Técnicas eficientes de identificación para 61 cultivares de té oleitoso (Camellia oleifera abel) utilizando la estrategia MCID y marcadores de ADN

Resumen

Este estudio empleó un diagrama manual de identificación de cultivares (MCID) derivado de patrones de bandillado de ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) para identificar de manera eficiente y reproducible 61 cultivares de Camellia oleifera Abel para la utilización de recursos de germoplasma e identificación de cultivares de té aceitoso.

Resumen

Es fundamental identificar materiales y cultivares de germoplasma de Camellia oleifera Abel [té de aceite (Ot)] para evaluar los recursos de germoplasma y valorar los mecanismos de protección de las variedades Ot. Este estudio empleó una técnica optimizada de RAPD aumentando la longitud del cebador y cribando la temperatura de recocido por PCR, lo que identificó 61 cultivares Ot de diversas regiones. Además, se desarrolló un MCID para diseñar marcadores RAPD eficientes para la identificación de cultivares. De 80 cebadores arbitrarios de 11 nts RAPD, se seleccionaron 10 cebadores que producían bandas polimórficas claras (PBs) para el análisis PCR de las 61 cultivares. Además, se empleó la estrategia MCID para distinguir manualmente 61 cultivares basándose en los PBs observados en las huellas dactilares de ADN de los 10 cebadores, que generaron el diagrama de identificación de cultivares Ot (Ot-CID). Este Ot-CID indicaba cada cultivar individualmente, utilizando PBs para la identificación del cultivar, con los cebadores adecuados colocados con precisión en el Ot-CID. La estrategia MCID proporciona un enfoque sencillo y práctico para la identificación de plantas utilizando marcadores de ADN. Además, este enfoque proporciona un método práctico y eficiente para la identificación de cultivares. El Ot-CID resultante de 61 cultivares Ot distinguió eficazmente las variantes Ot usando marcadores RAPD, facilitando así la diferenciación de cultivares para la protección de derechos de cultivar y la identificación temprana de plántulas en la industria vivera.

Introducción

Camellia oleifera Abel [té de aceite (Ot)] es una de las especies de árboles comestibles de aceite leñerosas más importantes del^mundo. China es considerada el centro de origen y diversidad de la Ot, con abundantes recursos de^{germoplasma 2}. La antigua tradición del Ot, la propagación vegetal y los diversos programas globales de mejoramiento han dado lugar a la aparición de numerosos^cultivares. El cultivo global generalizado de la cultura Ot ha dado lugar a cultivares con homónimos (cultivares distintos con el mismo nombre) y sinónimos (cultivares con más de un nombre)⁴. Por ello, es fundamental desarrollar técnicas para manejar una amplia gama de germoplasma Ot y distinguir con precisión los diferentes^{cultivares 3,5}.

A pesar de la aplicación de marcadores moleculares basados en ADN en la caracterización de cultivares, la investigación genética y la identificación de Ot, que pueden elucidar la diversidad genética y diferenciar a individuos de plantas, ningún estudio ha logrado identificar con éxito un número sustancial de cultivares Ot ni ha proporcionado una base fiable para la diferenciación^{de cultivares} 6,7,8,9 . La falta de métodos fiables es la principal limitación para la aplicación de marcadores de ADN en la identificación de cultivos vegetales. Esto podría deberse a que las técnicas analíticas utilizadas para las huellas dactilares de ADN no pueden proporcionar información pertinente que especifique claramente cebadores y marcadores polimórficos para diferenciar los cultivares que requieren identificación. Las técnicas analíticas para los patrones de bandado de ADN (llamadas análisis por conglomerado) no son adecuadas para distinguir eficazmente cultivares o especies.

Aunque se han desarrollado tarjetas de identificación molecular (ID) de ADN para más de 200 cultivares Ot utilizando los marcadores^SNP 2,3,10,11, aún existen varios desafíos: (1) El genoma Ot es complejo, con la mayoría de las camelias cultivadas siendo hexaploides, mientras que el genoma de referencia utilizado para construir las identificaciones moleculares de ADN es triploide, lo que puede resultar en cierta imprecisión 3 . (2) La secuenciación del genoma completo es costosa, especialmente para laboratorios con instalaciones limitadas, lo que impide su aplicación generalizada para el análisis de variedades a gran escala. Además, los productos de amplificación por PCR requieren secuenciación o detección de fluorescencia, lo que complica aún más el proceso¹². (3) En ausencia de marcadores distintivos para nuevas variedades, es necesario desarrollar nuevos cebadores de marcadores, lo que también requerirá la recodificación de los códigos de tarjeta de identificación para los tipos existentes. Esto resulta en una cantidad abrumadora de posiciones de código, disminuyendo la eficacia de la diferenciación de variedades. Por ello, es esencial emplear una técnica que proporcione una verificación sencilla, fiable, referenciable y práctica de cultivares Ot para el sector de viveros Ot, el negocio agrícola, la protección de patentes de plantas y la conservación y evaluación de recursos^{genéticos 5}.

Las estrategias tradicionales para la identificación de cultivares se basaban en características morfológicas, fisiológicas y agronómicas, pero estas características tienen límites ya que son susceptibles a influencias ambientales y requieren una evaluación exhaustiva de plantas completamente^{desarrolladas 13,14}. Además, los marcadores moleculares tienen la ventaja clara de no verse afectados por variables ambientales, sirviendo así como una herramienta eficiente para la caracterización precisa de^{cultivares 14,15}. Recientemente, se han establecido varios índices basados en ADN para evaluar la toma de huellas dactilares, diversidad genética, cultivar y^pureza 16,17,18,19,20,21,22. El marcador RAPD es ventajoso para el análisis de cultivares debido a su simplicidad, eficiencia y la falta de necesidad de datos de secuencia^{previos 23,24}. El enfoque RAPD puede mejorarse seleccionando cebadores de 11 nucleótidos (nt) junto con su temperatura de recocido PCR especificada para su aplicación en huellas dactilares vegetales, estableciendo así RAPD como un método preferente para la identificación de variedades vegetales y la evaluación de la diversidad^{genética 25,26}. Estos marcadores se han utilizado ampliamente en estudios de diferenciación de cultivos y correlación genética de diversas especies vegetales, incluyendo^{albaricoque 27}, melocotón^{ornamental 28}, granada²⁹, variedades^{landraces 20} y nogal³⁰ (Çilesiz et al., 2025). A pesar de su uso generalizado, muchos enfoques basados en marcadores de ADN siguen siendo insuficientes o eficientes para la identificación rutinaria de variedades vegetales.

Por ello, este estudio utilizó una técnica analítica novedosa para la identificación reproducible de varios cultivares Ot. El MCID, derivado de los patrones de bandillado RAPD, diferenció 61 cultivares Ot para la utilización de recursos de germoplasma e identificación de cultivares.

La estrategia RAPD-MCID descrita aquí (Figura 1) es más adecuada para la caracterización de germoplasma a pequeña y mediana escala en laboratorios con infraestructura estándar de PCR y electroforesis en gel, pero con acceso limitado a instalaciones de secuenciación. También es muy adecuado para un cribado preliminar rápido y rentable antes de un análisis genético más detallado. Los principales límites operativos del método incluyen su dependencia de marcadores dominantes y la necesidad de una cuidadosa estandarización de las condiciones de PCR para garantizar la reproducibilidad entre laboratorios. Para bancos de germoplasma a gran escala o registro legal de variedades, se recomienda el uso complementario de marcadores codominantes como SSRs o SNPs.

Protocolo

1. Material vegetal

1. Recoge hojas jóvenes de brotes sanos y en crecimiento activo de cada cultivar de té aceitoso del Repositorio Nacional de Germoplasma de Camelia, condado de Shucheng, provincia de Anhui.
2. Consulte la Tabla 1 para conocer los nombres y orígenes de estos cultivares.

2. Extracción de ADN genómico

1. Extrae ADN genómico total usando un kit de extracción de ADN vegetal según las instrucciones del fabricante.
2. El ADN fue eluído con un buffer de 1× TE. Tras la elución, confirma que la solución de ADN extraída parece clara e incolora. Mide la concentración de ADN usando un espectrofotómetro de microvolumen.
3. Ajusta la concentración de ADN a 30 ng·^μL-1 con 1× TE de tampón y almacena la solución ajustada de ADN a -20 °C.

3. Selección de imprimación RAPD

1. Desarrolla 80 cebadores aleatorios para el análisis de RAPD y analízalos usando algunos genotipos. Selecciona cebadores RAPD de 11-nt que produzcan patrones de banda claros e inequívocos en todos los genotipos probados.
2. Utiliza los cebadores seleccionados para la genotipificación para aumentar la credibilidad de los fragmentos amplificados. Seleccione 10 cebadores bien resueltos con bandas reproducibles para un análisis posterior, como se indica en la Tabla 2.

4. PCR de ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD)

1. Prepara las reacciones de amplificación modificando ligeramente el método²³ descrito anteriormente. Prepara las soluciones de reacción según la composición listada en la Tabla S1.
2. Realizar PCR utilizando un ciclador térmico con las siguientes condiciones: pre-desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos; 42 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, recocido durante 1 minuto a la temperatura optimizada indicada en la Tabla 2, y extensión a 72 °C durante 2 minutos; y una extensión final a 72 °C durante 10 minutos.

5. Detección y análisis de productos de PCR

1. Separa los fragmentos de ADN amplificados mediante electroforesis en gel a 100 V en 1,3% de agarosa (p/v) preparada en un tampón TAE de 1× que contiene 0,001 M EDTA y 0,04 M Trisacetato a pH 8,0. Teñe los geles con bromuro de etidio a 0,5 μg·^μL-1.
   PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno potente. Utiliza el equipo de protección personal adecuado al manipular soluciones de bromuro de etidio o geles teñidos.
2. Haz funcionar el gel a un voltaje constante de 100 V durante 45–60 minutos, o hasta que el frente de colorante azul bromofenol haya migrado aproximadamente dos tercios de la longitud del gel. Después de teñir y destituir, observa el gel bajo transiluminación UV.
   NOTA: Confirme que bandas de ADN distintas son claramente visibles bajo transiluminación UV. Asegúrate de que la escalera de ADN muestre bandas afiladas y bien separadas, que oscilan entre 100 y 2.000 pb.
3. Registrar las bandas polimórficas (PBs) de los cultivares en función de su presencia o ausencia bajo luz ultravioleta.
4. Realizar cada amplificación de PCR en triplicado para asegurar la reproducibilidad. Bandas solo de puntuación que estén consistentemente presentes o ausentes en las tres réplicas independientes para análisis posteriores. Confirma que la tasa de puntuación de la concordancia entre réplicas supera el 95%.

6. Análisis de datos

1. Puntua las bandas para la identificación del cultivar según su presencia o ausencia asignando "+ o" a bandas claramente visibles y "−" a bandas ausentes en la posición correspondiente del tamaño molecular en todos los cultivares. Incluye solo bandas que se observen de forma consistente en tres réplicas independientes.
2. Clasificar los cultivares con bandas distintivas en la huella digital producida por un único cebador de forma independiente. Categoriza los cultivares con patrones de bandas idénticos en el mismo subgrupo. Diferenciar progresiva y completamente todas las variedades de té oleaginoso basándose en estos parámetros.

7. Aplicación y eficiencia del diagrama en la identificación de cultivares

1. Selecciona aleatoriamente dos grupos de cultivares de té aceitaginoso de los intra e intergrupos para verificar la aplicabilidad y funcionalidad del diagrama que ilustra 61 cultivares de té aceitinoso. Realiza la selección manualmente consultando diferentes ramas del diagrama Ot-CID, sin necesidad de ningún software.
   NOTA: Se seleccionaron aleatoriamente 2 grupos de cultivares Ot para verificar la aplicabilidad y funcionalidad del diagrama que ilustra 61 cultivares Ot.
2. Designa los dos grupos seleccionados como "A" y "B". Selecciona los manuales relevantes para cada grupo del Ot-CID.

8. Orientación para la eliminación de residuos peligrosos

1. Prepara y manipula todas las soluciones de bromuro de etidio en un área designada. Recoger por separado todos los residuos sólidos contaminados con bromuro de etidio y los residuos líquidos para su disposición conforme a las directrices institucionales sobre residuos peligrosos.
2. Eliminar todos los materiales contaminados con bromuro de etidio en contenedores designados para residuos peligrosos. Contacte con la oficina de salud y seguridad ambiental institucional para obtener procedimientos aprobados para la eliminación si no está seguro.

Resultados

Los Resultados Representativos presentados aquí ilustran el flujo de trabajo completo de la estrategia RAPD-MCID, desde el cribado inicial de cebadores hasta la discriminación jerárquica de cultivares y la validación final. El proceso de discriminación escalonada está documentado en las Figuras 2, 3, 4, 5

Discusión

Los marcadores de ADN son herramientas poderosas que se utilizan para identificar cultivares de plantas y especies²⁴. Estos marcadores se han desarrollado y empleado en miles de estudios sobre análisis genético, identificación de cultivares, etc.; sin embargo, no son ni fáciles ni ampliamente utilizados en la genotipificación^24,31. Esto se debe a la falta de métodos eficientes y sencillos que util...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Centrífuga	Eppendorf, Alemania	5427R	Usado para la extracción de ADN genómico de hojas de té de aceite
Kit Hi-DNAsecure Plant	Tiangen, China	DP350	Usado para la extracción de ADN genómico de hojas de té de aceite
Instrumento de amplificación génica PCR	Monad, China	MP60901	Usado para amplificación PCR
SolarRed Agarose LE	Solarbio, China	A8202	Usado para electroforesis de fragmentos PCR
TAE	Tsingke, China	TSG001	Usado para electroforesis de fragmentos PCR
TaKaRa Ex Taq	Takara, Japón	RR001A	Usado para amplificación PCR
Espectrofotómetro Thermo Scientific NanoDrop 2000C	ABI, EE. UU.		Usado para determinar la concentración de ARN