Cuantificación de la citotoxicidad de células NK potenciada por receptores de antígenos quiméricos y anticuerpos terapéuticos mediante imagen de células vivas y citometría de flujo

Resumen

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado in vitro. para la medición consistente de la citotoxicidad natural, mediada por receptores de antígenos quiméricos y dependiente de anticuerpos en células humanas natural killer mediante imagen de células vivas y citometría de flujo.

Resumen

Las células natural killer (NK) son linfocitos innatos que desempeñan un papel fundamental en la inmunidad protectora frente a diversos patógenos intracelulares y cánceres. Su función principal es eliminar células objetivo que están infectadas, transformadas malignamente o recubiertas por anticuerpos mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Las células NK también pueden ser modificadas genéticamente para expresar receptores de antígenos quiméricos (CARs) que permiten el reconocimiento dirigido de antígenos específicos. La medición cuantitativa de la citotoxicidad de las células NK es esencial para evaluar la funcionalidad basal y para la evaluación preclínica de anticuerpos monoclonales y estrategias de ingeniería CAR. Sin embargo, los ensayos funcionales in vitro siguen siendo muy variables entre laboratorios debido a diferencias en la preparación celular, las células objetivo, las relaciones efector-objetivo, los tiempos de coincubación y los métodos de lectura, lo que limita la reproducibilidad y las comparaciones cruzadas. Este artículo presenta un protocolo estandarizado para la evaluación cuantitativa de la citotoxicidad de células NK utilizando citometría de flujo e imagen en tiempo real de células vivas. Se evaluaron células NK humanas primarias y células NK-92 que expresan CAR por su capacidad para eliminar células cancerosas y células objetivo recubiertas de anticuerpos en un formato de placas de 96 pozos para medir la citotoxicidad natural, la muerte mediada por CAR y la ADCC. La supervivencia de la célula objetivo se midió de forma continua mediante imágenes de células vivas o en un punto temporal definido mediante citometría de flujo, que también permitió la caracterización fenotípica de las células NK y las células objetivo. Estos protocolos proporcionan un marco robusto utilizando cultivos tisulares rutinarios, imágenes y métodos de citometría de flujo para permitir la cuantificación reproducible de las funciones efectoras de células NK para estudios de inmunidad innata e inmunoterapias basadas en células NK.

Introducción

Las células natural killer (NK) son linfocitos innatos que desempeñan un papel central en la vigilancia inmunitaria frente a células infectadas por virus y malignas, mostrando una citotoxicidad rápida^{y potente 1}. A diferencia de las células B y T, las células NK no expresan receptores específicos de antígenos y, en su lugar, dependen de una serie de receptores activadores e inhibidores para detectar la pérdida de expresión del complejo mayor de histocompatibilidad clase I o el estrés celular. Esto les permite mediar la citotoxicidad directa liberando gránulos citotóxicos que contienen perforina y granzymas o, en algunos casos, activando los receptores de muerte 1,2,3,4. Además de la citotoxicidad natural, las células NK expresan FcγRIII (CD16), un receptor que reconoce la porción Fc de la inmunoglobulina G (IgG) y media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra las células objetivo^{recubiertas de IgG 5,6}.

Debido a sus mecanismos citotóxicos intrínsecos y a su perfil de seguridad favorable, las células NK han surgido como candidatas prometedoras para la inmunoterapia celular. Con el potencial de uso alogénico, las células NK pueden funcionar como una terapia "lista para usar" con un riesgo mínimo de enfermedad injerto contra huésped, lo que permite una aplicabilidad clínica más amplia y costes^{reducidos 7}. Los avances recientes han ampliado aún más el potencial terapéutico de las células NK mediante estrategias de ingeniería genética, incluyendo la introducción de receptores quiméricos de antígenos (CARs) que redirigen a las células NK para reconocer antígenos tumorales específicos. Las células CAR-NK han demostrado eficacia antitumoral en modelos xenoinjertos in vivo y ensayos clínicos, con una toxicidad reducida en comparación con las células^{CAR-T 8,9,10}. Por ello, existe un interés creciente en desarrollar plataformas de células NK diseñadas y estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. En este contexto, una medición precisa y cuantitativa de la capacidad de destrucción de células NK es esencial para comprender la biología de las células NK, evaluar la eficacia de terapias con células NK u otras terapias modificadas para células NK, y evaluar anticuerpos monoclonales que dependen de ADCC.

Se han utilizado ampliamente en laboratorios diversos ensayos in vitro para evaluar la citotoxicidad de células NK. Los métodos comunes incluyen ensayos radiactivos de liberación de cromo-51, ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa y ensayos de liberación de calceína-acetoximetil^11,12. Aunque estos métodos tradicionales se han utilizado ampliamente para medir la citotoxicidad, se basan en lecturas indirectas de la muerte celular, proporcionan mediciones finales en lugar de datos cinéticos y ofrecen una sensibilidad y rango dinámico limitados. Tampoco proporcionan información sobre el fenotipo o el estado de activación de las células efectoras. Más recientemente, las plataformas de imagen de células vivas y la citometría de flujo se han adoptado cada vez más porque permiten la cuantificación directa de la supervivencia de la célula objetivo, el seguimiento de la muerte a lo largo del tiempo y el análisis fenotípico simultáneo de células efectoras y diana^13,14. Sin embargo, incluso entre estos enfoques más recientes, existe una variabilidad considerable entre laboratorios y estudios publicados, incluyendo diferencias en la preparación célula-objetivo, las proporciones efector-objetivo (E:T) y los tiempos de coincubación, limitando la reproducibilidad y comparaciones entre estudios, especialmente en evaluaciones preclínicas de inmunoterapias basadas en células NK.

Este artículo presenta un flujo de trabajo estandarizado para la evaluación cuantitativa de la citotoxicidad de células NK utilizando dos plataformas independientes y complementarias: la imagen en tiempo real de células vivas (IncuCyte SX5) y los ensayos de puntos finales basados en citometría de flujo. La imagen de células vivas permite un seguimiento continuo de la supervivencia de la célula objetivo durante el cocultivo con células efectoras, permitiendo la evaluación cinética de la citotoxicidad a través de múltiples proporciones E:T y condiciones experimentales con una manipulación mínima del^{ensayo 15}. En cambio, la citometría de flujo proporciona una medición extrema altamente sensible de la muerte de la célula objetivo, junto con la caracterización fenotípica simultánea de células NK y células objetivo mediante un panel de tinción multimarcador.

Además, este protocolo incorpora parámetros experimentales estandarizados, incluyendo las proporciones E:T, las condiciones de incubación, el formato de la placa y los flujos de trabajo analíticos, para mejorar la reproducibilidad y facilitar la comparación de mediciones de citotoxicidad entre laboratorios y estudios. El flujo de trabajo permite la evaluación cuantitativa de múltiples funciones efectoras NK, incluyendo citotoxicidad natural, eliminación mediada por CAR y ADCC, y es compatible con células NK humanas primarias y líneas celulares NK. Este protocolo proporciona un marco práctico para estudios de biología de células NK y evaluación preclínica del desarrollo de inmunoterapia basada en células NK.

Protocolo

El uso de muestras de donantes humanos para la investigación fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional y realizado conforme a las directrices institucionales (Approval #2022P000699).

1. Ensayo de muerte por imagen de células vivas en tiempo real

1. Placas de recubrimiento
   1. Añadir 50 μL/poli-D-lisina de pozo (0,1 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato [PBS]) a una rejilla de 6 × 10 en una placa de fondo plano de 96 pozos. Sacude suavemente la placa para asegurarte de que el fondo de cada pozo esté completamente cubierto.
   2. Incuba la placa durante 2 horas a temperatura ambiente (RT; 18°C–26°C) con la tapa puesta.
   3. Lava los pozos 3× con 200 μL/pozo PBS y descarta el sobrenadante.
      NOTA: Las placas recubiertas pueden sellarse con parafilm y almacenarse a 4°C durante hasta 1 semana, añadiendo 200 μL de PBS a cada pozo. Asegúrate de que las placas permanezcan estériles, descarta PBS y deja que se equilibren en RT antes de su uso.
2. Preparar las celdas objetivo
   1. Preparar 10 mL de 2× SYTOX Orange (200 nM) diluyendo la solución de SYTOX Orange (250 μM en DMSO) en un medio de cultivo NK-92 (añadir 8 μL de material a 10 mL de volumen total) en un tubo de centrífuga de fondo cónico de 15 mL.
      NOTA: El medio de cultivo para células NK-92 consiste en medio RPMI-1640 avanzado, suero bovino fetal al 10% (FBS), 2 mM de L-alanil-L-glutamina, 100 μg/mL de primocina y 500 U/mL de IL-2 humana.
      PRECAUCIÓN: SYTOX El naranja es un tinte fluorescente y puede suponer riesgos para la exposición de la piel o los ojos. Manejar con el equipo de protección individual adecuado y conforme a las directrices de seguridad institucional.
   2. Cuenta las células objetivo usando un método de conteo basado en exclusión de colorantes (por ejemplo, azul de tripán) o un método validado equivalente (por ejemplo, contador automático de celdas).
      NOTA: En este ensayo, las células objetivo eran células de Ramos, una línea celular de linfoma de células B que expresa antígenos de maduración de células B (BCMA⁺), que diseñamos para expresar la proteína fluorescente en infrarrojo cercano (NIR) emiRFP670.
   3. Transfiere la cantidad requerida a un tubo centrífugo cónico de 15 mL con fondo.
   4. Centrífuga (5 min, 300 × g, RT, aceleración = máximo; desaceleración [freno] = máximo).
   5. Descarta el sobrenadante.
   6. Resuspender las células objetivo hasta una concentración final de 2,5 × 10⁵ células/mL (2,5 × 10⁴ celdas/100 μL) en 2× medios SYTOX Orange.
      NOTA: Las células objetivo resuspendidas pueden mantenerse a 37°C con un 5% de CO₂ en el tubo durante hasta 30 minutos mientras preparan las diluciones de las células efectoras.
      NOTA: Para una placa completa, 60 pozos × 2,5 × 10⁴ celdas/pozo = 1,5 × 10⁶ celdas objetivo totales. Prepara 2.0 × 10⁶ celdas para compensar la pérdida. Ajusta el número de células según el tamaño del ensayo y la densidad de siembra deseada.
3. Preparar las células efectoras
   1. Evalúa la concentración y viabilidad de las células NK-92 utilizando un método de recuento celular basado en exclusión de colorantes (por ejemplo, azul de tripán) o un método equivalente validado. Proceder solo si la viabilidad es ≥80%, ya que una menor viabilidad puede afectar al rendimiento del ensayo.
      NOTA: Se utilizaron células NK-92 diseñadas para expresar establemente la proteína fluorescente ZsGreen, ya sea sola (control) o con constructos CAR dirigidos a BCMA, como células efectoras.
   2. Contar y transferir el número requerido de celdas a tubos centrífugos cónicos individuales de 15 mL de fondo.
      NOTA: Calcular el número total de celdas efectoras requeridas sumando el número de celdas necesarias en todas las proporciones E:T para una réplica, multiplicando por el número de réplicas y añadiendo un 50% de exceso para compensar la pérdida celular. Números redondos según sea necesario para facilitar la preparación. Por ejemplo, para proporciones E:T que van de 2:1 a 0,25:1, se utilizan 1,5 × 10 celdas^{de 5} NK por réplica. Para triplicados, prepare 4,5 × 10⁵ celdas por condición según la disposición de placas descrita en la Figura Suplementaria 1A.
   3. Celdas centrífugas (5 min, 300 × g, RT, aceleración = máximo; desaceleración [freno] = máximo).
   4. Descarta el sobrenadante.
   5. Resuspender las células hasta una concentración final de 5,0 × 10⁵ celdas/mL (5,0 × 10⁴ celdas/100 μL).
4. Preparar las diluciones de las celdas efectoras
   1. Preparar diluciones de celdas efectoras, incluyendo un control solo de objetivo, en una placa de fondo redondeado de 96 pozos (véase la Figura Suplementaria 1A para una disposición representativa de placas con cuatro condiciones en triplicados). Cada condición se prepara en triplicado.
   2. Añadir 240 μL/pozo de celdas efectoras (5,0 × 10⁵ celdas/mL) a pozos correspondientes a una proporción E:T de 2:1.
   3. Añade 120 μL/pozo de medio a todos los pozos restantes.
   4. Realizar diluciones en serie de 2 veces desde pozos E:T = 2:1 hasta pozos E:T = 0,25:1. Mezcla bien pipeteando ≥5 veces y cambia las puntas entre transferencias.
      NOTA: Si no se han programado las pruebas de imagen en el sistema, programálas antes de montar el cocultivo. Las diluciones preparadas de células efectoras pueden mantenerse a 37°C con un 5% de CO₂ en una placa de fondo redondeado de 96 pozos durante hasta 30 minutos mientras se instala el sistema de imagen de células vivas.
5. Establecer una cocultura
   1. Obtén la placa de fondo plano recubierta con poli-D-lisina y 96 pozos.
   2. Añadir 100 μL/pozo de suspensión de celda objetivo a todos los pozos. Resuspende completamente las células objetivo inmediatamente antes de dispensar, pipeteando arriba y abajo ≥5 veces usando una pipeta adecuada (por ejemplo, 200 μL) y evita la formación de burbujas durante la transferencia.
   3. Añadir 100 μL/pozo de suspensión de celda efectora a los pozos correspondientes. Resuspende completamente las celdas efectoras inmediatamente antes de dispensar, pipeteando arriba y abajo ≥5 veces usando una pipeta adecuada (por ejemplo, 200 μL) y evita la formación de burbujas durante la transferencia.
   4. Añade 200 μL/PBS por pozo a los pozos no utilizados circundantes.
   5. Centrifugar la placa (2 min, 100 × g, RT, aceleración = baja [por ejemplo, 2]; desaceleración [freno] = baja [por ejemplo, 2]).
      NOTA: Este giro suave es fundamental para asentar las células rápida y uniformemente en el fondo del pozo y obtener imágenes precisas en el IncuCyte SX5. Usamos una centrífuga de mesa Eppendorf 5810R compatible con rotor de cubo oscilante, con los ajustes de aceleración y desaceleración en 2 (de 9).
   6. Coloque la placa en el sistema de imagen de células vivas y adquiera imágenes cada 1 hora durante 24 horas (extendible hasta 72 horas si es necesario). Asegúrese de que las imágenes se realicen bajo condiciones estándar de incubación (37°C/5% CO₂).
      NOTA: Para asegurar que la imagen en t = 0 h refleje con precisión el recuento basal de células objetivo, comienza la adquisición de imagen en un plazo de 10–15 minutos tras la preparación del cocultivo y la centrifugación. Para una placa completa con tres canales de imagen (es decir, verde, naranja y NIR), el tiempo de escaneo es de aproximadamente 10 minutos por hora para 3 imágenes/pozo con una ampliación del 20×.
   7. Verifica la calidad de imagen tras el primer escaneo y ajusta la configuración si es necesario.
6. Ajustes de los instrumentos
   1. Configura la mezcla espectral para corregir el desbordamiento de fluorescencia de SYTOX Orange en el canal verde. Ajusta el valor de desmezclado en el software comparando los canales verde y naranja y confirmando que las células muertas ^Naranja+ no se detectan erróneamente como Verde⁺. Para el experimento representativo (Figura 1), la contribución del canal naranja al canal verde se estableció en un 8,5%. Estos valores son específicos de cada conjunto de datos y deben optimizarse para cada experimento.
   2. Configura el análisis célula por célula no adherente para asegurar una segmentación y enmascaramiento precisos de todas las celdas dentro de cada campo de visión (véase la Figura Suplementaria 1B para la configuración representativa). Se recomiendan los siguientes parámetros para el sistema de imagen de células vivas utilizando modelos de efector de suspensión y línea celular objetivo:
      1. Establece el diámetro esperado del objeto en 15 μm (diámetro aproximado de la celda).
      2. Ponle la sensibilidad umbral y la sensibilidad de texturas a 5.
      3. Ajusta la sensibilidad de los bordes a 10 para facilitar la separación de los grupos celulares.
      4. Ajusta el rango de filtro de área de objeto aceptada en 50–2000^μm2 para excluir escombros y objetos grandes.
      5. Ajusta el máximo de excentricidad a 0,95 para excluir objetos no celulares.
   3. Configura los umbrales de clasificación (véase la Figura Suplementaria 1C para la gestión representativa). Utiliza pozos de control solo de objetivo para definir la población de células vivas de NIR⁺/^Naranja− de referencia. Luego se utilizan pozos de co-cultivo en momentos posteriores (por ejemplo, t = 4 h) para confirmar la separación clara con una superposición mínima entre las poblaciones ^NIR+/− y Orange^+/−. Ejemplos de umbrales de clasificación y parámetros de análisis se muestran en la Figura Suplementaria 1C.
      1. Establece el umbral de intensidad naranja en aproximadamente 15.
      2. Establece el umbral de intensidad NIR en aproximadamente 0,1.
         NOTA: Los parámetros y los valores umbral pueden variar según el instrumento, el software, el modelo de línea celular y la intensidad de la señal de fluorescencia.
         NOTA: Este protocolo puede adaptarse para ensayos primarios de citotoxicidad de células NK humanas o ADCC si las células objetivo expresan de forma estable la fluorescencia NIR (por ejemplo, emiRFP670). También puede adaptarse para ensayos de eliminación basados en citometría de flujo omitiendo el recubrimiento de poli-D-lisina y utilizando placas de fondo plano o redondeado de 96 pozos.

Figura 1. Cuantificación de la cinética y potencia de la citotoxicidad mediada por células NK-92 mediante el receptor de antígenos quiméricos (CAR) mediante imagen en tiempo real de células vivas. (A) Visión esquemática del ensayo de imagen de células vivas IncuCyte para monitorizar la citotoxicidad mediada por células NK. Las células ^{objetivo de} BCMA+ Ramos que expresan emiRFP670 (canal de infrarrojo cercano [NIR]) se co-cultivan con células efectoras NK-92 que expresan ZsGreen (canal verde), y la muerte celular se detecta usando SYTOX Orange (canal naranja). (B) Imagen representativa de fluorescencia de un pozo de cocultivo con una relación efector-objetivo (E:T) de 1:1 a 12 horas. Las células objetivo vivas (emiRFP670⁺) se muestran en azul, las células efectoras NK-92 (ZsGreen⁺) en verde y las células muertas (SYTOX Orange⁺) en rojo. Las imágenes se adquirieron utilizando el módulo de análisis Célula por Célula no adherente con un aumento del 20×. Barra de escala = 100 μm. (C) Cuantificación del crecimiento y supervivencia de la célula objetivo a lo largo del tiempo en diferentes proporciones E:T para células NK-92 de control y que expresan CAR. (D) Cuantificación de la supervivencia de la célula objetivo en función de la relación E:T en múltiples momentos (4, 8, 16 y 24 horas). El recuento de celdas objetivo se normalizó a pozos solo objetivo (E:T = 0:1) en cada momento de la época. (E) Representación esquemática de métricas cuantitativas utilizadas para evaluar la citotoxicidad: KR₅₀, relación asesino-objetivo necesaria para lograr el 50% de muerte a 12 horas; KT₅₀, tiempo necesario para lograr el 50% de muerte con una relación E:T de 1:1; y IKI₅₀, índice integrado de asesinos definido como el área del mapa de calor por debajo de la isoclina de supervivencia del 50%. (F) Mapas de calor que muestran el crecimiento y la supervivencia de la célula objetivo en función de la relación E:T y el tiempo para cada condición efector. Se indican valores cuantitativos para KR₅₀, KT₅₀ e IKI₅₀ para cada condición. Se obtuvieron recuentos vivos de células objetivo en bruto a partir ^{de la población} naranja ^NIR+/SYTOX con puerta utilizando análisis de clasificación célula por célula en el software IncuCyte 2021C. Todas las condiciones se realizaron en triplicado (n = 3). Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Se utilizó un análisis de regresión no lineal para modelar las tendencias de citotoxicidad en los paneles D y F. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mediante citometría de flujo

1. Preparar las células NK humanas primarias
   NOTA: Las células NK humanas primarias se aislaron de sangre periférica enriquecida con leucocitos obtenida de donantes adultos sanos mediante un método de enriquecimiento de células NK seguido de centrifugación por gradiente de densidad, como se describió^{anteriormente 3}. Las células NK purificadas se criopreservaron a 5 ×^{10 6} células/mL en solución congelante (90% FBS y 10% sulfóxido de dimetil [DMSO]) en alicotas de 0,5 mL en crioviales y se almacenaron a menos de −150°C hasta el^{uso 3}.
   1. Descongelar un vial que contiene 5 ×^{10 6} células NK humanas primarias agitando suavemente el criovial en un baño maria a 37°C durante aproximadamente 1 minuto, hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo.
      PRECAUCIÓN: Manipular todas las muestras de origen humano utilizando procedimientos de bioseguridad apropiados y equipos de protección individual de acuerdo con las directrices institucionales.
      PRECAUCIÓN: El DMSO facilita la absorción de sustancias químicas en la piel. Lleva el equipo de protección adecuado y evita el contacto directo.
   2. Transfiere las células descongeladas a un tubo centrífuga de fondo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de medio de cultivo de células NK precalentado (37°C) y mezclar mediante suave giro.
      NOTA: El medio de cultivo de células NK consiste en RPMI-1640 avanzado suplementado con 10% FBS, suero AB humano al 10%, 2 mM de L-alanil-L-glutamina, 100 μg/mL de primocina y 50 U/mL de IL-2 humana.
   3. Celdas centrífugas (5 min, 300 × g, RT, aceleración = máximo; desaceleración [freno] = máximo).
   4. Descarta el sobrenadante.
   5. Resuspende el pellet en 5 mL de medio de cultivo de células NK precalentado (37°C).
   6. Celdas centrífugas (5 min, 300 × g, RT, aceleración = máximo; desaceleración [freno] = máximo).
   7. Descarta el sobrenadante.
   8. Resuspende el pellet en 1 mL de medio de cultivo de células NK precalentado.
   9. Transfiere la suspensión a un pozo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pozos.
   10. Añade 1 mL de PBS estéril a los pozos circundantes para minimizar la evaporación.
   11. Incubar la placa de 24 pozos en un ángulo de 45° (utilizando un soporte o soporte para placas para mantener el ángulo) a 37°C con 5% de CO₂ durante 16–24 horas para permitir la recuperación de las células NK.
       NOTA: Las células NK humanas primarias requieren un contacto cercano entre células para la máxima supervivencia y recuperación, lo cual puede lograrse inclinando la placa de 24 pozos y permitiendo la acumulación en el borde de los pozos. Mantén un tiempo de incubación constante entre los experimentos.
       NOTA: Tras el periodo de recuperación, proceda directamente a la preparación de la célula objetivo y a la preparación del cocultivo.
2. Tinte las células objetivo con éster de succinimidil de carboxifluoresceína (CFSE).
   1. Obtener 5 × 10^{celdas objetivo de 5} y transfiere a un tubo centrífuga de fondo cónico de 15 mL.
      NOTA: Se utilizó una línea celular de linfoma derivada del paciente CD38⁺ como célula^{objetivo 16}.
   2. Lava las células una vez con 10 mL de PBS.
   3. Celdas centrífugas (5 min, 300 × g, RT, aceleración = máximo; desaceleración [freno] = máximo).
   4. Preparar una solución de trabajo de CFSE de 0,5 μM en PBS utilizando una solución de 5 mM de material diluyendo 1 μL de material CFSE de 5 mM en 10 mL de PBS en un tubo de centrífuga de fondo cónico de 15 mL.
      PRECAUCIÓN: El CFSE es un colorante fluorescente reactivo que se une a las aminas y puede suponer riesgos en la exposición de la piel o los ojos. Manipular con el equipo de protección individual adecuado y deshacerse de los reactivos no utilizados según las directrices locales de bioseguridad.
   5. Descarta el sobrenadante.
   6. Resuspende el pellet aproximadamente a 1 × 10⁶ células/mL en la solución CFSE.
   7. Incuba durante 15 minutos a 37°C con el tubo envuelto en papel de aluminio o colocado dentro de un recipiente opaco para protegerlo de la luz.
   8. Apaga la reacción añadiendo entre 5 y 10 volúmenes de medio de cultivo.
   9. Incuba durante 5 minutos a 37°C.
   10. Celdas centrífugas (5 min, 300 × g, RT, aceleración = máximo; desaceleración [freno] = máximo).
   11. Descarta el sobrenadante.
   12. Resuspender las células a 2,5 × 10⁵ celdas/mL de modo que 100 μL contengan 2,5 × 10⁴ celdas.
       NOTA: Proceder directamente al recubrimiento para mantener una intensidad consistente de la señal CFSE y la viabilidad de la célula objetivo.
3. Celdas objetivo de placas
   1. Obtén una placa de fondo redondeado y 96 pozos.
   2. Añadir 100 μL/pozo de celdas objetivo (2,5 × 10⁵ celdas/mL) a pozos designados utilizando una pipeta multicanal (véase la Figura Suplementaria 2). Cada condición se repartió en triplicado.
      NOTA: Asegúrese de que la suspensión de la celda sea homogénea antes de colocar.
4. Prepara y añade anticuerpos
   1. Preparar 200 μL de solución de anticuerpos 4× (100 μg/mL) en un medio de cultivo de células NK para cada anticuerpo de prueba y control isotipo emparejado.
      NOTA: Este paso es modular y puede adaptarse a cualquier anticuerpo que medie la ADCC contra la línea celular objetivo elegida. Las concentraciones y formulaciones de stock de anticuerpos pueden variar; Ajusta las diluciones en consecuencia. Conservantes como la azida pueden afectar la supervivencia de las células objetivo y la funcionalidad de las células NK. Aunque se pueden probar una variedad de concentraciones de anticuerpos, aquí se utiliza una concentración final de 25 μg/mL.
   2. Transfiere soluciones de anticuerpos a una placa de pozo profundo.
   3. Añade 50 μL/pozo de solución de anticuerpos a las células objetivo y mezcla bien pipeteando ≥5 veces.
   4. Añade 50 μL/pozo de medio de cultivo de células NK a pozos de control sin anticuerpos y mezcla bien pipeteando ≥5 veces.
   5. Incubar durante 25–30 minutos a 37°C con un 5% de CO₂.
5. Prepara y añade células NK
   1. Contar y obtener 2 × 10 celdas^{de 5} NK utilizando un método de conteo de células basado en exclusión de colorantes (por ejemplo, azul de tripán) o un método equivalente validado. El número es suficiente para tres condiciones que contienen células NK en triplicado, con excedentes para compensar la pérdida por pipeteo (véase la Figura Suplementaria 2). Proceder si la viabilidad es ≥75%, ya que una menor viabilidad puede afectar al rendimiento del ensayo.
   2. Resuspender las células a 2,5 × 10⁵ células/mL en 800 μL de medio humano primario de cultivo de células NK (concentración final = 1,25 × 10⁴ células/50 μL).
   3. Añade 50 μL/pozo de celdas NK a los pozos correspondientes y mezcla bien pipeteando ≥5 veces.
      NOTA: Asegúrese de que la suspensión de la celda sea homogénea antes de colocar.
   4. Añade 50 μL/pozo de medio de cultivo para controlar los pozos y mezcla bien pipeteando ≥5 veces.
6. Establecer la cocultura final
   1. Inspeccione cuidadosamente la placa de fondo redondeado de 96 pozos para confirmar que todos los pozos contienen 200 μL con niveles uniformes de menisco y sin burbujas.
   2. Centrifugar la placa (2 min, 100 × g, aceleración = baja [por ejemplo, 2]; desaceleración [freno] = baja [por ejemplo, 2]).
      NOTA: Este giro blando es importante para asentar rápidamente las células y aumentar el contacto célula-célula. Usamos una centrífuga de mesa Eppendorf 5810R compatible con rotor de cubo oscilante, con los ajustes de aceleración y desaceleración en 2 (de 9).
   3. Incubar durante 16–18 horas (durante la noche) a 37°C con un 5% de CO₂.
      NOTA: Esta duración de incubación está optimizada para la lectura de citotoxicidad en lugar de la desgranulación, que se evalúa mejor midiendo la expresión de CD107a en momentos de tiempo anteriores (2–6 horas). Por tanto, las respuestas de desgranulación máximas pueden subestimarse.
      NOTA: No extiende la incubación más allá de 18 horas, ya que un cocultivo prolongado puede provocar una muerte excesiva de células objetivo en pozos de control y una reducción del rango dinámico entre condiciones experimentales.
7. Realizar citometría de flujo
   1. Centrífuga (5 min, 300 × g, aceleración = máximo; desaceleración [freno] = máximo).
   2. Descarta el sobrenadante.
   3. Lava todos los pozos con 200 μL/pozo de FACS buffer (2% FBS, 2 mM EDTA en PBS).
   4. Prepara una mezcla maestra de anticuerpos superficiales en el tampón FACS añadiendo CD56-BV421 a 1:50 de dilución, CD16-BV785 a 1:50 de dilución y CD107a-PE-Cy7 a 1:25 de dilución.
      NOTA: Calcular el volumen total de mezcla maestra basándose en el diseño experimental de placas (número de pozos × 50 μL/pozo + 20% de exceso). Los clones de anticuerpos pueden variar en intensidad de tinción y en accesibilidad al epítopo. Los clones utilizados en los datos representativos se listan en la Tabla de Materiales, y los clones alternativos pueden requerir titulación. Se pueden incluir anticuerpos adicionales para el fenotipado de subconjuntos de células NK (por ejemplo, KIRs, NKG2A/C/D y CD57) y marcadores de activación (por ejemplo, CD69 y HLA-DR).
   5. Resuspende las células en 50 μL/pozo de mezcla maestra de anticuerpos y mezcla a fondo pipeteando ≥5 veces.
   6. Incuba durante 15 minutos a 4°C con el plato envuelto en papel de aluminio o colocado dentro de un recipiente opaco para protegerlo de la luz.
   7. Añade 150 μL/pozo de buffer FACS.
   8. Centrífuga (5 min, 300 × g, aceleración = máximo; desaceleración [freno] = máximo).
   9. Descarta el sobrenadante.
   10. Resuspender las células en 100 μL/pozo de 5 μM 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en el tampón FACS y proceder inmediatamente a la adquisición de citometría en flujo. No se requiere incubación previa a la adquisición.
   11. Adquirir datos mediante citometría de flujo y registrar canales de fluorescencia para CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI y cualquier fluoróforo adicional.
       NOTA: Los ajustes de adquisición (por ejemplo, voltajes del detector, compensación y compuertas) pueden requerir optimización. Utiliza controles sin teñir y con una sola tinción para la compensación y la configuración de compuertas, con perlas de compensación o celdas representativas según corresponda. Se deben considerar controles de fluorescencia menos uno para marcadores con expresión continua o tenue (por ejemplo, CD107a). Mantener configuraciones y estrategias de acceso consistentes, incluyendo la filtración viva/muerta e identificación de poblaciones objetivo y efectores, entre los experimentos.
       NOTA: Tanto el Paso 1 como el Paso 2 pueden adaptarse para células objetivo adherentes. Las células objetivo de semilla (con sus respectivos medios de cultivo) en una placa de fondo plano de 96 pozos un día antes del cocultivo, a una densidad que alcanza aproximadamente el 70% de confluencia el día del ensayo. Tras confirmar la adherencia, descartar el medio de célula objetivo y reemplazarlo por 100 μL de medio NK fresco, luego añadir células efectoras para iniciar el cocultivo. Debido a las diferencias en el tamaño y la morfología de la célula, los parámetros de análisis célula por célula de IncuCyte deben optimizarse para cada línea celular adherente.
       NOTA: Para ensayos basados en citometría de flujo con células adherentes, tras el cocultivo, centrifugar la placa (300 × g, 5 min) y descartar el sobrenadante. Añadir 100 μL/pozo de TrypLE e incubar a 37°C con 5% de CO₂ durante aproximadamente 5–15 minutos (dependiendo de la línea celular) para desprender las células. Añade 100 μL/pozo de buffer FACS, mezcle pipeteando arriba y abajo en un movimiento circular, y transfiere todas las celdas a una placa de fondo redondeado de 96 pozos. Inspecciona los pozos microscópicamente para confirmar el desprendimiento completo antes de proceder con la tinción (Paso 2, Subpaso 7). Optimizar el tiempo de incubación de TrypLE según sea necesario para lograr una suspensión de célula única.

Resultados

Para cuantificar la citotoxicidad de las células NK en tiempo real, las células efectoras NK-92 diseñadas para expresar CARs anti-BCMA fueron co-cultivadas con células objetivo de Ramos ^BCMA+ en una placa negra y transparente de fondo plano de 96 pozos y monitorizadas mediante imágenes de células vivas (Figura 1A y Figura suplementaria 1A). Se añadieron celdas efectoras con proporciones E:T de 0:1 (solo objetivo), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 y 2:1, realizando cada condición en triplicado. Se evaluaron tres constructos diferentes de CAR NK-92: CAR1 sin dominio coestimulador, CAR2 con dominio coestimulador 4-1BB (CD137), y CAR3 con dominio COESTIMULADOR DAP10, junto con células NK-92 de control que expresan un vector solo ZsGreen. Todas las células efectoras se generaron mediante transducción lentiviral, como se describió^{anteriormente, 4} usando casetes de transgenes ZsGreen-P2A-CAR. Las células objetivo de Ramos fueron transducidas de forma similar con un vector lentiviral codificador emiRFP670. El crecimiento y la supervivencia de las células objetivo se monitorizaron cada hora durante un periodo de 24 horas utilizando el instrumento de imagen de células vivas, midiendo la fluorescencia verde para células ZsGreen⁺ NK-92, la fluorescencia naranja para células muertas SYTOX Orange⁺ y la fluorescencia NIR para las células objetivo emiRFP670⁺ (Figura 1A y Figuras suplementarias 1B y 1C).

Se adquirieron imágenes microscópicas en intervalos de tiempo definidos para visualizar células efectoras, células objetivo vivas y células muertas durante el cocultivo (Figura 1B). La cuantificación del crecimiento y supervivencia de la célula objetivo demostró que las células CAR2 y CAR3 NK-92 exhibían cinética de muerte más rápida que las células CAR1 NK-92, especialmente en momentos anteriores con una proporción E:T de 1:1. La muerte de células objetivo aumentó con mayores proporciones E:T, incluyendo en células NK-92 de control, que demostraron citotoxicidad natural (Figura 1C). Estas mediciones destacan la capacidad de la imagen de células vivas para captar cambios dinámicos en la actividad citotóxica. La supervivencia de la célula objetivo también se analizó en función de la relación E:T en puntos temporales definidos para comparar la potencia de CAR NK-92. Las celdas CAR2 y CAR3 NK-92 mostraron mayor potencia en proporciones E:T más bajas en momentos posteriores (por ejemplo, E:T = 0,25:1 a 24 h) y en proporciones intermedias E:T en momentos anteriores (por ejemplo, E:T = 1:1 a 4 h) (Figura 1D). No se observaron diferencias significativas en la muerte entre las células efectoras NK-92 de CAR2 y CAR3 en los análisis.

Un mapa de calor que integra la relación E:T, el tiempo de coincubación y la supervivencia de las células objetivo proporciona una visualización completa de la citotoxicidad natural y mediada por la CAR en todas las poblaciones de efectores, y permite una evaluación cuantitativa. Se definieron tres parámetros para cuantificar la potencia y la cinética: KR₅₀, la proporción asesino-objetivo que logra el 50% de muerte (a 12 horas); KT₅₀, el tiempo de coincubación requerido para lograr el 50% de matanza (con una proporción E:T de 1:1); y IKI₅₀, el índice integrado de asesino que representa el área del mapa de calor por debajo del 50% de supervivencia, definido por la isoclina del 50% de supervivencia (Figura 1E). Estas métricas permiten comparar la potencia celular CAR NK-92 (KR₅₀), la cinética de muerte (KT₅₀) y el rendimiento citotóxico integrado (IKI₅₀) (Figura 1F). Este análisis demuestra cómo el ensayo puede comparar cuantitativamente plataformas de células NK diseñadas a través de múltiples parámetros dentro de un solo experimento.

La citometría de flujo con recuento celular se utilizó para medir la ADCC mediante el co-cultivo de células blanco marcadas con fluorescencia con células NK humanas primarias en presencia o ausencia de anticuerpos terapéuticos y cuantificando la población residual de células blanco vivas tras 16–18 horas de incubación (Figura 2A). Se pueden utilizar citómetros de flujo como Cytek Aurora, BD Symphony o BD Fortessa con un muestreador de alto rendimiento. En la configuración representativa (Figura suplementaria 2), las células objetivo de linfoma derivadas ^{del paciente} CD38+ se colocaron en una placa de fondo redondeado de 96 pozos, y se añadió daratumumab (o anticuerpo isotipo) a los pozos apropiados. Las células NK se cocultivaron entonces con una relación E:T de 0,5:1, una proporción optimizada para estas células objetivo para minimizar la muerte natural y permitir la detección de ADCC. Tras la incubación, se realizó citometría de flujo para resolver poblaciones celulares por dispersión hacia adelante y lateral, excluir eventos no viables usando DAPI y separar las células objetivo ^CFSE+ de las células NK CD56⁺CD16⁺ para análisis paralelo (Figura 2B). Este diseño permite la medición simultánea de la citotoxicidad y la caracterización fenotípica.

Figura 2. El ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) basado en citometría de flujo permite cuantificar simultáneamente la supervivencia de la célula objetivo y la activación de las células NK. (A) Resumen esquemático del ensayo del ADCC. Las células objetivo de linfoma CD38⁺ marcadas con CFSE se colocaron en placas a 2,5 × 10⁴ células por pozo y se cultivaron bajo cinco condiciones: células objetivo solas; células objetivo con daratumumab (25 μg/mL); celdas objetivo con celdas NK (E:T = 0,5:1); células objetivo con células NK y daratumumab; y células objetivo con células NK y anticuerpo de control isotípico (25 μg/mL). (B) Estrategia representativa de compuerta de citometría de flujo. Los eventos fueron primero controlados por dispersión directa y dispersión lateral, seguidas por la exclusión de celdas no viables usando DAPI. Las células objetivo se identificaron como eventos ^CFSE+ y las células NK como eventos CD56⁺ y CD16⁺. La desgranulación de las células NK se evaluó mediante la expresión de CD107a. (C) Cuantificación de la supervivencia de la célula objetivo, expresada como porcentaje respecto a la condición de control solo objetivo (fijada al 100%). (D) Cuantificación de la desgranulación de células NK, mostrada como el porcentaje de células CD107a⁺ dentro de la población de células NK. Las barras representan la desviación media ± estándar, y los puntos superpuestos representan pozos replicados individuales (n = 3). El análisis estadístico se realizó utilizando análisis unidireccional de la varianza con la prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey. La significación estadística se indica de la siguiente manera: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

El objetivo principal es la supervivencia de la célula objetivo, calculada dentro de la compuerta ^CFSE+ en vivo y normalizada a la condición solo objetivo, que se establece al 100% de supervivencia. Esta normalización controla la pérdida espontánea de célula objetivo y permite la comparación directa entre condiciones. En datos representativos (Figura 2C), la adición de daratumumab por sí sola no redujo la supervivencia de las células objetivo, lo que confirma que el anticuerpo no tiene un efecto directo sobre la viabilidad de las células objetivo en ausencia de células efectoras. El cocultivo con células NK por sí sola redujo la supervivencia de la célula objetivo hasta aproximadamente el 70%, indicando citotoxicidad natural basal. La adición de daratumumab redujo aún más la supervivencia a aproximadamente un 37%, consistente con una mayor ejecución mediada por anticuerpos, mientras que la condición de control del isotipo mostró una supervivencia de aproximadamente un 62%, comparable a la condición solo de NK. Los experimentos exitosos muestran una clara separación entre las condiciones tratadas por anticuerpos y las de control con alta reproducibilidad entre réplicas.

El fenotipado secundario de las células NK proporciona una confirmación complementaria del vínculo entre la muerte de células objetivo y la activación del efector. La desgranulación de células NK, medida como el porcentaje de células NK CD107a⁺ , fue más baja en el cocultivo célula-objetivo célula NK sin anticuerpos y más alta en la condición tratada con daratumumab (aproximadamente 31%), con el control isotipo mostrando desgranulación intermedia (aproximadamente 19%), apoyando la activación mediada por anticuerpos (Figura 2D). Estos resultados demuestran que el ensayo puede distinguir la muerte de células objetivo de la activación del efector. Aunque las tendencias de desgranulación y supervivencia suelen estar alineadas, no se solapan completamente, lo que indica que representan procesos biológicos relacionados pero distintos.

Los experimentos subóptimos suelen mostrar una reducción de la separación entre condiciones, variabilidad en el recuento celular entre pozos, alta muerte de células objetivo en pozos de control, tinción de CFSE débil o una elevada desgranulación de fondo. Estos resultados pueden deberse a una pobre viabilidad de célula objetivo, recuperación inconsistente de células NK, mezcla inadecuada o variabilidad en la tinción y adquisición. Dado que el ensayo identifica de forma independiente los compartimentos objetivo y efector, puede ampliarse para incluir fenotipado adicional de las células objetivo (por ejemplo, densidad de antígenos o expresión de ligandos) y una caracterización más amplia de las células NK. La inclusión de una condición de "solo NK" puede cuantificar aún más la desgranulación basal y la viabilidad de las células NK. Este diseño multiparámetro es una ventaja clave, ya que permite interpretar la citotoxicidad funcional junto con fenotipos inmunitarios mecanicistas.

Figura suplementaria 1. Distribución representativa de placas y flujo de trabajo de análisis para el ensayo de citotoxicidad por imagen de células vivas. (A) Disposición representativa de placas de 96 pozos para el ensayo de muerte de células CAR NK. Cuatro condiciones de celda efectora están organizadas en cuadrantes, cada una evaluada en proporciones E:T de 0:1 (control solo objetivo), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 y 2:1, con cada condición realizada en triplicado (un total de 60 pozos de ensayo). (B) Configuración representativa del análisis célula-per-célula no adherente en el software IncuCyte 2021C, ilustrando parámetros espectrales de desmezcla, segmentación y enmascaramiento utilizados para identificar células efectoras y objetivo individuales, excluyendo escombros y agregados. (C) Estrategia representativa de gating de clasificación célula por célula usando fluorescencia NIR frente a SYTOX Orange para definir la población viva de células objetivo. Se utilizan pozos solo objetivo y pozos de cocultivo en un momento de ejemplo (t = 4 h) para confirmar la separación entre poblaciones de células vivas y muertas. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2. Disposición representativa de placas para el ensayo ADCC basado en citometría de flujo. Disposición representativa de placas de 96 pozos que ilustra cinco condiciones experimentales en triplicado en filas B–D y columnas 2–6 (pozos de ensayo totales = 15): (1) control solo objetivo, (2) células objetivo con daratumumab, (3) células objetivo con células NK, (4) células objetivo con células NK y daratumumab, y (5) células objetivo con células NK y anticuerpo de control isotípico. Las celdas objetivo se emplacaron a 2,5 × 10⁴ celdas por pozo, y se añadieron células NK a 1,25 × 10⁴ celdas por pozo para lograr una relación E:T de 0,5:1. Se utilizaron anticuerpos a una concentración final de 25 μg/mL. Los pozos circundantes se llenaron con PBS para minimizar la evaporación. La condición solo de objetivo se utilizó para normalizar la supervivencia de las células objetivo, y el control isotipo tuvo en cuenta los efectos de la formulación de anticuerpos independientemente de la especificidad del antígeno. Puede ser necesaria optimizar la relación E:T dependiendo de la susceptibilidad de la línea celular objetivo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Estos protocolos proporcionan dos enfoques complementarios para cuantificar la citotoxicidad de células NK en un formato estandarizado de placas de 96 pozos. El Paso 1 utiliza imágenes en tiempo real de células vivas para monitorizar continuamente la pérdida de célula objetivo y es muy adecuado para evaluar la cinética de la muerte natural y mediada por CAR a través de múltiples proporciones E:T. El paso 2 utiliza citometría de flujo para cuantificar la ADCC tras un periodo de coincubación definido, mientras se separa simultáneamente los compartimentos objetivo y efector para el análisis^{fenotípico 17}. Estos métodos, que se presentan como plataformas complementarias de ensayo que pueden usarse para modelar procesos biológicos distintos, también son fácilmente intercambiables. Las células NK humanas primarias pueden utilizarse para ensayos ADCC basados en imágenes de células vivas y también pueden ser diseñadas para la eliminación mediada por CAR en ensayos de citometría de flujo. Además, aunque las células NK-92 de tipo salvaje carecen de expresión^{CD16 18}, la introducción de CD16 (por ejemplo, mediante transducción lentiviral) permite fácilmente que las células NK-92 medien potentes ADCC. Por ello, ambos ensayos pueden adaptarse a las necesidades científicas y traslacionales individuales.

Hay varios pasos que son especialmente importantes para la reproducibilidad en ambos ensayos. Pequeños cambios en el número de células efectoras y fenotipo pueden alterar drásticamente la supervivencia de las células objetivo. Un recuento preciso de células y una resuspensión completa durante el blindaje son esenciales para minimizar desviaciones en el recuento celular y mezclas incompletas. De manera similar, la preparación celular debe mantenerse consistente entre experimentos, incluyendo viabilidad, tiempo de recuperación y exposición previa a citocinas, para garantizar una funcionalidad uniforme de los efectores. La geometría de las placas es otro factor clave que determina el rendimiento del ensayo. En el flujo de trabajo de imagen de células vivas, las placas recubiertas de fondo plano permiten la adquisición estable de imágenes y un análisis de campo consistente, mientras que en el flujo de citometría de flujo, las placas de fondo redondeado favorecen el contacto célula-célula y facilitan la recuperación de cocultivos no adherentes en el punto final. Además, la calidad del marcaje fluorescente debe confirmarse antes del ensayo, ya que una mala discriminación célula-objetivo mediante imagen o una débil separación CFSE mediante citometría de flujo comprometen la cuantificación e interpretación.

Estos dos flujos de trabajo presentan consideraciones técnicas distintas. En el ensayo de imagen de células vivas, las causas comunes de mala calidad de los datos incluyen el placado celular desigual, el agrupamiento o agrupamiento celular denso y umbrales subóptimos en el análisis de imágenes, todos ellos fácilmente corregibles. Estos problemas pueden distorsionar el recuento de células y provocar un seguimiento inconsistente a lo largo del tiempo. En el ensayo basado en citometría de flujo, los resultados subóptimos suelen ser causados por una alta muerte de células diana de fondo, una separación débil de poblaciones objetivo y efector, una mala tinción por anticuerpos o pipeteo inconsistente entre pozos replicados. Dado que estos ensayos están diseñados para análisis comparativos, la inclusión de controles internos adecuados es esencial para la interpretación, incluyendo controles solo de objetivo para la normalización y controles negativos emparejados para condiciones específicas de anticuerpos o CAR.

Con estos métodos deben considerarse varias limitaciones compartidas y específicas del ensayo. El ensayo de imagen de células vivas proporciona resolución temporal pero depende de parámetros precisos de marcaje fluorescente y análisis de imágenes, ambos influenciados por agrupamiento celular, solapamiento espectral o cambios en la morfología durante el^{cocultivo 15}. En algunos casos, especialmente cuando los ensayos involucran células efectoras primarias, lograr un marcaje fluorescente adecuado sin alterar la dinámica de la muerte es difícil o inviable. El ensayo basado en citometría de flujo proporciona una mayor resolución fenotípica en un extremo definido, pero no distingue de forma independiente la muerte temprana de la tardía a menos que se recojan múltiples puntos temporales coincidentes, lo que puede ser costoso y llevar mucho^tiempo. Además, las mediciones de los puntos finales pueden reflejar no solo la muerte de la célula objetivo, sino también diferencias en la proliferación de célula objetivo, la pérdida de efectores o la recuperación durante el manejo de la muestra. Por tanto, las lecturas mecanicistas como CD107a se interpretan mejor como indicadores complementarios de activación de células efectoras en lugar de sustitutos directos de la eliminación de célula^{objetivo 19}. De forma más amplia, ninguna de las dos plataformas reproduce completamente la arquitectura espacial, las interacciones estromales, los gradientes de citocinas o las restricciones de tráfico que moldean la función de las células NK in vivo.

También deben considerarse varios factores biológicos al interpretar ensayos de muerte de células NK. La variabilidad de donante a donante es intrínseca a los experimentos con células NK humanas primarias, que difieren en potencial citotóxico y composición de subconjuntos debido a la edad del donante, sexo, antecedentes de enfermedades infecciosas y polimorfismos de^{receptores 20}. El uso de células NK-92 reduce considerablemente la variabilidad, pero estas células aún pueden mostrar cambios relacionados con la fuente y el paso¹⁸. Nuestro protocolo mitiga diferencias técnicas o experimentales mediante parámetros estandarizados y comparaciones de placas comparativas para evaluar estos factores biológicos con mayor precisión. Cuando sea factible, recomendamos usar rangos definidos de paso NK-92 con umbrales de viabilidad fijos. Para las células NK primarias, los ensayos deben utilizar células NK de múltiples donantes para cada condición, con análisis estadísticos que tengan en cuenta la variabilidad entre donantes (por ejemplo, modelos pareados o de efectos mixtos), dado que las diferencias relativas entre condiciones generalmente se conservan entre donantes. Además, se pueden incorporar marcadores adicionales de células NK (por ejemplo, KIRs, NKG2A/C/D y CD57) en paneles de anticuerpos utilizados para citometría de flujo para comparar frecuencias de subconjuntos entre donantes y evaluar la activación específica de células NK de cada subconjunto (es decir, expresión CD107a y CD69), facilitando aún más la interpretación de los resultados. Finalmente, para todos los ensayos de muerte de células NK, deben considerarse ciertos escenarios adicionales. La expresión de antígenos dirigidos en células NK, ya sea por expresión endógena o por adquisición de antígenos de células objetivo mediante trogocitosis, puede dar lugar a fratricidios de células NK y desconcertar resultados. Por ejemplo, el daratumumab puede dirigirse al CD38 expresado en células NK e inducir el fratricidio²¹, limitando la magnitud del ADCC frente a los objetivos previstos. Afortunadamente, la imagen de células vivas y los ensayos de citometría de flujo permiten cuantificar células NK para evaluar el fratricidio.

A pesar de estas limitaciones, el uso combinado de imágenes de células vivas y citometría de flujo proporciona un marco práctico para la prueba funcional reproducible de células NK en una variedad de aplicaciones básicas y preclínicas. El flujo de trabajo de imagen es ventajoso cuando el comportamiento temporal es importante, como distinguir respuestas citotóxicas rápidas de retardadas o comparar la cinética de eliminación entre los diseños^{CAR 22}. El flujo de trabajo basado en citometría de flujo es ventajoso cuando las lecturas funcionales deben interpretarse junto con fenotipos de células efectoras y células objetivo dentro de la misma muestra. En conjunto, estos enfoques permiten la evaluación cuantitativa de la matanza natural, la citotoxicidad mediada por la RCA y el ADCC utilizando plataformas experimentales ampliamente accesibles. Al establecer un marco estandarizado y escalable, este sistema facilita una rigurosa evaluación comparativa y una interrogación mecanicista entre modalidades basadas en células NK, acelerando el desarrollo y la traducción clínica de inmunoterapias de próxima generación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Medio basal para cultivo de células NK-92 y células NK humanas primarias (consulte el protocolo para la formulación completa)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Marcador de degranulación para citometomía de flujo
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Citometomía de flujo
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Citometomía de flujo
Centrífuga de sobremesa con rotor de cubo oscilante compatible con tubos de 15 ml y placas de 96 pocillos (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	Utilizado para la sedimentación de células y la centrifugación de placas (100–300 × g)
Carboxiflurescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Tinte de proliferación celular para el marcado de células diana
Citómetro de flujo espectral Cytek Aurora (o equivalente)	Cytek Biosciences	N7-00003	Utilizado para la adquisición y análisis de citometomía de flujo
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindole)	BioLegend	422801	Tinte nuclear para discriminación entre células vivas y muertas
Placa de 96 pocillos de fondo plano	USA Scientific	1896-2110	Utilizado para la preparación de anticuerpos
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Reactivo de criopreservación
Suero fetal bovino (FBS)	Avantor	76419-584	Suplemento de medio basal; utilizado en el tampón FACS (FBS al 2%)
Baño de agua de propósito general, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	Para descongelación de células
GlutaMAX (suplemento de L-alanyl-L-glutamina)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Fuente estable de glutamina
Suero AB humano	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Suplemento para medio de cultivo de células NK humanas primarias
Sistema de imagen de células vivas IncuCyte SX5	Sartorius	4816	Imagen en tiempo real de células vivas y análisis célula por célula
Contador de células de doble fluorescencia LUNA-FL (o equivalente)	Logos Biosystems	L20001	Conteo automatizado de células
Parafilm M (rollo de 4 in × 250 pies)	Genesee	16-101	Sello y almacenamiento de placas
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), estéril (pH 7,2–7,4)	Corning	21-020-CV	Utilizado para lavados y preparación de tampón FACS
Poli-D-lisina (0,1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Reactivo de recubrimiento de placas
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antibiótico
Interleucina-2 humana recombinante (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Citocina
Kit de enriquecimiento de células NK humanas RosetteSep	STEMCELL Technologies	15065	Cóctel de enriquecimiento de células NK humanas
Tinte de células muertas SYTOX Orange	Thermo Fisher Scientific	S34861	Tinte de viabilidad para imagen de células vivas
Trypan Blue 0,4%	Gibco	15250-061	Tinte de viabilidad para el conteo de células
TrypLE Express Enzyme (1X), sin fenol rojo	Thermo Fisher Scientific	12604039	Para la desadhesión de células
EDTA UltraPure (0,5 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Utilizado para la preparación del tampón FACS
Tubos de centrífuga de fondo cónico de 15 ml	Corning	352097	Estériles
Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (tratada con cultivo de tejidos)	Corning	3524	Utilizado para la recuperación de células NK
Placa de 96 pocillos de fondo redondo transparente (tratada con cultivo de tejidos)	Corning	3799	Utilizado para ensayos de cocultivo y citometomía de flujo
Placa de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano transparente negro (tratada con cultivo de tejidos)	Corning	3603	Compatible con sistemas de imagen de células vivas