico cíclico se utilizó para producir estiramiento cíclico mecánico. Se utilizó una densidad de siembra de 2×10 5 células/mL para las células HSF placadas en placas de seis pozos con fondos flexibles recubiertos de colágeno. Las células del grupo de estiramiento estuvieron expuestas a estiramiento cíclico con un 10% de amplitud y 0,5 Hz, como se describió en nuestro estudioanterior 32. Las células cultivadas en placas de estiramiento, pero dejando estática sirvieron como controles. Experimento de knockdown de siRNA Piezo1: Las células recibieron una transfección de 48 horas de siRNA de Piezo1 o siRNA control negativo antes del estiramiento mecánico. Tras la transfección, las células sufrían estiramientos mecánicos cíclicos durante 24 horas. Se incluyeron cuatro grupos: (A) células transfectadas con siRNA de control sin estiramiento; (B) controlar las células transfectadas con siRNA mediante estiramiento; (C) Células transfectadas por siRNA Piezo1 sin estiramiento; (D) Células transfectadas con siRNA Piezo1 con estiramiento. Experimento con inhibidor piezo1 (GsMTx4): Las células fueron tratadas con 5 μM GsMTx4 antes y durante el estiramiento mecánico. Se incluyeron cuatro grupos: (A) células no tratadas sin estiramiento; (B) células sin tratar con estiramiento; (C) células tratadas con GsMTx4 sin estiramiento; (D) Células tratadas con GsMTx4 con estiramiento (con GsMTx4 presente en todo el sistema). Experimento del agonista piezo1 (Yoda1): Se cultivaron células en presencia de Yoda1 a 5 μM durante 24 horas. Se incluyeron dos grupos: (A) control no tratado (vehículo); (B) Células tratadas con Yoda1.
Western blot
Los niveles de proteína se evaluaron mediante Western blot siguiendo procedimientos rutinarios. Brevemente, lizamos muestras de fibroblastos esclerales o cultivados en un tampón RIPA. La proteína (20 μg) fue resuelta por SDS-PAGE y posteriormente secada sobre las membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con 5% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente, seguidas de incubación nocturna a 4 °C con los anticuerpos primarios adecuados. Los anticuerpos utilizados incluían Piezo1, colágeno tipo I, actina α-músculo liso, YAP y GAPDH. El anticuerpo Piezo1 ha sido validado por el fabricante para Western blot e inmunofluorescencia en tejidos de rata y humanos, con datos de knockout/knockdown disponibles en la hoja del producto. Tras tres lavados con TBST, incubamos las membranas con anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados (anti-rabbit o anti-mouse) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las intensidades de las bandas se midieron entonces mediante software de análisis de imágenes, y la señal de cada banda objetivo se normalizó a la señal GAPDH del mismo carril. Los datos resultantes se presentan como cambio de plegamiento relativo a la condición de control.
Proliferación celular
La proliferación celular se evaluó mediante un ensayo de viabilidad colorimétrica siguiendo el protocolo suministrado. Añadimos un compuesto de tetrazolio (10 μL/mL) a cada pozo e incubamos las placas durante 2 horas bajo condiciones estándar de cultivo (37 °C, 5% CO2). La absorbancia se leía entonces a 450 nm.
Pequeña transfección de ARN interferente
La transfección de siRNA piezo1 se realizó como se describióanteriormente 31. Las secuencias fueron las siguientes: Piezo1-siRNA, 5'-AGAAGAUCGUCAAGUATT-3' (sentido) y 5'-UACUUGACGAUCUUCUUCUTT-3' (antisentido), siRNA de control negativo (NC), 5'-GUGAGCGUCUAUAUACCAUTT-3' (sentido) y 5'-AUGGUAUAUAGACGCUCACTT-3' (antisentido).
Inmunofluorescencia
Para la inmunofluorescencia, las células cultivadas se fijaron con un 4% de paraformaldehído (20 min, temperatura ambiente), se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 (40 min) y luego se bloquearon con 10% de BSA. Las secciones tisulares fueron sometidas a fijación nocturna en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente, seguida de permeabilización y bloqueo. Se incubaron muestras con anticuerpos primarios contra Piezo1 y α-SMA. Posteriormente, aplicamos anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente: anti-ratón marcado con verde (para α-SMA) y anti-conejo marcado en rojo (para Piezo1), cada uno con una dilución de 1:500. Los núcleos se contrateñieron con DAPI y se capturaron imágenes con un microscopio de fluorescencia.
Tratamiento con agonistas e inhibidores
Las células HSF fueron tratadas con 5 μM GsMTx4 y 5 μM del agonista Piezo1 Yoda1 según estudiosprevios 33.
Análisis estadístico
Cada experimento se realizó en triplicado. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar (DS). Para comparar entre dos grupos, aplicamos un test t de Student de dos colas. Se realizaron comparaciones de varios grupos con ANOVA unidireccional seguida de la prueba post-hoc de Tukey. La normalidad de los datos se comprobó mediante la prueba de Shapiro-Wilk y la homogeneidad de las varianzas se evaluó mediante la prueba de Levene. La significación estadística se definió como p < 0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron con software estadístico dedicado.
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Piezo1 se expresa en tejidos de la esclerótica de rata y en células HSF
Primero, examinamos la expresión de Piezo1 tanto en tejidos esclerales de rata (in vivo) como en fibroblastos esclerales humanos cultivados (in vitro). Para analizar la expresión específica de Piezo1, se utilizó la base de datos de anotación génicaBioGPS 34. El análisis BioGPS reveló que Piezo1 se expresa altamente en diversos tejidos oculares, incl...
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La presión intraocular elevada (PIO) induce tensión mecánica en la cabeza del nervio óptico y en la cribrosa laminar, contribuyendo a la degeneración de las células ganglionaresretinianas 38,39. La esclerótica peripapilar (PPS) es un tejido portante principal que influye en la biomecánica de laONH 40. Estudios previos han demostrado que la tensión mecánica induce diferenciación fibroblasto escleral a miofi...
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Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención nº 82401257).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.3% carbomer solution (Carbomer 940 polymer) | Solarbio, Shanghai, China | — | 20 μL |
| 10% chloral hydrate | Macklin, Shanghai, China | — | 3 mL/kg |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| BioFlex six-well culture plates (coated with collagen I) | Flexcell Int Corp, Hillsborough, NC, USA | — | |
| Chlortetracycline hydrochloride | Zhenhua Pharmaceutical, Yunnan, China | — | |
| COL1 primary antibody | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| DMEM | Gibco, Grand Island, NY, USA | — | |
| FBS | Gibco Life Technologies, Australia | — | |
| GAPDH primary antibody | Bioworld, MN, USA | — | |
| GraphPad Prism version 8.4 | Inc., San Diego, CA, USA | — | |
| Nikon Eclipse E800 microscope | Nikon, Melville, NY, USA | — | |
| Nitrocellulose membranes | Pierce, Rockford, IL, USA | — | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, South Logan, UT, USA | — | |
| Piezo1 primary antibody | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| Rebound tonometer (TonoLab) | Icare, Espoo, Finland | — | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific, Shanghai, China | — | |
| The Flexcell FX-5000 Tension System | Flexcell International Corporation | — | Used to apply mechanical cyclic stretch to HSF cells. |
| Tropicamide | Bausch Lomb Freda, Shandong, China | — | |
| YAP primary antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, USA | — | |
| α-SMA primary antibody | Abcam, Cambridge, UK | — |
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