Aislamiento y validación de subpoblaciones de células madre mesenquimales positivas para podoplanina utilizando una estrategia indirecta de perlas magnéticas

Resumen

Este protocolo describe un método de clasificación basado en perlas magnéticas que utiliza anticuerpos de citometría de flujo marcados con ficoeritrina (PE) y microperlas anti-PE para aislar subpoblaciones específicas de células madre mesenquimales con alta positividad de marcadores objetivo postclasificación y actividad metabólica preservada basada en CCK-8 bajo las condiciones probadas, sin requerir costosos clasificadores celulares ni perlas personalizadas específicas para cada objetivo.

Resumen

El estudio de la heterogeneidad funcional en células madre mesenquimales se basa en el aislamiento eficiente de subpoblaciones específicas (por ejemplo, células positivas a podoplanina (PDPN)). Sin embargo, para la mayoría de las proteínas de membrana, las perlas magnéticas comerciales disponibles directamente para la clasificación son limitadas. Para abordar esto, nuestro laboratorio ha establecido y probado un protocolo estandarizado de clasificación de perlas magnéticas basado en el principio de acoplamiento indirecto de "anticuerpos de citometría de flujo marcados con ficoeritrina (PE)/perlas magnéticas anti-PE". Utilizando células PDPN-positivas como población objetivo modelo, este protocolo enriquece una fracción de célula objetivo sin depender de costosos clasificadores de células citométricas de flujo.

Los investigadores pueden utilizar anticuerpos compatibles de citometría de flujo marcados con PE dirigidos a proteínas de superficie celular accesibles y combinarlos con microperlas anti-PE disponibles comercialmente para establecer un flujo de trabajo de clasificación para objetivos seleccionados tras la optimización específica del objetivo. Este enfoque evita los largos plazos de entrega y los altos costes asociados a la personalización o el pedido de perlas magnéticas específicas para cada nuevo objetivo, lo que lo hace especialmente adecuado para marcadores de superficie accesibles que son raros o poco estudiados. En el sistema modelo de PDPN probado aquí, el protocolo permitió el enriquecimiento de la subpoblación objetivo con alta positividad post-clasificación de PDPN y preservó la proliferación/actividad metabólica basada en CCK-8 en comparación con las MSC no clasificadas.

Introducción

En el campo de la ortopedia, lesiones como daños en el cartílago y lesiones en la zona avascular (zona blanca) del menisco suelen provocar una destrucción irreversible de las articulaciones y pérdida de función, lo que finalmente conduce a la osteoartritis. Esto se debe en gran parte a la pobre capacidad regenerativa de estos tejidos, que se debe a la falta de sangre directa y suministro linfático, así como a la presencia de células altamente diferenciadas con capacidad limitada de proliferación y ^migración 1,2,3,4. Para abordar este desafío, se han explorado diversas estrategias clínicas, incluyendo el uso de exosomas ^5,6, trasplante autólogo o alogénico de condrocitos ^7,8, y enfoques de ingeniería^tisular 9,10,11,12. En los últimos años, las células madre mesenquimales (MSC) han surgido como una fuente celular prometedora para la reparación regenerativa, gracias a su potencial de diferenciación multilineal y propiedades inmunomoduladoras, ofreciendo nuevas esperanzas para la regeneración del cartílago 13,14,15,16.

A pesar de su potencial terapéutico, las CMM presentan una heterogeneidad significativa. Incluso dentro de una única fuente tisular, como la médula ósea o el cordón umbilical, subpoblaciones distintas de CMM pueden mostrar una considerable variabilidad en la capacidad de proliferación, el potencial de diferenciación multilineal (particularmente la diferenciación condrogénica) y la función regenerativa in vivo 17,18,19. Por lo tanto, la identificación precisa y el aislamiento de subpoblaciones de MSC definidas funcionalmente —como aquellas con capacidad condrogénica mejorada— es esencial para avanzar en nuestra comprensión de sus propiedades biológicas y mejorar la eficacia de la reparación del cartílago. Esto representa un paso fundamental en nuestra investigación.

A medida que avanza la investigación, se ha identificado un número creciente de nuevas proteínas de membrana como marcadores de subpoblaciones de MSC funcionalmente distintas. Sin embargo, traducir estos descubrimientos en estrategias efectivas de clasificación celular sigue siendo un reto técnico. La clasificación celular activada por fluorescencia convencional (FACS), aunque potente, requiere instrumentación especializada y conocimientos técnicos, lo que limita su accesibilidad en muchos laboratorios. Por otro lado, la clasificación de células inmunomagnéticas —aunque más utilizada— está limitada por la limitada disponibilidad de reactivos comerciales, que están diseñados principalmente para unos pocos blancos de membrana bien establecidos. En consecuencia, para muchos marcadores recién descubiertos con potencial significado biológico, no existen perlas magnéticas comercialmente disponibles, lo que dificulta el enriquecimiento específico de estas valiosas subpoblaciones de MSC.

Para superar esta limitación, el presente estudio pretende establecer y estandarizar un protocolo flexible, rentable y eficiente para la selección positiva de células. Este enfoque se basa en la conjugación indirecta de anticuerpos conjugados con ficoeritrina (PE) disponibles comercialmente con perlas inmunomagnéticas anti-PE. Informes previos han demostrado que los MSC positivos para podoplanina (^PDPN+) poseen una capacidad superior de mantenimiento y diferenciación de la talla en comparación con ^sus homólogos^PDPN-20. Además, la implicación de las MSC de ^PDPN+ en la regeneración del cartílago y la progresión de la osteoartritis (OA) ha sido documentada en la literatura^21,22. Utilizando podoplanina (PDPN)—un marcador candidato recientemente identificado de subpoblaciones funcionales de MSC—como objetivo modelo, clasificamos células positivas para PDPN de MSCs derivadas de médula ósea. Ofrecemos un protocolo detallado paso a paso que cubre la preparación de la suspensión de células individuales, el marcaje de anticuerpos y perlas magnéticas, y la separación magnética. Además, evaluamos el rendimiento, la positividad post-clasificación de PDPN y la proliferación/actividad metabólica basada en CCK-8 de las células clasificadas. Al estandarizar este protocolo, pretendemos proporcionar a los investigadores un método versátil y accesible para aislar subpoblaciones celulares objetivo utilizando anticuerpos compatibles contra marcadores accesibles en la superficie celular, facilitando así la investigación fundamental con células madre y futuras aplicaciones traslacionales en medicina regenerativa.

Protocolo

Los MSC derivados de médula ósea humana se obtuvieron comercialmente (véase la Tabla de Materiales). El proveedor confirmó la identidad de MSC mediante la expresión positiva de CD73, CD90 y CD105; expresión negativa de CD34, CD45 y HLA-DR; y el potencial de diferenciación trilineal. Las células se expandieron en cultivo y se utilizaron en los pasajes 3–5. Todo el trabajo celular de origen humano se realizó en un gabinete de seguridad biológica de Clase II bajo condiciones estériles. Como las células se adquirieron comercialmente y no se reclutaron ni muestrearon directamente sujetos humanos en este protocolo, no se requirió la aprobación directa del IRB.

1. Preparación de la suspensión de celda única

NOTA: La calidad de la suspensión de celda única afecta directamente a la eficiencia de clasificación. Asegúrate de que las células estén bien dispersas, sean altamente viables y estén libres de grumos. Los grumos visibles deben dispersarse mediante pipeteo suave y repetido hasta que los grumos ya no sean visibles.

1. Selecciona MSCs (pasajes 3–5) que hayan alcanzado una confluencia del 80–90%. Descarta el medio cultural.
2. Lava las células con 2 × 10 mL de PBS precalentado. Mecía suavemente el recipiente y descarta el PBS.
3. Añade 2 mL de tripsina-EDTA al 0,25% e incuba a 37 °C durante 3–5 minutos. Observa las células bajo un microscopio hasta que se redondeen y empiecen a desprenderse.
4. Añade 4 mL de medio de cultivo que contenga un 16,5% de FBS (véase la Tabla de Materiales) para neutralizar la tripsina. Haz una pipete suave en las células para asegurar el desprendimiento completo. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo centrífugo de 15 mL.
   NOTA: Comprueba bajo el microscopio que todas las células han sido recogidas.
5. Centrifugar a 300 × g durante 3 minutos y descartar el sobrenadante.
6. Resuspende el pellet celular en 1 mL de tampón (véase la Tabla de Materiales). Procede a contar células.

2. Recuento celular y ajuste de concentración

NOTA: Si el número total de células es inferior a 1 × 10⁷, añade igualmente los anticuerpos y reactivos magnéticos basados en el volumen estándar para 1 × 10^{7 células} para asegurar la eficiencia del marcado.

1. Centrifuga la suspensión de celda de nuevo a 300 × g durante 3 minutos y descarta el sobrenadante.
2. Resuspende las celdas en Buffer para lograr una densidad de 1 × 10⁸ celdas/mL.
   NOTA: Por ejemplo, para procesar 1 × 10⁷ celdas, resuspende el pellet en 100 μL de tampón.
3. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 mL.

3. Marcado de anticuerpos

1. Añadir 10 μL de Fc gamma RII Blocker (véase la Tabla de Materiales) por cada 1 × 10⁷ celdas. Mezcla suavemente y incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos.
2. Añadir 5 μL de anticuerpo anti-PDPN humano conjugado con PE (véase la Tabla de Materiales) por cada 1 × 10⁷ células, siguiendo la concentración recomendada por el fabricante. Mezcla suavemente y incuba a temperatura ambiente durante 15–20 minutos, protegido de la luz.
   NOTA: El volumen del anticuerpo debe ajustarse según la hoja de datos del anticuerpo específico de citometría de flujo que se esté utilizando, ya que las concentraciones pueden variar entre productos.

4. Etiquetado de cuentas magnéticas

NOTA: Mantén todos los reactivos en hielo antes de usarlos y devólvelos al hielo inmediatamente después de cada adición para mantener la actividad y la consistencia.

1. Añade 10 μL de Cóctel de Selección por cada 1 × 10⁷ celdas (véase la Tabla de Materiales). Mezcla suavemente y incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos.
2. Añadir 5 μL de perlas magnéticas por cada 1 × 10⁷ celdas (véase la Tabla de Materiales). Mezcla suavemente y incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos.
   NOTA: Vierte vigorosamente las perlas magnéticas durante 30 segundos antes de usarlas para asegurar una dispersión uniforme.

5. Separación magnética

1. Coloque un tubo de fondo redondeado de poliestireno de 5 mL que contiene la muestra de celda etiquetada en el soporte de separación magnética (véase la Tabla de Materiales).
2. Añade buffer al tubo para llevar el volumen total a 2,5–3 mL. Incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Realiza la separación: Manteniendo el imán y el tubo juntos como una sola unidad, invirtiéndolos para verter el sobrenadante en un nuevo tubo de recogida. Esta fracción recogida contiene las células negativas para PDPN; Mantén este tubo en hielo.
   NOTA: No retire el tubo del soporte magnético durante este paso, ya que esto interrumpirá la separación y hará que el procedimiento falle.
4. Repite los pasos 5.1–5.3 3 veces. Cada vez, añade buffer al tubo original del imán, espera 5 minutos y vierte el sobrenadante en el mismo tubo de recogida de fracciones negativas usado en el paso 5.4.
5. Tras el lavado final, retira el tubo que contiene las celdas magnéticamente unidas del soporte. Este tubo contiene la fracción celular positiva para PDPN.
6. Añade 3 mL de buffer para resuspender las células positivas. Transfiere esta suspensión a un tubo nuevo y etiquetado (el tubo de fracción positiva).

6. Recogida, cultivo y validación de células objetivo

1. Cuenta las células tanto de los tubos de fracción positiva como negativa. Registra el rendimiento de las celdas para cada fracción.
2. Centrifuga la suspensión de celda de fracción positiva a 300 × g durante 3 minutos. Descarta el sobrenadante.
3. Resuspende el pellet celular en un medio de cultivo Alfa MEM que contenga un 16,5% de FBS. Ajusta la densidad celular según sea necesario y siembra las células en placas de cultivo o frascos.
4. Incubar las células a 37 °C en una incubadora al 5% de CO₂.

7. Preparación de muestras para la pureza y validación funcional

1. Cuenten las células y siéntenlas en una placa de cultivo de 100 mm a una densidad de 3 × 10⁶ células por plato en 12 mL de medio de cultivo. Veinticuatro horas después de la siembra, observa la unión de las células. Sustituye el medio de cultivo por un medio fresco para eliminar cualquier perla magnética residual y células no adherentes.
2. Extrae las células mediante tripsinización. Pipetea suavemente arriba y abajo 10–15 veces para desalojar y eliminar perlas magnéticas y anticuerpos residuales.
3. Evalúa el porcentaje de células positivas para PDPN-PE mediante citometría de flujo (véase el Archivo Suplementario 1 para el protocolo detallado).
4. Recoge células durante la fase de crecimiento logarítmico. Siéntalas en una placa de 96 pozos. En diferentes momentos (0 h, 24 h, 48 h, 72 h), añade reactivo CCK-8 (véase la Tabla de Materiales) y mide la absorbancia según las instrucciones del fabricante. Grafica una curva de proliferación basada en los datos.

Resultados

El principio general y el flujo de trabajo del experimento se ilustran en la Figura 1. Todos los datos experimentales posteriores se basan en células del paso 5. Tras la separación magnética, las células ^PDPN+ obtenidas se cultivaron durante 24–48 horas. Tras reemplazar el medio de cultivo para eliminar las células no adherentes y las posibles perlas magnéticas residuales (Figura 2A), evaluamos la eficiencia de clasif...

Discusión

En este estudio, establecimos un protocolo basado en perlas magnéticas para aislar células de PDPN+ de MSCs derivadas de médula ósea. Este enfoque permite un enriquecimiento eficiente de la subpoblación positiva para PDPN, manteniendo la proliferación/actividad metabólica basada en CCK-8 bajo las condiciones probadas.

En comparación con los métodos convencionales de clasificación inmunomagnética directa, la ventaja más significativa de esta estrategia radica e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
7-AAD Cell Viability Assay Kit	KeyGEN	KGD1202-50
Anti-human CD32 Blocker (Fc gamma RII Blocker)	STEMCELL Technologies	18520
Buffer	STEMCELL Technologies	20104	Buffer
CCK-8	Meilunbio	MA0218-5
Dextran Magnetic Particles	STEMCELL Technologies	50100	Magnetic Particles
Fetal Bovine Serum	Gibco	16050-122
Magnet	STEMCELL Technologies	18000	magnetic separation stand
MEM Alpha Medium	Gibco	C12571500BT	MEM Alpha Medium (82.5%) + FBS (16.5%) + Penicillin-Streptomycin (1.0%)
MSCs	KeyGEN	KGG5575-1	Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
PE-conjugated Anti-Human PDPN Antibody	ABclonal	A26770	PDPN-PE
PE Selection Cocktail	STEMCELL Technologies	18151	Selection Cocktail
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072